CN105102474A - 组成型大豆启动子 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于调控植物中异源核苷酸序列表达的组合物和方法。组合物包括用于编码大豆中γ液泡膜内在蛋白和质膜内在蛋白的基因的两个新型启动子核苷酸序列，以及包括这些启动子核苷酸序列或其变体和片段的载体、微生物、植物以及植物细胞。还提供了用于使用本文所披露的启动子序列在植物中表达异源核苷酸序列的方法。这些方法包括将可操作地连接到本发明的启动子的核苷酸序列稳定地结合到植物细胞的基因组中，并且再生出表达该核苷酸序列的经过稳定转化的植物。

Description

组成型大豆启动子

相关申请的交叉引用

本申请要求2013年3月15日提交的美国临时申请61/790,907的权益，其内容通过引用以其全文结合在此。

以电子方式提交的序列表的参考

通过EFS-Web以电子方式提交ASCII格式的序列表副本，其文件名为“2912939-20179WO01_Sequence_Listing.txt”，创建于2014年3月10日，文件大小为4.14千字节，并与本说明书同时提交。该ASCII格式文档中所含的序列表是本说明书的一部分并通过引用以其全文结合在此。

发明领域

本发明涉及植物分子生物学领域，更具体而言涉及植物中调控元件的识别和使用。

发明背景

当前存在对转基因植物的高度需求，这些转基因植物通过生物技术以高水平或可诱导水平表达重要蛋白产物。对作物植物进行操作以改变和/或改善表型特征(例如生产率或质量)需要在植物组织中表达异源基因。该基因操作由于以下两个发现已经成为可能，即将异源遗传物质转化进植物细胞的能力，以及存在能够驱动异源遗传物质表达的启动子。

最常用的启动子是胭脂碱合酶(NOS)启动子(艾伯特等人，美国国家科学院院刊84:5745-5749(1987))(Ebertetal,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:5745-5749(1987))；章鱼碱合酶(OCS)启动子，花椰菜花叶病毒启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S启动子(劳顿等人，植物分子生物学9:315-324(1987))(Lawtonetal,PlantMol.Biol.9:315-324(1987))；CaMV35S启动子(奥德尔等人，自然313:810-812(1985))(Odelletal,Nature313:810-812(1985))，以及玄参花叶病毒35S启动子(桑格尔等人，植物分子生物学14:433-43(1990))(Sangeretal,PlantMol.Biol.14:433-43(1990))；来自核酮糖二磷酸羧化酶小亚基的光诱导型启动子(佩莱格里内斯基等人，生物化学学会会刊23(2):247-250(1995))(Pellegrineschietal.,Biochem.Soc.Trans.23(2):247-250(1995))；Adh启动子(沃克等人，美国国家科学院院刊84:6624-66280(1987))(Walkeretal,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:6624-66280(1987))；蔗糖合酶启动子(杨等人，美国国家科学院院刊87:4144-4148(1990))(Yangetal,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:4144-4148(1990))；R基因复合物启动子(钱德勒等人，植物细胞1:1175-1183(1989))(Chandleretal,PlantCell1:1175-1183(1989))；叶绿素a/b结合蛋白基因启动子；等等。

识别和分离有用于微生物和植物中基因的强烈表达或可诱导表达的调控元件在转基因植物的商业品种开发中将是有益的。

发明内容

本发明提供了用于调控植物中基因表达的组合物和方法。组合物包括源自大豆的核苷酸序列及其在植物中启动转录的变体。特别地，提供了从γ液泡膜分离出的转录起始区和大豆的质膜基因。本发明的组合物还包括SEQIDNO:1和2所示的核苷酸序列及其变体和片段。本发明的组合物也包括表达盒，其包括可操作地连接到目的异源核苷酸序列的启动子。本发明还提供包括表达盒的载体，以及基因组中稳定地结合了上述表达盒的植物和植物细胞。此外，组合物包括这些植物的转基因的种子。

可操作地连接到启动子的是可以修饰植物表型的目的序列。该修饰可以包括，例如，调整内源性产物的产生，或可以包括外源表达产物的产生，以在植物中提供新功能或产物。例如，包括异源核苷酸序列，其编码赋予对除草剂或有害生物的抗性的基因产物。

