CN104584834A

CN104584834A - 一种采用Sr18生物制剂促进植物生长的方法

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Publication number: CN104584834A
Application number: CN201510039224.8A
Authority: CN
Inventors: 冯欣; 黄弢; 任毅; 田中原; 王修清; 刘屾; 王亚萍; 孙建华
Original assignee: Tianjin Normal University
Current assignee: Tianjin Normal University
Priority date: 2015-01-27
Filing date: 2015-01-27
Publication date: 2015-05-06
Anticipated expiration: 2035-01-27
Also published as: CN104584834B

Abstract

本发明公开了一种采用Sr18生物制剂促进蔬菜生长的方法，它是将挑选出的粒大饱满的蔬菜种子冲洗活化；再将其28℃催芽两天；待胚根长至0.5cm即可播种于穴盘中，28℃条件下继续培养，待蔬菜幼苗破土后，将恒温箱温度调整，培养幼苗12-15天，供试土壤为重量份数比的灭菌土：营养土：蛭石=2：1：1；移栽蔬菜苗次日，向幼苗的根系周围施加Sr18发酵滤液，待植株生长20天后，重新补加一次该发酵滤液；然后测定蔬菜生长的各项指标。室内及田间实验结果显示：Sr18发酵滤液对蔬菜生长有促进作用，通过改善植株的营养状况，能显著提高苗期的株高，增加蔬菜的生物量；通过诱导植株抗性，增加植株抵御病虫害的能力。

Description

一种采用Sr18生物制剂促进植物生长的方法

本发明得到国家自然科学基金资助，项目号：31272019。

技术领域

本发明涉及一种微生物代谢产物，更确切地说是总状共头霉丝状真菌Sr18（Syncephalastrum racemosum ）发酵滤液以及该制剂促进植物生长，提高作物产量的应用。

背景技术

传统的植株种植过程中，多是使用化学肥料为植物提供所需营养，支持植物生长。但是化肥利用率平均只有30%～35%，每年有大量肥份流入水体，造成富营养化日趋严重，同时对水体、土壤、大气、生物及人体健康造成了严重危害。近年来，随着人们生活水平的提高和环保意识的增强，对农产品的品质要求越来越高。为了避免土壤板结、腐蚀等理化性状的恶化，提高农作物的产量，生产绿色无公害有机食品，使用安全、高效、无环境污染的生物有机肥料防治植物病害已普遍为人们所接受。

20世纪后期，人们便开始研究利用生物菌剂防治病害促进植物的生长。许多研究已经证明植物生长发育过程中，根际或共生微生物可产生植物激素直接地促进植物生长，有些菌株也可能诱导植物生理代谢发生变化直接促进植物生长。取材于天然的生物菌剂，与环境相容性高、无毒害、无污染、资源丰富、分布广泛，还具有明显的杀线活性。

植物线虫病是近年来严重危害农作物生产的主要病害，虫体寄生范围广，致病性强，大多数分布在表层土的耕作层中，可以寄生在植物的根系、幼芽、茎叶等部位，主要为害植物的根部，破坏植物根系输导组织，在寄主植物的整个生长周期内均可受到线虫的侵染。植物寄生线虫约占线虫全部种类的10%，几乎每种植物都可被一种或几种线虫寄生或为害，在全球农林业中，每年因作物病原线虫造成的直接经济损失高达1570亿美元以上。其中，根结线虫和孢囊线虫对作物的危害最为严重，它们具有广泛的寄主群体，造成的危害程度已超过细菌、病毒，成为仅次于真菌的第二大植物病害，严重影响了农作物的产量。根结线虫对植物根系侵染的同时，又加重了枯萎病、白粉病、根腐病等其他土传真菌病害和部分细菌性病害的发生，已成为设施作物生产发展的障碍。

发明内容

本发明立足于生产实践的需要，利用从土壤中筛选出的总状共头霉丝状真菌Sr18发酵产物进行土壤处理，药效实验证实对植物根结线虫病害有较好的防治效果并具有促进植株生长和明显的增产作用。与同类生长促进剂相比，Sr18 发酵滤液不仅能够有效促进植物地上及地下部分生长，显著增产增收，同时还具有耐热、水溶性、低毒、杀线虫谱广、作用快、药效高等特点。

本发明涉及微生物发酵产物，更确切地说是总状共头霉丝状真菌Sr18（Syncephalastrum racemosum ）的发酵滤液。以及该制剂促进植物生长上的应用，其中的Sr18菌菌种，制备方法见ZL03130527.X。

本发明采用微生物发酵产物作为生物农药使用，降低了因使用化学农药的高成本，同时不会造成因使用活菌剂而造成的二次污染，该制剂的开发和使用，有利于环境的保护和绿色蔬菜的生产，具有良好的市场前景和应用前景。

为实现上述目的本发明公开了一种采用Sr18生物制剂促进蔬菜生长的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）将挑选出的粒大饱满的蔬菜种子用清水冲洗干净，经5%次氯酸溶液消毒后，放在55-58℃温水中恒温浸种15-20min，以促进种子吸水活化；

（2）待水温降至23-25℃，继续浸泡5－6个小时，再将蔬菜种子轻搓洗净后放入恒温培养箱，26-28℃条件下催芽两天；

（3）待胚根长至0.4-0.5 cm 即可播种于穴盘中，26-28℃条件下继续培养，待蔬菜幼苗破土后，将恒温箱温度调整为白天16h、28℃，夜晚8h、22℃，培养幼苗12-15天，选取株高统一的蔬菜幼苗移栽至高16cm、直径18cm花盆中，每盆定植一棵蔬菜幼苗；供试土壤为重量份数比的灭菌土：营养土：蛭石=2：1：1；

