CN104540951A

CN104540951A - 使用芸苔属双向组成型启动子表达转基因的构建体和方法

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Publication number: CN104540951A
Application number: CN201380041949.XA
Authority: CN
Inventors: M·古普塔; S·M·拉塞尔; L·Y·沈; S·R·谢纳雷迪; J·R·劳特; S·诺瓦克
Original assignee: Dow AgroSciences LLC
Current assignee: Corteva Agriscience LLC
Priority date: 2012-06-07
Filing date: 2013-06-05
Publication date: 2015-04-22
Anticipated expiration: 2033-06-05
Also published as: EP2859104A4; ZA201408854B; RU2619178C2; WO2013184764A2; DK2859104T3; CA2875055A1; AU2013271740B2; CN104540951B; WO2013184764A3; AU2013271740A1; JP6262217B2; BR102013014125A2; JP2015518733A; CL2014003314A1; EP2859104A2; RU2014153506A; AR091286A1; IL235809A0; EP2859104B1

Abstract

提供了使用源自欧洲油菜(Brassica napus)或芸苔属(Brassica)双向组成型启动子(BBCP)的公开的双向启动子在植物细胞和/或植物组织中表达多个基因的构建体和方法。提供的构建体包含至少一个这样的连接多个基因表达盒的双向启动子，其中所述每个基因表达盒包含至少一个转基因。在一些实施方案中，提供的所述构建体和方法允许二至二十个的基因的表达。

Description

使用芸苔属双向组成型启动子表达转基因的构建体和方法

相关文献的交叉引用

本申请要求申请日为2012年6月7日的美国临时申请No.61/656,634的优先权，其公开内容在此通过参考文献以其整体并入。

通过提述电子提交材料而并入

通过提述以其整体并入的是计算机可读的序列表，所述序列表在此一并提交，并鉴定如下：名为“70136_ST25.txt”的78,835字节的ASCII(文本)文档，所述文档创建于2013年5月13日。

发明领域

本发明一般地涉及植物分子生物学的领域，并且更具体为多个基因在转基因植物中稳定表达的领域。

发明背景

许多植物品种能够用来自其他品种的转基因进行转化来引入农业上理想的性状或特征，例如，改进的营养价值品质、升高的产量、赋予的害虫或疾病抗性、升高的干旱和压力耐性、改进的园艺质量(如色素沉淀和生长)、赋予的除草剂抗性、使得来自植物的工业上有用的化合物的生产成为可能和/或使得药物生产成为可能。将转基因引入植物细胞以及随后回收包含稳定整合的转基因拷贝的能育转基因植物可用于产生具有理想性状的转基因植物。

控制和调节基因的表达可通过多种机构发生。基因的转录初始是起主导作用的基因表达的控制机构。转录的初始一般通过转录基因的5’侧翼或上游区的多核苷酸序列控制。这些序列共同被称为启动子且被归类于基因调节元件。已被克隆且广泛用于基础研究和生物技术应用的植物中的启动子一般是单向的，仅指导融合在其3’末端(即下游)的一个基因。参见，例如，Xie等(2001)Nat.Biotechnol.19(7):677-9；美国专利号6,388,170。

其他的基因调节元件包括与特定的DNA结合因子相互作用的序列。虽然这些序列基序可在基因编码序列的5’或3’处或内含子中找到，它们有时指顺式元件，且通常是位置和方向依赖的。这些与组织特异性或发育特异性转录因子结合的顺式元件可单独或组合地确定启动子在转录水平上的空间表达模式。这些顺式元件在它们对可操作连接的基因所发挥的控制的类型上变化广泛。一些元件起作用以增加可操作连接的基因响应环境应答(例如，温度，湿度和伤害)的转录。其他顺式元件可响应发育指示(例如，发芽，种子成熟和开花)或空间信息(例如，组织特异性)。参见，例如，Langridge等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:3219-23。

常常有必要将多个基因引入植物中用于代谢工程和性状叠加，其中基因经常通过相同或同源的启动子控制。然而，当多个引入的转基因具有驱动它们的同源启动子时，基于同源性的基因沉默(HBGS)可能出现。参见，例如，Mol等(1989)Plant Mol.Biol.13:287-94。已报道HBGS在转基因植物中广泛出现。参见例如，Vaucheret和Fagard(2001)Trends Genet.17:29-35。已表明多个机构试图解释HBGS现象，它们全部包括启动子中的序列同源性触发导致重复基因的沉默的细胞识别机构的特征。参见，例如，Matzke和Matzke(1995)PlantPhysiol.107:679-85；Meyer和Saedler(1996)Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.47:23-48；Fire(1999)Trends Genet.15:358-63；Hamilton和Baulcombe(1999)Science 286:950-2；和Steimer等(2000)Plant Cell 12:1165-78。

在转基因植物中避免HBGS的策略通常涉及功能上等同但具有最小序列同源性的不同启动子的开发。因此，仍然需要有效的、具有对转基因通过育种或在转基因植物中多次传代的重组或丢失的最小风险的稳定表达多个转基因的构建体和方法。

发明内容

提供了用于在植物细胞和/或植物组织中用公开的来自欧洲油菜(Brassicanapus)或芸苔属(Brassica)的双向组成型启动子(BBCP)表达多个基因的构建体和方法。提供的构建体包含与多个基因表达盒连接的至少一个所述双向启动子，其中各基因表达盒包含至少一个转基因。在一些实施方案中，提供的所述构建体和方法使得二至二十个基因表达。

一方面，提供的是用于在植物细胞和/或组织中表达多个基因的核酸构建体。所述核酸构建体包含(a)含有与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性的核苷酸序列的双向启动子；以及(b)在双向启动子相反末端的两个基因表达盒。

在一个实施方案中，所述双向启动子包含至少一个增强子。在另一实施方案中，所述双向启动子不包含增强子。在另一实施方案中，所述核酸构建体包含用于植物转化的双元载体。在另一实施方案中，所述核酸构建体包含用于土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化的双元载体。在另一实施方案中，所述双向启动子包含至少一个内含子。在另一实施方案中，所述双向启动子包含至少一个5’非翻译区。在一个实施方案中，所述双向启动子包含选自SEQ ID NO:2或3的核苷酸序列。在另一实施方案中，所述双向启动子包含与SEQ ID NO:1具有至少85％、90％、95％或100％同一性的核苷酸序列。在另一实施方案中，所述双向启动子包含选自SEQ ID NO:1、22-25或其互补物的核苷酸序列。在进一步或可替代的实施方案中，所述双向启动子包含选自SEQ ID NO:1、22-24或其互补物的核苷酸序列。在进一步或可替代的实施方案中，所述双向启动子包含选自SEQ ID NO:1、22-23或其互补物的核苷酸序列。在进一步或可替代的实施方案中，所述双向启动子包含选自SEQ ID NO:1、22或其互补物的核苷酸序列。

在一个实施方案中，至少一个基因表达盒包含两个或多个经由翻译开关连接的基因。在另一实施方案中，两个基因表达盒都包含两个或多个经由翻译开关连接的基因。在进一步或可替代的实施方案中，所述翻译开关选自下组：内部核糖体进入位点(IRES)、可替代的剪接位点、核酶切割位点、编码2A肽的多核苷酸序列、编码2A-样肽的多核苷酸序列、编码内蛋白的多核苷酸序列、编码蛋白酶切割位点的多核苷酸序列及其组合。在进一步或可替代的实施方案中，所述翻译开关包含顺式作用的水解酶元件(CHYSEL)。在另一实施方案中，所述CHYSEL是2A或2A-样肽序列。在另一实施方案中，所述翻译开关的上游基因不包含翻译终止密码子。

在一个实施方案中，核酸构建体包含至少一个转基因。在另一实施方案中，所述核酸构建体使得或允许至少四个基因表达。在进一步的实施方案中，全部四个基因为转基因。在另一实施方案中，所述核酸构建体使得三至二十个基因表达。在另一实施方案中，所述核酸构建体使得四至八个基因表达。在进一步或可替代的实施方案中，所述基因为转基因。在另一实施方案中，至少一个基因表达盒包含编码融合蛋白的多核苷酸序列。在进一步的实施方案中，所述融合蛋白包含三至五个基因。在另一实施方案中，两个基因表达盒都不包含EPSPS或平行同源物。

在另一方面中，提供了核酸构建体，其包含用于终止单个或多个基因在植物细胞和/或组织中表达的调节元件。调节元件包含可与转基因3’端融合的多A区或平行同源物A 3’非翻译区(UTR)。在一个实施方案中，所述平行同源物A 3’UTR包含用于终止和调节转录和翻译的具有功能的多腺苷酸化序列。在进一步或可替代的实施方案中，所述调节元件包含与SEQ ID NO:26或其互补物具有至少80％、85％、90％、95％或100％同一性的多核苷酸序列。在另一实施方案中，所述调节元件包含SEQ ID NO:26的多核苷酸序列或其互补物。

另一方面，提供了用于生成转基因植物的方法，其包括用本文提供的核酸构建体转化植物细胞。另一方面，提供了用于生成转基因细胞的方法，其包括用本文提供的核酸构建体转化所述细胞。另一方面，提供了包含本文提供的核酸构建体的植物细胞。在进一步或可替代的实施方案中，所述核酸构建体稳定转化入所述植物细胞。另一方面，提供了转基因植物或种子，其包含本文提供的核酸构建体。在进一步或可替代的实施方案中，所述核酸构建体稳定转化入所述植物或种子中。在进一步的实施方案中，所述转基因植物是双子叶植物。在另外进一步的实施方案中，所述转基因植物是单子叶植物。另一方面，提供了用于在植物细胞和/或组织中表达多个基因的方法，其包括将本文提供的核酸构建体引入所述植物细胞和/或组织。在进一步或可替代的实施方案中，所述植物细胞和/或组织用本文提供的核酸构建体稳定转化。另一方面，提供了用于土壤杆菌属介导转化的双元载体。所述双元载体包含本文提供的核酸构建体。另一方面，提供了本文提供的双向启动子用于在植物中表达多个转基因的用途。在一个实施方案中，所述双向启动子包含与SEQ ID NO:1具有至少80％、85％、90％、95％或100％同一性的核苷酸序列。另一方面，提供了本文提供的双向启动子在制造转基因植物或种子中的用途。在一个实施方案中，所述双向启动子包含与SEQ ID NO:1具有至少80％、85％、90％、95％或100％同一性的核苷酸序列。

