JP6262217B2 - アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）二方向構成的プロモーターを使用してトランス遺伝子を発現するための構築物および方法 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は２０１２年６月７日提出の米国特許仮出願第６１／６５６，６３４号明細書の優先権を主張するものであり、前記特許文献の開示は参照によりその全体を明確に本明細書に組み込まれる。

電子的に提供される資料を参照することによる組込み
添付して同時に提供され以下の：２０１３年５月１３日作成の「７０１３６＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と名付けられた１つの７８，８３５バイトＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイルの通りに同定されるコンピュータ可読配列表は参照によりその全体を組み込まれる。

本発明は一般的には植物分子生物学の分野、さらに具体的にはトランスジェニック植物における複数の遺伝子の安定な発現の分野に関する。

多くの植物種は他の種由来のトランス遺伝子で形質転換して、農学的に望ましい形質または特徴を導入する、例えば、栄養価品質を改良する、収率を増加する、病害虫もしくは疾患抵抗性を与える、乾燥およびストレス耐性を増加する、園芸性質（例えば、色素沈着および成長）を改良する、除草剤抵抗性を分け与える、植物からの産業的に有用な化合物および／もしくは原料の生産を可能にする、ならびに／または医薬品の製造を可能にすることができる。植物細胞へのトランス遺伝子の導入およびトランス遺伝子の安定的に組み込まれたコピーを含有する繁殖性トランスジェニック植物のその後の回収を使用すれば、望ましい形質を有するトランスジェニック植物を産生することができる。

遺伝子発現の制御および調節は多数の機構を通じて起こることがある。遺伝子の転写開始は遺伝子発現の支配的な制御機構である。転写の開始は一般には転写される遺伝子の５’隣接または上流領域に位置するポリヌクレオチド配列により制御される。これらの配列は集合的にプロモーターと呼ばれ、遺伝子調節エレメントとして分類される。基礎研究と生物工学的応用の両方のためにクローニングされ広く使用されてきた植物中のプロモーターは、一般に一方向性であり、その３’末端（すなわち、下流に）に融合された１つの遺伝子のみを方向付ける。例えば、Xieら、(2001) Nat. Biotechnol. 19(7):677〜9：米国特許第６，３８８，１７０号を参照されたい。

追加の遺伝子調節エレメントには、特定のＤＮＡ結合因子と相互作用する配列が含まれる。これらの配列モチーフはシスエレメントと呼ばれることがあり、通常は位置および配向非依存性であるが、遺伝子コード配列の５’側もしくは３’側に、またはイントロン中に見出されることもある。そのようなシスエレメントは、組織特異的または発生特異的転写因子が個別にまたは組み合わせて結合するが、転写レベルでのプロモーターの時空間的発現パターンを決定しうる。これらのシスエレメントは、作動可能に連結された遺伝子に対して行使する制御の種類が広く異なる。一部のエレメントは環境応答（例えば、温度、湿度、および創傷）へ応答して作動可能に連結された遺伝子の転写を増加させるように作用する。他のシスエレメントは発生上の合図（例えば、発芽、種子成熟、および開花）または空間情報（例えば、組織特異性）に応答しうる。例えば、Langridgeら、(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3219〜23を参照されたい。

その遺伝子が同一のまたは相同なプロモーターにより制御されることが多い、代謝操作および形質スタッキングのためには植物に複数の遺伝子を導入する必要がある場合が多い。しかし、複数の導入されたトランス遺伝子がその遺伝子を駆動させる相同なプロモーターを有する場合には、相同性ベースの遺伝子サイレンシング（ＨＢＧＳ）が生じる可能性が高い。例えば、Molら、(1989) Plant Mol. Biol. 13:287〜94を参照されたい。ＨＢＧＳはトランスジェニック植物においては広範囲に起こることが報告されている。例えば、Vaucheret and Fagard (2001) Trends Genet. 17:29〜35を参照されたい。いくつかの機構がＨＢＧＳの現象を説明するために提唱されてきたが、その全てが、プロモーター中の配列相同性が反復遺伝子のサイレンシングをもたらす細胞認識機構を始動させるという特長を含む。例えば、Matzke and Matzke (1995) Plant Physiol. 107:679〜85; Meyer and Saedler (1996) Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47:23〜48; Fire (1999) Trends Genet. 15:358〜63; Hamilton and Baulcombe (1999) Science 286:950〜2; および Steimerら、(2000) Plant Cell 12:1165〜78を参照されたい。

トランスジェニック植物においてＨＢＧＳを回避する戦略は、機能的に等価であるが最小配列相同性を有する様々なプロモーターの開発を伴う場合が多い。したがって、トランスジェニック植物における育種または複数の世代を通じてトランス遺伝子の組換えまたは消失のリスクを効果的に最小限に抑えて、複数のトランス遺伝子を安定的に発現させるための構築物および方法の必要性が依然として存在する。

セイヨウアブラナ（brassica napus）由来の開示された二方向プロモーターまたはアブラナ属（Brassica）二方向構成的プロモーター（ＢＢＣＰ）を使用して植物細胞および／または植物組織において複数の遺伝子を発現するための構築物および方法が提供される。提供される構築物は、遺伝子発現カセットのそれぞれが少なくとも１つのトランス遺伝子を含む、複数の遺伝子発現カセットに連結された少なくとも１つのそのような二方向プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、提供される構築物および方法は２から２０の遺伝子の発現を可能にする。

一態様では、植物細胞および／または組織において複数の遺伝子を発現するための核酸構築物が提供される。核酸構築物は、（ａ）配列番号１に少なくとも８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む二方向プロモーター、および（ｂ）前記二方向プロモーターの両端に２つの遺伝子発現カセットを含む。

一実施形態では、二方向プロモーターは少なくとも１つのエンハンサーを含む。別の実施形態では、二方向プロモーターはエンハンサーを含まない。別の実施形態では、核酸構築物は植物形質転換のためのバイナリーベクターを含む。別の実施形態では、核酸構築物は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換のためのバイナリーベクターを含む。別の実施形態では、二方向プロモーターは少なくとも１つのイントロンを含む。別の実施形態では、二方向プロモーターは少なくとも１つの５’非翻訳領域を含む。一実施形態では、二方向プロモーターは配列番号２または３から選択されるヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、配列番号１に少なくとも８５％、９０％、９５％、または１００％同一性を有するヌクレオチド配列を含んでいる二方向プロモーター。別の実施形態では、二方向プロモーターは配列番号１、２２〜２５から選択されるヌクレオチド配列、またはその相補体を含む。追加のまたは代わりの実施形態では、二方向プロモーターは配列番号１、２２〜２４から選択されるヌクレオチド配列、またはその相補体を含む。追加のまたは代わりの実施形態では、二方向プロモーターは配列番号１、２２〜２３から選択されるヌクレオチド配列、またはその相補体を含む。追加のまたは代わりの実施形態では、二方向プロモーターは配列番号１、２２から選択されるヌクレオチド配列、またはその相補体を含む。

一実施形態では、遺伝子発現カセットのうちの少なくとも１つは、翻訳スイッチを介して連結された２つまたはそれよりも多い遺伝子を含む。別の実施形態では、両方の遺伝子発現カセットは翻訳スイッチを介して連結される２つ以上の遺伝子を含む。追加のまたは代わりの一実施形態では、翻訳スイッチは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、選択的スプライシング部位、リボザイム切断部位、２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、２Ａ様ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、インテインをコードするポリヌクレオチド配列、プロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド配列、およびそれらの組合せからなる群から選択される。追加のまたは代わりの一実施形態では、翻訳スイッチはシス作用性ヒドロラーゼエレメント（ＣＨＹＳＥＬ）を含む。追加の実施形態では、ＣＨＹＳＥＬは２Ａまたは２Ａ様ペプチド配列である。別の実施形態では、翻訳スイッチの上流の遺伝子は翻訳停止コドンを含まない。

一実施形態では、核酸構築物は少なくとも１つのトランス遺伝子を含む。別の実施形態では、核酸構築物は少なくとも４つの遺伝子の発現を可能にするまたは許容する。追加の実施形態では、４つの遺伝子全てがトランス遺伝子である。別の実施形態では、核酸構築物は３つから２０までの遺伝子の発現を可能にする。別の実施形態では、核酸構築物は４つから８つまでの遺伝子の発現を可能にする。追加のまたは代わりの一実施形態では、遺伝子はトランス遺伝子である。別の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子発現カセットは融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む。追加の実施形態では、融合タンパク質は３つから５つの遺伝子を含む。別の実施形態では、両方の遺伝子発現カセットがＥＰＳＰＳ遺伝子またはパラログを含むわけではない。

別の態様では、植物細胞および／または組織において単一のまたは複数の遺伝子の発現を終結させるのに有用な調節エレメントを含む核酸構築物が提供される。調節エレメントは、パラログＡ３’非翻訳領域（ＵＴＲ）またはトランス遺伝子の３’末端に融合させることができるポリＡ領域を含む。一実施形態では、パラログＡ３’ＵＴＲは、転写および翻訳の終結および調節に有用である機能的ポリアデニル化配列を含む。追加のまたは代わりの実施形態では、調節エレメントは配列番号２６に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一性を有するポリヌクレオチド配列、またはその相補体を含む。追加の実施形態では、調節エレメントは配列番号２６またはその相補体のポリヌクレオチド配列を含む。

別の態様では、植物細胞を本明細書に提供される核酸構築物で形質転換することを含む、トランスジェニック植物を作製するための方法が提供される。別の態様では、細胞を本明細書に提供される核酸構築物で形質転換することを含む、トランスジェニック細胞を作製するための方法が提供される。別の態様では、本明細書に提供される核酸構築物を含む植物細胞が提供される。追加のまたは代わりの一実施形態では、核酸構築物は植物細胞に安定的に形質転換される。別の態様では、本明細書に提供される核酸構築物を含むトランスジェニック植物または種子が提供される。追加のまたは代わりの一実施形態では、核酸構築物はトランスジェニック植物または種子の細胞に安定的に形質転換される。追加の実施形態では、トランスジェニック植物は双子葉植物である。別の追加の実施形態では、トランスジェニック植物は単子葉植物である。別の態様では、植物細胞および／または組織に本明細書に提供される核酸構築物を導入することを含む、植物細胞および／または組織において複数の遺伝子を発現するための方法が提供される。追加のまたは代わりの一実施形態では、植物細胞および／または組織は本明細書に提供される核酸構築物で安定的に形質転換される。別の態様では、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換のためのバイナリーベクターが提供される。バイナリーベクターは本明細書に提供される核酸構築物を含む。別の態様では、植物における複数のトランス遺伝子発現のための本明細書に提供される二方向プロモーターの使用が提供される。一実施形態では、二方向プロモーターは配列番号１に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一性を有するヌクレオチド配列を含む。別の態様では、トランスジェニック植物または種子の生産における本明細書に提供される二方向プロモーターの使用が提供される。一実施形態では、二方向プロモーターは配列番号１に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

別の態様では、トランスジェニック植物細胞および／または組織において少なくとも１つのアブラナ属（Brassica）イントロン配列を含む核酸構築物が提供される。一実施形態では、アブラナ属（Brassica）イントロン配列は配列番号２７〜３３から選択される。別の態様では、トランスジェニック植物または種子の生産において少なくとも１つのアブラナ属（Brassica）イントロン配列の使用が提供される。一実施形態では、アブラナ属（Brassica）イントロン配列は配列番号２７〜３３から選択される。