（4）在移栽蔬菜苗后的第二天，向每盆幼苗的根系周围施加供试剂：①Sr18发酵滤液组：施加1.75mL Sr18发酵滤液；②1/2 Sr18发酵滤液组：施加0.875mL Sr18发酵滤液；③1/4Sr18发酵滤液组: 施加0.4375mL Sr18发酵滤液，待植株生长20天后，各浓度实验组重新补加一次供试Sr18发酵滤液；

（5）然后测定蔬菜生长的各项指标。

本发明所述的Sr18发酵滤液指的是：5吨罐发酵液，添加国产麦芽精5吨罐发酵。

本发明所述的蔬菜指的是黄瓜、芹菜、辣椒、番茄。

本发明所述Sr18生物制剂促进蔬菜生长的方法，其中对辣椒植株生长的促进作用，指的是Sr18发酵滤液用量5mL/m²，在辣椒定植前5天兑水500kg-700kg/667 m²均匀沟施。实验结果显示：②1/2 Sr18发酵滤液5mL/m²处理区增产44.68％，具有显著的刺激生长的作用。

本发明公开的采用Sr18生物制剂促进蔬菜生长的方法与本发明以前自己公开的内容的主要差别（例如ZL03130527.X）在于：

（1）Sr18生防制剂的小规模制备方法。

（2）Sr18生防制剂广谱、有效地用于防治松材线虫、根结线虫、大豆孢囊线虫、甘薯茎线虫等植物寄生线虫。

（3）未涉及Sr18生防制剂促生长方面的作用

本发明这次重点解决了：

（1）实验室条件下盆栽条件的优化，即培养的温度、时间、移栽时机以及供试土壤的组成成分及比例等。

（2）室内条件下分别在移栽幼苗和生长20天各施用一次Sr18发酵滤液及施用量。

（3）温室大棚条件下定植前5天兑水沟施，施用量为500kg-700kg/667 m²。

（4）Sr18发酵滤液对蔬菜生长有促进作用，通过改善植株的营养状况，能显著提高植株株高，增加蔬菜的生物量；能够诱导植株抗性，增加植株抵御病虫害的能力。

本发明更加详细的描述如下：

1．实验方法

1.1 Sr18发酵滤液促进黄瓜植株的生长实验

黄瓜植株栽培：实验选用的供试黄瓜品种为“津春4号”。将挑选出的粒大饱满的种子用清水冲洗干净，经5%次氯酸溶液消毒后，放在55℃温水中恒温浸种15min，以促进种子吸水活化；待水温降至25℃左右，继续浸泡5－6个小时，再将种子轻搓洗净后放入恒温培养箱，28℃条件下催芽两天；待胚根长至约0.4-0.5 cm 即可播种于穴盘中。28℃条件下继续培养，待黄瓜幼苗破土后，将恒温箱温度调整为白天16h、28℃，夜晚8h、22℃。培养幼苗约15天左右，选取株高统一的黄瓜幼苗移栽至花盆中（高16cm、直径18cm），每盆定植一棵黄瓜幼苗。供试土壤配比为灭菌土：营养土：蛭石=2：1：1。

收集根结线虫：将接种南方根结线虫3个月后的黄瓜根部取出，糖旋法收集虫卵，制成卵悬浮液。将虫卵置于无菌水中25℃孵化，取第8天孵化出的根结线虫。

供试制剂的配置：现有的Sr18发酵滤液为5吨罐发酵所得，作为供试药剂原液，并在此基础上设置浓度梯度为1/2、1/4倍原液（即Sr18发酵滤液、1/2 Sr18发酵滤液、1/4Sr18发酵滤液），清水组为对照组。

施加Sr18供试制剂的量：根据田间实验的用药量为参照，在移栽黄瓜苗后的第二天，向每盆幼苗的根系周围施加供试剂；①Sr18发酵滤液组：施加1.75mL Sr18发酵滤液；②1/2 Sr18发酵滤液组：施加0.875mL Sr18发酵滤液；③1/4Sr18发酵滤液组: 施加0.4375mL Sr18发酵滤液。待植株生长20天后，各浓度实验组重新补加一次供试试剂。

1.1.1黄瓜生长指标测定

（1）黄瓜株高、茎粗、叶片面积的测量：分别在移栽黄瓜苗后的20、40、60天测定黄瓜植株地上部分株高、茎粗、最大叶叶片面积的数值，每个处理测量5个植株。

（2）黄瓜植株地上部分鲜重、干重及根系鲜重、干重的测量：黄瓜植株生长60天后，分别测量黄瓜植株地上部分鲜重、干重及根系鲜重、干重，每个处理测量5个植株。

（3）黄瓜植株生长20天时根系长度的测量

1.1.2黄瓜生理生化指标测定

（1）叶绿素含量测定：将黄瓜叶片用蒸馏水清洗干净，吸干水分称重0.2g；加入少量石英砂、碳酸钙和80%丙酮后充分研磨，转移至20mL容量瓶中，用80%丙酮多次洗涤研钵，定容至刻度，4℃避光过夜；第二日摇匀离心取上清液，测定663nm、645nm处的OD值。