附图说明

图1显示了当处于Pbdc6(SEQIDNO:1)和Pbdc7(SEQIDNO:2)启动子控制下时荧光素酶的高水平表达。

详细说明

本发明涉及用于调控植物或植物细胞中基因表达的组合物和方法。本发明的组合物包括用于大豆启动子的新型核苷酸序列。具体地，本发明提供了分离的启动子核酸分子，其包含SEQIDNO:1或2所示的核苷酸序列，及其片段和变体。此外，还提供了转化的植物、植物细胞以及种子。

当本发明的启动子序列在DNA构建体内被组装好以使该启动子可操作地连接到目的核苷酸序列时，该启动子序列驱动通过该DNA构建体稳定转化的生物体细胞，特别是植物细胞，的核苷酸序列的表达。启动子序列也可用作探针用于隔离其他大豆启动子序列或基因，用作分子标记等等。

用于在植物中表达核苷酸序列的方法包括：将包括本发明的启动子的表达盒引入植物细胞，该启动子可操作地连接到目的核苷酸序列，并且从植物细胞再生成转化植物。

本文所用冠词“一”是指语法上该冠词的宾语有一个或一个以上(即指至少一个)。举例而言，“元件”意指一个或多个元件。

本文所用术语“核酸分子”旨在包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)以及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA类似物。该核酸分子可以是单链的，或是双链的，但优选地是双链的DNA。

“分离的”或“纯化的”核酸分子或其生物活性部分，当由重组技术制备而得时，基本不含其它细胞物质或培养基，或当经化学合成时，基本不含化学前体或其它化学物质。优选地，“分离的”核酸中不含有天然侧接生物体基因组DNA中核酸(即位于该核酸5′端和3′端的序列)的序列(优选地蛋白编码序列)，该生物体为该核酸来源。就本发明而言，当“分离的”用于表述核酸分子时，不包括分离的染色体。例如，在不同的实施例中，启动子分子可包含小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，该核苷酸序列天然侧接细胞基因组DNA中的核酸分子，该细胞为该核酸来源。以下小节中更详细地阐述本发明的不同方面。

分离的核酸分子及其变体和片段

本发明的核苷酸序列包含SEQIDNO:1和2所示的启动序列及其变体。“启动子”是指作用是引导下游编码序列转录的核酸序列。启动子一般包括DNA序列，该序列与位于转录起始(加帽)位点5'端10-30个碱基对附近的共有5'-TATAAT-3'(TATA盒)同源，该转录起始位点能够引导RNA聚合酶以启动RNA合成。启动子可以进一步包括其他识别序列，通常位于TATA盒上游或5'端，称为上游启动子元件，其影响转录起始速率。这些包括CAAT盒，其经常在TATA盒5'端30-70碱基对附近被发现，并且与标准形式5'-CCAAT-3'(布里纳希和尚邦(1981)生物化学年鉴50:349-383)(BreathnachandChambon(1981)Ann.Rev.Biochem.50:349-383)同源。在植物中，CAAT盒有时由称为AGGA盒的序列所替换，该序列区具有腺嘌呤残基，其对称地侧接三联体G(或T)NG(梅辛等人(1983)，植物基因工程，T.小菅，C.梅雷迪思以及A.霍尔安德尔(编)，纽约普莱南出版社，第211-227页)(Messingetal.(1983),inGeneticEngineeringofPlants,T.Kosuge,C.MeredithandA.Hollaender(eds.),PlenumPress,NewYork,pp.211-227)。这些元件，连同其他转录和翻译调控核酸序列(也称“控制序列”)，都是表达目的DNA序列所必需的。用于分离和识别本文未提及的调控元件的方法是本领域中公知的，例如增强子和负责编码区的组织或时空表达的元件，参见例如，美国专利号5,635,618、6,218,140、6,303,370、6,310,197以及6,355,864。

“核心启动子”是指无启动子元件的启动子。核心启动子含有用于启动子起作用的必需核苷酸序列，包括TATA盒和转录起始位点。这样的区域通常存在于大多数启动子中，并伴随一些变化。核心启动子区通常被称为最小启动子区，因为其能够独自起作用以启动基础水平的转录。在不同的实施例中，Pbdc6的核心启动子序列对应于SEQIDNO:1的约29-318核苷酸；TATA对应于SEQIDNO:1的约288-296核苷酸；并且翻译起始位点对应于SEQIDNO:1的核苷酸位置318。在其他实施例中，Pbdc7的核心启动子序列对应于SEQIDNO:2的约1341-1643核苷酸，TATA对应于SEQIDNO:2的约1603-1608核苷酸；并且翻译起始位点对应于SEQIDNO:2的核苷酸位置1643。本领域的技术人员将理解核心启动子区可以与以上所述位置在上游或者下游有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多核苷酸不同，并且可以容许核心启动子序列内的变化。