一方面，在转基因植物细胞和/或组织中提供了包含至少一个芸苔属内含子序列的核酸构建体。在一个实施方案中，所述芸苔属内含子序列选自SEQID NO:27-33。另一方面，提供了至少一种芸苔属内含子序列在制造转基因植物和种子中的用途。在一个实施方案中，所述芸苔属内含子序列选自SEQ IDNO:27-33。

附图和序列简述

图1A显示了芸苔属双向组成型启动子(BBCP)的739个核苷酸的核心双向启动子的序列(SEQ ID NO:1)。图1B显示了修饰的1226个核苷酸的BBCP序列(SEQ ID NO:2)，其中添加核苷酸序列“gg”以引入限制酶切割位点。图1C显示了SEQ ID NO:3，其为SEQ ID NO:2的反向互补物，其中SEQ ID NO:2的添加的“gg”序列显示为SEQ ID NO:3中的“cc”序列。

图2A显示了来自欧洲油菜(Brassica napus)基因组的BBCP的鉴定，其中EPSPS平行同源物A基因的表达通过BBCP驱动。在来自EPSPS平行同源物A基因的BBCP相反端，也鉴定了提出的未知基因。图2B显示了天然基因组序列的多核苷酸序列(SEQ ID NO:4)，其包含：(1)提出的未知基因，(2)BBCP和(3)EPSPS平行同源物A基因。图3A进一步显示该提出的未知基因的预测的蛋白质序列(SEQ ID NO:5)，而图3B显示了对应的编码序列(SEQ ID NO:6)。

图4A显示了EPSPS平行同源物A基因的部分序列(SEQ ID NO:7)，其与US 2009/0205083的SEQ ID NO:10相同。图4B显示了EPSPS平行同源物A基因的完整序列。图4C进一步显示了EPSPS平行同源物A的蛋白质序列(SEQ IDNO:9)而图4D显示了EPSPS平行同源物A的对应的编码序列(SEQ ID NO:10)。

图5A显示了EPSPS平行同源物B基因的序列(SEQ ID NO:11)，其与US2009/0205083的SEQ ID NO:11相同。图5B进一步显示了EPSPS平行同源物B的蛋白质序列(SEQ ID NO:12)，而图5C显示了EPSPS平行同源物B的对应的编码序列(SEQ ID NO:13)。

图6A显示了EPSPS平行同源物C基因的序列(SEQ ID NO:14)，其与US2009/0205083的SEQ ID NO:12相同。图6B进一步显示了EPSPS平行同源物C的蛋白质序列(SEQ ID NO:15)，而图6C显示了EPSPS平行同源物C的对应的编码序列(SEQ ID NO:16)。

图7A显示了EPSPS平行同源物E基因的序列(SEQ ID NO:17)，其与US2009/0205083的SEQ ID NO:14相同。图7B进一步显示了EPSPS平行同源物E的蛋白质序列(SEQ ID NO:18)，而图7C显示了EPSPS平行同源物E的对应的编码序列(SEQ ID NO:19)。

图8显示了EPSPS平行同源物A(SEQ ID NO:9)、EPSPS平行同源物B(SEQ ID NO:12)、EPSPS平行同源物C(SEQ ID NO:15)和EPSPS平行同源物E(SEQ ID NO:18)的蛋白质序列之间的例示性序列比对。

图9显示了来自pDAB100331(SEQ ID NO:20)的例示序列，其在BBCP相反端包含GUS和GFP的基因表达盒。GUS和GFP的表达均通过BBCP驱动。

图10显示了来自pDAB100333(SEQ ID NO:21)的例示序列，其在BBCP相反端包含GUS和GFP的基因表达盒。GUS和GFP的表达均通过BBCP驱动。

图11显示了可替换的BBCP序列，其包括SEQ ID NO:22-25。

图12显示了质粒pDAB100331和pDAB100333的代表性图谱。

图13显示了质粒pDAB108710和pDAB108711的代表性图谱。

图14显示了例示的EPSPS平行同源物A 3’UTR基因序列(SEQ ID NO:26)，以及七个平行同源物A内含子序列(SEQ ID NO:27-33)。

发明详述

转基因产品的发展已变得越来越复杂，其需要将多个转基因堆叠入单基因座。传统上每个转基因通常需要用于表达的独特的启动子，因此需要多个启动子在一个基因堆叠内表达不同转基因。除增加基因堆叠的大小外，其经常导致相同启动子的重复使用以获得用于单个多基因性状表达的不同转基因的表达模式的相似水平。通过相同启动子驱动的多基因构建体已知可引起基因沉默，从而在该领域产生不十分有效的转基因产品。由于启动子重复导致的转录因子(TF)结合位点的过量可引起内源TFs的消耗从而导致转录失活。转基因的沉默有可能不理想地影响产生的转基因植物的表达转基因的性能。转基因内的重复序列可引起导致多核苷酸重排的基因座内(intra-locus)同源重组。

提供了用芸苔属双向组成型启动子(BBCP)在植物中表达转基因的方法和构建体。还提供了在启动子的任一端或两端将双向启动子系统与基因的双顺反子组织组合的方法和构建体，例如使用来自Thosea asigna病毒的2A序列。仅16-20氨基酸长的2A蛋白质，在其本身的羧基末端切割该多聚蛋白。该2A或2A-样肽的“自切割”或“核糖体跳跃(ribosome skip)”特性可用于加工在转基因植物中产生的人工多聚蛋白。在一个实施方案中，Cry34和Cry35基因在一个基因表达盒中融合，其中GFP(或YFP或PhiYFP)和AAD1基因融合入另一基因表达盒(具有置于每个组合中的两基因间的2A蛋白质基因拷贝的单开放阅读框(ORF))。例如，这些基因表达盒中(或基因对)的每一个可置于双向启动子的任一末端以使用单启动子驱动4个转基因。因此，本文提供的构建体和方法可用于避免重复使用相同启动子并显著减少商业启动子的大小。此外，用一个启动子驱动四个或更多个基因也提供了控制单个多基因性状的共表达基因的能力。

公开的一些缩写列举于表1中。

用于基础研究或生物技术应用的植物启动子一般为单向，仅指导融合在其3’末端(下游)的一个基因。经常有必要将多基因引入植物用于其代谢工程和性状叠堆，未来的转基因作物中通常需要多启动子来驱动多基因的表达。设计能够节省所运用的启动子的数目并允许基因堆叠的同步共调节表达的策略是理想的。在一些实施方案中，提供的双向启动子可驱动多转录单位，包括RNAi、人工miRNA或发夹-环RNA序列的转录。

本文所用冠词“一个/一种(a,an)”和“所述”包括复数指称，除非上下文明确且不含糊地另外指示。

本文所用短语“回交”指育种者将杂交子代与亲代之一返回交配的过程，例如，第一代杂交F1与所述F1杂交的亲本基因型之一。

本文所用短语“内含子”指任何包含于转录的而非翻译的基因中的核酸序列(或感兴趣的表达的核苷酸序列)。内含子包括在表达的DNA序列内的非转录核酸序列，以及由其转录的RNA分子中的对应序列。

提供的构建体还包括增强翻译和/或mRNA稳定性的序列如内含子。一个这种内含子的实例是拟南芥(Arabidopsis thaliana)的组蛋白H3.III变体的基因II的第一内含子或任何其他公知的内含子序列。Chaubet等Journal ofMolecular Biology,225:569-574(1992)。本领域已知内含子可与启动子序列组合使用以增强翻译和/或RNA稳定性。

本文所用短语“5’非翻译区”或“5’UTR”指在前-mRNA或成熟mRNAs的5’末端的非翻译区段。例如，在成熟mRNAs上，5’UTR通常在其5’端携带7-甲基化鸟苷帽且参与多个过程如剪接、多腺苷酸化、朝细胞质的mRNA输出、通过翻译机构对mRNA的5’端的鉴定以及保护mRNA免于降解。

本文所用短语“3’非翻译区”或“3’UTR”指在前-mRNA或成熟mRNAs的3’末端的非翻译片段。例如，在成熟mRNAs上，所述3’UTR携带多(A)尾且已知在mRNA稳定性、翻译起始、mRNA输出中具有多种作用。

本文所有短语“多腺苷酸化信号”指存在于mRNA转录子中的核酸序列，当多(A)聚合酶存在时，“多腺苷酸化信号”使得所述转录子在例如，位于多(A)信号10至30个碱基下游的多腺苷酸化位点上被多腺苷酸化。许多多腺苷酸化信号是本领域已知的且可用于本发明。实例包括人变体生长激素多腺苷酸化信号，SV40晚期多腺苷酸化信号和牛生长激素多腺苷酸化信号。

本文所用短语“分离的”指生物组分与该组分天然存在的生物体的细胞中的其他生物组分(即其他染色体的和染色体外的DNA和RNA，以及蛋白质)基本上分离、分开产生、或纯化分开，其影响组分中的化学或功能变化(例如，核酸可通过断裂将核酸与在染色体中的其余DNA相连的化学键而从染色体分离)。已“分离的”核酸分子和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸分子和蛋白质。短语“分离的”还涵盖通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸和蛋白质，以及化学合成的核酸分子、蛋白质和肽。