（2）可溶性蛋白含量的测定：将黄瓜叶片用蒸馏水清洗干净后，吸干水分称重0.2g；加入适量预冷的50mmol/L磷酸缓冲液（pH=7.8）及少量石英砂，在预冷的研钵中磨成匀浆，将匀浆液全部倒入离心管中；离心取上清液即为可溶性蛋白提取液；取0.1mL蛋白提取液加入3mLG-250溶液，充分混合反应5分钟，用分光光度计在波长595nm处比色。

（3）根系活力的测定：将黄瓜根系小心取出清洗干净，用滤纸吸干水分后称取0.5g新鲜根样品，使之完全浸入盛有0.4%TTC和66mmol/L磷酸缓冲液等量混合液的试管中，37℃暗水浴直至根系变红；加入1mol/L硫酸2mL终止还原反应；取出根后小心擦干水分，加入乙酸乙酯和少量的石英砂充分研磨至匀浆，过滤后将红色提取液移入10mL的试管，定容至刻度；混匀后用分光光度计在485nm下比色。

1.1.3黄瓜植株酶活指标

样品酶液的提取：准确称量黄瓜叶片组织的0.5g，按重量（g）：体积（mL）

=1:9的比例，加入9倍体积的0.1mol/L的磷酸缓冲液，将植物叶片组织剪碎后放入匀浆器，在冰浴中研磨后获取植物组织匀浆，经离心后取得的上清液即为酶提取液。酶活力测定：采用超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒测定SOD活力；采用过氧化物酶(POD)测定试剂盒测定POD活力；采用过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒测定CAT活力；采用植物多酚氧化酶 (PPO)酶联免疫检测试剂盒测定PPO活力；采用植物苯丙氨酸解氨酶(PAL)酶联免疫检测试剂盒测定PAL活力；所有试剂盒统一购买于南京建成生物工程研究所。

1. 2 Sr18发酵滤液促进田间作物生长和产量的实验

1.2.1 Sr18发酵滤液对芹菜促生长作用的田间药效试验

1）试验地点及条件

试验设在山东省济南市济阳县崔寨镇前街村。冬暖式大棚，正常栽培管理；芹菜品种为四季西芹。2007年9月14日处理土壤，9月23日定植，12月15日收获时进行调查。

2）供试药剂

Sr18发酵滤液1号（5吨罐发酵后浓缩10倍液），2号（添加国产麦芽精）（均为天津师范大学试产，其中的Sr18菌菌种，制备方法见ZL03130527.X）。对照化学药剂福气多（10％噻唑膦颗粒剂）由日本石原产业株式会社生产。对照生物药剂海正灭虫灵Ⅲ（1.8％阿维菌素乳油）由浙江海正化工股份有限公司生产。

3）试验设计及处理

施药前先平整小区，小区面积13.9m²。

其中Sr18发酵滤液1号、2号均为定植前9天兑水适量均匀喷洒土壤，而海正灭虫灵以及福气多为定植时均匀喷洒和撒施。然后充分耙平使药剂和根层土壤充分混和。各处理重复4次，32个小区，随机区组排列。施药后9天移栽健康的芹菜苗。

4）调查方法

芹菜收获时，采取5点取样法每小区调查10株。分别调查其株高、株重；产量是按照单位面积的株数×株重进行测产。

1.2.2 Sr18发酵滤液对辣椒促生长作用的田间药效试验

1) 试验作物和品种的选择

作物品种：辣椒，品种为朝天椒。

2) 作物栽培及环境条件

试验设在海南省海口市云龙镇，土质为红壤土，肥力中等。

3) 试验设计和安排

试验药剂：Sr18发酵滤液，同1.2.1。

对照药剂：1.8%阿维菌素乳油，浙江海正化工有限公司生产；

5%好年冬颗粒剂，美国富美实公司生产。

4）药剂用量与处理编号

表2 供试药剂试验设计

小区安排

小区排列：各处理重复四次，共32个小区，小区排列图如下：

小区面积和重复：小区面积12 m²，重复四次，按照随机区组排列。

施药方法：

Sr18发酵滤液、海正灭虫灵乳油（1.8%阿维菌素乳油）定植前5天兑水500-700kg/667m²均匀喷洒起垄后的土壤，使药剂和根层土壤充分混和，好年冬颗粒剂拌适量细沙后撒施。

施药器械：人工施药。

施药时间和次数：2007年11月10日施药1次，2007年11月15日移栽。

4）调查、记录和测量方法

土壤资料：土壤类型为红壤土，肥力中等。

调查方法、时间和次数

调查时间和次数： 2008年3月5日开始进行产量调查，2008年6月20日收获前计算增产效果和防治效果。

2．实验结果

2.1 Sr18发酵滤液促进植物生长实验

2.1.1黄瓜生长指标

（1）黄瓜株高、茎粗、叶片面积的测量

分别在移栽黄瓜苗后的20、40、60天测定黄瓜植株地上部分株高、茎粗、最大叶叶片面积的数值，每个处理测量5个植株。

由图1可以看出，随着黄瓜生长天数的增加，不同浓度的Sr18发酵滤液对植株高度产生了明显的促进作用。施加1/4Sr18发酵滤液处理时，60天的植株株高是清水对照组株高的1.1倍；当发酵滤液浓度增加一倍达到1/2Sr18浓度时，60天的株高是清水对照组的1.25倍；用Sr18原液植株处理后，60天的株高是对照组的1.3倍。

