CN101691549B

CN101691549B - 能防治连作甜瓜枯萎病的拮抗菌及其微生物有机肥料

Info

Publication number: CN101691549B
Application number: CN200910035426XA
Authority: CN
Inventors: 沈其荣; 赵青云; 徐阳春; 杨兴明; 冉伟
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: JIANGSU YONGLU FERTILIZER Co Ltd
Priority date: 2009-09-28
Filing date: 2009-09-28
Publication date: 2011-02-02
Anticipated expiration: 2029-09-28
Also published as: CN101691549A

Abstract

本发明涉及能防治连作甜瓜枯萎病的拮抗菌及其生产的微生物有机肥料，属于农业集约化生产技术。本发明分离到了两株对连作甜瓜枯萎病病原真菌有显著拮抗作用的拮抗菌(多粘芽孢杆菌NJY10和枯草芽孢杆菌NJY-IVI)，拮抗菌与有机肥混合制成微生物有机肥料，肥料中含有1×10⁸个/g以上的拮抗菌、全氮含量为4～5％，总氮磷钾养分为6～10％、有机质含量为30～35％。试验表明，这种微生物有机肥料施入土壤后能够使拮抗菌迅速繁殖，在土壤中形成优势群，在甜瓜枯萎病严重的的连作土壤中对甜瓜枯萎病的生物防治率达80％以上。在还没有形成连作障碍的土壤中长期施用本微生物有机肥料能在很大程度上防治甜瓜枯萎病的发生。

Description

能防治连作甜瓜枯萎病的拮抗菌及其微生物有机肥料

一、技术领域

本发明涉及能防治连作甜瓜枯萎病的拮抗菌及其微生物有机肥料，属于农业集约化生产技术，专用于克服和消除连作甜瓜枯萎病问题。

二、技术背景

甜瓜在世界各地均有栽培，是全球十大水果之一，是世界各地人们普遍喜食的鲜食水果。分布范围从北纬65°左右到南纬23°左右，遍及五大洲，其中中国的栽培面积最大。我国南北各地都有广泛种植，其中新疆、甘肃等西北地区是薄皮甜瓜的传统产区。甜瓜病虫害特别是甜瓜枯萎病历来是影响其生产的重要问题，90年代以来保护地设施化栽培方式逐步推广，甜瓜枯萎病更趋严重。连作甜瓜枯萎病是由病原真菌(尖孢镰刀菌)引起，在连作2茬时就开始出现，连作3茬以后越发严重。传统的化学防治方法会对环境及人类造成负面影响。我们的研究结果表明，连作作物枯萎病的关键问题不是养分缺乏或不平衡，也不是土壤次生盐渍化问题，而是土壤中的微生物区系改变及其次生代谢物的致毒问题。

另一方面，水稻、小麦、玉米、油菜等作物秸秆就地焚烧、规模化养殖后的畜禽粪便随地弃置等不仅严重污染了环境，也极大地浪费了能作为有机肥和生物有机肥产品的原料；大量的养分资源(C、N、P、K、S及微量元素)流失于土壤-植物系统之外，明显地削弱了我国农业可持续发展的能力。如何将从土壤中因作物收获而取走的营养元素最大限度地归还到土壤中去，唯一的途径就是将这些固体有机废弃物制成商品有机肥料再施入土壤。如果将这些固体有机废弃物经过高温发酵合成高品位的有机堆肥，再用作功能菌的载体，所制成的微生物有机肥料功能明确，将会有很好的应用前景。

三、发明内容

1.技术问题

本发明的目的在于研制一种能防治连作甜瓜枯萎病的微生物有机肥料，克服或消除连作甜瓜枯萎病的效率达到80％以上，使大量的设施农业土壤和露地甜瓜连作障碍土壤得到生物修复，确保集约化农业的顺利发展。

2.技术方案

两株能克服或消除连作甜瓜枯萎病的拮抗菌NJY10和NJY-IVI，分别属于多粘芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，2009年7月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，NJY10的保藏号为CGMCCNO.3178，NJY-IVI的保藏号为CGMCC NO.3179。

NJY10的主要生物学特性为：革兰氏染色阳性(G⁺)，细胞为杆状，过氧化氢酶阳性、淀粉水解阳性、V.P.反应阳性，甲基红试验阴性，纤维素分解阴性，明胶水解阳性，硝酸盐还原阳性，吲哚试验阴性，能利用柠檬酸盐，能产氨，发酵葡萄糖产酸产气，发酵木糖、L-阿拉伯糖、甘露糖只产酸。