本文所有短语“基因表达”指通过该过程核酸转录单位(包括，例如，基因组DNA)的编码信息被转化成为细胞的可操作的、不可操作的或结构的部分，经常包括蛋白质的合成。基因表达可受外部信号影响；例如，细胞、组织或生物体暴露于增加或降低基因表达的作用剂。基因的表达可在从DNA至RNA至蛋白质的途径中的任何地方调节。调节基因表达，例如，通过作用于转录、翻译、RNA转运和加工、中间分子如mRNA的降解的控制，或通过特定蛋白质分子在其生成后的激活、失活、区室化或降解，或通过其组合而发生。基因表达可通过本领域已知的任何方法(包括但不限于，Northern印迹、RT-PCR、Western印迹、或体外、原位或体内的蛋白质活性测定法)在mRNA水平或蛋白质水平测量。

本文所用短语“基于同源性的基因沉默(HBGS)”指包括转录基因沉默和转录后基因沉默两者的专业术语。通过不相连沉默基因座的靶基因座的沉默可起因于转录抑制(转录基因沉默；TGS)或mRNA降解(转录后基因沉默；PTGS)，其归因于分别与启动子或转录序列对应的双链RNA(dsRNA)的产生。在每个过程中的不同细胞组分的参与表明dsRNA诱导的TGS和PTGS可能起因于古老的共同机构的多样化。然而，TGS和PTGS的严格比较难于实现，因为其一般依赖于不同沉默基因座的分析。可描述单转基因座以触发TGS和PTGS两者，其归因于与启动子和不同靶基因的转录序列对应的dsRNA的产生。参见，例如，Mourrain等(2007)Planta 225:365-79。可能的是siRNA是在同源序列上触发TGS和PTGS的真正分子：在该模型内siRNA会以顺式和反式通过将转基因序列的甲基化传播入内源启动子而触发同源序列的沉默和甲基化。

本文所用短语“核酸分子”(或“核酸”或“多核苷酸”)指多聚化形式的核苷酸，其可包括RNA、cDNA、基因组DNA以及上述的合成形式和混合多聚物的有义和反义链。核苷酸可指核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或修饰形式的任一种核苷酸。本文所用的“核酸分子”与“核酸”和“多核苷酸”为同义词。除非另外详明，核酸分子长度上通常至少10个碱基。该术语可指不确定长度的RNA或DNA分子。该术语包括DNA的单和双链形式。核酸分子可包括通过天然存在的和/或非天然存在的核苷酸键连接在一起的天然存在的和修饰的核苷酸之一或两者。

核酸分子可化学或生化修饰，或可含有非天然或衍生的核苷酸碱基，如本领域的技术人员所容易理解的。这些修饰包括，例如，标签、甲基化，一个或多个天然存在的核苷酸用类似物取代，核苷酸间修饰(例如，不带电荷的键：例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等；带电荷的键：例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等；悬凸基团(pendent moieties)：例如，肽；嵌入剂：例如，吖啶、补骨脂素等；螯合剂；烷化剂；及修饰的键：例如，α-异头物核酸等)。术语“核酸分子”还包括任何拓扑构象，其包括单链、双链、部分地双链化、三链化、发夹化、圆形和挂锁构象。

转录以5’至3’方式沿DNA链进行。这意指通过顺序添加核糖核苷-5’-三磷酸至生成链的3’末端(及焦磷酸盐的必要消除)来产生RNA。在线性或环状的核酸分子中，分散的元件(例如，特定核酸序列)如果以从另一元件的5’方向结合或将要结合至相同核酸，其可称为在相对于另一元件的“上游”。类似地，离散元件如果以从另一元件的3’方向结合至相同核酸，其可在相对于另一元件的“下游”。

本文所用短语“碱基位置”指给定碱基或核苷酸残基在指定核酸内的位置。指定核酸可通过与参照核酸比对(见下文)而限定。

本文所用短语“杂交”指寡核苷酸及其类似物通过互补碱基间的氢键键合(其包括沃森-克里克(Watson Crick)、Hoogsteen或反Hoogsteen氢键键合)而杂交的过程。一般地，核酸分子由作为嘧啶(胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)和胸腺嘧啶(T))或嘌呤(腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G))的含氮碱基组成。这些含氮碱基在嘧啶和嘌呤间形成氢键，并且嘧啶与嘌呤的键合称为“碱基配对”。更具体地，A会与T或U氢键键合，而G会与C键合。“互补的”指两种独特的核酸序列或相同核酸序列的两个独特的区之间发生的碱基配对。

本文所用短语“可特异性杂交的”和“特异性互补的”指足够的互补性程度，使得在寡核苷酸和DNA或RNA靶物间发生稳定的且特异性的结合。寡核苷酸不需要与其可特异性杂交的靶序列100％互补。在寡核苷酸对靶DNA或RNA分子的结合干扰靶DNA或RNA的正常功能，并且有足够的互补性程度以避免寡核苷酸在期望的特异性结合的条件下(例如，在体内测定法或系统的情况中在生理条件下)与非靶序列的非特异性结合时，寡核苷酸是可特异性杂交的。此类结合称为特异性杂交。

导致特定严格性程度的杂交条件会取决于选择的杂交方法的性质和杂交核酸序列的组成和长度而变化。一般地，杂交的温度和杂交缓冲液的离子强度(尤其是Na⁺和/或Mg²⁺浓度)会有助于杂交的严格性，尽管洗涤次数也影响严格性。关于获得特定的严格性程度所需的杂交条件的计算讨论于Sambrook等(编),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,vol.1-3,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989,第9和11章。

本文所用“严格条件”涵盖若杂交分子与DNA靶物之间有小于50％错配才会发生杂交的条件。“严格条件”进一步包括特定的严格性水平。因此，如本文中所使用的，“中等严格性”条件是具有超过50％序列错配的分子不会杂交的条件；“高严格性”条件是具有超过20％错配的序列不会杂交的条件；“非常高严格性”条件是具有超过10％错配的序列不会杂交的条件。

在具体的实施方案中，严格条件可包括在65℃杂交，然后是在65℃用0.1xSSC/0.1％SDS洗涤40分钟。

下列是代表性的、非限制性的杂交条件：

非常高严格性：在5x SSC缓冲液中于65℃杂交16小时；在2x SSC缓冲液中于室温洗涤两次每次15分钟；并在0.5x SSC缓冲液中于65℃洗涤两次，每次20分钟。

高严格性：在5-6x SSC缓冲液中于65-70℃杂交16-20小时；在2x SSC缓冲液中于室温洗涤两次每次5-20分钟；并在1x SSC缓冲液中于55-70℃洗涤两次，每次20分钟。

中等严格性：在6x SSC缓冲液中于室温至55℃杂交16-20小时；在2x-3xSSC缓冲液中于室温至55℃洗涤至少两次每次20-30分钟。

在具体的实施方案中，可特异性杂交的核酸分子能在非常高严格性的杂交条件下保持结合。在这些和进一步的实施方案中，可特异性杂交的核酸分子能在高严格性的杂交条件下保持结合。在这些和进一步的实施方案中，可特异性杂交的核酸分子能在中等严格性的杂交条件下保持结合。

本文所用术语“寡核苷酸”指短的核酸多聚物。寡核苷酸可通过更长的核酸区段切割或通过聚合单独的核苷酸前体而形成。自动化的合成仪使得寡核苷酸合成直至长度为数百碱基对。由于寡核苷酸可结合至互补核苷酸序列，其可用作检测DNA或RNA的探针。由DNA组成的寡核苷酸(寡脱氧核糖核酸)可用于PCR，一种用于扩增小DNA序列的技术。在PCR中，所述寡核苷酸通常称为“引物”，其允许DNA聚合酶延伸所述寡核苷酸并复制互补链。

本文所用短语“序列同一性”或“同一性”指两个核酸或多肽序列的语境，可指当在特定的比较窗口中以最大一致性进行比对时两序列中相同的残基。

本文所用术语“序列同一性的百分比”指在比较窗口中通过比较两个最佳比对的序列(例如，核酸序列和氨基酸序列)所确定的值，其中为得到两序列的最佳比对，在比较窗口中的序列部分相比于参考序列(其不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(即，缺口)。该百分比通过如下计算：确定在两序列中出现相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数目以获得匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中位置的总数，并将结果乘以100以获得序列同一性的百分数。

用于比对序列进行比较的方法为本领域公知。多种程序和比对算法描述于，例如，Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444；Higgins和Sharp(1988)Gene 73:237-44；Higgins和Sharp(1989)CABIOS 5:151-3；Corpet等(1988)Nucleic Acids Res.16:10881-90；Huang等(1992)Comp.Appl.Biosci.8:155-65；Pearson等(1994)MethodsMol.Biol.24:307-31；Tatiana等(1999)FEMS Microbiol.Lett.174:247-50。序列比对方法和同源性计算的详细考虑可见于，例如，Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-10。

美国国立生物技术信息中心(NCBI)基础局部比对搜索工具(BLAST^TM；Altschul等(1990))可从多个来源获得，包括美国国立生物技术信息中心(Bethesda,MD)，和在互联网上，用于与几个序列分析程序相关。如何利用该程序确定序列同一性的描述可从互联网上BLAST^TM的“帮助”部分获得。对于核酸序列的比较，可使用默认参数采用BLAST^TM(Blastn)程序的“Blast2序列”功能。与参考序列具有甚至更大相似性的核酸序列当利用该方法评估时会显示升高的百分数。

本文所用短语“可操作连接的”指在第一核酸序列与第二核酸序列在功能性关系中时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接的语境。例如，在启动子影响编码序列的转录或表达时，启动子与编码序列可操作连接。在重组生成时，可操作连接的核酸序列一般是连续的，且在必需连接两个蛋白质编码区的情况中，处于相同阅读框中。然而，元件不需要连续而成为可操作连接的。