本发明还包括核酸分子，该核酸分子为所披露的启动子序列的片段。“片段”是指启动子序列的一部分。核苷酸序列的片段可以具有生物活性，并且因此能够启动在植物中可操作地连接的核苷酸序列的转录，或者它可以是用作使用下述方法的杂交探针或PCR引物的片段。确定这些片段是否降低表达水平或改变表达特性(组成型表达或诱导型表达)的试验是本领域中所公知的。

核酸分子是启动子序列的片段，根据所期望的用途可包括至少大约20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600个连续核苷酸，或高达存在于本文披露的全长启动子序列中的核苷酸数目(例如，用于SEQIDNO:1的1230个核苷酸，或用于SEQIDNO:2的1688个核苷酸)。“连续的”核苷酸是指彼此紧邻的核酸残基。本发明的启动子的生物活性片段将保留启动子活性(即，启动转录)。“保留启动子活性”是指片段将具有全长启动子的启动子活性的至少大约30％、至少大约50％、至少大约70％或至少大约80％。启动子的生物活性部分可通过分离本发明的启动子核苷酸序列之一的一部分，并且评估该启动子部分的活性来进行制备。用于测定启动子活性的方法是本领域中所公知的。适当方法的实例，参见题为“启动子活性评估”的部分。

这些片段将一般包括具体启动子序列的TATA识别序列。这些片段可通过用限制性酶切割本文披露的天然存在的启动子核苷酸序列、通过合成来自启动子DNA序列的天然存在的序列的核苷酸序列、或通过使用PCR技术来获得。特别参见穆利斯等人(1987)酶学方法155:335-350(Mullisetal.(1987)MethodsEnzymol.155:335-350)以及埃尔利赫编(1989)PCR技术(纽约斯托克顿出版社)(Mullisetal.(1987)MethodsEnzymol.155:335-350,andErlich,ed.(1989)PCRTechnology(StocktonPress,NewYork)。这些启动子片段的变体，例如由定点诱变形成的那些变体，也包括在本发明的组合物中。

本文所披露的启动子序列的变体也包括在其中。“变体”是指足够相同的序列。本发明包括的启动子序列与SEQIDNO:1或2的核苷酸序列足够相同。“足够相同”是指使用如本文所述的比对程序中之一与参考序列相比，核苷酸序列具有至少大约70％或75％、大约80％或85％的序列一致性、大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性。

通过使用众所周知的分子生物学技术，例如聚合酶链式反应(PCR)和如下文概述的杂交技术，可以识别天然存在的变体。核苷酸序列变体还包括通过合成衍生的核苷酸序列，这些通过合成衍生的核苷酸序列如通过使用定点诱变产生，但是仍具有本文限定的启动子活性的核苷酸序列。

本发明所包括的变体具有生物活性，即其继续拥有天然序列所需的生物活性，即，保留启动子活性(即，启动转录)。“保留启动子活性”是指变体将具有天然序列的启动子活性的至少大约30％、至少大约50％、至少大约70％或至少大约80％或更高。用于测定启动子活性的方法是本领域中所公知的。适当方法的实例，参见题为“启动子活性评估”的部分。

熟练的业内人士将进一步了解，通过突变可以改变本发明的核苷酸序列，而不改变启动子在植物细胞中的驱动表达的能力。因而，通过将一个或多个核苷酸取代、添加或缺失引入本文所披露的相应核苷酸序列中，可以产生分离的核酸分子变体。通过标准技术，例如定点诱变和PCR-介导的诱变，可以引入突变。这些核苷酸序列变体也包括在本发明中。

作为替代方案，通过沿着全部或部分的启动子序列随机引入突变，例如通过饱和诱变，可以产生核苷酸序列变体，并且在得到的突变体中，可以筛选能够驱动植物细胞中可操作地连接的核苷酸序列的表达的突变体。

“可操作地连接”是指启动子和第二序列之间的功能连接，其中启动子序列启动并介导与第二序列相对应的DNA序列的转录。通常，可操作地连接意味着连接的核酸序列是毗邻的，且在需要连接两个蛋白编码区时这些连接的核酸序列是毗邻的并处在同一阅读框中，但并非总是如此。