図１Ａはアブラナ属（Brassica）二方向構成的プロモーター（ＢＢＣＰ）の７３９ｎｔコア二方向プロモーターの配列（配列番号１）を示す図である。図１ＢはＢＢＣＰの改変１２２６ｎｔ配列（配列番号２）を示す図であり、制限酵素切断部位を導入するためにヌクレオチド配列「ｇｇ」が付加されている。図１Ｃは配列番号２の逆相補体である配列番号３を示す図であり、配列番号２の付加された「ｇｇ」配列は配列番号３では「ｃｃ」配列として示されている。 図２Ａはセイヨウアブラナ（brassica napus）のゲノム由来のＢＢＣＰの同定を示す図であり、ＥＰＳＰＳパラログＡ遺伝子の発現はＢＢＣＰにより推進される。ＥＰＳＰＳパラログＡ遺伝子の反対のＢＢＣＰ末端では、提唱されている未知の遺伝子も同定されている。図２Ｂは（１）提唱されている未知の遺伝子、（２）ＢＢＣＰ、および（３）ＥＰＳＰＳパラログＡ遺伝子を含む天然のゲノム配列ポリヌクレオチド配列（配列番号４）を示す図である。 図３Ａはこの提唱されている未知の遺伝子の予想されるタンパク質配列（配列番号５）をさらに示す図であり、図３Ｂは対応するコード配列（配列番号６）を示す図である。 図４ＡはＥＰＳＰＳパラログＡ遺伝子の部分的配列（配列番号７）を示す図であり、ＵＳ２００９／０２０５０８３の配列番号１０と同じである。図４ＢはＥＰＳＰＳパラログＡ遺伝子の全配列を示す図である。図４ＣはＥＰＳＰＳパラログＡのタンパク質配列（配列番号９）をさらに示す図であり、図４ＤはＥＰＳＰＳパラログＡの対応するコード配列（配列番号１０）を示す図である。 図５ＡはＥＰＳＰＳパラログＢ遺伝子の配列（配列番号１１）を示す図であり、ＵＳ２００９／０２０５０８３の配列番号１１と同じである。図５ＢはＥＰＳＰＳパラログＢのタンパク質配列（配列番号１２）をさらに示す図であり、図５ＣはＥＰＳＰＳパラログＢの対応するコード配列（配列番号１３）を示す図である。 図６ＡはＥＰＳＰＳパラログＣ遺伝子の配列（配列番号１４）を示す図であり、ＵＳ２００９／０２０５０８３の配列番号１２と同じである。図６ＢはＥＰＳＰＳパラログＣのタンパク質配列（配列番号１５）をさらに示す図であり、図６ＣはＥＰＳＰＳパラログＣの対応するコード配列（配列番号１６）を示す図である。 図７ＡはＥＰＳＰＳパラログＥ遺伝子の配列（配列番号１７）を示す図であり、ＵＳ２００９／０２０５０８３の配列番号１４と同じである。図７ＢはＥＰＳＰＳパラログＥのタンパク質配列（配列番号１８）をさらに示す図であり、図７ＣはＥＰＳＰＳパラログＣの対応するコード配列（配列番号１９）を示す図である。 図８はＥＰＳＰＳパラログＡ（配列番号９）、ＥＰＳＰＳパラログＢ（配列番号１２）、ＥＰＳＰＳパラログＣ（配列番号１５）、およびＥＰＳＰＳパラログＥ（配列番号１８）のタンパク質配列間の例となる配列アライメントを示す図である。 図９はＢＢＣＰの反対の末端にＧＵＳおよびＧＦＰの遺伝子発現カセットを含むｐＤＡＢ１００３３１由来の例となる配列（配列番号２０）を示す図である。ＧＵＳとＧＦＰの両方の発現はＢＢＣＰにより推進される。 図１０はＢＢＣＰの反対の末端にＧＵＳおよびＧＦＰの遺伝子発現カセットを含むｐＤＡＢ１００３３３由来の例となる配列（配列番号２１）を示す図である。ＧＵＳとＧＦＰの両方の発現はＢＢＣＰにより推進される。 図１１は、配列番号２２〜２５を含む、代わりのＢＢＣＰ配列を示す図である。 図１５はプラスミドｐＤＡＢ１００３３１およびｐＤＡＢ１００３３３の代表的マップを示している。 図１６はプラスミドｐＤＡＢ１０８７１０およびｐＤＡＢ１０８７１１の代表的マップを示している。 図１４は例となるＥＰＳＰＳパラログＡ３’ＵＴＲ遺伝子配列（配列番号２６）および７つのパラログＡイントロン配列（配列番号２７〜３３）を示す図である。

トランスジェニック産物の開発はますます複雑になっており、単一遺伝子座に複数のトランス遺伝子をスタッキングする必要がある。伝統的に、それぞれのトランス遺伝子は通常、発現のための独自のプロモーターが必要であり、したがって、１つの遺伝子スタック内で異なるトランス遺伝子を発現するには複数のプロモーターが必要である。このせいで、遺伝子スタックのサイズが増えることに加えて、同じプロモーターを繰り返し使用して、単一の多遺伝子形質の発現のための異なるトランス遺伝子の類似するレベルの発現パターンを得る場合が多くなる。同じプロモーターにより駆動される多重遺伝子構築物は、遺伝子サイレンシングを引き起こし、したがってトランスジェニック産物のフィールドでの効果が低くなることが知られている。プロモーター繰り返しに起因する過剰な転写因子（ＴＦ）結合部位は内在性ＴＦを枯渇させ、転写不活性化をもたらすことがある。トランス遺伝子のサイレンシングは、トランス遺伝子を発現するために作製されたトランスジェニック植物の性能におそらく望ましくない影響を与えることになる。トランス遺伝子内の反復配列は、遺伝子座内相同組換えをもたらし、ポリヌクレオチド再配置を生じることがある。

植物においてトランス遺伝子を発現させるアブラナ属（Brassica）二方向構成的プロモーター（ＢＢＣＰ）を使用する方法および構築物が提供される。また、二方向プロモーター系を、プロモーターのどちらか１つのまたは両方の末端で遺伝子のバイシストロン性組織と、例えば、トーセア・アシグナ（Thosea asigna）ウイルス由来の２Ａ配列の使用と組み合わせる方法および構築物も提供される。２Ａタンパク質は、わずか１６〜２０アミノ酸長であるが、ポリタンパク質をそれ自体のカルボキシ末端で切断する。２Ａまたは２Ａ様ペプチドの「自己切断」または「リボソームスキップ」特性を使用して、トランスジェニック植物において産生される人工的ポリタンパク質を加工することができる。一実施形態では、Ｃｒｙ３４とＣｒｙ３５遺伝子は１つの遺伝子発現カセットに融合され、そこではＧＦＰ（またはＹＦＰ、またはＰｈｉＹＦＰ）とＡＡＤ１遺伝子はもう１つの遺伝子発現カセットに融合されている（２Ａタンパク質遺伝子のコピーがそれぞれの組合せの２つの遺伝子間に置かれている単一オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する）。例えば、これらの遺伝子発現カセット（または遺伝子対）のそれぞれは二方向プロモーターのどちらかの末端に置かれ、単一のプロモーターを使用して４つのトランス遺伝子を駆動させることができる。したがって、本明細書に提供される構築物および方法は、同じプロモーターを繰り返して使用することを回避し商業的構築物のサイズを著しく減少させるのに有用である。さらに、４つ以上の遺伝子を１つのプロモーターで駆動させれば、単一の多遺伝子形質を制御する遺伝子を同時発現させる能力も与えられる。

開示されているある特定の略字は表１に収載されている。

基礎研究または生物工学的応用のために使用される植物プロモーターは、一般に一方向性であり、その３’末端（下流）に融合されている１つの遺伝子のみに指令を与える。代謝工学および形質スタッキングのために植物に複数の遺伝子を導入することが必要であることが多く、したがって、複数の遺伝子の発現を駆動させるためには複数のプロモーターが典型的には将来のトランスジェニック作物に必要となる。配置されるプロモーターの数を節約し遺伝子スタッキングのための同時共調節発現を可能にすることができる戦略を設計するのが望ましい。ある実施形態では、提供される二方向プロモーターは、ＲＮＡｉ、人工ｍｉＲＮＡ、またはヘアピンループＲＮＡ配列を含む、複数の転写単位の転写を駆動させることができる。

本明細書で使用されるように、冠詞「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈がはっきりと明確に他の方法で指示していなければ、複数の参照を含む。

本明細書で使用されるように、語句「戻し交配」とは、育種家が雑種子孫を親のうちの一方、例えば、Ｆ１雑種の親遺伝子型のうちの１つを有する第１世代雑種Ｆ１と再び交雑させる工程のことである。

本明細書で使用されるように、語句「イントロン」とは、転写されるが翻訳はされない遺伝子（または対象の発現されたヌクレオチド配列）に含まれる任意の核酸配列のことである。イントロンには、ＤＮＡの発現された配列内の非翻訳核酸配列、ならびにそこから転写されるＲＮＡ分子中の対応する配列が含まれる。

提供される構築物は翻訳および／またはｍＲＮＡ安定性を増強するイントロンなどの配列も含有することが可能である。１つのそのようなイントロンの例は、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のヒストンＨ３．ＩＩＩバリアントの遺伝子ＩＩの第一イントロンまたは他の任意の一般に知られているイントロン配列である。Chaubetら、 Journal of Molecular Biology, 225:569〜574 (1992)。イントロンはプロモーター配列と組み合わせて使用して翻訳および／またはｍＲＮＡ安定性を増強することができることは当技術分野では公知である。

本明細書で使用されるように、語句「５’非翻訳領域」または「５’ＵＴＲ」とはプレｍＲＮＡまたは成熟ｍＲＮＡの５’終端における非翻訳セグメントのことである。例えば、成熟ｍＲＮＡ上では、５’ＵＴＲは典型的にはその５’末端で７−メチルグアノシンキャップを抱えており、スプライシング、ポリアデニル化、細胞質へのｍＲＮＡ核外輸送、翻訳機械によるｍＲＮＡの５’末端の識別および分解からのｍＲＮＡの保護などの多くのプロセスに関与している。

本明細書で使用されるように、語句「３’非翻訳領域」または「３’ＵＴＲ」とはプレｍＲＮＡまたは成熟ｍＲＮＡの３’終端における非翻訳セグメントのことである。例えば、成熟ｍＲＮＡ上では、この領域はポリ（Ａ）テイルを抱えており、ｍＲＮＡ安定性、翻訳開始、ｍＲＮＡ核外輸送に多くの役割を有することが知られている。

本明細書で使用されるように、語句「ポリアデニル化シグナル」とは、転写物が、ポリ（Ａ）ポリメラーゼの存在下にある場合、例えば、ポリ（Ａ）シグナルの１０から３０塩基下流に位置するポリアデニル化部位上でポリアデニル化されるのを可能にするｍＲＮＡ転写物に存在する核酸配列のことである。多くのポリアデニル化シグナルが当技術分野では知られており、本発明に有用である。例には、ヒトバリアント成長ホルモンポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナルおよびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルが含まれる。

本明細書で使用されるように、語句「単離された」とは、構成成分内に化学的または機能的変化をもたらしつつ（例えば、核酸は、染色体内でこの核酸を残りのＤＮＡに連結している化学結合を切断することにより染色体から単離されることもある）、構成成分が天然に存在している生物の細胞内の他の生物学的構成成分（すなわち、他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにタンパク質）から実質的に分離されている、これとは別に産生された、またはこれから精製分離されている生物学的構成成分（核酸またはタンパク質を含む）のことである。「単離」された核酸分子およびタンパク質には、標準精製法により精製された核酸分子およびタンパク質が含まれる。語句「単離された」は、宿主細胞において組換え発現により調製された核酸およびタンパク質、ならびに化学的に合成された核酸分子、タンパク質、およびペプチドも包含する。

本明細書で使用されるように、語句「遺伝子発現」とは、核酸転写単位のコードされた情報（例えば、ゲノムＤＮＡを含む）が、タンパク質の合成を含むことが多い、細胞の操作的、非操作的、または構造的部分に変換される過程のことである。遺伝子発現は、外部シグナル、例えば、遺伝子発現を増加させるまたは減少させる作用因子への細胞、組織、または生物の曝露により影響を受けることがある。遺伝子の発現は、ＤＮＡからＲＮＡそしてタンパク質への経路における任意の場所でも調節されることがある。遺伝子発現の調節は、例えば、転写、翻訳、ＲＮＡ輸送およびプロセシング、ｍＲＮＡなどの中間分子の分解に作用する制御を通して、または産生された後の特定のタンパク質分子の活性化、不活性化、区分化、もしくは分解を通して、またはそれらの組合せにより起こる。遺伝子発現は、限定せずに、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、ウェスタンブロット、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｓｉｔｕもしくはｉｎ ｖｉｖｏタンパク質活性アッセイ（複数可）を含む、当技術分野で公知のどんな方法によってもＲＮＡレベル、またはタンパク質レベルで測定することが可能である。

本明細書で使用されるように、語句「相同性ベースの遺伝子サイレンシング」（ＨＢＧＳ）とは、転写遺伝子サイレンシングと転写後遺伝子サイレンシングの両方を含む総称のことである。非連結サイレンシング遺伝子座による標的遺伝子座のサイレンシングは、プロモーターまたは転写された配列に対応する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の産生のせいでそれぞれ転写阻害（転写遺伝子サイレンシング；ＴＧＳ）またはｍＲＮＡ分解（転写後遺伝子サイレンシング；ＰＴＧＳ）に起因することがある。それぞれの過程への異なる細胞構成成分の関与は、ｄｓＲＮＡ誘導ＴＧＳおよびＰＴＧＳがおそらく古代の共通な機構の多様化に起因することを示唆している。しかし、ＴＧＳとＰＴＧＳを厳密に比較するのは、その比較が一般に異なるサイレンシング遺伝子座の解析に依拠しているために困難であった。単一トランス遺伝子座は、異なる標的遺伝子のプロモーターと転写された配列に対応するｄｓＲＮＡの産生のせいで、ＴＧＳとＰＴＧＳの両方を始動させると説明することができる。例えば、Mourrainら、(2007) Planta 225:365〜79を参照されたい。ｓｉＲＮＡは相同な配列上でＴＧＳとＰＴＧＳを始動させる実際の分子である可能性が高く、ｓｉＲＮＡはこのモデルでは、トランス遺伝子配列のメチル化を内在性プロモーター内に広げることを通じて相同な配列のサイレンシングおよびメチル化をシスでおよびトランスで始動させると考えられる。