接种根结线虫后（图2），线虫对黄瓜生长的抑制在40天时就已经显示出来，接种线虫的黄瓜与清水对照组相比较，株高降低了39.2%；植株生长至60天时，接种线虫的黄瓜株高只有清水对照组的72.5%；而加入Sr18发酵滤液后，根结线虫受到控制，对黄瓜株高的抑制降低，60天时1/2 Sr18发酵滤液+线虫组和Sr18发酵滤液+线虫组是线虫对照组的1.35倍、1.47倍，1/4Sr18发酵滤液+线虫植株也比接种线虫的黄瓜植株高了1.2倍。实验证明，不同浓度的Sr18发酵滤液对黄瓜植株的株高起到了促进作用，在施加Sr18发酵滤液后又对线虫起到防治作用，降低了虫害对黄瓜植株高度的影响。

由图3可以看出，随着Sr18发酵滤液浓度的升高，黄瓜植株的茎粗也随之增加；清水对照组在20天时的黄瓜茎粗只有Sr18发酵滤液组黄瓜茎粗的79%，生长到40天时，清水对照组相比较20天时增加了11.9%，1/4Sr18发酵滤液处理的植株茎粗增加了14.9%；在实验组中，生长至60天时1/4Sr18发酵滤液、1/2 Sr18发酵滤液、Sr18发酵滤液处理后的黄瓜植株的茎粗分别是清水组20天时的1.5倍、1.6倍和1.6倍。

接种根结线虫60天后(图4)，接种线虫的黄瓜与加入Sr18发酵滤液的实验组相比较，Sr18发酵滤液的实验组植株茎粗比接种线虫的植株茎粗增加21.3%； 1/2 Sr18发酵滤液+线虫植株和1/4Sr18发酵滤液+线虫植株在60天时，茎粗比接种线虫的黄瓜植株增加19%。证实不同浓度的Sr18发酵滤液有效增加了黄瓜植株的茎粗，对根结的防治效果也起到促进作用。

由图5可以看出黄瓜移栽20天时，各组植株的叶面积差值不明显，只有加了Sr18发酵滤液的黄瓜植株叶面积比对照组清水黄瓜的叶面积增加15.7cm²；随着生长天数的增加，叶面积的差值越来越显著，当生长到60天时，施加Sr18发酵滤液的黄瓜叶面积是清水组黄瓜叶面积的1.24倍，施加1/2Sr18发酵滤液和1/4Sr18发酵滤液的实验组的黄瓜叶面积也分别是对照组的1.2倍和1.1倍。

接种线虫后（图6）的黄瓜植株相比较未接种线虫的黄瓜植株，生长较为缓慢，叶面积较小，20天时各浓度植株间的差异只有10.08 cm²，生长至60天时，Sr18发酵滤液+线虫植株的叶面积比线虫对照组高出30%。实验结果可知，Sr18发酵滤液对植株的生长有很大的促进作用（图7-10）。

（2）黄瓜植株地上部分鲜重、干重及根系鲜重、干重的测量

黄瓜植株生长60天后，分别测量黄瓜植株地上部分鲜重、干重及根系鲜重、干重，每个处理测量5个植株。

由图11、12显示，与对照组清水相比，施加Sr18发酵滤液显著增加了黄瓜地上部分的鲜重和干重，1/4Sr18发酵滤液植株的地上部分鲜重、干重较对照组分别增加了40.3%、36.4%；当发酵滤液浓度增加到1/2倍Sr18发酵滤液时，植株的的地上部分鲜重、干重较对照组分别增加了79%、80%；而施加Sr18发酵滤液后，与对照组相比，地上部分鲜重、干重分别增加了80.7%、89%。

从图13、14可以看出，清水对照组黄瓜的根系鲜重、干重都低于实验组，1/4Sr18、1/2Sr18、Sr18发酵滤液组的黄瓜根系鲜重分别是对照组的1.2倍、1.4倍和1.5倍，而根系的干重分别是对照组的1.3倍、1.9倍、2倍。

（3）黄瓜植株生长20天时根系长度的测量

从图15可以看出，施加Sr18发酵滤液的植株根长远远大于清水对照组，施加1/4Sr18发酵滤液的植株的根系长度是清水对照组的2.3倍，施加1/2Sr18发酵滤液的植株的根系长度是对照组的3倍，而Sr18发酵滤液原液高达清水对照组的8倍，可见Sr18发酵滤液对植株的根系生长有很大促进作用。

接种线虫后，根系的生长受到抑制，施加Sr18发酵滤液后对线虫起到一定的防治效果，根系的生长也显著增加；1/4Sr18 +线虫植株、1/2 Sr18发酵滤液+线虫植株和Sr18发酵滤液+线虫植株的根系长度分别是线虫对照组的1.6倍、2.3倍和2.7倍。

2.1.2 黄瓜生理生化指标

（1）叶绿素含量测定结果

表3 不同浓度的Sr18发酵滤液对黄瓜叶片光合色素含量的影响

注：小写字母表示差异显著性（P ＜0.05）。

表4 接种根结线虫后对黄瓜叶片光合色素含量的影响

注：小写字母表示差异显著性（P ＜0.05）。

如表3所示，植株生长60天后，加入Sr18发酵滤液的黄瓜植株的叶绿素a含量均高于清水对照组，而且随Sr18发酵滤液浓度的增加，其叶绿素a含量都有所上升。施加Sr18发酵滤液的黄瓜植株叶绿素a含量是对照组的1.3倍，施加1/2 Sr18发酵滤液、1/4 Sr18发酵滤液的黄瓜植株叶绿素a含量也均是对照组的1.2、1.1倍。叶绿素b含量的变化趋势与叶绿素a相同，只是变化幅度没有叶绿素a明显，黄瓜叶片中叶绿素a+b含量的变化趋势与叶绿素a基本一致。