本文所用短语“启动子”指转录需要的一般位于上游(朝向基因的5’区)的DNA区。启动子可容许其控制的基因的正确活化或阻抑。启动子可含有转录因子识别的特定序列。这些因子可结合启动子DNA序列，并导致RNA聚合酶(从基因的编码区合成RNA的酶)的募集。

本文所用短语“转化”或“转导”指在病毒或载体将核酸分子转移入细胞时的过程。在核酸分子通过将核酸分子并入细胞基因组中，或者通过附加体复制而被细胞稳定复制时，细胞被“转导”入细胞中的核酸分子“转化”。如本文中使用的，术语“转化”涵盖可以将核酸分子导入所述细胞的所有技术。例子包括但不限于用病毒载体转染、用质粒载体转化、电穿孔(Fromm等(1986)Nature 319:791-3)、脂转染(Felgner等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413-7)、显微注射(Mueller等(1978)Cell 15:579-85)、土壤杆菌属介导的转移(Mueller等(1978)Cell 15:579-85)、直接的DNA摄取、Whiskers-介导的转化和微粒轰击(Klein等(1987)Nature 327:70)。

本文所用短语“转基因”指外源核酸序列。在一个例子中，转基因是基因序列(例如，除草剂抗性基因)、编码工业或药学上有用的化合物的基因、或编码合意的农业性状的基因。在又一个实施方案中，转基因是反义核酸序列，其中反义核酸序列的表达抑制靶核酸序列的表达。转基因可含有与转基因可操作连接的调节序列(例如，启动子)。在一些实施方案中，感兴趣的核酸序列是转基因。然而，在其它实施方案中，感兴趣的核酸序列是内源核酸序列，其中内源核酸序列的额外的基因组拷贝是合意的，或相对于宿主生物体中的靶核酸分子处于反义取向的核酸分子。

本文所用短语“载体”指如导入细胞由此生成经转化的细胞的核酸分子。载体可包括容许其在宿主细胞中复制的核酸序列，如复制起点。例子包括但不限于质粒、粘粒、噬菌体或病毒，其将外源DNA携带入细胞。载体还可包括一个或多个基因、反义分子、和/或可选择标记基因和本领域中已知的其它遗传元件。载体可转导、转化、或感染细胞，由此引起细胞表达由载体编码的核酸分子和/或蛋白质。载体可任选地包括帮助实现核酸分子进入细胞中的材料(例如，脂质体)。

本文所用术语“植物”包括植物和植物部分，包括但不限于植物细胞和植物组织，如叶、茎、根、花、花粉、和种子。可用于本发明的植物类别一般与可顺应突变的高等或低等植物类别同样宽泛，包括被子植物(单子叶和双子叶植物)，裸子植物、蕨类植物和多细胞藻类。因此，“植物”包括双子叶植物和单子叶植物。双子叶植物的实例包括烟草、拟南芥、大豆、番茄、木瓜、芸苔(canola)、向日葵、棉花、苜蓿、马铃薯、葡萄、木豆(pigeon pea)、豌豆、芸苔/油菜(Brassica)、鹰嘴豆、糖甜菜、油菜子、西瓜、瓜、胡椒属(pepper)、花生、南瓜、萝卜、菠菜、倭瓜/笋瓜(squash)、花椰菜/甘蓝(broccoli)、甘蓝/卷心菜(cabbage)、胡萝卜、花椰菜、芹菜、大白菜(Chinese cabbage)、黄瓜、茄子、莴苣(lettuce)。单子叶植物的实例包括玉米、水稻、小麦、甘蔗、大麦、黑麦、高粱、兰花(orchid)、竹子、香蕉、香蒲(cattail)、百合、燕麦、洋葱、小米(millet)和黑小麦(triticale)。

本文所用短语“植物材料”指叶、茎、根、花或花的部分、果实、花粉、卵细胞、合子、种子、插条、细胞或组织培养物，或植物的任何其他部分或产品。在一些实施方案中，植物材料包括子叶和叶。

本文所用短语“翻译开关”指在基因末端使得直接下游基因翻译的机构。翻译开关的机构可在核酸水平(例如，病毒或真核内部核糖体进入位点(IRES)、可替代的剪接位点或核酶切割位点)或者在肽/蛋白质水平(例如，2A肽、2A-样肽、内蛋白或蛋白酶切割位点)起作用。

这些在核酸水平或在肽/蛋白质水平的翻译开关的机构为本领域熟知。参见，例如，li,Z.,H.M.Schumacher,等(2010)J Biotechnol 145(1):9-16；Chen,Y.,K.Perumal,等(2000)Gene Expr 9(3):133-143；Dinkova,T.D.,H.Zepeda,等(2005)Plant J 41(5):722-731；Dorokhov,Y.L.,M.V.Skulachev,等(2002)Proc Natl AcadSci U S A 99(8):5301-5306；Fernandez-Miragall,O.和C.Hernandez(2011)PLoSOne 6(7):e22617；Groppelli,E.,G.J.Belsham,等(2007)J Gen Virol 88(Pt 5):1583-1588；Ha,S.H.,Y.S.Liang,等(2010)Plant Biotechnol J 8(8):928-938；Karetnikov,A.和K.Lehto(2007)J Gen Virol 88(Pt 1):286-297；Karetnikov,A.和K.Lehto(2008)Virology 371(2):292-308；Khan,M.A.,H.Yumak,等(2009)J BiolChem 284(51):35461-35470；和Koh,D.C.,S.M.Wong,等(2003)J Biol Chem278(23):20565-20573，其内容通过提述以其整体并入本文。包含修饰的内蛋白的多基因表达构建体已公开于美国专利号7,026,526和7,741,530，以及美国专利申请2008/0115243，其内容通过提述以其整体并入本文。

本文所用短语“可选择标记”或“可选择标记基因”指任选用于植物转化，例如，以保护植物免于选择性作用剂或提供选择性作用剂抗性/耐性的基因。只有那些接受有功能的可选择标记的细胞或植物能在具有可选择的作用剂的条件下分裂或生长。选择性作用剂的实例可包括，例如，抗生素，其包括壮观霉素、新霉素、卡那霉素、巴龙霉素、庆大霉素和潮霉素。这些可选择标记包括用于新霉素磷酸转移酶的基因(npt II)，其表达赋予对抗生素卡那霉素的抗性的酶，而对于相关抗生素新霉素、巴龙霉素、庆大霉素和G418的基因，或表达赋予对潮霉素抗性的酶潮霉素磷酸转移酶的基因(hpt)。其他可选择标记基因可包括编码除草剂抗性的基因，其包括Bar(针对(草铵膦)，或草丁膦(PPT)的抗性)、乙酰乳酸合酶(ALS，针对抑制剂如磺脲类药物(SUs)、咪唑啉酮(IMIs)、三唑嘧啶(TPs)、嘧啶基氧苯甲酸酯(POBs)和阻止支链氨基酸的合成中的第一步的磺酰氨基羰基三唑啉酮的抗性)、草甘膦、2,4-D、以及金属抗性或敏感性。短语“标记阳性”指植物经转化以包括可选择标记基因。

多种可选择或可检测的标记可并入选择的表达载体以使得转化的植物或转化子的鉴定和选择成为可能。多种方法是可用的以确认选择标记在转化的植物中的表达，其包括例如DNA测序和PCR(聚合酶链式反应)，Southern印迹、RNA印迹、用于检测由载体表达的蛋白质的免疫学方法，例如，介导草丁膦抗性的沉淀蛋白质，或其他蛋白质如报告基因β-葡糖醛酸苷酶(GUS)、荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、DsRed、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、碱性磷酸酶等(见Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbor Press,N.Y.,2001，其内容通过提述以其整体并入本文)。

利用可选择标记基因用于转化的细胞或组织的选择。可选择标记基因包括编码抗生素抗性的基因，如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的那些以及赋予除草化合物抗性的基因。除草剂抗性基因一般编码对除草剂不敏感的修饰的靶蛋白或在植物中在除草剂作用前对其降解或解毒的酶。例如，对草甘膦的抗性通过使用编码突变的靶物酶5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的基因获得。关于EPSPS的基因和突变体已被公开于美国专利号4,940,835、5,188,642、5,310,667、5,633,435、5,633,448和6,566,587，其内容通过提述以其整体并入本文。对草铵膦、溴苯腈和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的抗性可通过使用编码草丁膦乙酰转移酶、腈水解酶、或2,4-二氯苯氧乙酸单加氧酶的细菌基因而获得，其可解毒各自的除草剂。用于草铵膦抗性/耐性的酶/基因已公开于美国专利号5,273,894、5,276,268、5,550,318和5,561,236，其内容通过提述以其整体并入本文。用于2,4-D抗性的酶/基因已公开于美国专利号6,100,446和6,153,401以及专利申请US 2009/0093366和WO 2007/053482，其内容通过提述以其整体并入本文。用于2,4-D抗性的酶/基因之前已被公开于美国专利号6,100,446和6,153,401以及专利申请US 2009/0093366和WO2007/053482，其内容通过提述以其整体并入本文。用于腈水解酶的酶/基因之前已公开于美国专利号4,810,648，其内容通过提述以其整体并入本文。

其他除草剂可抑制生长点或分生组织、其包括咪唑啉酮类或磺酰脲类，对于这些除草剂已描述用于乙酰羟酸合酶(AHAS)和乙酰乳酸合酶(ALS)的抗性/耐性的基因。AHAS和突变体的基因和突变体已公开于美国专利号4,761,373、5,304,732、5,331,107、5,853,973和5,928,937，其内容通过提述以其整体并入本文。ALS的基因和突变已公开于美国专利号5,013,659和5,141,870，其内容通过提述以其整体并入本文。