NJY-IVI的主要生物学特性为革兰氏染色阳性(G⁺)，细胞为杆状，过氧化氢酶阳性、淀粉水解阳性、V.P.反应阳性，甲基红试验阴性，纤维素分解阴性，明胶水解阳性，硝酸盐还原阳性，吲哚试验阳性，能利用柠檬酸盐，能产氨，发酵葡萄糖产酸产气，发酵木糖、L-阿拉伯糖、甘露糖只产酸。

用上述能克服或消除连作甜瓜枯萎病拮抗菌所生产的微生物有机肥料中含有1×10⁸个/g以上的拮抗菌NJY10或NJY-IVI，或拮抗菌NJY10和NJY-IVI、全氮含量为4～5％(90％以上为有机氮)、总氮磷钾养分为6～10％、有机质含量为30～35％。其生产方法包括：

1)将拮抗菌NJY10和NJY-IVI分别接种到PDA培养液，分别进行液体发酵生产，发酵生产的条件为：pH生长范围自然，培养温度范围30～38℃，搅拌速度为180～300转/分钟，发酵中后期形成芽孢，使发酵液中含菌或芽孢量≥5×10⁹个/ml。所用PDA培养液配制方法为，以配制1L培养基为例：用200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，经过滤后滤液中加20g普通蔗糖，定容至1000ml，pH值调至7.2-7.4，121℃灭菌20min。

2)将拮抗菌与腐熟后的猪粪堆肥和菜粕微生物酶解混合物分别进行固体发酵，每吨固体有机物料中加入拮抗菌液50L，固体发酵过程中每天翻堆1次，使固体发酵温度不超过50℃，一般发酵5天后结束，使拮抗菌含量达到1×10⁸个/g以上，获得拮抗菌NJY10的猪粪堆肥固体菌剂和菜粕微生物酶解混合物固体菌剂，同样获得拮抗菌NJY-IVI的两种固体菌剂。所用腐熟后的猪粪堆肥发芽指数为98％以上，有机质质量比含量≥35％，有机氮质量比含量为1.2-2％，含水量质量比25-30％。

其中菜粕的微生物酶解混合物制备方法为，将保藏号为CGMCC NO.1543的嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)菌株37-1发酵液加入到菜粕原料中，调节含水量55-65％和pH 6.0-7.5，进行开放式固体发酵，待发酵温度上升至50℃时立即开始翻堆，以后每天翻堆，使堆温始终维持在35-50℃共5天，固体发酵开始后，堆物的pH会不断上升，每次翻堆时用含酸液体调节含水量和pH，使它们分别维持在55-65％和6.0-7.0，发酵终止时再用含酸液体进行喷洒，直至堆物pH调整为5.0左右，再进行低温干燥或自然凉干，即为菜粕的微生物酶解混合物。

3)按猪粪堆肥和菜粕的微生物酶解混合物两类分别将拮抗菌NJY10固体菌剂和NJY-IVI固体菌剂以体积比1∶1混合，获得猪粪堆肥的固体混合菌剂和菜粕微生物酶解混合物的固体混合菌剂。

4)再将猪粪堆肥的固体单一菌剂、混合菌剂按体积比50-70％分别与菜粕微生物酶解混合物的固体单一菌剂、混合菌剂按体积比30-50％的比例充分混合，并后熟2-3天，后熟过程中翻堆2次，最后在温度不超过60℃的条件下将微生物有机肥的含水量蒸发至30％以下，分别获得能防治连作甜瓜枯萎病的拮抗菌NJY10、NJY-IVI单菌微生物有机肥以及拮抗菌NJY10和NJY-IVI混合微生物有机肥，包装出厂即为防治连作甜瓜枯萎病的微生物有机肥料。

上述微生物有机肥料可专用于防治连作甜瓜枯萎病。

3.有益效果

本发明一种能克服或消除连作甜瓜枯萎病的微生物有机肥料及其生产方法，利用猪粪堆肥和菜粕微生物酶解氨基酸混合物，再与拮抗菌液混合后制成微生物有机肥料，其产品与目前市场上的产品相比具有如下优点：

1)肥料产品中含有抑制甜瓜枯萎病原真菌生长的专一性高效菌株(NJY10，NJY-IVI)，其抑制效果非常显著，肥料中该高效菌株的含量达到1×10⁸个/g以上，施入土壤后能形成优势群，并在土壤中存活下来。