为了确定两个核酸的百分比一致性，对这些序列进行了比对，以达到最佳比较效果。两个核酸的百分比一致性是这些序列共有相同位置的数目的函数(即，百分比一致性＝相同位置的数目/位置总数(例如，重叠位置)x100)。在一个实施例中，两个序列具有相同长度。使用与以下所述类似的技术，无论允许或不允许缺口，可以确定两个序列之间的百分比一致性。在计算百分比一致性时，典型地对精确匹配进行计算。

两个序列之间的百分比一致性的确定可以使用数学算法来完成。用于比较两个序列的数学算法的非限制性实例是卡林和阿特舒尔(1990)美国国家科学院院刊87:2264(arlinandAltschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264)的算法，该算法在卡林和阿特舒尔(1993)美国国家科学院院刊90:5873-5877(KarlinandAltschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877)中得以改良。将该算法结合到阿特舒尔等人(1990)分子生物学杂志Biol.215:403)(Altschuletal.(1990)J.Mol.Biol.215:403.)的BLASTN程序中。可以用BLASTN程序(分值＝100，字长＝12)进行BLAST核苷酸检索，以获得与本发明的启动子同源的核苷酸序列。为了获得有缺口的比对用于进行比较，如阿特舒尔等人(1997)核酸研究25:3389。(Altschuletal.(1997)NucleicAcidsRes.25:3389)所述可利用GappedBLAST。作为替代方案，可用PSI-Blast进行迭代检索以检测分子间的远源关系。参见上文阿特舒尔等人(1997)(Altschuletal.(1997))。当利用BLAST、GappedBLAST以及PSI-Blast程序时，可使用相应程序(例如，BLASTN)的默认参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。用于比较序列的数学算法的另一非限制性实例是ClustalW算法(希金斯等人(1994)核酸研究22:4673-4680)(Higginsetal.(1994)NucleicAcidsRes.22:4673-4680)。ClustalW比较序列并比对DNA序列的整体，因此可以提供关于完整核苷酸序列的序列保守性的数据。ClustalW算法已被用于几种商业上可获得的DNA分析软件包中，例如载体NTi程序组(Informax,Inc)的ALIGNX模块。可用于分析ClustalW比对的软件程序的非限制性实例是GeneDoc^TM。GeneDoc^TM(KarlNicholas)允许评价多个基因之间的DNA相似性和一致性。用于比较序列的数学算法的另一个优选的、非限制性的实例是米勒和迈尔斯(1988)生物科学中的计算机应用4:11-17(MyersandMiller(1988)CABIOS4:11-17)的算法。这样的算法被结合到ALIGN程序(2.0版)中，它是GCG序列比对软件包(可购自美国加利福尼亚州圣地亚哥市9865斯克兰顿路(ScrantonRd.)的阿赛乐德公司(Accelrys,Inc.))的一部分。

除非另有说明，使用内德勒曼和翁施(1970)分子生物学杂志48(3):443-453(NeedlemanandWunsch(1970)J.Mol.Biol.48(3):443-453)的算法的GAP版本10，将用于使用如下参数确定序列一致性或相似性：核苷酸序列使用50的缺口权重和3的长度权重以及nwsgapdna.cmp记分矩阵确定百分比一致性和百分比相似性；核苷酸序列使用8的缺口权重和2的长度权重以及BLOSUM62记分程序确定百分比一致性和百分比相似性。也可采用等效程序。“等效程序”是指任何序列比对程序，当与GAP版本10产生的相应比对相比时，其对任何两个相关序列的对比产生相同的核苷酸残基匹配和相同的百分序列一致性。

使用例如PCR、杂交等方法可以鉴定来自其他生物(特别是其他植物)的相应序列，这些序列与本发明的序列基本上相同。参见例如，J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔(2001)分子克隆：实验手册(纽约冷泉港冷泉港实验室出版社)(SambrookJ.,andRussell,D.W.(2001)MolecularCloning:ALaboratoryManual.(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY))以及英尼斯等人(1990)PCR协议：方法和应用指南(纽约学术出版社)(Innis,etal.(1990)PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications(AcademicPress,NY))。本发明包括通过其与本文所述启动子序列的一致性被识别出的序列。