接种线虫后（表4）黄瓜叶片的叶绿素a含量降低，施加Sr18发酵滤液后有所缓解，黄瓜叶片的光合强度随着Sr18发酵滤液浓度的增加，Sr18发酵滤液+线虫植株、1/2 Sr18发酵滤液+线虫植株和1/4Sr18发酵滤液+线虫的叶绿素含量均比对照组接种线虫的黄瓜植株高，相对增加了植株的光合能力。

（2）可溶性蛋白含量测定结果

图16显示，可溶性蛋白在黄瓜植株叶片内的含量相对稳定，未接种线虫的黄瓜植株中，施加Sr18发酵滤液的黄瓜植株叶片内可溶性蛋白含量较高，与清水对照组相比较增加了11.7%，1/4浓度、1/2浓度的Sr18发酵滤液分别增加了3.9%、9.4%。接种线虫后，叶片内可溶性蛋白含量相比清水对照组降低了7.4%，而在喷洒了Sr18发酵滤液后，叶片内可溶性蛋白含量有所升高，施加Sr18发酵滤液的黄瓜植株叶片内可溶性蛋白含量相比较只接种线虫的对照组，增加了7.1%。

（3）根系活力的测定结果

地上部的生长和营养状况，根系活力是衡量根系功能的主要指标之一。

实验结果：从图17可以看出，在未接种线虫的黄瓜植株中，随着Sr18发酵滤液浓度的增加，根系活力也随之增加，施加Sr18发酵滤液的植株的根系活力比清水对照组升高了51.7%，施加1/2Sr18发酵滤液的植株的根系活力较对照组也增加了26.9%。接种线虫后，线虫对根系侵染使根系活力显著降低，线虫组较清水对照组降低了19.4%，在加入了Sr18发酵滤液的实验组中，根系活力有所上升，施加1/4Sr18发酵滤液的植株的根系活力比线虫组的根系活力增加了14.7%，1/2Sr18发酵滤液组和Sr18发酵滤液组植株的根系活力也分别增加了17.3%、22.6%。Sr18发酵滤液对植物根部的影响较为显著，能够促进根系活力的提升。

2.1.3黄瓜酶活指标

（1）超氧化物歧化酶（SOD）

超氧化物歧化酶（SOD）是植物体中清除自由基最重要的防御酶类之一，是自然界中唯一以氧自由基为底物的酶，通过歧化反应生成过氧化氢和氧分子，可以清除植物体内由于过多氧自由基存在而造成的生物损伤，SOD 在植物体中具有明显抗逆作用。

由图18可知，未接种线虫时，植物体内的SOD活力比接种线虫后要高，随着发酵滤液浓度的增加，在1/2浓度时，SOD活力达到最大值，比清水对照组高35.8%。在接种线虫后，黄瓜叶片中的 SOD 活性处于不同的高度水平，施加Sr18发酵滤液的植株体内SOD 活性较高，1/4Sr18发酵滤液+线虫组植物体内的SOD 活性比线虫对照组高22.4%，1/2Sr18发酵滤液+线虫组植物的SOD 活性比线虫对照组高23.7%，施加Sr18原液发酵滤液的SOD 活性比线虫对照组高42%。可见Sr18发酵滤液对线虫起到防治作用，并及时清除了植物体内过多的自由基，对植物起到了保护作用。

（2）过氧化物酶（POD）

过氧化物酶（POD）是细胞内重要的活性氧清除剂，是广泛存在于各种动植物体内的一种还原酶类，植物细胞内产生的O₂ ^－经SOD催化反应形成的H₂O₂，而 POD主要功能是催化H₂O₂分解成H₂O和O₂，此外还可在脱氢酶的作用下催化许多重要酚类物质的氧化反应，在植物与病原物相互作用的过程中诱导植物细胞壁发生改变，参与木质素的聚合过程，使植物细胞壁形成物理屏障物，从而加强植物的抗病作用。

图19所示，未接种根结线虫的黄瓜植株叶片内的POD活性随Sr18发酵滤液浓度增加而变大，Sr18发酵滤液组与清水组的POD活性相比提高幅度为50.6%。在接种线虫后，对照组间的POD活性差值变小，线虫组较清水组降低了8.5%，施加Sr18发酵滤液后，POD有所增加，1/4Sr18发酵滤液+线虫组、1/2Sr18发酵滤液+线虫组、Sr18发酵滤液+线虫组分别比线虫对照组增加了35.5%、40.1%、36.3%。发酵滤液处理过的植株叶片内的POD活力增加，同时提高了植株对虫害的防御能力。

（3）过氧化氢酶（CAT）

过氧化氢酶（CAT）是功能较专一的酶，参加活性氧的代谢过程，它可促使H₂O₂分解为分子氧和水，清除体内的过氧化氢，维持生物体内活性氧的正常水平，从而使细胞免于遭受H₂O₂的毒害。CAT是过氧化物酶体的标志酶，是生物防御体系的关键酶之一。