2)肥料产品中含有丰富的可溶性有机碳和有机氮，能给功能菌提供十分优越的生长环境，极大地提高了拮抗菌在土壤中的定殖和发挥功能的能力。

3)本发明产品有机磷和有机氮含量特别高，均达到4％。本产品原料之一为猪粪，总磷含量很高，而且生物有效性特别高，在制成的微生物有机肥料产品中无需添加任何含磷化肥，使用本产品后能使作物顺利度过苗期磷素敏感期。相比之下，含磷化肥施入土壤后生物有效性较差；本产品中有机氮能达到4％以上(大部分为氨基酸和小分子多肽)，确保了肥料氮素持续稳定的供应，使所种作物生长和抗逆能力大大增强。

4)试验结果表明，在连作甜瓜的土壤上施用本产品后，能显著降低枯萎病的发病率，生物防治率达80％以上，连续三年施用本肥料的土壤，连作甜瓜枯萎病的生物防治率更高。

四、附图说明

图1拮抗菌株抑菌圈

五、具体实施方式

(一)菌株的分离和鉴定

采集已经发生连作障碍并出现严重甜瓜枯萎病的植株和周围土壤，样品低温保存，采用Kelman‘s TTC Agar选择性培养基分离病原菌。然后以甜瓜枯萎病病原菌为指示菌，从连作甜瓜枯萎病发病田块中的健康植株根际土壤中分离拮抗菌。再通过盆栽试验和大田试验最终复筛出高效拮抗菌株NJY10，NJY-IVI，鉴定到属种，菌种于30％甘油中-70℃保存。拮抗菌株NJY10，NJY-IVI抑菌圈如图1所示。

拮抗菌NJY10属于多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)，其主要生物学特性为：革兰氏染色阳性(G⁺)，细胞为杆状，过氧化氢酶阳性、淀粉水解阳性、V.P.反应阳性，甲基红试验阴性，纤维素分解阴性，明胶水解阳性，硝酸盐还原阳性，吲哚试验阴性，能利用柠檬酸盐，能产氨，发酵葡萄糖产酸产气，发酵木糖、L-阿拉伯糖、甘露糖只产酸。

拮抗菌NJY-IVI属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其主要生物学特性为：革兰氏染色阳性(G⁺)，细胞为杆状，过氧化氢酶阳性、淀粉水解阳性、V.P.反应阳性，甲基红试验阴性，纤维素分解阴性，明胶水解阳性，硝酸盐还原阳性，吲哚试验阳性，能利用柠檬酸盐，能产氨，发酵葡萄糖产酸产气，发酵木糖、L-阿拉伯糖、甘露糖只产酸。

(二)菌剂生产

其中菜粕的微生物酶解混合物制备方法为(公知公用，见发明专利ZL200610086126.0，一种农用氨基酸的生物制取方法及其肥料产品)，将嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)菌株37-1发酵液加入到菜粕原料中，调节含水量55-65％和pH 6.0-7.5，进行开放式固体发酵，待发酵温度上升至50℃时立即开始翻堆，以后每天翻堆，使堆温始终维持在35-50℃共5天，固体发酵开始后，堆物的pH会不断上升，每次翻堆时用含酸液体调节含水量和pH，使它们分别维持在55-65％和6.0-7.0，发酵终止时再用含酸液体进行喷洒，直至堆物pH调整为5.0左右，再进行低温干燥或自然凉干，即为菜粕的微生物酶解混合物(含氨基酸的混合材料)。

3)按猪粪堆肥和菜粕的微生物酶解混合物两类分别将拮抗菌NJY10固体菌剂和NJY-IVI固体菌剂以体积比1∶1混合，获得猪粪堆肥的固体混合菌剂和菜粕微生物酶解混合物的固体混合菌剂；

4)再将含单一菌NJY10、单一菌NJY-IVI、混合菌NJY10和NJY-IVI的猪粪堆肥固体菌剂按体积比50-70％分别与含单一菌NJY10、单一菌NJY-IVI、混合菌NJY10和NJY-IVI的菜粕微生物酶解混合物固体菌剂按体积比30％的比例充分混合，并后熟2-3天，后熟过程中翻堆2次，最后在温度不超过60℃的条件下将微生物有机肥的含水量蒸发至30％以下，获得能防治连作甜瓜枯萎病的单菌微生物有机肥(分别含拮抗菌NJY10、NJY-IVI)、混合微生物有机肥(含拮抗菌NJY10和NJY-IVI)。