可以设计寡核苷酸引物用于PCR反应，以扩增来自目的植物的cDNA或基因组DNA的相应DNA序列。用于设计PCR引物和PCR克隆的方法是本领域普遍已知的并且披露在萨姆布鲁克等人(1989)分子克隆：实验手册(第二版，纽约冷泉港冷泉港实验室出版社)(Sambrooketal.(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual(2ded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY))中。参见英尼斯等人编(1990)PCR协议：方法和应用指南(纽约学术出版社)(Innisetal.,eds.(1990)PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications(AcademicPress,NewYork))；英尼斯和盖尔芬德编(1995)PCR策略(纽约学术出版社)(InnisandGelfand,eds.(1995)PCRStrategies(AcademicPress,NewYork))；以及英尼斯和盖尔芬德编(1999)PCR方法手册(纽约学术出版社)(InnisandGelfand,eds.(1999)PCRMethodsManual(AcademicPress,NewYork))。已知的PCR方法包括但不限于使用配对引物、巢式引物、单个特异引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物和部分错配的引物的方法。

在杂交方法中，已知的全部或部分核苷酸序列可以用于筛选cDNA或基因组文库。用于构建这些cDNA和基因组文库的方法是本领域普遍已知的，且披露在上文萨姆布鲁克和拉塞尔，2001(SambrookandRussell,2001)中。杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸，且可以标有可检测的基团(例如³²P)或其他任何可检测的标记，例如其他的放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。可以通过基于本文披露的已知启动子序列，对合成寡核苷酸标记来制造用于杂交的探针。另外，可以使用依据核苷酸序列中的保守性核苷酸而设计的简并引物。探针典型地包括核苷酸序列区域，该核苷酸序列区域在严格条件下与本发明启动子序列的至少大约12、至少大约25、至少大约50、75、100、125、150、175、200、250、300、350或400个连续核苷酸或其片段或变体杂交。杂交探针的制备是本领域普遍已知的，且披露在上文萨姆布鲁克和拉塞尔，2001(SambrookandRussell,2001)中，其通过引用结合在此。

例如，本文所披露的完整启动子序列，或其一个或多个部分，可以被用作能够特异地与类似启动子的相应序列杂交的探针。为了实现在多种条件下的特异性杂交，这些探针包含唯一的、且至少约10个核苷酸长或至少约20个核苷酸长的序列。这些探针可以用于通过PCR扩增来自选定生物体的对应启动子序列。该技术可以用于从目的生物体分离附加的编码序列，或者作为确定生物体中是否存在编码序列的诊断性试验。杂交技术包括平板脱氧核糖核酸库(斑片或菌落)的杂交筛选(参见例如，萨姆布鲁克等人(1989)分子克隆：实验手册(第二版，纽约冷泉港冷泉港实验室出版社)(Sambrooketal.(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual(2ded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY))中。

可以在严格条件下进行这些序列的杂交。“严格条件”或“严格杂交条件”意指这样的条件，在该条件下探针将会与其靶序列杂交，其可检测程度高于与其它序列杂交的可检测程度(例如，至少高于背景技术两倍)。严格条件是依赖序列的，并且在不同的环境中会不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴别出与探针100％互补的靶序列(同源探测)。作为替代方案，严格条件可调整以允许序列中的一些错配，使得检测出更低的相似度(异源探测)。通常，探针长度小于大约1000个核苷酸，或者长度小于500个核苷酸。

典型地，严格条件将是以下条件，其中盐浓度在pH为7.0到8.3时为低于约1.5MNa离子，通常为大约0.01到1.0M钠离子浓度(或其他盐)并且短探针(例如，10到50个核苷酸)的温度为至少约30摄氏度且长探针(例如，大于50个核苷酸)的温度为至少约60摄氏度。也可以通过添加去稳定剂如甲酰胺实现严格性条件。示例性低严格条件包括用30％-35％甲酰胺的缓冲溶液、1MNaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)于37摄氏度杂交，以及在1X至2XSSC(20XSSC＝3.0MNaCl/0.3M柠檬酸三钠)中于50至55摄氏度冲洗；示例性中等严格条件包括在40％-45％甲酰胺、1.0MNaCl、1％SDS中于37摄氏度杂交，以及在0.5X至1XSSC中于55至60摄氏度冲洗；示例性高严格条件包括在50％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS中于37摄氏度杂交，以及在0.1XSSC中于60至65摄氏度冲洗。任选地，冲洗缓冲剂可以包括大约0.1％至大约1％SDS。通常杂交持续时间小于约24小时，通常约4至约12小时。任选地，冲洗缓冲剂可以包括大约0.1％至大约1％SDS。