本明細書で使用されるように、語句「核酸分子」（または「核酸」または「ポリヌクレオチド」）とは、ヌクレオチドのポリマー形態のことであり、これにはＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成形態のセンス鎖とアンチセンス鎖の両方ならびに上記の混合ポリマーを含みうる。ヌクレオチドとは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはどちらかの種類のヌクレオチドの改変された形態のことでもよい。本明細書で使用される「核酸分子」は「核酸」および「ポリヌクレオチド」と同義である。核酸分子は通常、他の方法で指定されなければ、少なくとも１０塩基長である。この用語は未定長のＲＮＡまたはＤＮＡの分子のことでもよい。この用語には一本鎖形態および二本鎖形態のＤＮＡを含む。核酸分子は、天然に存在するおよび／または天然には存在しないヌクレオチド連鎖により互いに連結された天然に存在するおよび改変されたヌクレオチドのどちらかまたは両方を含んでいてもよい。

核酸分子は、当業者により容易に認識されるように、化学的に改変されても生化学的に改変されてもよく、または非天然もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含有していてもよい。そのような改変には、例えば、標識、メチル化、天然に存在するヌクレオチドのうちの１つまたは複数の類似体との置換、ヌクレオチド間改変（例えば、無電荷連鎖、例えば、メチルホスホン酸、リン酸トリエステル、ホスホロアミド酸、カルバミン酸、等；電荷連鎖、例えば、ホスホロチオエート、ジチオリン酸、等；ペンダント部分、例えば、ペプチド；介入物、例えば、アクリジン、ソラレン、等；キレート剤；アルキル化剤；および改変連鎖、例えば、アルファアノマー核酸、等）が含まれる。用語「核酸分子」には、一本鎖、二本鎖、部分的二重鎖、三重鎖、ヘアピン、環状、および錠かけ型の立体構造を含む、任意のトポロジー立体構造も含まれる。

転写はＤＮＡ鎖に沿って５’から３’への様式で進む。これにより、ＲＮＡは伸長している鎖の３’末端へのリボヌクレオチド−５’−三リン酸の連続付加（ピロリン酸の不可欠な除去と共に）により作られる。線形または環状核酸分子どちらでも、別々のエレメント（例えば、特定のヌクレオチド配列）は、そのエレメントから５’方向の同じ核酸に結合しているまたは結合することになるのであれば、追加のエレメントに対して「上流」にあると呼んでもよい。同様に、別々のエレメントは、そのエレメントから３’方向の同じ核酸に結合しているまたは結合することになるのであれば、追加のエレメントに対して「下流」にあることになりうる。

本明細書で使用されるように、語句「塩基位置」とは、指定された核酸内の所与の塩基またはヌクレオチド残基の位置のことである。指定された核酸は、基準核酸とのアライメント（下参照）により定義してもよい。

本明細書で使用されるように、語句「ハイブリダイゼーション」とは、オリゴヌクレオチドとその類似体が水素結合によりハイブリダイズする過程のことであり、水素結合には相補的塩基間のワトソン−クリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン水素結合が含まれる。一般に、核酸分子は、ピリミジン（シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）、およびチミン（Ｔ））またはプリン（アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ））のどちらかである窒素塩基からなる。これらの窒素塩基はピリミジンとプリン間で水素結合を形成し、プリンへのピリミジンの結合は「塩基対合」と呼ばれる。さらに具体的には、ＡはＴまたはＵと水素結合し、ＧはＣと結合する。「相補的」とは、２つの異なる核酸配列または同じ核酸配列の２つの異なる領域間で起こる塩基対合のことである。

本明細書で使用されるように、語句「特異的にハイブリダイズ可能な」および「特異的に相補的な」とは、オリゴヌクレオチドとＤＮＡまたはＲＮＡ標的の間で安定で特異的な結合が生じるのに十分な程度の相補性のことである。特異的にハイブリダイズ可能であるためにはオリゴヌクレオチドはその標的配列と１００％相補的である必要はない。標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子へのオリゴヌクレオチドの結合が標的ＤＮＡまたはＲＮＡの正常な機能を妨害し、特異的結合が望ましい条件下で、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイまたは系の場合の生理的条件下で非標的配列へのオリゴヌクレオチドの非特異的結合を避けるのに十分な程度の相補性が存在するとき、オリゴヌクレオチドは特異的にハイブリダイズ可能である。そのような結合は特異的ハイブリダイゼーションと呼ばれる。

特定の程度の厳密性を生じるハイブリダイゼーション条件は、選択されたハイブリダイゼーション法の性質ならびにハイブリダイズする核酸配列の組成および長さに応じて変化することになる。一般に、ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーションバッファーのイオン強度（特に、Ｎａ＋および／またはＭｇ２＋濃度）はハイブリダイゼーションの厳密性に寄与するが、洗浄時間も厳密性に影響を与える。特定の程度の厳密性を達成するのに必要なハイブリダイゼーション条件に関する計算は、Sambrookら、（ed.）、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、2nd ed.、vol. 1〜3、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York、1989、chs. 9 and 11で考察されている。

本明細書で使用されるように、語句「厳密な条件」は、ハイブリダイゼーション分子とＤＮＡ標的の間のミスマッチが５０％未満である場合にのみハイブリダイゼーションが起こる条件を包含する。「厳密な条件」には、さらに特定のレベルの厳密性が含まれる。したがって、本明細書で使用されるように、「中程度の厳密性」条件とは、５０％を超える配列ミスマッチを有する分子ではハイブリダイズしない条件であり、「高厳密性」の条件とは、２０％を超えるミスマッチを有する配列ではハイブリダイズしない条件であり、「超高厳密性」の条件とは、１０％を超えるミスマッチを有する配列ではハイブリダイズしない条件である。

特定の実施形態では、厳密な条件は、６５℃でのハイブリダイゼーション、続いて０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳを用いた６５℃での４０分間の洗浄を含むことができる。

以下は代表的、非限定的ハイブリダイゼーション条件である。
超高厳密性：５×ＳＳＣバッファー中６５℃で１６時間のハイブリダイゼーション；２×ＳＳＣバッファー中室温でそれぞれ１５分間の洗浄２回；および０．５×ＳＳＣバッファー中６５℃でそれぞれ２０分間の洗浄を２回。
高厳密性：５〜６×ＳＳＣバッファー中６５〜７０℃で１６〜２０時間のハイブリダイゼーション；２×ＳＳＣバッファー中室温でそれぞれ５〜２０分間の洗浄２回；および１×ＳＳＣバッファー中５５〜７０℃でそれぞれ３０分間の洗浄を２回。
中程度厳密性：６×ＳＳＣバッファー中室温から５５℃で１６〜２０時間のハイブリダイゼーション；２×〜３×ＳＳＣバッファー中室温から５５℃でそれぞれ２０〜３０分間の洗浄を少なくとも２回。

特定の実施形態では、特異的にハイブリダイズ可能な核酸分子は、超高厳密性ハイブリダイゼーション条件下で結合したままでいることができる。これらのおよび追加の実施形態では、特異的にハイブリダイズ可能な核酸分子は、高厳密性ハイブリダイゼーション条件下で結合したままでいることができる。これらのおよび追加の実施形態では、特異的にハイブリダイズ可能な核酸分子は、中程度厳密性ハイブリダイゼーション条件下で結合したままでいることができる。

本明細書で使用されるように、語句「オリゴヌクレオチド」とは、短い核酸ポリマーのことである。オリゴヌクレオチドは、さらに長い核酸セグメントを切断することによりまたは個々のヌクレオチド前駆体を重合することにより形成しうる。自動合成装置を使用すれば、最大数百塩基対長のオリゴヌクレオチドの合成が可能になる。オリゴヌクレオチドは相補的ヌクレオチド配列に結合することができるので、ＤＮＡまたはＲＮＡを検出するためのプローブとして使用しうる。ＤＮＡで構成されているオリゴヌクレオチド（オリゴデオキシリボヌクレオチド）は、小ＤＮＡ配列の増幅のための技法であるＰＣＲにおいて使用しうる。ＰＣＲでは、オリゴヌクレオチドは典型的には「プライマー」と呼ばれ、これによりＤＮＡポリメラーゼはオリゴヌクレオチドを伸長して相補鎖を複製することができる。

本明細書で使用されるように、語句「配列同一性」または「同一性」とは、２つの核酸またはポリペプチド配列が、特定された比較窓にわたって最大一致に整列された場合と同じである２つの配列中の残基を指しうるコンテキストのことである。

本明細書で使用されるように、語句「配列同一性の百分率」とは、比較窓にわたって２つの最適に整列された配列（例えば、核酸配列およびアミノ酸配列）を比較することにより決定される値のことであり、比較窓内の配列の一部は、２つの配列の最適アライメントの基準配列（付加も欠失も含まない）と比べた場合、付加または欠失（例えば、ギャップ）を含んでいてもよい。百分率は、同一ヌクレオチドまたはアミノ酸残基が両方の配列中に存在する位置の数を決定して適合した位置の数を得て、適合した位置の数を比較窓内の位置の総数で割り、この結果に１００を掛けることにより計算されて配列同一性の百分率が得られる。

比較のために配列を整列させる方法は当技術分野では周知である。様々なプログラムおよびアライメントアルゴリズムが、例えば、Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444; Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237〜44; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151〜3; Corpetら、(1988) Nucleic Acids Res. 16:10881〜90; Huangら、(1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155〜65; Pearsonら、(1994) Methods Mol. Biol. 24:307〜31; Tatianaら、(1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247〜50に記載されている。配列アライメント法および相同性計算の詳細な検討は、例えば、Altschulら、(1990) J. Mol. Biol. 215:403〜10に見ることができる。

国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）Basic Local Alignment Search Tool (BLAST（商標）;Altschulら、(1990)）は、いくつかの配列解析プログラムに関連して使用するための、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）、およびインターネット上を含むいくつかの供給源から入手可能である。このプログラムを使用して配列同一性を決定する方法の記載は、インターネット上のＢＬＡＳＴ（商標）についての「ヘルプ」セクションで入手可能である。核酸配列の比較では、ＢＬＡＳＴ（商標）（Ｂｌａｓｔｎ）プログラムの「Ｂｌａｓｔ２配列」機能はデフォルトパラメータを使用して用いてもよい。基準配列にはるかに大きな類似性を有する核酸配列であれば、この方法により評価される場合、百分率同一性の増加を示すことになる。

本明細書で使用されるように、語句「作動可能に連結された」とは、第一の核酸配列が第二の核酸配列と機能的な関係にある場合、第一の核酸配列は第二の核酸配列に作動可能に連結しているコンテキストのことである。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を与える場合、プロモーターはコード配列に作動可能に連結している。組換え的に産生される場合、作動可能に連結された核酸配列は一般に連続しており、２つのタンパク質コード領域を結合させる必要がある場合は、同じリーディングフレーム内にある。しかし、エレメントは作動可能に連結されるのに近接している必要はない。

本明細書で使用されるように、語句「プロモーター」とは、一般に上流に（遺伝子の５’領域の方に）位置しているＤＮＡの領域であって、転写に必要な領域のことである。プロモーターは、それが制御している遺伝子の適切な活性化または抑圧を可能にしてもよい。プロモーターは転写因子により認識される特定の配列を含有しうる。これらの因子はプロモーターＤＮＡ配列に結合して、遺伝子のコード領域からＲＮＡを合成する酵素である、ＲＮＡポリメラーゼを動員することができる。