用上述拮抗菌所生产的混合微生物有机肥(防治连作甜瓜枯萎病的微生物有机肥料)，其中含有1×10⁸个/g以上的拮抗菌NJY10或NJY-IVI，或拮抗菌NJY10和NJY-IVI、全氮含量为4～5％(90％以上为有机氮)、总氮磷钾养分为6～10％、有机质含量为30～35％。

(三)盆栽试验

选取健康水稻土过筛作为育苗土。营养钵采用一次性塑料水杯，每钵装土300g，微生物肥料施用量为2g/100g土。

大盆每盆装10kg病原土，病原土采自安徽和县甜瓜连作大棚内(枯萎病发病率达到70％以上)。大盆中微生物有机肥施用量为0.5％，即每盆加入50g微生物有机肥，肥料与病原土充分混合均匀。待甜瓜幼苗长至3-4片真叶时移栽入装有甜瓜枯萎病病原菌病土的大盆钵中。共设置8个处理，每处理重复10次。该盆栽试验与2008年3月至11月在江苏省宜兴工程中心温室连续种植三季。

该盆栽试验处理如下：

1、营养钵、大盆均施用等量化肥(即对照)

2、营养钵施用普通有机肥，大盆施等量化肥

3、营养钵施NJY10单菌微生物有机肥，大盆施等量化肥

4、营养钵施NJY-IVI单菌微生物有机肥，大盆施等量化肥

5、营养钵施NJY10和NJY-IVI混合菌微生物有机肥，大盆施等量化肥

6、营养钵施等量化肥，大盆施NJY10和NJY-IVI混合菌微生物有机肥

7、营养钵施普通有机肥，大盆施NJY10和NJY-IVI混合菌微生物有机肥

8、营养钵、大盆均施NJY10和NJY-IVI混合菌微生物有机肥

自移栽16天时发现枯萎病发病植株，每天观察植株发病情况，记录发病率，并采集各处理的植株样和土样带回实验室分析测定。

结果表明(表1)，处理1、2、3、4、5、6、7、8甜瓜植株发病率分别为90％、70％、20％、20％、15％、70％、70％、15％，说明无论营养钵中或大盆中单独施用由拮抗菌制成的微生物有机肥都能使甜瓜枯萎病的发病率下降，但营养钵中使用微生物有机肥的效果更明显，营养钵中使用NJY-IVI单菌微生物有机肥或NJY10单菌微生物有机肥，对甜瓜枯萎病的防治率均达77.8％，而营养钵中使用NJY10、NJY-IVI混合菌微生物有机肥对对甜瓜枯萎病的防治率可达80％。营养钵中和大盆中均施用混合菌微生物有机肥料后对甜瓜枯萎病的防治率也达到80％。施用混合菌对防治甜瓜枯萎病效果最好。

营养钵或者营养钵和大盆均施用混合菌微生物有机肥都能够明显增加植株生物量。处理1(营养钵大盆均施用化肥)植株生物量为10.4g/株，而处理5(营养钵施NJY10和NJY-IVI混合菌微生物有机肥，大盆施化肥)、处理8(营养钵、大盆均施NJY10和NJY-IVI混合菌微生物有机肥)植株生物量分别为113.9g/株、183.3g/株，植株生物量分别增加了9.9，16.6倍。同时，营养钵施用NJY10、NJY-IVI单菌微生物有机肥也都能够明显增加植株生物量，植株生物量分别为114.73g/株、93.68g/株，植株生物量分别增加了10倍，8倍。结果表明：营养钵、大盆均施用混合菌微生物有机肥增产效果最好。

利用尖孢镰刀菌选择性培养基对甜瓜植株茎、根系、根围、根际土壤中病原菌尖孢镰刀菌进行计数(表2、3)，结果表明不施用微生物有机肥时植株茎、根系、根际病原菌数量分别达到10⁴，10⁵以上，植株发病率达到90％以上；而营养钵施用微生物有机肥后，病原菌在植株及土壤中的数量均在10³，10⁴水平上，这表明施用微生物有机肥能够显著降低土壤、植株中病原菌的数量，从而改善连作土壤中微生物的种群结构，起到防治连作甜瓜枯萎病的生防作用。