图20显示，未接种线虫时，1/4Sr18发酵滤液植株体内的CAT活性与清水对照组相比较差异不显著，只有当浓度达到1/2倍的Sr18发酵滤液时，可以看到CAT活性比清水对照组提高了16.2%，当使用原液Sr18发酵滤液时，植株体内的CAT活性比清水对照组高出21.6%。接种线虫后，线虫组较清水组的CAT活力显著降低，但在接种线虫组内，黄瓜植株叶片内的过氧化氢酶活性随施加发酵滤液浓度的增加呈现上升的趋势，1/4Sr18发酵滤液+线虫组、1/2Sr18发酵滤液+线虫组、Sr18发酵滤液+线虫组内的CAT活性分别比线虫对照组增加了40.6%、46.1%和63%。与超氧化物歧化酶（SOD）相同，发酵滤液促进了CAT活性的升高，加强了植株的自身保护防御系统。

（4）多酚氧化酶（PPO）

多酚氧化酶（PPO）是细胞形成木质素的前体物质，普遍存在于植物体内酚类物质中, 在细胞受到破坏时，多酚氧化酶就被激活，与从植物液泡中释放出来的酚类物质起反应，产生醌类物质，参与保护植物免受进一步伤害，因此多酚氧化酶的活性与抗病性相关，生防菌也可诱导多酚氧化酶活性的增强。

从图21可以看出，无线虫侵染时，用Sr18发酵滤液处理过的黄瓜叶片PPO活性较清水对照组增加了48.7%，当浓度降至1/2和1/4时，其PPO活性也较清水对照组增加了40.6%和25.3%。在黄瓜植株接种线虫后，体内的PPO活性降低至清水对照组的63.8%；施加Sr18发酵滤液后，植株体内的酶活性有所增加，对植物起到一定的保护作用。1/4Sr18发酵滤液+线虫的PPO活性比线虫对照组高16.6%，1/2Sr18发酵滤液+线虫的PPO活性比线虫对照组高36.7%，原液Sr18发酵滤液+线虫则高出43.3%。由此可以看出，随着Sr18发酵滤液浓度的增加，保护作用加强。

（5）苯丙氨酸解氨酶（PAL）

苯丙氨酸解氨酶（PAL）是植物苯丙烷类代谢的关键酶之一，与木质素、植物保卫素等防卫物质的合成有着重要的关系。对许多植物来说，生防菌的侵染能够诱导苯丙氨酸解氨酶活性增强，且酶活性的增强与抗病性呈正相关。

由图22所示，不同浓度的Sr18发酵滤液对黄瓜叶片PAL的含量影响不同，1/4Sr18发酵滤液处理过的植株PAL含量最高，相比清水对照组幅度提高了86.8%，原液Sr18发酵滤液比对照组高出51.5%。当植株遭受线虫侵害后，其体内的PAL含量比清水对照组降低了21.3%，1/4Sr18发酵滤液+线虫组、1/2Sr18发酵滤液+线虫组、Sr18发酵滤液+线虫组分别是线虫对照组的PAL含量的1.96倍、1.76倍和1.68倍。

绿色植物通过有氧呼吸获得能量，然而当氧分子在植物体内还原成水时，会产生过多的对生命体有毒害作用的氧自由基，通常称之为活性氧（包括 O²-、H₂O₂、.OH、RO.和 ROOH 等）。正常情况下，植物体内的酶系会及时清除自由基，从而使细胞中的活性氧处于一种平衡状态，但如果活性氧过多，产生速度过快，而细胞清除活性氧的能力得不到明显提高时，生命体的衰老速度就会加快。用于清除植物体内自由基的酶系被称为防御酶系或抗逆酶系，这些酶系与植物的抗病性有关，能减轻多余活性氧对机体带来的损害，主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）等。

2.2 Sr18发酵滤液对田间作物长势和产量的影响

2.2.1 芹菜田间药效试验结果（山东省济南市济阳县崔寨镇农业前街村）（图23）

2.2.1.1对芹菜株高及产量的影响

芹菜收获时的调查表明(见表5)，Sr18发酵滤液1号3mL/m² 、5mL/m² 和7mL/m² 处理、Sr18发酵滤液2号株高、鲜重及产量均显著高于药剂对照和空白对照区。其中发酵滤液1号7mL/ m²处理区增产34.04％，发酵滤液2号5mL/m²处理区增产44.68％，这说明该发酵滤液具有显著的刺激生长的作用。

表5 生物杀线剂对芹菜生物量的影响

2.2.2辣椒田间药效试验结果（海南省海口市云龙镇）（图24-25）

2.2.2.1药剂对辣椒植株生长量的影响

从表6可见，Sr18发酵滤液1号用量3mL/m²-7mL/m²对辣椒生长有促进作用，平均株高增长率为4.8%-17.2%；苗重增加率为7.2%-46.4%。Sr18发酵滤液1号用量以中等剂量5mL/m²对辣椒植株生长的促进作用最好，高剂量7mL/m²促进植株生长的作用最差。

Sr18发酵滤液2号用量5 mL/m²对辣椒生长有促进作用，平均株高增长率为12.8%；苗重增加率为39.1%。Sr18发酵滤液2号用量7mL/m²能促进辣椒株高的生长，但对苗重的增加有抑制作用，苗重降低10.1%，即抑制辣椒的生物量的增长。因此，Sr18发酵滤液2号用量以5mL/m²最好，Sr18发酵滤液2号7 mL/m²用量太大，不利于辣椒的生长。