本明細書で使用されるように、語句「形質転換する」または「形質導入する」とは、ウイルスまたはベクターが核酸分子を細胞内に移す過程のことである。核酸分子を細胞ゲノムに取り込むことによりまたはエピソーム複製によりのいずれかで、細胞により核酸分子が安定的に複製される場合、細胞は、細胞内に「形質導入された」核酸分子により「形質転換」される。本明細書で使用されるように、用語「形質転換」は、核酸分子をそのような細胞内に導入することができる全ての技法を包含する。例には、ウイルスベクターを用いたトランスフェクション；プラスミドベクターを用いた形質転換；エレクトロポレーション（Frommら、(1986) Nature 319:791〜3）；リポフェクション（Felgnerら、(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413〜7）；マイクロインジェクション（Muellerら、(1978) Cell 15:579〜85）；アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介移入（Fraleyら、(1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803〜7）；直接ＤＮＡ取り込み；ウィスカー媒介形質転換；および微粒子銃（Kleinら、(1987) Nature 327:70）が含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用されるように、語句「トランス遺伝子」とは、外来性核酸配列のことである。一例では、トランス遺伝子は遺伝子配列（例えば、除草剤耐性遺伝子）、産業的にまたは薬剤的に有用な化合物をコードする遺伝子、または望ましい農業上の形質をコードする遺伝子である。さらに別の例では、トランス遺伝子は、その発現により標的核酸配列の発現が阻害されるアンチセンス核酸配列である。トランス遺伝子は、それに作動可能に連結している調節配列（例えば、プロモーター）を含有していてもよい。いくつかの実施形態では、対象の核酸配列はトランス遺伝子である。しかし、他の実施形態では、対象の核酸配列は、その追加のゲノムコピーが望ましい内在性核酸配列、または宿主生物における標的核酸分子の配列に関してアンチセンス配向である核酸配列である。

本明細書で使用されるように、語句「ベクター」とは、細胞に導入され、それにより形質転換細胞を作製する核酸分子のことである。ベクターは、複製起点などの、ベクターが宿主細胞内で複製することを可能にする核酸配列を含みうる。例には、プラスミド、コスミド、バクテリオファージ、または外来性ＤＮＡを細胞内に運ぶウイルスが含まれるが、これらに限定されない。ベクターは、１つもしくは複数の遺伝子、アンチセンス分子、および／または選択可能マーカー遺伝子ならびに当技術分野で公知の他の遺伝要素も含むことができる。ベクターは、細胞を形質導入する、形質転換する、または感染させ、それにより細胞に核酸分子および／またはベクターにコードされたタンパク質を発現させうる。ベクターは、場合によって、核酸分子の細胞内への進入を達成するのに役立つ物質（例えば、リポソーム）を含みうる。

本明細書で使用されるように、語句「植物」には、植物細胞ならびに葉、茎、根、花、花粉、および種子などの植物組織を含むがこれらに限定されない植物および植物部分が含まれる。本発明で使用することができる植物の種類は一般に、被子植物（単子葉および双子葉植物）、裸子植物、シダ類および多細胞藻類を含む、変異誘発を受け入れられる高等および下等植物の種類と同じくらい幅広い。したがって、「植物」には双子葉植物および単子葉植物が含まれる。双子葉植物の例には、タバコ、シロイズナズナ（Arabidopsis）、ダイズ、トマト、パパイア、キャノーラ、ヒマワリ、ワタ、アルファルファ、ジャガイモ、ブドウ、キマメ、エンドウマメ、アブラナ属（Brassica）、ヒヨコマメ、サトウダイコン、ナタネ、スイカ、メロン、コショウ、ピーナッツ、カボチャ（pumpkin）、ダイコン、ホウレンソウ、カボチャ（squash）、ブロッコリー、キャベツ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、ハクサイ、キュウリ、ナスおよびレタスが含まれる。単子葉植物の例には、トウモロコシ、イネ、コムギ、サトウキビ、オオムギ、ライムギ、モロコシ、ラン、タケ、バナナ、ガマ、ユリ、カラスムギ、タマネギ、アワ、およびライコムギが含まれる。

本明細書で使用されるように、語句「植物物質」とは、葉、茎、根、花もしくは花部、果実、花粉、卵細胞、接合体、種子、挿し木、細胞もしくは組織培養物、または植物の他の任意の部分もしくは産物のことである。ある実施形態では、植物物質には子葉および葉が含まれる。

本明細書で使用されるように、語句「翻訳スイッチ」とは、すぐ下流の遺伝子の翻訳を可能にする遺伝子末端の機構のことである。翻訳スイッチの機構は、核酸レベルで（例えば、ウイルスもしくは真核生物配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、選択的スプライシング部位、またはリボザイム切断部位）またはペプチド／タンパク質レベルで（例えば、２Ａペプチド、２Ａ様ペプチド、インテインペプチド、またはプロテアーゼ切断部位）機能することができる。

核酸レベルでのまたはペプチド／タンパク質レベルでの翻訳スイッチのこれらの機構は当技術分野では周知である。例えば、li, Z., H. M. Schumacherら、(2010) J Biotechnol 145(1): 9〜16; Chen, Y., K. Perumalら、(2000) Gene Expr 9(3): 133〜143; Dinkova, T. D., H. Zepedaら、(2005) Plant J 41(5): 722〜731; Dorokhov, Y. L., M. V. Skulachevら、(2002) Proc Natl Acad Sci U S A 99(8): 5301〜5306; Fernandez-Miragall, O. and C. Hernandez (2011) PLoS One 6(7): e22617; Groppelli, E., G. J. Belshamら、(2007) J Gen Virol 88(Pt 5): 1583〜1588; Ha, S. H., Y. S. Liangら、(2010) Plant Biotechnol J 8(8): 928〜938; Karetnikov, A. and K. Lehto (2007) J Gen Virol 88(Pt 1): 286〜297; Karetnikov, A. and K. Lehto (2008) Virology 371(2): 292〜308; Khan, M. A., H. Yumakら、(2009) J Biol Chem 284(51): 35461〜35470; and Koh, D. C., S. M. Wongら、(2003) J Biol Chem 278(23): 20565〜20573を参照されたい。前記文献の内容は本明細書によりその全体を参照によって組込まれている。改変されたインテインを含有する多重遺伝子発現構築物は、米国特許第７，０２６，５２６号および米国特許第７，７４１，５３０号ならびに米国特許出願公開第２００８／０１１５２４３号に開示されている。前記文献の内容は本明細書によりその全体を参照によって組込まれている。

本明細書で使用されるように、語句「選択可能マーカー」または「選択可能マーカー遺伝子」とは、例えば、植物細胞を選択剤から保護するまたは選択剤に対する抵抗性／耐性を与えるために、場合によって植物形質転換において使用される遺伝子のことである。機能的選択可能マーカーを受け入れる細胞または植物のみが、選択剤を有する条件下で分裂または増殖することができる。選択剤の例は、例えば、スペクチノマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、パロモマイシン、ゲンタマイシン、およびハイグロマイシンを含む抗生物質を含むことができる。これらの選択可能マーカーには、抗生物質カナマイシンに対する抵抗性を与える酵素を発現するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔＩＩ）の遺伝子、ならびに関連抗生物質ネオマイシン、パロモマイシン、ゲンタマイシン、およびＧ４１８の遺伝子、またはハイグロマイシンに対する抵抗性を与える酵素を発現するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ）の遺伝子が含まれる。他の選択可能マーカー遺伝子は、Ｂａｒ（ＢＡＳＴＡ（登録商標）（グルホシネートアンモニウム）、またはホスフィノトリシン（ＰＰＴ）に対する抵抗性）、アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ、分岐鎖アミノ酸の合成の第１ステップを妨げるスルホニル尿素（ＳＵ）、イミダゾリノン（ＩＭＩ）、トリアゾロピリミジン（ＴＰ）、ピリミジニルオキシベンゾエート（ＰＯＢ）、およびスルホニルアミノカルボニルトリアゾリノンなどの阻害剤に対する抵抗性）、グリホサート、２，４−Ｄを含む除草剤抵抗性、および金属抵抗性または感受性をコードする遺伝子を含むことができる。語句「マーカー陽性」とは、選択可能マーカー遺伝子を含むように形質転換された植物のことである。

様々な選択可能なまたは検出可能なマーカーを選ばれた発現ベクター中に取り込ませて、形質転換された植物、または形質転換体の同定および選択を可能にすることができる。例えば、ＤＮＡ塩基配列決定およびＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、サザンブロッティング、ＲＮＡブロッティング、ベクターから発現されたタンパク質、例えば、ホスフィノトリシン抵抗性を媒介する沈降タンパク質、またはレポーター遺伝子β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＤｓＲｅｄ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アルカリホスファターゼ、および同類の物などの他のタンパク質を検出するための免疫学的方法を含む、形質転換植物における選択マーカーの発現を確認するための多くの方法が利用可能である（Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Third Edition、Cold Spring Harbor Press、N.Y.、2001参照、前記文献の内容は本明細書によりその全体を参照によって組込まれている）。

選択可能マーカー遺伝子は形質転換細胞または組織の選択のために利用される。選択可能マーカー遺伝子には、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）およびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）をコードする遺伝子などの抗生物質抵抗性をコードする遺伝子、ならびに除草剤化合物に対する抵抗性を与える遺伝子が含まれる。除草剤抵抗性遺伝子は一般に、除草剤に非感受性の改変された標的タンパク質または除草剤が機能することができる前に植物中で除草剤を分解するもしくは解毒する酵素をコードしている。例えば、グリホサートに対する抵抗性は、変異体標的酵素、５−エノールピルビルシキミ酸−３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）をコードする遺伝子を使用することにより獲得されてきた。ＥＰＳＰＳの遺伝子および変異体は、米国特許第４，９４０，８３５号、米国特許第５，１８８，６４２号、米国特許第５，３１０，６６７号、米国特許第５，６３３，４３５号、米国特許第５，６３３，４４８号、および米国特許第６，５６６，５８７号に開示されている。前記文献の内容は本明細書によりその全体を参照によって組込まれている。グルホシネートアンモニウム、ブロモキシニル、および２，４−ジクロロフェノキシアセテート（２，４−Ｄ）に対する抵抗性は、それぞれの除草剤を解毒するホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ、ニトリラーゼ、または２，４−ジクロロフェノキシアセテートモノオキシゲナーゼをコードする細菌遺伝子を使用することにより獲得されてきた。グルホシネート抵抗性／耐性のための酵素／遺伝子は、米国特許第５，２７３，８９４号、米国特許第５，２７６，２６８号、米国特許第５，５５０，３１８号、および米国特許第５，５６１，２３６号に開示されている。前記文献の内容は本明細書によりその全体を参照によって組込まれている。２，４−Ｄ抵抗性のための酵素／遺伝子は、米国特許第６，１００，４４６号および米国特許第６，１５３，４０１号、ならびに米国特許出願公開第２００９／００９３３６６号およびＷＯ２００７／０５３４８２に既に開示されている。前記文献の内容は本明細書によりその全体を参照によって組込まれている。ニトリラーゼに対する酵素／遺伝子は米国特許第４，８１０，６４８号に既に開示されている。前記文献の内容は本明細書によりその全体を参照によって組込まれている。

イミダゾリノンまたはスルホニル尿素を含む、他の除草剤は成長点または分裂組織を阻害することができ、これらの除草剤に対するアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）およびアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）の抵抗性／耐性の遺伝子は記載されている。ＡＨＡＳおよび変異体の遺伝子および変異体は、米国特許第４，７６１，３７３号、米国特許第５，３０４，７３２号、米国特許第５，３３１，１０７号、米国特許第５，８５３，９７３号、および米国特許第５，９２８，９３７号に開示されている。前記文献の内容は本明細書によりその全体を参照によって組込まれている。ＡＬＳの遺伝子および変異体は米国特許第５，０１３，６５９号および米国特許第５，１４１，８７０号に開示されている。前記文献の内容は本明細書によりその全体を参照によって組込まれている。

グリホサート抵抗性遺伝子には、それぞれ変異体５−エノールピルビルシキミ酸−３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰ）遺伝子（組み換え核酸の導入および／または天然のＥＰＳＰ遺伝子の様々な形態のｉｎ ｖｉｖｏ変異誘発を介して）、ａｒｏＡ遺伝子およびグリホサートアセチルトランスフェラーゼ（ＧＡＴ）遺伝子が含まれる。他のホスホノ化合物に対する抵抗性遺伝子には、グルホシネート（ストレプトミセス・ハイグロスコピクス（Streptomyces hygroscopicus）およびストレプトミセス・ビリジクロモジェネス（Streptomyces viridichromogenes）を含むストレプトミセス（Streptomyces）種由来のホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子）、およびピリジノキシまたはフェノキシプロピオン酸およびシクロヘキソン（cyclohexone）（ＡＣＣアーゼ阻害因子コード遺伝子）が含まれる。アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓ）の除草剤抵抗性／耐性遺伝子は、米国特許第５，１６２，６０２号および米国特許第５，４９８，５４４号に記載されている。前記文献の内容は本明細書によりその全体を参照によって組込まれている。