表1甜瓜盆钵试验发病率和植株生物量

表2植株茎、根系病原菌数量

表3根表土、根际土病原菌数量

Claims

1.能防治连作甜瓜枯萎病的拮抗菌，包括菌株NJY10和菌株NJY-IVI，分别属于多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，于2009年7月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，NJY10的保藏号为CGMCC NO.3178，NJY-IVI的保藏号为CGMCC NO.3179；

NJY10的主要生物学特性为：革兰氏染色阳性G⁺，细胞为杆状，过氧化氢酶阳性、淀粉水解阳性、V.P.反应阳性，甲基红试验阴性，纤维素分解阴性，明胶水解阳性，硝酸盐还原阳性，吲哚试验阴性，能利用柠檬酸盐，能产氨，发酵葡萄糖产酸产气，发酵木糖、L-阿拉伯糖、甘露糖只产酸；

NJY-IVI的主要生物学特性为革兰氏染色阳性G⁺，细胞为杆状，过氧化氢酶阳性、淀粉水解阳性、V.P.反应阳性，甲基红试验阴性，纤维素分解阴性，明胶水解阳性，硝酸盐还原阳性，吲哚试验阳性，能利用柠檬酸盐，能产氨，发酵葡萄糖产酸产气，发酵木糖、L-阿拉伯糖、甘露糖只产酸。

2.用权利要求1所述拮抗菌生产的微生物有机肥料。

3.根据权利要求2所述的微生物有机肥料，其特征在于：该肥料中含有1×10⁸个/g以上的拮抗菌NJY10和NJY-IVI、全氮质量比含量为4～5％、全氮中质量比90％以上为有机氮、总氮磷钾养分质量比为6～10％、有机质质量比含量为30～35％。

4.权利要求2或3所述微生物有机肥料的生产方法，包括：

1)将拮抗菌NJY10和NJY-IVI分别接种到PDA培养液，分别进行液体发酵生产，发酵生产的条件为：培养温度范围30～38℃，搅拌速度为180～300转/分钟，发酵中后期形成芽孢，使发酵液中含菌或芽孢量≥5×10⁹个/ml，所用PDA培养液配制方法为，以配制1L培养基为例：用200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，经过滤后滤液中加20g普通蔗糖，定容至1000ml，pH值调至7.2-7.4，121℃灭菌20min；

2)将拮抗菌与腐熟后的猪粪堆肥和菜粕的微生物酶解混合物分别进行固体发酵，每吨固体有机物料中加入拮抗菌液50L，固体发酵过程中每天翻堆1次，使固体发酵温度不超过50℃，一般发酵5天后结束，使拮抗菌含量达到1×10⁸个/g以上，获得拮抗菌NJY10的猪粪堆肥固体菌剂和NJY10的菜粕微生物酶解混合物固体菌剂，同样获得拮抗菌NJY-IVI的两种固体菌剂；

其中菜粕的微生物酶解混合物制备方法为，将保藏号为CGMCC NO.1543的嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)菌株37-1发酵液加入到菜粕原料中，调节含水量55-65％和pH 6.0-7.5，进行开放式固体发酵，待发酵温度上升至50℃时立即开始翻堆，以后每天翻堆，使堆温始终维持在35-50℃共5天，固体发酵开始后，堆物的pH会不断上升，每次翻堆时用含酸液体调节含水量和pH，使它们分别维持在55-65％和6.0-7.0，发酵终止时再用含酸液体进行喷洒，直至堆物pH调整为5.0左右，再进行低温干燥或自然凉干，即为菜粕的微生物酶解混合物；

4)再将猪粪堆肥的固体混合菌剂按体积比50-70％与菜粕微生物酶解混合物的固体混合菌剂按体积比30-50％的比例充分混合，并后熟2-3天，后熟过程中翻堆2次，最后在温度不超过60℃的条件下将微生物有机肥的含水量蒸发至30％以下，获得能防治连作甜瓜枯萎病的拮抗菌NJY10和NJY-IVI混合微生物有机肥，包装出厂即为防治连作甜瓜枯萎病的微生物有机肥料。

5.根据权利要求4所述微生物有机肥料的生产方法，其中步骤2)所用腐熟后的猪粪堆肥发芽指数为98％以上，有机质质量比含量≥35％，有机氮质量比含量为1.2-2％，含水量质量比25-30％。

6.权利要求2或3所述微生物有机肥料在防治连作甜瓜枯萎病中的应用。