与两种对照药剂相比，Sr18发酵滤液1号、2号对植株生长的促进作用与5%好年冬颗粒剂的促进作用相近，均能显著促进辣椒植株的生长，但没有显著性差异；Sr18发酵滤液1号、2号对植株生长的促进作用高于1.8%阿维菌素乳油，且有显著性差异。

表6 Sr18发酵滤液对辣椒植株生物生长量的影响

2.2.2.2对辣椒根结线虫病的防治效果及产量的影响

从表7可见，Sr18生物杀线虫剂1号用量3mL/m²-7 mL/m²对辣椒根结线虫的防治效果为38.4-61.6%，增产率为20.9-23.0%，高浓度的防治效果显著高于中浓度与低浓度的防治效果，但三者之间的增产效果没有显著差异。

Sr18生物杀线虫剂2号用量5mL/m²-7mL/m²对辣椒根结线虫的防治效果为61.6-69.4%，增产率为18.1-23.7%，高浓度的防治效果显著高于中浓度的防治效果，但二者之间的增产效果没有显著差异。

与对照药剂1.8%阿维菌素乳油相比，Sr18生物杀线虫剂1号3mL/m²-7mL/m²和2号5mL/m²-7mL/m²对辣椒根结线虫的防治效果低于1.8%阿维菌素乳油1mL/m²的防治效果，且有显著性差异；Sr18生物杀线虫剂与阿维菌素的增产效果相近，没有显著性差异。

与对照药剂5%好年冬颗粒剂相比，Sr18生物杀线虫剂1号3mL/m²-7mL/m²和2号5mL/m²-7mL/m²对辣椒根结线虫的防治效果高于5%好年冬颗粒剂6g/m²的防治效果，且有显著性差异；Sr18发酵滤液的增产效果高于好年冬，且有显著性差异。

表7 Sr18发酵滤液防治辣椒根结线虫病防治效果及对辣椒产量的影响

综上所述，Sr18发酵滤液对辣椒植株生长有促进作用，能显著提高植株的株高，增加植株的生物量；同时，能有效控制辣椒根结线虫的危害，提高辣椒的产量，适于在辣椒生产中推广使用。Sr18发酵滤液1号建议用量5mL/m²、Sr18发酵滤液2号建议用量5mL/m²，在辣椒定植前5天兑水500kg-700kg/667 m²均匀沟施。

附图说明：

图1 不同浓度的Sr18发酵滤液对黄瓜株高的影响；

图2 接种根结线虫后对黄瓜株高的影响；

图3不同浓度的Sr18发酵滤液对黄瓜茎粗的影响；

图4 接种根结线虫后对黄瓜茎粗影响；

图5不同浓度的Sr18发酵滤液对黄瓜叶面积的影响；

图6 接种根结线虫后对黄瓜叶面积的影响；

图7接种线虫黄瓜盆栽未施用Sr18发酵滤液20天生长情况；

图8未接种线虫黄瓜盆栽未施用Sr18发酵滤液20天生长情况；

图9接种线虫黄瓜盆栽未施用Sr18发酵滤液60天生长情况；

图10接种线虫黄瓜盆栽施用Sr18发酵滤液60天生长情况；

图11不同浓度发酵滤液对黄瓜地上部分鲜重的影响；

图12不同浓度发酵滤液对黄瓜地上部分干重的影响；

图13不同浓度发酵滤液对黄瓜根系鲜重的影响；

图14接种根结线虫后对黄瓜根系干重的影响；

图15不同浓度的Sr18发酵滤液对黄瓜植株和接种线虫的黄瓜植株根长的影响；

图16不同浓度的Sr18发酵滤液对黄瓜植株和接种线虫的黄瓜植株丙二醛含量的影响；

图17不同浓度的Sr18发酵滤液对黄瓜植株和接种线虫的黄瓜植株根系活力的影响；

图18 不同浓度的Sr18发酵滤液对黄瓜植株和接种线虫的黄瓜植株SOD活力的影响；

图19 不同浓度的Sr18发酵滤液对黄瓜植株和接种线虫的黄瓜植株POD活力的影响；

图20 不同浓度的Sr18发酵滤液对黄瓜植株和接种线虫的黄瓜植株CAT活力的影响；

图21 不同浓度的Sr18发酵滤液对黄瓜植株和接种线虫的黄瓜植株PPO活力的影响；

图22 不同浓度的Sr18发酵滤液对黄瓜植株和接种线虫的黄瓜植株PAL活力的影响；

图23芹菜田间药效试验结果；

图24辣椒田间药效试验结果；

图25辣椒田间药效试验结果。

具体实施方式

以下结合较佳实施例，对本发明做进一步的描述，特别加以说明。本发明所用到的试剂均由市售。其中的Sr18菌菌种，制备方法见ZL03130527.X。

实施例1

水溶性生物杀线虫剂的制备：

（1） Sr18菌活化培养及孢子悬液的制备：将安瓿管中保藏的菌种接入斜面培养基，26℃静置培养6d；取活化后的Sr18菌斜面，加入5ml无菌水洗下斜面上的孢子，倒入加有玻璃珠的三角瓶内，振荡1分钟，计数；