変異体ａｒｏＡ遺伝子をコードするＤＮＡ分子はＡＴＣＣ受託番号３９２５６の下で入手可能であり、この変異体遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｃｏｍａｉへの米国特許第４，７６９，０６１号、Ｋｕｍａｄａらへの欧州特許出願第０３３３０３３号、およびＧｏｏｄｍａｎらへの米国特許第４，９７５，３７４号で開示されており、Ｌ−ホスフィノトリシンなどの除草剤に対する抵抗性を与えるグルタミンシンテターゼ遺伝子のヌクレオチド配列を開示している。ＰＡＴ遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｌｅｅｍａｎｓらへの欧州特許出願第０２４２２４６号に提供されている。DeGreefら、Bio/Technology 7:61(1989)も、ＰＡＴ活性をコードするキメラバー遺伝子を発現するトランスジェニック植物の作製を記載している。セトキシジムおよびハロキシホップを含む、フェノキシプロピオン酸およびシクロヘキソンに対する抵抗性を与える遺伝子の例は、Marshallら、Theon. Appl. Genet. 83:435 (1992)により記載されているＡｃｃ１−Ｓ１、Ａｃｃ１−Ｓ２およびＡｃｃ１−Ｓ３遺伝子である。グリホサート抵抗性を与えることができるＧＡＴ遺伝子は、ＣａｓｔｌｅらへのＷＯ２００５０１２５１５に記載されている。２，４−Ｄ、ｆｏｐおよびピリジルオキシオーキシン除草剤に対する抵抗性を与える遺伝子はＷＯ２００５１０７４３７および米国特許出願第１１／５８７，８９３号に記載されている。

トリアジン（ｐｓｂＡおよび１ｓ＋遺伝子）またはベンゾニトリル（ニトリラーゼ遺伝子）を含む、他の除草剤は光合成を阻害することができる。Przibilaら、Plant Cell 3:169 (1991)は、変異体ｐｓｂＡ遺伝子をコードするプラスミドを有するクラミドモナス（Chlamydomonas）の形質転換を記載している。ニトリラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｓｔａｌｋｅｒへの米国特許第４，８１０，６４８号に開示されており、これらの遺伝子を含有するＤＮＡ分子はＡＴＣＣ受託番号５３４３５、ＡＴＣＣ受託番号６７４４１、およびＡＴＣＣ受託番号６７４４２の下で入手可能である。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼをコードするＤＮＡのクローニングおよび発現はHayesら、Biochem. J. 285:173 (1992)により記載されている。

本発明の目的のために、選択可能マーカー遺伝子には、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（Fraleyら、(1986) CRC Critical Reviews in Plant Science、4:1〜25）、シアナミドヒドラターゼ（Maier-Greinerら、(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA、88:4250〜4264）、アスパラギン酸キナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ（Perlら、(1993) Bio/Technology、11:715〜718）、トリプトファンデカルボキシラーゼ（Goddijnら、(1993) Plant Mol. Bio.、22:907〜912）、ジヒドロジピコリン酸シンターゼおよび脱感作アスパルテード（aspartade）キナーゼ（Perlら、(1993) Bio/Technology、11:715〜718）、バー遺伝子（Tokiら、(1992) Plant Physiol., 100:1503〜1507 および Meagherら、(1996) and Crop Sci., 36:1367）、トリプトファンデカルボキシラーゼ（Goddijnら、(1993) Plant Mol. Biol.、22:907〜912）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＥＯ）（Southernら、(1982) J. Mol. Appl. Gen., 1:327、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴまたはＨＹＧ）（Shimizuら、(1986) Mol. Cell Biol., 6:1074）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）（Kwokら、(1986) PNAS USA 4552）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（DeBlockら、(1987) EMBO J., 6:2513）、２，２−ジクロロプロピオン酸デハロゲナーゼ（Buchanan-Wollatronら、(1989) J. Cell. Biochem. 13D:330）、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（Andersonら、米国特許第４，７６１，３７３号; Haughnら、(1988) Mol. Gen. Genet. 221:266）、５−エノールピルビル−シキミ酸−リン酸シンターゼ（ａｒｏＡ）（Comaiら、(1985) Nature 317:741）、ハロアリールニトリラーゼ（Stalkerら、公開されたＰＣＴ出願ＷＯ８７／０４１８１）、アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ（Parkerら、(1990) Plant Physiol. 92:1220）、ジヒドロプテロイン酸シンターゼ（ｓｕｌ Ｉ）（Guerineauら、(1990) Plant Mol. Biol. 15:127）、および３２ｋＤ光化学系ＩＩポリペプチド（ｐｓｂＡ）（Hirschbergら、(1983) Science, 222:1346）をコードする遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。

クロラムフェニコール（Herrera-Estrellaら、(1983) EMBO J., 2:987〜992）、メトトレキサート（Herrera-Estrellaら、(1983) Nature, 303:209〜213; Meijerら、(1991) Plant Mol Bio., 16:807〜820 (1991)）、ハイグロマイシン（Waldronら、(1985) Plant Mol. Biol., 5:103〜108; Zhijianら、(1995) Plant Science, 108:219〜227 および Meijerら、(1991) Plant Mol. Bio. 16:807〜820）、ストレプトマイシン（Jonesら、(1987) Mol. Gen. Genet., 210:86〜91）、スペクチノマイシン（Bretagne-Sagnardら、(1996) Transgenic Res., 5:131〜137）、ブレオマイシン（Hilleら、(1986) Plant Mol. Biol., 7:171〜176）、スルホンアミド（Guerineauら、(1990) Plant Mol. Bio., 15:127〜136）、ブロモキシニル（Stalkerら、(1988) Science, 242:419〜423）、２，４−Ｄ（Streberら、(1989) Bio/Technology, 7:811〜816）、グルホサート（Shawら、(1986) Science, 233:478〜481）、およびホスフィノトリシン（DeBlockら、(1987) EMBO J., 6:2513〜2518）に対する抵抗性をコードする遺伝子も含まれる。本開示に列挙される参考文献はすべて、別段に記述されなければ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。

選択可能マーカーおよびレポーター遺伝子の上記一覧は限定することを意図していない。いかなるレポーターまたは選択可能マーカー遺伝子も本発明に包含される。必要な場合には、そのような遺伝子は当技術分野で公知である方法により塩基配列決定することができる。

レポーターおよび選択可能マーカー遺伝子は、植物における最適発現のために合成される。すなわち、遺伝子のコード配列は植物における発現を増強するように改変されている。合成マーカー遺伝子は植物においてより高いレベルで発現されてより高い形質転換効率を生じるように設計されている。遺伝子の合成最適化のための方法は当技術分野で入手可能である。実際、いくつかの遺伝子は、植物における遺伝子産物の発現を増加するように最適化されている。

マーカー遺伝子配列は特定の植物種における発現のために最適化することが可能であり、またはあるいは植物科における最適発現のために改変することが可能である。植物の好ましいコドンは、対象の特定の植物種において最大量で発現されるタンパク質において最も使用頻度の高いコドンから決定しうる。例えば、ＥＰＡ０３５９４７２；ＥＰＡ０３８５９６２；ＷＯ９１／１６４３２； Perlakら、(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA、88:3324〜3328; およびMurrayら、(1989) Nucleic Acids Research、17: 477〜498;米国特許第５，３８０，８３１号；および米国特許第５，４３６，３９１号を参照されたい。参照によって本明細書に組込まれている。このように、ヌクレオチド配列は任意の植物における発現に最適化することが可能である。遺伝子配列の全てまたは任意の部分は最適化するまたは合成であってもよいことが認識される。すなわち、完全に最適化されたまたは部分的に最適化された配列も使用しうる。

除草剤に対する抵抗性を与える遺伝子：
Ａ．除草剤イミダゾリノンまたはスルホニル尿素に対するアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）およびアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）の抵抗性／耐性。ＡＨＡＳおよび変異体の遺伝子および変異体は、米国特許第４，７６１，３７３号、米国特許第５，３０４，７３２号、米国特許第５，３３１，１０７号、米国特許第５，８５３，９７３号、および米国特許第５，９２８，９３７号に開示されている。ＡＬＳの遺伝子および変異体は米国特許第５，０１３，６５９号および米国特許第５，１４１，８７０号に開示されている。

Ｂ．除草剤シクロヘキサンジオンおよび／またはアリールオキシフェノキシプロパン酸（Ｈａｌｏｘｙｆｏｐ、Ｄｉｃｌｏｆｏｐ、Ｆｅｎｏｘｙｐｒｏｐ、Ｆｌｕａｚｉｆｏｐ、Ｑｕｉｚａｌｏｆｏｐを含む）に対するアセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）の抵抗性／耐性遺伝子は米国特許第５，１６２，６０２号および米国特許第５，４９８，５４４号に記載されている。

Ｃ．グルホサート抵抗性／耐性の遺伝子。５−エノールピルビル−３−ホスホシキミ酸シンターゼ（ＥＳ３Ｐシンターゼ）の遺伝子は米国特許第４，７６９，６０１号に記載されている。５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）および変異体の遺伝子は米国特許第４，９４０，８３５号、米国特許第５，１８８，６４２号、米国特許第５，３１０，６６７号、米国特許第５，６３３，４３５号、米国特許第５，６３３，４４８号、および米国特許第６，５６６，５８７号に記載されている。

Ｄ．グルホシネート（ビアラホス、ホスフィノトリシン（ＰＰＴ））抵抗性／耐性の遺伝子。ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（Ｐａｔ）の遺伝子は米国特許第５，２７３，８９４号、米国特許第５，２７６，２６８号、および米国特許第５，５５０，３１８号に記載されており、ビアラホス抵抗性の遺伝子（Ｂａｒ）は米国特許第５，５６１，２３６号、および米国特許第５，６４６，０２４号、米国特許第５，６４８，４７７号、および米国特許第７，１１２，６６５号に記載されている。グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）の遺伝子は米国特許第４，９７５，３７２号および欧州特許出願ＥＰ０３３３０３３ Ａ１に記載されている。

Ｅ．除草剤イソオキサゾール、ジケトニトリル、および／またはスルコトリオンおよびメソトリオンを含むトリケトンに対するヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）の抵抗性／耐性遺伝子は、米国特許第６，２６８，５４９号および米国特許第６，０６９，１１５号に記載されている。

Ｆ．２，４−Ｄ抵抗性／耐性の遺伝子。２，４−Ｄ−モノオキシゲナーゼの遺伝子は米国特許第６，１００，４４６号および米国特許第６，１５３，４０１号に記載されている。２，４−Ｄ抵抗性／耐性の追加の遺伝子はＵＳ２００９／００９３３６６およびＷＯ２００７／０５３４８２に開示されている。

Ｇ．除草剤イミダゾールおよび／またはトリアゾールに対するイミダゾールグリセロールリン酸デヒドラターゼ（ＩＧＰＤ）の遺伝子は米国特許第５，５４１，３１０号に記載されている。除草剤Ｄｉｃａｍｂａに対するＤｉｃａｍｂａ分解酵素（オキシゲナーゼ、フェレドキシン、およびレダクターゼ）の遺伝子は米国特許第７，０２２，８９６号および米国特許第７，１０５，７２４号に開示されている。

Ｈ．トリアジン（ｐｓｂＡおよび１ｓ＋遺伝子）またはベンゾニトリル（ニトリラーゼ遺伝子）を含む、光合成を阻害する除草剤の遺伝子。例えば、変異ｐｓｂＡ遺伝子をコードするプラスミドでのクラミドモナス（Chlamydomonas）の形質転換を開示しているPrzibilaら、Plant Cell 3:169 (1991)を参照されたい。ニトリラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は米国特許第４，８１０，６４８号に開示されており、これらの遺伝子を含有するＤＮＡ分子はＡＴＣＣ受託番号５３４３５、ＡＴＣＣ受託番号６７４４１、およびＡＴＣＣ受託番号６７４４２下で入手可能である。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼをコードするＤＮＡのクローニングおよび発現はHayesら、Biochem. J. 285:173 (1992)により記載されている。

他の方法で具体的に説明されなければ、本明細書で使用される全ての専門用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者が一般的に理解しているのと同じ意味を有する。分子生物学の一般用語の定義は、例えば、Lewin, Genes V, Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrewら、(eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); およびMeyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)に見ることができる。