草甘膦抗性基因分别包括突变的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPs)基因(经由重组核酸和/或天然EPSPs基因的体内诱变的不同形式的引入)、aroA基因和草甘膦乙酰转移酶(GAT)基因)。用于其他膦化合物的抗性基因包括草铵膦(来自链霉菌属(Streptomyces)菌种包括吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)和Streptomyces viridichromogenes的草丁膦乙酰转移酶(PAT)基因，和吡啶氧基(pyridinoxy)或苯氧基(phenoxy)丙酸和环己烯酮(cyclohexones)(ACCase抑制剂编码基因)。乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)的除草剂抗性/耐性基因已描述于美国专利5,162,602和5,498,544，其内容通过提述以其整体并入本文。

编码突变的aroA基因的DNA分子可以ATCC登录号39256获得，而突变体基因的核苷酸序列被公开于授予Comai的美国专利号4,769,061、授予Kumada等的欧洲专利申请No.0333033和授予Goodman等的美国专利号4,975,374中，其公开了赋予对于除草剂如L-草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列。PAT基因的核苷酸序列提供于授予Leemans等的欧洲申请No.0242246。还有DeGreef等,Bio/Technology 7:61(1989)描述了表达编码PAT活性的嵌合的bar基因的转基因植物的产生。赋予对苯氧基丙酸和环己烯酮抗性的基因的例示，包括稀禾定(sethoxydim)和氟吡禾灵(haloxyfop)，是由Marshall等,Theon.Appl.Genet.83:435(1992)描述的Acc1-S1、Acc1-S2和Acc1-S3基因。能够赋予草甘膦抗性的GAT基因描述于授予Castle等的WO2005012515中。赋予对2,4-D、Fop和吡啶氧基生长素除草剂的抗性的基因描述于WO 2005107437和美国专利申请系列号11/587,893中。

其他除草剂可抑制光合作用，其包括三嗪(psbA和1s+基因)或苯甲腈(腈水解酶基因)。Przibila等,Plant Cell 3:169(1991)描述了用编码突变的psbA基因的质粒转化衣藻(Chlamydomonas)。腈水解酶基因的核苷酸序列公开于授予Stalker的美国专利号4,810,648，而包含这些基因的DNA分子可以ATCC登录号53435、67441和67442获得。编码谷胱甘肽-S-转移酶的DNA的克隆和表达描述于Hayes等,Biochem.J.285:173(1992)。

就本发明而言，可选择标记基因包括，但不限于编码如下的基因：新霉素磷酸转移酶II(Fraley等(1986)CRC Critical Reviews in Plant Science,4:1-25)；氨腈水合酶(Maier-Greiner等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:4250-4264)；天门冬氨酸激酶；二氢吡啶二羧酸合成酶(Perl等(1993)Bio/Technology,11:715-718)；色氨酸脱羧酶(Goddijn等(1993)Plant Mol.Bio.,22:907-912)；二氢吡啶二羧酸合酶和脱敏的天冬氨酸激酶(Perl等(1993)Bio/Technology,11:715-718)；bar基因(Toki等(1992)Plant Physiol.,100:1503-1507和Meagher等(1996)和Crop Sci.,36:1367)；色氨酸脱羧酶(Goddijn等(1993)Plant Mol.Biol.,22:907-912)；新霉素磷酸转移酶(NEO)(Southern等(1982)J.Mol.Appl.Gen.,1:327)；潮霉素磷酸转移酶(HPT或HYG)(Shimizu等(1986)Mol.CellBiol.,6:1074)；二氢叶酸还原酶(DHFR)(Kwok等(1986)PNAS USA 4552)；草丁膦乙酰转移酶(DeBlock等(1987)EMBO J.,6:2513)；2,2-二氯丙酸脱卤素酶(Buchanan-Wollatron等(1989)J.Cell.Biochem.13D:330)；乙酰羟酸合酶(Anderson等,美国专利号4,761,373；Haughn等(1988)Mol.Gen.Genet.221:266)；5-烯醇丙酮莽草酸磷酸合酶(aroA)(Comai等(1985)Nature 317:741)；卤芳基腈水解酶(haloarylnitrilase)(Stalker等,published PCT applicationWO87/04181)；乙酰辅酶A羧化酶(Parker等(1990)Plant Physiol.92:1220)；二氢蝶酸合酶(sul I)(Guerineau等(1990)Plant Mol.Biol.15:127)；以及32kD光合系统II多肽(psbA)(Hirschberg等(1983)Science,222:1346)。

还包括编码对于如下抗性的基因：氯霉素(Herrera-Estrella等(1983)EMBO J.,2:987-992)；甲氨蝶呤(Herrera-Estrella等(1983)Nature,303:209-213；Meijer等(1991)Plant Mol Bio.,16:807-820(1991)；潮霉素(Waldron等(1985)Plant Mol.Biol.,5:103-108；Zhijian等(1995)Plant Science,108:219-227和Meijer等(1991)Plant Mol.Bio.16:807-820)；链霉素(Jones等(1987)Mol.Gen.Genet.,210:86-91)；壮观霉素(Bretagne-Sagnard等(1996)Transgenic Res.,5:131-137)；博莱霉素(Hille等(1986)Plant Mol.Biol.,7:171-176)；磺酰胺(sulfoamide)(Guerineau等(1990)Plant Mol.Bio.,15:127-136)；溴苯腈(Stalker等(1988)Science,242:419-423)；2,4-D(Streber等(1989)Bio/Technology,7:811-816)；草甘膦(Shaw等(1986)Science,233:478-481)和草丁膦(DeBlock等(1987)EMBO J.,6:2513-2518)。除非另外叙述，本公开中引用的所有参考文献在此通过提述以其整体并入。

可选择标记和报告基因的上述列表并非意在限制。任何报告或可选择标记基因可涵盖于本发明。如果需要，这些基因可通过本领域已知的方法测序。

为在植物中最佳表达合成了报告基因和可选择标记基因。即，基因的编码序列已经修饰以在植物中的增强表达。设计合成的标记基因从而以较高水平在植物中表达导致较高转化效率。用于合成优化基因的方法是本领域中可用的。事实上，多个基因已被优化以增加基因产物在植物中的表达。

可优化标记基因序列以供在特定的植物品种中表达或者可经修饰以供在植物家族中最佳表达。植物优选的密码子可从感兴趣的特定植物中以最大量表达的蛋白质中的最高频率密码子确定。参见，例如，EPA 0359472；EPA0385962；WO 91/16432；Perlak等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:3324-3328和Murray等(1989)Nucleic Acids Research,17:477-498；美国专利号5,380,831以及美国专利号5,436,391，其通过提述并入本文。以此方式，核苷酸序列可优化以供在任何植物中表达。认可的是基因序列的全部或任何部分可为优化或合成的。即，还可使用全部优化的或部分优化的序列。

赋予对除草剂抗性的基因

A.针对除草剂咪唑啉酮类或磺酰脲类的乙酰羟酸合酶(AHAS)和乙酰乳酸合酶(ALS)的抗性/耐性。AHAS和突变体的基因和突变已公开于美国专利号4,761,373、5,304,732、5,331,107、5,853,973和5,928,937。ALS的基因和突变体已公开于美国专利号5,013,659和5,141,870。

B.针对除草剂环己二酮和/或芳氧基苯氧基丙酸(aryloxyphenoxypropanoic acid)(包括氟吡禾灵(Haloxyfop)、禾草灵(Diclofop)、精噁唑禾草灵(Fenoxyprop)、吡氟禾草灵(Fluazifop)、喹禾灵(Quizalofop))的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抗性/耐性基因已描述于美国专利5,162,602和5,498,544。

C.草甘膦抗性/耐性的基因。5-烯醇丙酮-3-磷酸莽草酸合酶(5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase)(ES3P合酶)已描述于美国专利号4,769,601。5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)和突变体的基因已描述于美国专利号4,940,835、5,188,642、5,310,667、5,633,435、5,633,448和6,566,587。

D.草铵膦(双丙氨膦、草丁膦(PPT))抗性/耐性的基因。草铵膦乙酰转移酶(Pat)的基因已描述于美国专利号5,273,894,5,276,268和5,550,318；而双丙氨膦抗性基因(Bar)的基因已描述于美国专利号5,561,236和5,646,024、5,648,477和7,112,665。谷氨酰胺合成酶(GS)的基因已描述于美国专利号4,975,372和欧洲专利申请EP 0333033 A1。

E.针对除草剂异噁唑、二酮腈(diketonitriles)、和/或三酮类(包括磺草酮(sulcotrione)和甲基磺草酮(mesotrione))的羟基苯基丙酮酸双加氧酶抗性/耐性基因已描述于美国专利号6,268,549和6,069,115。

F.用于2,4-D抗性/耐性的基因。2,4-D-单加氧酶的基因已描述于美国专利号6,100,446和6,153,401。2,4-D抗性/耐性的其他基因公开于US2009/0093366和WO 2007/053482。

G.针对除草剂咪唑和/或三唑的咪唑甘油磷酸脱水酶(IGPD)基因描述于美国专利号5,541,310。针对除草剂麦草畏(Dicamba)的麦草畏降解酶(加氧酶、铁氧化还原酶和还原酶)已公开于美国专利号7,022,896和7,105,724。

H.对于抑制光合作用的除草剂，包括三嗪(psbA和1s+基因)或苯甲氰(腈水解酶基因)的基因。参见，例如，Przibila等,Plant Cell 3:169(1991)，其公开了用编码突变体psbA基因的质粒转化衣藻。腈水解酶基因的核苷酸序列公开于美国专利号4,810,648而包含这些基因的DNA分子可以ATCC登录号53435、67441和67442得到。编码谷胱甘肽-S-转移酶的DNA的克隆和表达由Hayes等,Biochem.J.285:173(1992)描述。