（2）200L罐发酵放大：采用50L 发酵罐作为种子罐制备一级种子：按照2.75×10⁶/L孢子浓度将步骤（1）制备的孢子悬液接入装有22L培养基的种子罐中，26℃培养24h。以4%接种量将一级种子接入装有150L发酵培养基的200L发酵罐中，搅拌转速198r/min，罐压0.05MPa，通气量以维持溶氧水平为20%为原则，发酵时间40h；所述的发酵培养基 (w/w) 为：30%马铃薯浸汁+2%蔗糖+0.2%进口麦芽精；

(3)5t罐发酵放大:利用马铃薯脱皮机，对马铃薯进行脱皮，切片机切片，浸汁；采用500L发酵罐制备一级种子：以2.794×10⁶/L孢子浓度的孢子悬液接入装有250L培养基的种子罐中，26℃培养24h，以4%(w/w)接种量将一级种子接入装有3.29t发酵培养基的5t发酵罐中，搅拌转速120r/min，罐压0.03MPa，通气量以维持溶氧水平20%为原则，发酵时间40h；所说的发酵培养基指的是PS或PSM培养基：去皮马铃薯300g煮汁，蔗糖20g，自来水1000mL(其中PSM添加国产麦芽精2g)，pH自然；

（4）浓缩水剂的制备：发酵结束后，将菌液加热至70℃，采用板框过滤去除菌体，所得滤液经真空浓缩锅浓缩得8-10倍重量浓缩水剂。

实施例2

采用Sr18生物制剂促进蔬菜生长的方法：

（1）将挑选出的粒大饱满的黄瓜种子用清水冲洗干净，经5%次氯酸溶液消毒后，放在55℃温水中恒温浸种15min，以促进种子吸水活化；

（2）待水温降至23℃，继续浸泡5个小时，再将黄瓜种子轻搓洗净后放入恒温培养箱，26℃条件下催芽两天；

（3）待胚根长至0.4cm 即可播种于穴盘中，26℃条件下继续培养，待黄瓜幼苗破土后，将恒温箱温度调整为白天16h、28℃，夜晚8h、22℃，培养幼苗12天，选取株高统一的蔬菜幼苗移栽至高16cm、直径18cm花盆中，每盆定植一棵黄瓜幼苗；供试土壤为重量份数比的灭菌土：营养土：蛭石=2：1：1；

（4）在移栽蔬菜苗后的第二天，向每盆幼苗的根系周围施加供试剂：①Sr18发酵滤液组：施加1.75mL Sr18发酵滤液；②1/2 Sr18发酵滤液组：施加0.875mL Sr18发酵滤液；③1/4Sr18发酵滤液组: 施加0.4375mL Sr18发酵滤液，待植株生长20天后，各浓度实验组重新补加一次供试Sr18发酵滤液；所述的Sr18发酵滤液指的是：5吨罐发酵液、添加国产麦芽精5吨罐发酵。

（5）然后测定黄瓜生长的各项指标。

实施例3

采用Sr18生物制剂促进辣椒生长的方法：

（1）将挑选出的粒大饱满的辣椒种子用清水冲洗干净，经5%次氯酸溶液消毒后，放在58℃温水中恒温浸种20min，以促进种子吸水活化；

（2）待水温降至25℃，继续浸泡6个小时，再将辣椒种子轻搓洗净后放入恒温培养箱， 28℃条件下催芽两天；

（3）待胚根长至0.5 cm 即可播种于穴盘中， 28℃条件下继续培养，待辣椒幼苗破土后，将恒温箱温度调整为白天16h、28℃，夜晚8h、22℃，培养幼苗15天，选取株高统一的蔬菜幼苗移栽至高16cm、直径18cm花盆中，每盆定植一棵蔬菜幼苗；供试土壤为重量份数比的灭菌土：营养土：蛭石=2：1：1；

对辣椒苗期生长的促进作用，指的是Sr18发酵滤液用量5mL/m²，在辣椒定植前5天兑水500-700kg/667 m²均匀沟施。

Claims

1.一种采用Sr18生物制剂促进蔬菜生长的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）将挑选出的粒大饱满的蔬菜种子用清水冲洗干净，经5%(w/w)次氯酸溶液消毒后，放在55-58℃温水中恒温浸种15-20min，以促进种子吸水活化；

（4）在移栽蔬菜苗后的第二天，向每盆幼苗的根系周围施加供试剂：①Sr18发酵滤液：施加1.75mL Sr18发酵滤液；②1/2 Sr18发酵滤液：施加0.875mL Sr18发酵滤液；③1/4Sr18发酵滤液：施加0.4375mL Sr18发酵滤液，待植株生长20天后，各浓度实验组重新补加一次供试Sr18发酵滤液；

（5）然后测定蔬菜生长的各项指标。

2.权利要求1所述采用Sr18生物制剂促进蔬菜生长的方法，其中所述的Sr18发酵滤液指的是：5吨罐发酵液、添加国产麦芽精5吨罐发酵。

3.权利要求1所述采用Sr18生物制剂促进蔬菜生长的方法，其中所述的蔬菜指的是黄瓜、芹菜、辣椒、番茄。

4.采用权利要求1所述Sr18生物制剂促进蔬菜生长的方法，其中对辣椒植株生长的促进作用，指的是Sr18发酵滤液用量5mL/m²，在辣椒定植前5天兑水500kg-700kg/667 m²均匀沟施。

5.采用权利要求1所述Sr18生物制剂促进蔬菜生长的方法，其中②1/2 Sr18发酵滤液5mL/m²处理区增产44.68％，具有显著的刺激生长的作用。