３つのＥＰＳＰＳ遺伝子パラログ（Ａ、ＢおよびＣ）ならびにセイヨウアブラナ（brassica napus）中の５’ＵＴＲなどのその遺伝子成分、プロモーターおよび輸送ペプチドに関係する構築物および方法が提供される。遺伝子およびその遺伝子エレメントのトランスジェニックおよび非トランスジェニック（その天然環境において）使用も開示される。いくつかの実施形態では、これらの遺伝子またはエレメントのトランスジェニック使用は植物における除草剤（例えば、グリホサートまたは２，４−Ｄ）耐性という形質を与えることができる。パラログＡとＢは高度な相同性または同一性（約９２％）を共有しており、パラログＣとＤも同様である（約９５％）。パラログＡは複数の組織型において異なる植物成長段階において最も高度な発現パラログである。ＥＰＳＰＳパラログＡ遺伝子は、すべての試験された植物組織、例えば、葉、根、茎、頂端分裂組織、花、花蕾、等において４〜８葉期で構成的に発現される。さらに、パラログＡはその他の４種のパラログと比べて独特の輸送ペプチド配列を有する。いくつかの実施形態では、ＥＰＳＰＳパラログＡの輸送ペプチドを使用して細胞質から色素体までのタンパク質前駆体の効果的移行を提供する。さらに、ＥＰＳＰＳパラログＢ、ＣおよびＥの輸送ペプチドは細胞質から色素体までのタンパク質前駆体の移行を提供するのに有用になりうる。ＥＰＳＰＳ酵素は、植物、菌類および微生物における芳香族アミノ酸および芳香族代謝物の合成のためのシキミ酸経路の６番目の重要な酵素を表す。したがって、ＥＰＳＰＳ遺伝子は、植物中のアミノ酸含有量を操作するように適用される既存のまたは将来のどんな技術によっても植物中で上方調節するまたは下方調節することが可能である。例えば、ＷＯ２００９／０４２１６４を参照されたい。前記特許文献の内容は参照によりその全体を組み込まれる。これらの特長はすべて、単独でまたは組み合わせれば、ＥＰＳＰＳパラログは、シキミ酸および関連経路の操作の結果として除草剤耐性などの形質ならびに／またはアミノ酸、炭素および窒素含有量の変化を与えるトランスジェニックもしくは非トランスジェニック（天然の遺伝子環境）適用における使用に重要になる。本発明に従ったトランスジェニックキャノーラは特に興味深い。

セイヨウアブラナ（B. napus）変種Ｎｅｘ７１０由来のＥＰＳＰＳパラログＡのプロモーター配列が提供される。ＥＰＳＰＳパラログＡのこのプロモーターは、トランスジェニックセイヨウアブラナ（B. napus）カルス組織および苗木において示される結果に基づけば二方向であり、したがってアブラナ属（Brassica）二方向構成的プロモーター（ＢＢＣＰ）と呼ばれる。トランスジェニック植物においてＢＢＣＰを使用すれば、以下の利点、（ａ）植物ゲノムへの１回の形質転換でより多くの遺伝子を積み重ねることができる、（ｂ）トランス遺伝子をすべての植物組織および部分において構成的に発現させることができる、および（ｃ）亜鉛フィンガー媒介精密遺伝子スタッキングを用いて標的遺伝子座において新しい遺伝子をさらに付加するまたは交換することができる、のうちの少なくとも１つを提供することができる。例えば、ＢＢＣＰを使用すれば、一方向に選択可能マーカー／除草剤耐性形質の、別の方向に対象の遺伝子（例えば、作物保護または産出高増強という形質）の発現を可能にできる。パラログＡ遺伝子配列に含有され、色素体、例えば、葉緑体へのタンパク質ターゲティングを可能にする独特の輸送ペプチドがさらに提供される。

セイヨウアブラナ（B. napus）は複二倍体種であり、２つの染色体セット、ブラッシカ・ラパ（B. rapa）（２ｎ＝２０、ＡＡ）とブラッシカ・オレラセア（B. oleracea）（２ｎ＝１８、ＣＣ）の組合せから生じる。したがって、提供される複数のＥＰＳＰＳ遺伝子パラログは、その起源がＡゲノム由来もしくはＣゲノム由来に応じて（相同な（homeologous））または種分化に続くゲノム内でのその重複の結果として（パラロガスな（paralogous））相同遺伝子またはパラロガス遺伝子であることもある。

提供される方法および構築物を使用すれば、インプット形質（例えば、虫害抵抗性および除草剤耐性形質）、農業形質（例えば、産出高増強）、アウトプット形質（例えば、ヘルシー油）、等などの任意の形質をキャノーラまたは双子葉／単子葉植物において発現させることができる。ＢＢＣＰを使用する特異的ベクターの構築およびキャノーラまたは他の植物へのその形質転換に関連するすべての方法も提供される。

送達および／または形質転換。植物の形質転換に適した方法には、ＤＮＡを細胞内に導入することができるいかなる方法でも、例えば、限定せずに、エレクトロポレーション（例えば、米国特許第５，３８４，２５３号参照）、微粒子銃（例えば、米国特許第５，０１５，５８０号、米国特許第５，５５０，３１８号、米国特許第５，５３８，８８０号、米国特許第６，１６０，２０８号、米国特許第６，３９９，８６１号、および米国特許第６，４０３，８６５号参照）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換（例えば、米国特許第５，６３５，０５５号、米国特許第５，８２４，８７７号、米国特許第５，５９１，６１６号、米国特許第５，９８１，８４０号、および米国特許第６，３８４，３０１号参照）、プロトプラスト形質転換（例えば、米国特許第５，５０８，１８４号参照）が含まれる。前述の技法などの技法の適用を通じて、事実上どんな植物種の細胞も安定的に形質転換され、これらの細胞は当業者には公知の技法によりトランスジェニック植物に成長させうる。例えば、ワタ形質転換のコンテキストで特に有用でありうる技法は、米国特許第５，８４６，７９７号、米国特許第５，１５９，１３５号、米国特許第５，００４，８６３号、および米国特許第６，６２４，３４４号に記載されており、特にアブラナ属（Brassica）植物を形質転換するための技法は、例えば、米国特許第５，７５０，８７１号に記載されており、ダイズを形質転換するための技法は、例えば、米国特許第６，３８４，３０１号に記載されており、トウモロコシを形質転換するための技法は、例えば、米国特許第７，０６０，８７６号および米国特許第５，５９１，６１６号、ならびに国際ＰＣＴ出願ＷＯ９５／０６７２２に記載されている。

受容細胞への外来性核酸の送達を達成後、形質転換細胞は一般にさらなる培養および植物再生のために同定される。形質転換体を同定する能力を改善するために、形質転換体を生み出すのに使用される形質転換ベクターと一緒に選択可能またはスクリーニング可能マーカー遺伝子を用いることを望む場合がある。この場合、潜在的形質転換細胞集団は、細胞を選択剤（複数可）に曝露することによりアッセイすることができる、または望ましいマーカー遺伝子形質を求めて細胞をスクリーニングすることが可能である。

選択剤への曝露を乗り切る細胞、またはスクリーニングアッセイにおいて陽性とスコア化された細胞は、植物の再生を支持する培地で培養してもよい。いくつかの実施形態では、どんな適切な植物組織培養培地（例えば、ＭＳおよびＮ６培地）でも、成長調節物質などのさらなる物質を含むことにより改変しうる。組織は、植物再生取組みを始めるのに十分な組織が入手可能になるまで、または手動選択のラウンドの繰り返しに続いて、組織の形態が再生に適するまで（例えば、少なくとも２週間）成長調節物質を有する基礎培地で維持され、次に苗条形成の助けになる培地へ移されうる。培養物は十分な苗条形成が生じるまで定期的に移される。苗条が形成されると、根形成の助けになる培地へ移される。十分な根が形成されると、植物はさらなる成長と成熟のために土壌に移すことができる。

再生中の植物における提供される構築物を含む望ましい核酸分子の存在を確認するため、種々のアッセイを実施しうる。そのようなアッセイは、サザンおよびノーザンブロッティングならびにＰＣＲなどの分子生物学的アッセイ；例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットおよび／または液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ−ＭＳ ＭＳ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ））によりまたは酵素機能によりタンパク質産物の存在を検出するなどの生化学的アッセイ；葉または根アッセイなどの植物部分アッセイ；ならびに／または全再生植物の表現型の解析を含みうる。

標的にされる組込み事象は、例えば、対象の核酸分子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、例えば、ＰＣＲ増幅によりスクリーニングしうる。ＰＣＲ遺伝子型判定には、ゲノムに組み込まれた対象の核酸分子を含有すると予測される単離された宿主植物カラス組織由来のゲノムＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、続いてＰＣＲ増幅産物の標準クローニングおよび配列解析が含まれるがこれらに限定されないと理解されている。ＰＣＲ遺伝子型判定の方法はよく記載されており（例えば、Riosら、(2002) Plant J. 32:243〜53参照）、細胞培養物を含む、任意の植物種または組織型由来のゲノムＤＮＡに適用しうる。標的配列と導入された配列の両方に結合するオリゴヌクレオチドプライマーの組合せは、ＰＣＲ増幅反応において順次使用されてもまたは多重化されてもよい。標的部位、導入された核酸配列、および／または前記２つの組合せにアニールするように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを作製しうる。したがって、ＰＣＲ遺伝子型判定戦略には、例えば、限定せずに、植物ゲノムにおける特定の配列の増幅、植物ゲノムにおける複数の特定の配列の増幅、植物ゲノムにおける非特異的配列の増幅、および前述のいずれかの組合せが含まれうる。当業者であれば、プライマーと増幅反応の追加の組合せを考案してゲノムを調べることができる。例えば、フォワードとリバースオリゴヌクレオチドプライマーのセットを、導入された核酸配列の境界の外側で標的に特異的な核酸配列（複数可）にアニールするように設計しうる。

フォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドプライマーは、導入された核酸分子に、例えば、そこに含まれる対象のヌクレオチド配列内のコード領域に対応する配列で、またはこの核酸分子の他の部分に特異的にアニールするように設計しうる。これらのプライマーは上記のプライマーと併せて使用しうる。オリゴヌクレオチドプライマーは所望の配列に従って合成することができ、市販されている（例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡから）。増幅に続いてクローニングおよび塩基配列決定を、または増幅産物の直接配列解析を実施してもよい。当業者であれば、ＰＣＲ遺伝子型判定中に生み出される増幅産物の解析のための代替方法を想定してもよい。一実施形態では、遺伝子標的に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーはＰＣＲ増幅において用いられる。

本発明は特定の方法および実施形態を参照して説明されてきたが、本発明から逸脱することなく様々な改変および変化を加えられることは認識されるであろう。本明細書で引用される出版物はすべて、本発明に関連して使用されることがある組成物および方法を説明し開示する目的で、参照により本明細書に明確に組み込まれる。引用されている特許、特許出願、ならびに参照ウェブサイトおよび公表データベース中の配列情報もすべて参照により組み込まれる。
（実施例）

ＥＰＳＰＳパラログＡプロモーター（ＢＢＣＰ）配列の同定
セイヨウアブラナ（Brassica napus）中の５つの５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）遺伝子配列（パラログまたは相同体）はＵＳ２００９／０２０５０８３Ａ１に記載されている。これら５つの遺伝子間では、ＥＰＳＰＳパラログＡのプロモーターが種々の植物組織において最も強力な発現を推進する。１５７１ｎｔＥＰＳＰＳパラログＡの配列（配列番号７）を伸長するためには、ＥＰＳＰＳパラログＡ遺伝子の追加の配列はＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（商標）ユニバーサルキット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）を使用してゲノムを介して得られ、そのプロモーター領域および３’非翻訳領域（例えば、配列番号２６）を含むＥＰＳＰＳパラログＡの完全な配列（配列番号８）が得られる。

ＥＰＳＰＳパラログＡ遺伝子のプロモーター配列を同定するために、様々な植物およびアブラナ属（Brassica）データベースに対してＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）を使用して完全配列を探索する。ＥＰＳＰＳパラログＡ遺伝子発現の方向に整列したセイヨウアブラナ（Brassica napus）およびブラッシカ・ラパ（Brassica rapa）の６つのｃＤＮＡおよび／またはｍＲＮＡ配列が同定される。これらの配列のジェンバンク識別番号（ＩＤ）はＥＳ９３７１７８、ＥＳ９０４０５５、ＣＤ８２５７９８、ＣＤ８３５７６８、ＣＤ８３７４６４およびＥＶ１２１９１５である。これらのｃＤＮＡおよび／またはｍＲＮＡ配列は、標的種の葉、根または胚ライブラリーから検出することができるが、これらのｃＤＮＡまたはｍＲＮＡの特定の役割についてはジェンバンクには注釈はない。興味深いことに、ＥＰＳＰＳパラログＡ遺伝子の発現の反対方向にＥＰＳＰＳパラログＡ遺伝子の５’配列に適合する３つのｃＤＮＡおよび／またはｍＲＮＡが同定される。これらの配列のジェンバンクＩＤはＣＤ８３６０９５、ＥＶ１００３６６およびＥＥ５６８３３７である。セイヨウアブラナ（Brassica napus）ｃＤＮＡおよび／またはｍＲＮＡ配列はこれらの配列の供給源であり、やはりジェンバンクではこれらの配列に特定の機能は割り当てられていない。

この実施例の配列分析により、ＥＰＳＰＳパラログＡ遺伝子のプロモーター配列は二方向プロモーターであることが明らかにされ、このプロモーターはアブラナ属（Brassica）二方向構成的プロモーター（ＢＢＣＰ）と呼ばれる。