除非另外特别解释，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的技术人员所通常理解的相同的含义。分子生物学通用术语的定义可见，例如：Lewin,Genes V,Oxford University Press,1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等(编),The Encyclopedia of Molecular Biology,Blackwell Science Ltd.,1994(ISBN 0-632-02182-9)；和Meyers(编),Molecular Biology andBiotechnology:A Comprehensive Desk Reference,VCH Publishers,Inc.,1995(ISBN 1-56081-569-8)。

提供了欧洲油菜(Brassica napus)中涉及三种EPSPS基因的平行同源物(A、B和C)及其基因组分，如5’UTRs、启动子和转运肽的构建体和方法。还公开了所述基因和其基因元件的转基因和非转基因(在其天然环境中)的用途。在一些实施方案中，这些基因或元件的转基因用途可赋予植物中的除草剂(例如，草甘膦或2,4-D)耐性的性状。平行同源物A和B分享高度同源性或同一性(～92％)且C和E也是如此(～95％)。平行同源物A是在多个组织类型和不同植物生长阶段最高表达的平行同源物。EPSPS平行同源物A基因在所有测试的植物组织，例如叶、根、茎、顶端分生组织、花、花蕾等中在4-8叶阶段组成型表达。此外，平行同源物A与其他四个平行同源物相比，具有独特的转运肽序列。在一些实施方案中，EPSPS平行同源物A的转运肽用于提供蛋白质前体从细胞质到质体的有效易位。此外，所述EPSPS平行同源物B、C和E的转运肽可用于提供蛋白质前体从细胞质到质体的易位。EPSPS酶代表用于植物、真菌和微生物中芳香族氨基酸和芳族代谢物合成的莽草酸途径的第六种关键酶。因此，EPSPS基因可通过用以操纵植物中的氨基酸含量的任何已有或未来技术而在植物中上或下调。参见，例如，WO 2009/042164，其内容通过提述以其整体并入。所有这些特征单独或组合使得EPSPS平行同源物对用于转基因或非转基因(天然基因环境)应用以赋予性状(如作为操纵草莽酸及相关途径的结果的除草剂耐性和/或氨基酸、碳和氮含量中的改变)而言是重要的。

提供了来自欧洲油菜种类Nex710的EPSPS平行同源物A的启动子序列。该EPSPS平行同源物A的启动子基于转基因欧洲油菜愈伤组织和植物中显示的结果是双向的，且因此称为芸苔属双向组成型启动子(BBCP)。BBCP在转基因植物中的使用可提供至少一种下列优势：(a)更多基因可堆叠在向植物基因组的一轮转化中；(b)转基因可组成性地表达于所有植物组织和部分中，以及(c)新的基因可进一步以锌指介导的精确基因堆叠在靶基因座添加或交换。例如，BBCP的使用可使得可选择标记/除草剂抗性性状在一个方向表达和一个感兴趣的基因(例如，作物保护或产量增强的性状)在另一个方向表达。还提供包含于平行同源物A基因序列中的独特的转运肽以使得蛋白质靶向质体例如叶绿体。

欧洲油菜是起因于芜菁(B.rapa)(2n＝20,AA)和甘蓝(B.oleracea)(2n＝18,CC)的两个染色体组的组合的双倍体物种。因此，提供的多个EPSPS基因平行同源物可为同源或平行同源基因，取决于它们的来源是来自A或C基因组(同源的)还是作为物种形成后它们在基因组内复制的结果(平行同源的)。

提供的方法和构建体可用于在芸苔或双/单子叶植物中表达任何性状，如输入性状(例如，昆虫抗性和除草剂耐性性状)，农业性状(例如，产量增强)，输出性状(例如，健康的油)等。也提供与使用BBCP构建特定载体及其向芸苔或其他植物的转化有关的所有方法。

递送和/或转化：合适的用于植物转化的方法包括通过其可将DNA引入细胞的任何方法，例如但不限于：电穿孔(参见，例如，美国专利5,384,253)；微粒轰击(参见，例如，美国专利5,015,580、5,550,318、5,538,880、6,160,208、6,399,861和6,403,865)；土壤杆菌属介导的转化(参见，例如，美国专利5,635,055、5,824,877、5,591,616、5,981,840和6,384,301)和原生质体转化(参见，例如，美国专利5,508,184)。通过应用如上所述的技术，可稳定转化实质上任何植物物种的细胞，且这些细胞可通过本领域的技术人员已知的技术发育成转基因植物。例如，在棉转化的语境中特别有用的技术描述于美国专利5,846,797、5,159,135、5,004,863和6,624,344，用于转化芸苔属植物的技术特别描述于5,750,871；用于转化大豆的技术描述于，例如，美国专利6,384,301；而用于转化玉米的技术描述于，例如，美国专利7,060,876和5,591,616以及国际PCT公开WO 95/06722。

外源核酸至受体细胞发生递送之后，通常鉴定转化的细胞用于进一步的培养和植物再生。为了改进鉴定转化子的能力，可意欲采用可选择或可筛选的标记基因及用于生成转化子的转化载体。在这种情况下，潜在的转化细胞群体可通过将细胞暴露于选择性作用剂或作用剂来进行测定，或者可筛选细胞的合意的标记基因性状。

暴露于选择性作用剂而存活的细胞，或在筛选测定中计分阳性的细胞可在支持植物再生的培养基中培养。在一些实施方案中，任何合适的植物组织培养基(例如，MS和N6培养基)可通过包括另外的物质，如生长调节剂来修饰。组织可维持在具有生长调节剂的基础培养基上直至充分的组织可用于开始植物再生努力，或随后进行重复多轮的人工选择，直至组织的形态学适合再生(例如，至少12周)，随后转移至有益于芽苗形成的培养基。一旦形成充足的根，可将植物转移至土壤用于进一步生长和成熟。

为确认包含提供的构建体的合意的核酸分子存在于再生植物中，可实施多种测定法。这些测定法可包括：分子生物学测定法，如Southern和Northern印迹以及PCR；生化测定法，如检测蛋白质产物的存在，例如，通过免疫学手段(ELISA、Western印迹和/或LC-MS MS分光光度法)或通过酶的功能；植物部分测定法，如叶或根测定法；和/或整体再生的植物的表型的分析。

例如，可通过PCR扩增使用例如对感兴趣的核酸分子特异性的寡核苷酸引物筛选靶向的整合事件。理解PCR基因分型包括，但不限于，对源自预测包含整合至基因组的感兴趣的核酸分子的分离的宿主植物愈伤组织的基因组DNA进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，随后对PCR扩增产物进行标准克隆和序列分析。PCR基因分型的方法已充分描述(参见，例如，Rios等(2002)Plant J.32:243-53)，且可应用于来自任何植物物种或组织类型，包括细胞培养物的基因组DNA。与靶序列和引入序列两者结合的寡核苷酸引物的组合可顺序使用或在PCR扩增反应中多重化。可生成经设计以与靶位点退火的寡核苷酸引物、引入的核酸序列和/或两者的组合。因此，PCR基因分型策略可包括，例如且不限于：植物基因组中特定序列的扩增、植物基因组中多个特定序列的扩增、植物基因组中非特定序列的扩增以及任何上述的组合。本领域的技术人员可发明引物和扩增反应的额外组合来详查基因组。例如，可设计正向和反向寡核苷酸引物组以与对于在引入的核酸序列边界之外的靶物特异的核酸序列退火。

可设计正向和反向寡核苷酸引物以与引入的核酸分子特异性地退火，例如，在与其中所包含的感兴趣的核苷酸序列内的编码区对应的序列处，或核酸分子其他部分。这些引物可与上述的引物联合使用。寡核苷酸引物可根据合意的序列合成，且为商业上可得到的(例如，从Integrated DNA Technologies,Inc.,Coralville,IA)。扩增后可为克隆和测序，或为扩增产物的直接序列分析。本领域的技术人员可预期用于分析在PCR基因分型过程中生成的扩增产物的可替代的方法。在一个实施方案中，在PCR扩增中采用对于基因靶物特异的寡核苷酸引物。

虽然参考特定的方法和实施方案描述了本发明，可理解的是可进行多种修饰和改变而不背离本发明。为达到描述和公开可与本发明相关使用的组合物和方法的目的，本文引用的所有出版物通过提述并入本文。所有引用的专利、专利申请和参考的网站中的序列信息以及公共数据库也通过提述并入。

实施例

实施例1 EPSPS平行同源物A启动子(BBCP)序列的鉴定

欧洲油菜中的五个5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因序列描述于US 2009/0205083A1。在这五个基因中，EPSPS平行同源物A的启动子在多种植物组织中驱动最强的表达。为扩增1571个核苷酸EPSPS平行同源物A的序列(SEQ ID NO:7)，使用GenomeWalker^TM通用试剂盒(ClonetechLaboratories,Palo Alto,CA)经由基因组获得EPSPS平行同源物A基因的额外序列以获得EPSPS平行同源物A的全长序列(SEQ ID NO:8)，其包括它的启动子区和3’非翻译区(例如SEQ ID NO:26)。

为鉴定EPSPS平行同源物A基因的启动子序列，使用Basic LocalAlignment Search Tool(BLAST)针对多种植物和芸苔属数据库对全长序列进行搜索。鉴定了以EPSPS平行同源物A基因表达的方向比对的欧洲油菜和芜菁的六个cDNA和/或mRNA序列。这些序列的GenBank身份号(ID)为ES937178、ES904055、CD825798、CD835768、CD837464和EV121915。这些cDNA和/或mRNA序列可从靶物种的叶、根或胚胎文库中检测，但这些cDNA或mRNA的特定作用在GenBank中并无注释。有趣的是，鉴定了三种cDNA和/或mRNA，其以EPSPS平行同源物A基因表达的相反方向匹配EPSPS平行同源物A基因的5’序列。这些序列的GenBank ID为：CD836095、EV100366和EE568337。欧洲油菜cDNA和/或mRNA序列是这些序列的来源，同样在GenBank中无指派给它们的特定功能。