ＢＢＣＰ構築物の設計および構築
ｐＤＡＢ１００３３３と名付けられる単一バイナリーベクター（図１２）は、当技術分野において認知されている手順を使用して構築する。バイナリーｐＤＡＢ１００３３３は遺伝子発現カセットまたは植物転写ユニット（ＰＴＵ）の２つのセットを含有している。第一のＰＴＵセットは、２つのレポーター遺伝子を推進する二方向セイヨウアブラナ（Brassica napus）パラログＡプロモーター（ＢＢＣＰ）からなる。ＢＢＣＰの一方の末端はβ−グルクロニダーゼレポーター遺伝子（ＧＵＳ）の発現を推進するように構築され、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）オープンリーディングフレーム−２４ ３’非翻訳領域（ＡｔｕＯＲＦ２４ ３’ＵＴＲ）が終端をなす。ＢＢＣＰの反対の末端は緑色蛍光タンパク質レポーター遺伝子（ＧＦＰ）を推進するように構築され、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ノパリンシンターゼ３’非翻訳領域（Ａｔｕ Ｎｏｓ ３’ＵＴＲ）が終端をなす。

ｐＤＡＢ１００３３３の第二のＰＴＵセットは、イソペンテニルトランスフェラーゼコード配列（ｉｐｔ ＣＤＳ；ジェンバンク受託番号Ｘ００６３９．１）内にクローニングされ、それによりｊｐｔコード配列を中断する選択可能マーカーを含み、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ユビキチン１０プロモーター（ＡｔＵｂｉ１０プロモーター）を使用してホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼコード配列（ＰＡＴ）を推進し、ＰＴＵはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（A. tumefaciens）オープンリーディングフレーム−１ ３’非翻訳領域（ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ）が終端をなす。得られたバイナリーベクターは、二方向プロモーターにより推進される２つの視覚的レポーター遺伝子（ＧＵＳおよびＧＦＰ）および選択可能マーカー遺伝子（ＰＡＴ）を含有する。

バイナリーベクターｐＤＡＢ１００３３３は、エレクトロポレーションを使用してアグロバクテリウム・ツメファシエンス（A. tumefaciens）内に動員する。個々のコロニーは、抗生物質スペクチノマイシンを含有するＹＥＰ培地上で同定する。単一コロニーは単離し、ｐＤＡＢ１００３３３バイナリーベクターの存在は制限酵素消化により確かめることができる。

もう１つのバイナリーベクターｐＤＡＢ１００３３１（図１２）も、当技術分野において認知されている手順を使用して構築する。バイナリーｐＤＡＢ１００３３１は、ｐＤＡＢ１００３３３の場合とは逆配向にＢＢＣＰを含有するように構築するが、特長はｐＤＡＢ１００３３３と同じである。したがって、バイナリーベクターｐＤＡＢ１００３３１は遺伝子発現カセットまたは植物転写ユニット（ＰＴＵ）の２つのセットからなる。第一のＰＴＵセットは、２つのレポーター遺伝子を推進する二方向セイヨウアブラナ（Brassica napus）パラログＡプロモーター（ｐＤＡＢ１００３３３と比べた場合逆配向のＢＢＣＰ）からなる。ＢＢＣＰの一方の末端は緑色蛍光タンパク質レポーター遺伝子（ＧＦＰ）を推進するように構築され、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ノパリンシンターゼ３’非翻訳領域（Ａｔｕ Ｎｏｓ ３’ＵＴＲ）が終端をなす。ＢＢＣＰの反対の末端はβ−グルクロニダーゼレポーター遺伝子（ＧＵＳ）の発現を推進するように構築され、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）オープンリーディングフレーム−２４ ３’非翻訳領域（ＡｔｕＯＲＦ２４ ３’ＵＴＲ）が終端をなす。

ｐＤＡＢ１００３３１の第二のＰＴＵセットも、イソペンテニルトランスフェラーゼコード配列（ｉｐｔ ＣＤＳ；ジェンバンク受託番号Ｘ００６３９．１）内にクローニングされ、それによりｊｐｔコード配列を中断する選択可能マーカーを含み、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ユビキチン１０プロモーター（ＡｔＵｂｉ１０プロモーター）を使用してホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼコード配列（ＰＡＴ）を推進し、ＰＴＵはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（A. tumefaciens）オープンリーディングフレーム−１ ３’非翻訳領域（ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ）が終端をなす。得られたバイナリーベクターは、二方向プロモーターにより推進される２つの視覚的レポーター遺伝子（ＧＵＳおよびＧＦＰ）および選択可能マーカー遺伝子（ＰＡＴ）を含有する。

同様に、バイナリーベクターｐＤＡＢ１００３３１は、エレクトロポレーションを使用してアグロバクテリウム・ツメファシエンス（A. tumefaciens）内に動員する。個々のコロニーは、抗生物質スペクチノマイシンを含有するＹＥＰ培地上で同定する。単一コロニーは単離し、ｐＤＡＢ１００３３１バイナリーベクターの存在は制限酵素消化により確かめることができる。

高コピー数ｐＵＣベースのプラスミドにクローニングする直接ＤＮＡ送達ベクターは、上に記載されているＢＢＣＰプロモーターを含有する第一ＰＴＵのみを使用して構築する。プラスミドｐＤＡＢ１０８７１０およびｐＤＡＢ１０８７１１（図１４）は当技術分野において認知されている手順を使用して構築する。この２つのベクターは、ＢＢＣＰを異なる配向で含有するように構築されて同じ特長を推進するので、異なっている。単一ＰＴＵは２つのレポーター遺伝子を推進する二方向セイヨウアブラナ（Brassica napus）パラログＡプロモーターからなる。ＢＢＣＰの１つの末端は緑色蛍光タンパク質レポーター遺伝子（ＧＦＰ）を推進するように構築され、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ノパリンシンターゼ３’非翻訳領域（Ａｔｕ Ｎｏｓ ３’ＵＴＲ）が終端をなす。ＢＢＣＰの反対の末端はβ−グルクロニダーゼレポーター遺伝子（ＧＵＳ）の発現を推進するように構築され、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）オープンリーディングフレーム−２４ ３’非翻訳領域（ＡｔｕＯＲＦ２４ ３’ＵＴＲ）が終端をなす。直接ＤＮＡ送達ベクターは、トウモロコシ組織のパーティクルボンバードメントのために使用する。

セイヨウアブラナ（Brassica napus）中でのＢＢＣＰ構築物の発現
キャノーラ形質転換−胚軸セグメントの調製および前処理：エリートキャノーラ遺伝子型、Ｎｅｘ７１０の種子を１０％市販の漂白剤で１０分間表面殺菌し無菌蒸留水で３回すすぐ。種子は無菌ペーパータオルで乾燥させ、次に２分の１濃度のＭＳ基本培地［Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈ Ｃａｔ＃Ｍ ５１９（ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｈａｗｎｅｅ Ｍｉｓｓｉｏｎ、ＫＳ）］、２０ｇ／Ｌショ糖、および８ｇ／Ｌ ＴＣ寒天からなる「発芽培地」を含有するＰｈｙｔａトレイに置き、１６時間明／８時間暗の光周期で２３℃に設定された成長レジーム下に維持する。

５日目に、実生は不稔性について検査され、Ｐｈｙｔａトレイは不稔性を維持するためラミナーフローフード（Ｔｈｅ Ｂａｋｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ ＥｄｇｅＧＡＲＤ）の内部に置く。無菌鉗子と剥離鋏を使用して、苗木はＰｈｙｔａトレイから取り除き、気生（分裂組織および子葉）領域と根は剥離し捨てる。胚軸は、乾燥を防ぐために必要な無菌蒸留水を含有する１００×２５ｍｍペトリ皿に置く。胚軸は２ｍｍセグメントに横方向に切断し、ＭＳ培地（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈ Ｍ５１９）、３０ｇ／Ｌショ糖、１ｍｇ／Ｌキネチン、および７ｇ／Ｌ ＴＣ寒天で凝固させた１ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄからなる「カルス誘導培地ＭＳＫ１Ｄ１」上に重ね置きされた無菌フィルターペーパー上に水平に置く。プレートは透明なＳｔｅｒｉｌｉｔｅ（登録商標）タブに置き、前処理として３日間同じ成長レジーム下に維持する。

アグロバクテリウム（Agrobacterium）の調製：アグロバクテリウム（Agrobacterium）感染の四日前に、アグロバクテリウム（Agrobacterium）株ＤＡ２５５２（例えば、ＷＯ２０１２／０１６２２２参照）中のｐＤＡＢ１０３３３およびｐＤＡＢ１０３３１をグリセロールストックから、ＹＥＰ培地（１０ｇ／Ｌペプトン、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１０ｇ／Ｌショ糖プラス１００ｍｇ／Ｌスペクチノマイシンおよび１５０ｍｇ／Ｌエリスロマイシンおよび１５ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏ Ａｇａｒで凝固されている）上にストリークアウト（streak out）して、２８℃で培養器（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｓｏｔｅｍｐ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）中２日間生育させる。２日後、アグロバクテリウム（Agrobacterium）の小ループを、１５０ｍＬの「液体細菌増殖培地」（上記と同じ培地であるが凝固剤がない）を含有する５００ｍＬの無菌整流装置付きフラスコに置く。培養物は囲い込み振盪機（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｎｏｖａ ４３３０冷蔵培養器振盪機）上２００ｒｐｍで、暗所において２８℃で１６時間増殖させる。１６時間後、アグロバクテリウム（Agrobacterium）培養物は振盪機から取り除き、５０ｍＬ遠心管にアリコートする。遠心管は遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｍｏｄｅｌ Ｊ２−２１遠心分離機）に置き、６，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、続いてＬＳ塩（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈ Ｌ６８９）、３％グルコース、改変Ｇａｍｂｏｒｇ Ｂ５ビタミン（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈ Ｇ２４９）、２１５ｍｇ／Ｌキネチン、および２２１ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄからなる「液体培養培地Ｍ」にｐＨ５で再懸濁する。

感染およびカルス誘導：感染の１日目、アグロバクテリウム（Agrobacterium）の準備ができるのを待っている間、キャノール胚軸セグメントを２０ｍＬの「液体培養培地」を含有する１００×２５無菌ペトリ皿に移す。次に「液体培養培地」は胚軸セグメントから取り除き、４０ｍＬのアグロバクテリウム（Agrobacterium）懸濁液を短時間ボルテックスし、胚軸セグメントを含有する１００×２５ｍｍペトリ皿に注ぎ入れ３０分間処置する。３０分間の処置後、アグロバクテリウム（Agrobacterium）懸濁液はすべて二重ピペットを使用して取り除く。処理された胚軸は「カルス誘導培地ＭＳＫ１Ｄ１」上に重ね置きされたフィルターペーパー上に再び置く。培養物はＳｔｅｒｉｌｉｔｅ（登録商標）タブに戻し、色の濃い蓋で覆い、３日間の同時栽培期間、上記と同じ成長レジーム下の培養室に戻す。３日間の同時栽培期間の後、胚軸は「選択１培地ＭＳＫ１Ｄ１Ｈ１」（「カルス誘導培地」プラス１ｍｇ／Ｌ Ｈｅｒｂｉａｃｅからなる）上に直に置き、透明な蓋付きの元のタブに戻し、培養室に戻して、上記と同じ成長レジームを維持する。１週間後、次に胚軸は「選択２培地ＭＳＫ１Ｄ１Ｈ３」（「カルス誘導培地」プラス３ｍｇ／Ｌ Ｈｅｒｂｉａｃｅからなる）に直に移す。２週間後、胚軸は「選択３培地ＭＳＫ１Ｄ１Ｈ５」（「カルス誘導培地」プラス５ｍｇ／Ｌ Ｈｅｒｂｉａｃｅからなる）に直に移す。胚軸セグメントは、胚軸の両末端に十分なカルスが形成されるまで２週間ごとに新しい選択３培地に移し続ける。次に、カルスはＧＵＳについてアッセイする。

キャノーラ胚軸セグメントのＧＵＳ染色：ＧＵＳ染色手順は当技術分野では公知であり、以下の、ｐＨ８で０．１ＭのＮａＰＯ_４バッファー、０．５ｍＭのＫ_３（Ｆｅ（ＣＮ）_６、１０ｍＭのＮａ_２ＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍｌのＸ−Ｇｌｕｃ、および０．０６％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００の通りにＧＵＳ染色液をわずかに変更する。染色された組織由来の葉緑素は７０％エタノールにより取り除く。ＧＵＳアッセイは、少なくとも２週間選択３培地上に置かれた後に胚軸セグメントにおいて行う。カルスをＧＵＳ染色液中に浸し、３７℃、暗所で一晩インキュベートする。非感染組織およびＧＵＳ陽性対照は、陰性および陽性対照についてのアッセイでは常に含まれる。