对这些实例的序列分析显示EPSPS平行同源物A基因的启动子序列是双向启动子，其称为芸苔属双向组成型启动子(BBCP)。

实施例2 BBCP构建体的设计和构建

使用本领域认可的方法构建标记为pDAB100333(图12)的单个双元载体。双元pDAB100333包含两组基因表达盒或植物转录单位(PTUs)。第一PTU组由驱动两报告基因的双向欧洲油菜平行同源物A启动子(BBCP)组成。BBCP的一端经构建来驱动β-葡糖醛酸糖苷酶报告基因(GUS)的表达，且通过根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)开放阅读框-24 3’非翻译区(AtuORF243’UTR)终止。BBCP的相反末端经构建以驱动绿色荧光蛋白报告基因(GFP)且用根癌土壤杆菌胭脂碱(nopaline)合酶3’非翻译区(Atu Nos 3’UTR)终止。

pDAB100333的第二PTU组包括克隆于异戊烯基转移酶编码序列(iptCDS；Genbank登录号X00639.1)内由此中断jpt编码序列的可选择标记，其中拟南芥泛素10启动子(AtUbi10启动子)用于驱动草丁膦乙酰转移酶编码序列(PAT)，且PTU通过根癌土壤杆菌开放阅读框-1 3’非翻译区(AtuORF1 3’UTR)终止。所得双元载体包含通过双向启动子和可选择标记基因(PAT)驱动的两个可视的报告基因(GUS和GFP)。

使用电穿孔将双元载体pDAB100333移动入根癌土壤杆菌。在包含抗生素壮观霉素的YEP培养基上鉴定单菌落。分离单菌落并经由限制酶消化确认pDAB100333双元载体。

还使用本领域认可的方法构建了另一双元载体pDAB100331(图12)。构建双元pDAB100331以pDAB100333的反向包含BBCP但具有与pDAB100333相同的特征。因此，双元载体pDAB100331由两组基因表达盒或植物转录单位(PTUs)组成。第一PTU组由驱动两报告基因的双向欧洲油菜平行同源物A启动子(BBCP以与pDAB100333相比反向)组成。BBCP的一端经构建以驱动绿色荧光蛋白报告基因(GFP)且用根癌土壤杆菌胭脂碱合酶3’非翻译区(Atu Nos 3’UTR)终止。BBCP的相反端经构建以驱动β-葡糖醛酸糖苷酶报告基因(GUS)的表达，且通过根癌土壤杆菌开放阅读框-24 3’非翻译区(AtuORF24 3’UTR)终止。

pDAB100331的第二PTU组还包括克隆于异戊烯基转移酶编码序列(iptCDS；Genbank登录号X00639.1)内由此中断jpt编码序列的可选择标记，其中拟南芥泛素10启动子(AtUbi10启动子)用于驱动草丁膦乙酰转移酶编码序列(PAT)，且PTU通过根癌土壤杆菌开放阅读框-1 3’非翻译区(AtuORF1 3’UTR)终止。所得双元载体包含通过双向启动子和可选择标记基因(PAT)驱动的两种可视的报告基因(GUS和GFP)。

类似地，使用电穿孔将双元载体pDAB100331移动入根癌土壤杆菌。在包含抗生素壮观霉素的YEP培养基上鉴定单个菌落。分离单菌落并经由限制酶消化确认pDAB100331双元载体的存在。

仅使用包含上述的BBCP启动子的第一PTU构建克隆入高拷贝数基于pUC的质粒的直接DNA递送载体。使用本领域认可的方法构建了质粒pDAB108710和pDAB108711(图14)。所述两载体不同因为它们经构建以相反的方向包含BBCP以驱动相同特征。单PTU由驱动两报告基因的双向欧洲油菜平行同源物A启动子组成。BBCP的一端经构建以驱动绿色荧光蛋白报告基因(GFP)且用根癌土壤杆菌胭脂碱合酶3’非翻译区(Atu Nos 3’UTR)终止。BBCP的相反端经构建以驱动β-葡糖醛酸糖苷酶报告基因(GUS)的表达，且通过根癌土壤杆菌开放阅读框-24 3’非翻译区(AtuORF24 3’UTR)终止。将直接DNA递送载体用于玉米组织的粒子轰击。

实施例3.欧洲油菜中BBCP构建体的表达

芸苔转化-下胚轴部分的制备和预处理：将良种芸苔基因型Nex710的种子用10％商业漂白剂表面灭菌10分钟并用无菌蒸馏水漂洗3次。所述种子经由无菌纸巾干燥然后置于包含由一个半(one half)浓度的MS基础培养基[Phytotech Cat# M 519(PhytoTechnology Laboratories,Shawnee Mission,KS)]、20g/L蔗糖和8g/L TC琼脂组成的“出芽培养基”的Phyta托盘中且以在设置为23℃及16小时光/8小时黑暗的光周期的生长方案下维持。

在第五天，检查芽苗的无菌性并将Phyta托盘置于层流罩内(The BakerCompany EdgeGARD)来保持无菌性。用无菌的镊子和解剖剪将植物从Phyta托盘中移出并分离和丢弃气生(分生组织和子叶)区和根。将下胚轴置于包含无菌蒸馏水(其为必需的以防止干燥)的100x25mm培养皿。横向剪切下胚轴至2mm部分，并水平放置在无菌滤纸上，覆盖于(overlay on)由MS培养基(Phytotech M519)、30g/L蔗糖、1mg/L激动素(kinetin)和用7g/L TC琼脂固化的1mg/L 2,4-D组成的“愈伤组织诱导培养基MSK1D1”上。将板置于澄清的浴盆中并在相同的生长方案下保持三天，作为预处理物。

土壤杆菌属的制备：土壤杆菌属感染的四天前，将土壤杆菌属菌株DA2552(参见，例如WO 2012/016222)中的pDAB10333和pDAB10331从甘油储备物中划线取出(streak out)并置于YEP培养基(10g/L蛋白胨,10g/L酵母提取物,5g/L NaCl,10g/L蔗糖加100mg/L壮观霉素和150mg/L红霉素并用15g/L细菌用琼脂固化)上在培养箱(Fisher Scientific Isotemp Incubator)中于28℃生长两天。两天后，土壤杆菌属的小环被置于包含150mL“液体细菌生长培养基”(与上述相同的培养基但减去固化剂)的500mL无菌一次性带挡板烧瓶。该培养物在28℃暗处在封闭的摇床(New Brunswick Scientific Innova4330冷却培养摇床(refrigerated incubator shaker))上以200rpm生长16小时。16小时后将土壤杆菌属培养物从摇床中移出并等分入50mL离心管中。将离心管置于离心机(Beckman Model J2-21离心机)并在6000rpm离心15分钟且随后重悬于由LS盐(Phytotech L689)、3％葡萄糖、修饰的Gamborg B5维生素(Phytotech G249)、215mg/L激动素和221mg/L 2,4-D在pH 5组成的的“液体培养物培养基M”中。

感染和愈伤组织诱导：在感染的当天，在等待土壤杆菌属就绪的同时将芸苔下胚轴部分转移入包含20mL的“液体培养物培养基”的100x25无菌培养皿。然后从下胚轴部分移出“液体培养物培养基”并将40mL土壤杆菌属悬浮液快速涡旋并倾入包含下胚轴部分的100x25mm培养皿进行30分钟处理。30分钟处理后，使用双排移液器(double stacked pipette)移出所有的土壤杆菌属悬浮液。将处理的下胚轴放回滤纸上，覆盖于“愈伤组织诱导培养基MSK1D1”上，将培养返回至浴盆，盖上暗色盖子并返回培养室以与上述相同的生长方案进行三天共培养期。三天的共培养期之后，将下胚轴直接置于“选择1培养基MSK1D1H1”(由“愈伤组织诱导培养基”加1mg/LHerbiace组成)，放回带有透明盖的盆并返回至培养室，保持与上文相同的生长方案。一周后，将下胚轴直接转移至“选择2培养基MSK1D1H3”(由“愈伤组织诱导培养基”加3mg/L Herbiace组成)。两周后，将下胚轴转移至“选择3培养基MSK1D1H5”(由“愈伤组织诱导培养基”加5mg/L Herbiace组成)。每两周将下胚轴部分持续转移至新鲜的选择3培养基直至在下胚轴两端形成足够的愈伤组织。然后测定所述愈伤组织的GUS。

芸苔下胚轴部分的GUS染色：GUS染色方法为本领域已知，具有GUS染色溶液具有微小改变如下：0.1M NaPO₄缓冲液在pH 8、0.5mM K₃(Fe(CN)₆、10mM Na₂EDTA、1mg/ml X-Gluc以及0.06％Triton X-100。通过70％乙醇去除来自染色组织的叶绿素。GUS测定法在下胚轴部分在选择3培养基中至少两周后完成。将愈伤组织浸入GUS染色溶液并在暗处于37℃温育过夜。未感染的组织和GUS阳性对照也常规地包括于测定法中作为阴性和阳性对照。

结果显示从pDAB100331和pDAB100333转化获得的转基因愈伤组织样品中显著的GUS表达。非转基因对照样品中无可见蓝色。因此，转基因实验结果证实了BBCP是双向启动子。

实施例4 BBCP构建体在大豆中的表达

分别用双元载体pDAB9381(不包含BBCP双向启动子的对照双元载体)、pDAB100331和pDAB100333电穿孔根癌土壤杆菌菌株EHA105。在包含抗生素壮观霉素的YEP培养基上鉴定分离的菌落。分离单菌落并经由限制酶消化来确认pDAB9381、pDAB100331和pDAB100333双元载体的存在。可根据本领域熟知的方法实施大豆(大豆Maverick栽培种(Glycine max c.v.Maverick))的土壤杆菌属介导的转化。

转化后，一旦根发育，用482nm/502nm GFP滤器覆盖的激发/发射对GFP的表达拍照生根的小植物(rooted plantlet)。根据从Jefferson,R.,(1987)“Histochemical localization of β-glucuronidase(GUS)reporter activity in planttissues”Plant Mol.Biol.Reporter,5:387-405改编的规程从小植物取样叶子用于GUS染色。然后将叶浸入染色溶液中，染色溶液包括：2X磷酸盐缓冲液pH7.0(1x由0.1M NaH₂PO₄和0.1M Na₂HPO₄制成)、0.5mM K₃(Fe(CN)₆、10mM Na₂EDTA、1mg/ml X-Gluc和0.06％Triton X-100，并在37℃温育过夜。温育后，除去染色溶液并将组织用多次更换的70％乙醇洗涤并在拍照前于乙醇中放置过夜。

对测试的外植体和转基因小植物的四轮实验结果示于表2。表2显示转基因芽苗的数目，其经确认以包含通过BBCP驱动的GFP和GUS报告基因的表达的蛋白质产物。用构建体pDAB100331和pDAB100333稳定转化的大豆转基因植物以3-14％的频率再生。大约81-99％的再生芽苗(小植物)表达GFP，而他们中的41％表达GFP和GUS两者。在用pDAB100333再生的植物中，GUS表达在整个叶中更均一且并非主要表达于中脉组织和叶脉中。与从pDAB100331再生的植物相比，GUS表达显得更定位于叶的中脉和叶脉，如对多个叶完成的研究中所观察的。用对照构建体pDAB9381转化的转基因植物不显示任何GFP或GUS表达。结果证实BBCP在两个方向以合理的水平驱动转基因表达，尽管在叶组织内的表达模式上可有较小的方向差异。

实施例5玉米叶组织的瞬时转化

组织制备：在轰击前的三至四小时收获暗处生长的叶组织并置于表3描述的轰击制备培养基上。将板包裹并在28℃在暗处保存直至准备好用于轰击。

微粒(金)制备：30毫克金(1微米尺寸，购自Bio-Rad,Hercules,CA)在500μl冷乙醇中洗涤，声处理十五秒，然后涡旋十五秒。将颗粒静置十分钟后在3000rpm离心60秒。然后弃去上清液，用冷水洗涤沉淀(用移液器尖端和/或手指涡流破坏沉淀)，然后是以3000rpm离心六十秒。此洗涤和离心步骤可再重复两次。最终漂洗后，添加250μl 50％甘油(终浓度～12mg/ml)。将样品声处理十五秒，涡旋十五秒钟，分装入Eppendorf管。

制备微载体：对于待轰击的组织的各板，金/DNA的反应制备如下：5-15μg DNA(质粒pDAB108710、pDAB108711或对照质粒DNA)、6mg金、终浓度为1M CaCl₂和16mM的亚精胺在125μl总反应体积中。声处理和涡旋后，立即将50μl金悬浮液等分试样置于每个反应管。将反应管涡旋然后添加50μl预先冷却的CaCl₂，然后再次涡旋之后添加20μl 0.1M亚精胺。然后将反应管涡旋多至十分钟，并在工作台上放置十分钟之后在5000rpm离心15秒。弃去上清并将沉淀重悬于150μl 70％乙醇。然后用移液器和/或手指涡流破坏沉淀之后在5000rpm离心15秒。然后弃去上清并将沉淀重悬于150μl乙醇。然后再次用移液器和/或手指涡流破坏沉淀之后在5000rpm离心15秒。最后，轰击实验前将沉淀重悬于36μl乙醇中(36μl每6mg金)。等分于微载体上前，将沉淀声处理十五秒并涡旋直到金呈现充分悬浮。将沉淀等分至三个微载体每个10μl。建议等分试样之间的声处理和涡流。

轰击条件：准备基于氦的微载体盘和微载体支架并在使用前高压灭菌。DNA涂覆的金颗粒(10μl充分悬浮的)置于微载体上五分钟直至干燥。为组装用于射击的微载体发射，将停止屏幕(stop screen)首先置于组装单位中。然后将微载体倒置于组装单位之后关闭组装的微载体盖，之后将新鲜的和快速漂洗的(在70％乙醇中)1350psi断裂盘置于保留帽中并附接于气体加速管。然后在关闭室门前立即将微载体组装单位置于高水平槽。轰击前在真空室中激活真空。通过按压和保持发射(fire)按钮轰击样品直至1350psi断裂盘爆裂且氦压力表降至零。可对具有相同质粒的每个盘轰击多至三次，其中可转动盘使得轰击可在板上的不同点/方向发生。轰击后，在GFP观察和/或用Sigma-Aldrich染色试剂盒进行GUS染色前在暗处在28℃将盘保存至少二十四小时。

结果：在用包含通过BBCP驱动的GUS基因的质粒轰击的叶组织中观察到GUS表达。用对照质粒的轰击的玉米叶组织未显示任何GUS表达。在用具有通过BBCP驱动的GFP基因的质粒转化的玉米叶样品中观察到GFP表达。用对照构建体轰击的玉米叶组织不显示任何GFP表达。结果证实BBCP是双向启动子，其以两个方向驱动报告基因GUS和GFP的表达。总之，可在双子叶(大豆和欧洲油菜)和单子叶(玉米)植物组织中观察到来自BBCP的双向表达。

虽然许多例示的方面和实施方案已在上文讨论，本领域的技术人员会认可一些修改、置换、添加和其亚组合。因此意欲将下面所附的权利要求和此后引入的权利要求解释为包括所有这样的修改、置换、添加和亚组合，如在其真实的精神和范围内。

Claims

1.一种用于在植物细胞和/或组织中表达多个基因的核酸构建体，其包含：

a)双向启动子，其包含与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性的核苷酸序列；以及

b)在所述双向启动子的相反末端的两个基因表达盒。

2.权利要求1的核酸构建体，其中所述双向启动子包含至少一个增强子。

3.权利要求1的核酸构建体，其中所述核酸构建体包含用于土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化的双元载体。

4.权利要求1的核酸构建体，其中所述双向启动子包含至少一个内含子。

5.权利要求1的核酸构建体，其中所述双向启动子包含至少一个5’未翻译区。

6.权利要求1的核酸构建体，其中所述双向启动子包含选自SEQ ID NO:2或3的核苷酸序列。

7.权利要求1的核酸构建体，其中所述双向启动子包含选自SEQ ID NO:1、22-25或它们的互补物的核苷酸序列。

8.权利要求1的核酸构建体，其中至少一个所述基因表达盒包含两个或更多个经由翻译开关连接的基因。

9.权利要求1的核酸构建体，其中两个基因表达盒包含两个或更多个经由翻译开关连接的基因。

10.权利要求8的核酸构建体，其中所述翻译开关选自下组：内部核糖体进入位点(IRES)、可替代的剪接位点、编码2A肽的多核苷酸序列、编码2A-样肽的多核苷酸序列、编码内蛋白的多核苷酸序列、编码蛋白酶切割位点的多核苷酸序列及其组合。

11.权利要求8的核酸构建体，其中所述翻译开关上游的基因不包含翻译终止密码子。

12.权利要求1的核酸构建体，其中所述核酸构建体使至少四个基因的表达成为可能。

13.权利要求1的核酸构建体，其中所述核酸构建体使三至二十个基因的表达成为可能。

14.权利要求13的核酸构建体，其中所述核酸构建体使四至八个基因的表达成为可能。

15.权利要求1的核酸构建体，其中所述两个基因表达盒都不包含EPSPS基因或平行同源物。

16.用于在植物细胞和/或组织中表达转基因的核酸构建体，其包含用于终止单个或多个基因在植物细胞和/或组织中的表达的调控元件，其中所述调控元件包含平行同源物A 3’非翻译区(UTR)或多A区。

17.权利要求16的核酸构建体，其中所述调控元件包含与SEQ ID NO:26或其互补物具有至少80％同一性的多核苷酸序列。

18.权利要求16的核酸构建体，其中所述调控元件包含SEQ ID NO:26或其互补物的多核苷酸序列。

19.用于生成转基因植物的方法，其包括用权利要求1的核酸构建体转化植物细胞。

20.用于生成转基因细胞的方法，其包括用权利要求1的核酸构建体转化细胞。

21.包含权利要求1的核酸构建体的植物细胞。

22.权利要求21的植物细胞，其中所述核酸构建体稳定转化入所述植物细胞。

23.包含权利要求1的核酸构建体的转基因植物或种子。

24.权利要求23的转基因植物或种子，其中所述核酸构建体稳定转化入所述转基因植物或种子的细胞。

25.权利要求23的转基因植物，其中所述转基因植物是双子叶植物。

26.权利要求23的转基因植物，其中所述转基因植物是单子叶植物。

27.用于在植物细胞和/或组织中表达多个基因的方法，其包括向所述植物细胞和/或组织中引入权利要求1所述核酸构建体。

28.权利要求27的方法，其中所述植物细胞和/或组织用权利要求1的核酸构建体稳定转化。

29.用于土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化的双元载体，其包含权利要求1所述的核酸构建体。

30.双向启动子在制造转基因植物或种子中的用途，其中所述双向启动子包含与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性的核苷酸序列。

31.一种核酸构建体，其在转基因植物细胞和/或组织中包含至少一个芸苔属(Brassica)内含子序列。

32.权利要求31的核酸构建体，其中所述芸苔属(Brassica)内含子序列选自SEQ ID NO:27-33。

33.至少一个芸苔属(Brassica)内含子序列在制造转基因植物或种子中的用途。

34.权利要求33的用途，其中所述芸苔属(Brassica)内含子序列选自SEQID NO:27-33。