結果によれば、ｐＤＡＢ１００３３１とｐＤＡＢ１００３３３形質転換の両方から得られるトランスジェニックカルス試料における著しいＧＵＳ発現が示されている。非トランスジェニック対照試料では青色は目に見えない。したがって、トランスジェニック実験結果により、ＢＢＣＰが二方向プロモーターであることが確かめられる。

ダイズにおけるＢＢＣＰ構築物の発現
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株ＥＨＡ１０５にバイナリーベクターｐＤＡＢ９３８１（ＢＢＣＰ二方向プロモーターを含有しない対照バイナリーベクター）、ｐＤＡＢ１００３３１およびｐＤＡＢ１００３３３を別々に電気穿孔する。単離されたコロニーは抗生物質スペクチノマイシンを含有するＹＥＰ培地上で同定する。単一のコロニーは単離し、ｐＤＡＢ９３８１、ｐＤＡＢ１００３３１およびｐＤＡＢ１００３３３バイナリーベクターの存在は制限酵素消化により確かめることができる。ダイズ（ダイズ（Glycine max）ｃ．ｖ．Ｍａｖｅｒｉｃｋ）のアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換は当技術分野で周知の方法に従って実施することができる。

形質転換後、根が発生すると、根付いた小植物はＧＦＰ発現について励起／発光をカバーする４８２ｎｍ／５０２ｎｍ ＧＦＰフィルター付きで撮影する。葉は、Jefferson, R., (1987) “Histochemical localization of β-glucuronidase (GUS) reporter activity in plant tissues” Plant Mol. Biol. Reporter, 5: 387〜405から適応させたプロトコールに従ってＧＵＳ染色のために小植物から試料採取する。次に、葉は、２×リン酸バッファーｐＨ７．０（１×の０．１ＭのＮａＨ_２ＰＯ_４および０．１ＭのＮａ_２ＨＰＯ_４で作製）、０．５ｍＭのＫ_３（Ｆｅ（ＣＮ）_６、１０ｍＭのＮａ_２ＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍｌのＸ−Ｇｌｕｃ、および０．０６％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００からなる染色液に浸し、３７℃で一晩インキュベートする。インキュベーション後、染色液は取り除き、組織は７０％エタノールを数回交換して洗浄し、撮影する前にエタノール中に一晩放置しておく。

試験した外植片およびトランスジェニック小植物についての４ラウンドの実験結果は表２に示している。表２は、ＢＢＣＰにより推進されるＧＦＰおよびＧＵＳレポーター遺伝子の発現されたタンパク質産物を含有することを確認しているトランスジェニック苗条の数を示している。構築物ｐＤＡＢ１００３３１およびｐＤＡＢ１００３３３で安定的に形質転換されているダイズトランスジェニック苗木は３〜１４％の頻度で再生される。再生された苗条（小植物）のほぼ８１〜９９％がＧＦＰを発現し、その４１％がＧＦＰとＧＵＳの両方を発現する。ｐＤＡＢ１００３３３で再生された苗木では、ＧＵＳ発現は葉全体でより均一であり、中肋組織および葉脈では第一に発現されることはない。複数の葉について終了している研究において観察されたように、ｐＤＡＢ１００３３１から再生される苗木において比較して、ＧＵＳ発現は葉の中肋および葉脈においてより局在化していると思われる。対照構築物ｐＤＡＢ９３８１で形質転換されているトランスジェニック苗木は、ＧＦＰまたはＧＵＳ発現を全く示さない。結果により、ＢＢＣＰはトランス遺伝子発現を両方向に妥当なレベルで推進するが、葉組織内では発現パターンにいくつかのマイナーな方向の違いがある可能性があることが確かめられる。

トウモロコシ葉組織の一過性形質転換
組織調製：濃褐色葉組織は照射の３〜４時間前に収穫し、表３に記載される照射調製培地上に置く。プレートはラップをし、照射の準備ができるまで２８℃、暗所で保存する。

マイクロ粒子（金）調製：３０ｍｇ金（１μｍの大きさをＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡより購入）を５００μｌの冷エタノール中で洗浄し１５秒間超音波処理し、次に１５秒間ボルテックスする。粒子は１０分間沈殿させた後３０００ｒｐｍで６０秒間遠心分離させる。次に上清は捨て、ペレットは冷水で洗浄し（ペレットはピペット先端および／または指ボルテックスで壊す）、続いて３０００ｒｐｍで６０秒間遠心分離する。この洗浄および遠心分離ステップはさらに２回繰り返すことができる。最終すすぎ後、２５０μｌの５０％グリセロール（最終濃度約１２０ｍｇ／ｍｌ）を添加する。試料は１５秒間超音波処理し、１５秒間ボルテックスし、エッペンドルフ管内にアリコートする。

マイクロキャリアを調製する：照射する組織のプレートごとに、金／ＤＮＡ反応物を、以下の通りに、５〜１５μｇ ＤＮＡ（プラスミドｐＤＡＢ１０８７１０、ｐＤＡＢ１０８７１１、または対照プラスミドＤＮＡ）、６ｍｇの金、最終濃度１ＭのＣａＣｌ_２および１６ｍＭのスペルミジンを総反応容積１２５μｌで調製する。超音波処理およびボルテックスの直後、５０μｌの金懸濁液アリコートをそれぞれの反応管に入れる。反応管は５０μｌの予め冷却していたＣａＣｌ_２の添加前にボルテックスし、次に２０μｌの０．１Ｍスペルミジンの添加前に再度ボルテックスする。次に、反応管は最長１０分までボルテックスし、５０００ｒｐｍで１５秒間遠心分離する前に実験台上で１０分間そのままにしておく。上清は捨て、ペレットは１５０μｌの７０％エタノールに再懸濁する。次に、ペレットは、５０００ｒｐｍで１５秒間遠心分離する前にピペットおよび／または指ボルテックスで壊す。上清は捨て、ペレットは１５０μｌのエタノールに再懸濁する。次に、ペレットは、５０００ｒｐｍで１５秒間遠心分離する前にピペットおよび／または指ボルテックスで再度壊す。最後に、ペレットは照射実験の前に３６μｌのエタノール（６ｍｇ金あたり３６μｌ）に再懸濁する。マイクロキャリア上へのアリコート前に、ペレットは１５秒間超音波処理し、金が十分懸濁しているように見えるまでボルテックスする。ペレットをそれぞれ１０μｌで３つのマイクロキャリア上にアリコートする。アリコート間の超音波処理およびボルテックスが推奨される。

照射条件：ヘリウムベースのマイクロキャリアディスクおよびマイクロキャリアホルダーを使用に先立って準備しオートクレーブする。ＤＮＡ被覆金粒子（１０μｌで十分懸濁されている）を乾燥するまで５分間マイクロキャリアの上に置く。発射のためのマイクロキャリア発射台を組み立てるために、停止スクリーンを先ず組み立て装置に設置する。次に、マイクロキャリアを組み立て装置上に逆さまに置き、次に組み立てマイクロキャリア蓋を閉じて、その後新たに手短にすすいだ（７０％エタノール中で）１３５０ｐｓｉ破裂板をストッパーに設置し、ガス加速管に取り付ける。次に、マイクロキャリア組み立て装置を直ちに最上層のスロットに入れて、その後チャンバーの扉を閉める。照射前に真空排気室において真空を起動させる。１３５０ｐｓｉ破裂板が破裂しヘリウム圧力計がゼロに下がるまで発射ボタンを押し続けることにより試料に照射する。それぞれのプレートは同じプラスミドで３回まで照射することができ、プレートは照射がプレート上の異なる部位／方向で起こることができるように向きを変えることができる。照射後、プレートはＧＦＰ観察および／またはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ染色キットを使用するＧＵＳ染色前に少なくとも２４時間２８℃で暗所に保存する。

結果：ＧＵＳ発現は、ＢＢＣＰにより推進されるＧＵＳ遺伝子を含有するプラスミドを照射した葉組織において観察される。対照プラスミドを照射したトウモロコシ葉組織はＧＵＳ発現を全く示していない。ＧＦＰ発現は、ＢＢＣＰにより推進されるＧＦＰ遺伝子を有するプラスミドで形質転換されたトウモロコシ葉試料において観察される。対照構築物を照射されたトウモロコシ葉組織はＧＦＰ発現を全く示していない。この結果により、ＢＢＣＰはレポーター遺伝子、ＧＵＳおよびＧＦＰの発現を両方向に推進する二方向プロモーターであることが確かめられる。結論として、ＢＢＣＰからの二方向発現は、双子葉（ダイズおよびセイヨウアブラナ（B. napus））植物組織でも単子葉（トウモロコシ）植物組織でも観察することができる。

多くの例となる態様および実施形態を上で考察してきたが、当業者であればある種の改変、置換、追加およびそれらの部分的組合せを認識するであろう。したがって、以下の添付の特許請求の範囲および今後導入される特許請求の範囲は、その真の精神および範囲内であるような改変、置換、追加および部分的組合せを全て含むと解釈されることが意図されている。

Claims (27)

1. （ａ）配列番号１に少なくとも９０％同一性を有するヌクレオチド配列を含み、ＧＦＰ及びＧＵＳレポーター遺伝子を発現させることができる二方向プロモーター、および
   （ｂ）二方向プロモーターの両端に２つの遺伝子発現カセットを含む、
   植物細胞および／または組織において複数の遺伝子を発現するための核酸構築物。
2. 二方向プロモーターが少なくとも１つのエンハンサーを含む、請求項１に記載の核酸構築物。
3. 核酸構築物がアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換のためのバイナリーベクターを含む、請求項１に記載の核酸構築物。
4. 二方向プロモーターが少なくとも１つのイントロンを含む、請求項１に記載の核酸構築物。
5. 二方向プロモーターが少なくとも１つの５’非翻訳領域を含む、請求項１に記載の核酸構築物。
6. 二方向プロモーターが配列番号２または３から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の核酸構築物。
7. 二方向プロモーターが配列番号１、２２〜２５から選択されるヌクレオチド配列、またはその相補体を含む、請求項１に記載の核酸構築物。
8. 遺伝子発現カセットのうちの少なくとも１つが翻訳スイッチを介して連結された２つ以上の遺伝子を含む、請求項１に記載の核酸構築物。
9. 両方の遺伝子発現カセットが翻訳スイッチを介して連結された２つ以上の遺伝子を含む、請求項１に記載の核酸構築物。
10. 翻訳スイッチが、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、選択的スプライシング部位、２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、２Ａ様ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、インテインをコードするポリヌクレオチド配列、プロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド配列、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項８に記載の核酸構築物。
11. 翻訳スイッチの上流の遺伝子が翻訳停止コドンを含まない、請求項８に記載の核酸構築物。
12. 少なくとも４つの遺伝子の発現を可能にする、請求項１に記載の核酸構築物。
13. ３つから２０までの遺伝子の発現を可能にする、請求項１に記載の核酸構築物。
14. ４つから８つまでの遺伝子の発現を可能にする、請求項１３に記載の核酸構築物。
15. 両方の遺伝子発現カセットがＥＰＳＰＳ遺伝子またはパラログを含むわけではない、請求項１に記載の核酸構築物。
16. 請求項１に記載の核酸構築物で植物細胞を形質転換することを含む、トランスジェニック植物を作製するための方法。
17. 請求項１に記載の核酸構築物で細胞を形質転換することを含む、トランスジェニック細胞を作製するための方法。
18. 請求項１に記載の核酸構築物を含む植物細胞。
19. 核酸構築物が植物細胞に安定的に形質転換されている、請求項１８に記載の植物細胞。
20. 請求項１に記載の核酸構築物を含むトランスジェニック植物または種子。
21. 核酸構築物がトランスジェニック植物または種子の細胞に安定的に形質転換されている、請求項２０に記載のトランスジェニック植物または種子。
22. 双子葉植物である、請求項２０に記載のトランスジェニック植物。
23. 単子葉植物である、請求項２０に記載のトランスジェニック植物。
24. 請求項１に記載の核酸構築物を植物細胞および／または組織中に導入することを含む、植物細胞および／または組織において複数の遺伝子を発現させるための方法。
25. 植物細胞および／または組織が請求項１に記載の核酸構築物で安定的に形質転換されている、請求項２４に記載の方法。
26. 請求項１に記載の核酸構築物を含む、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換のためのバイナリーベクター。
27. 二方向プロモーターが配列番号１に少なくとも９０％同一性を有するヌクレオチド配列を含み、ＧＦＰ及びＧＵＳレポーター遺伝子を発現させることができる、トランスジェニック植物または種子の生産における二方向プロモーターの使用。