特异性典型地是指杂交后冲洗的功能，关键因素是最终冲洗解决方案的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交，T_m可以从梅尼克斯和沃尔(1984)分析生物化学138:267-284(MeinkothandWahl(1984)Anal.Biochem.138:267-284)的等式大致估算：T_m＝81.5摄氏度+16.6(logM)+0.41(GC百分比)-0.61(百分比形式)-500/L；式中，M是单价阳离子的摩尔浓度，GC百分比是DNA中的鸟甙和胞嘧啶核苷酸的百分率，百分比形式是甲酰胺在杂交溶液中的百分率，并且L是碱基对中的杂交的长度。T_m是温度(在确定的离子强度和pH下)，在此温度下，50％的互补靶序列与完全相配的探针杂交。每错配1％，T_m降低约1摄氏度；因而，可调整T_m、杂交和/或冲洗条件至与预期同一性的序列杂交。例如，如果获得同一性大于或等于90％的序列，T_m可以降低10摄氏度。通常，严格条件被选择为比在确定的离子强度和pH下的特异序列及其补足物的热力学熔点(T_m)低大约5摄氏度。然而，高度严格条件可以在比热力学熔点(T_m)低1、2、3或4摄氏度下采用杂交和/或洗涤；中等严格条件可以在比热力学熔点(T_m)低6、7、8、9或10摄氏度下采用杂交和/或洗涤；低严格条件可以在比热力学熔点(T_m)低11、12、13、14、15或20摄氏度下采用杂交和/或洗涤。使用等式、杂交、洗涤组合物以及预期的T_m，普通专业技术人员将会理解，杂交和/或洗涤液条件严格性的变化属本质性描述。如果预期的错配度导致T_m少于45摄氏度(水溶液)或32摄氏度(甲酰胺溶液)，SSC浓度可以增加，以便可以使用较高温度。核酸杂交的广泛指南可见于迪杰森(1993)生物化学和分子生物学实验技术一核酸探针杂交第2章第I部分(纽约爱思唯尔出版社)(Tijssen(1993)LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicAcidProbes,PartI,Chapter2(Elsevier,NewYork))；以及奥苏贝尔等人编(1995)现代分子生物学技术，第2章(纽约格林出版社与威立交叉科学出版社)(Ausubeletal.,eds.(1995)CurrentProtocolsinMolecularBiology,Chapter2(GreenePublishingandWiley-Interscience,NewYork)。参见萨姆布鲁克等人(1989)分子克隆：实验手册(第二版，纽约冷泉港冷泉港实验室出版社)(Sambrooketal.(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual(2ded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY))。

本发明包括具有启动子活性且在严格条件下与本文所披露的启动子序列或其片段杂交的分离序列。

使用方法

本发明的方法针对在本发明的启动子序列控制下在植物和植物细胞中表达异源核苷序列。转基因植物可以在表型上发生变化，包括但不限于病原体或昆虫防卫机制的改变，对一种或多种除草剂抗性增强，对胁迫环境条件的耐受能力增强，生产淀粉的能力提高，淀粉生产的水平提高，油含量和/或组分提高，利用、分隔和/或储存氮的能力提高，等等。这些结果可以通过异源基因的表达实现或通过在植物中的内源产物的增加的表达实现。作为替代方案，结果可以通过减少一种或多种内源产物的表达，特别是酶类、转运体，或辅因子实现，或影响在植物中的养分摄取来实现。

通常，本发明启动子的核苷酸序列设置在表达盒中，其具有目的核苷酸序列，典型地异源核苷酸序列，用于在目的植物中的表达。“异源核苷酸序列”是指非自然地可操作地连接至启动子序列的序列，包括自然存在的脱氧核糖核酸序列的非自然存在的多个拷贝。虽然此核苷酸序列对启动子序列是异源的，但对植物宿主可以是同源的、或天然的或异源的或外来的。应该认识到，启动子也可以驱动其相应的同源或天然核苷酸序列的表达。在某些情况下，转化植物可以在表型上发生变化。异源核酸序列包括外源的，或不存在于未转化植物细胞中的序列，也可以是内源的，或存在于未转化植物细胞中的序列。“异源”通常是指如下核酸序列，其对于所在细胞或天然基因组的一部分不是内源的，且已经通过感染、转染、显微注射、电穿孔、显微映像等添加到细胞中。

任何目的序列可以由本发明的启动子序列表达。这些异源核苷酸序列包括但不限于抗除草剂编码序列、杀虫剂编码序列、杀线虫编码序列、抗菌编码序列、抗真菌编码序列、抗病毒编码序列，非生物和生物胁迫耐受编码序列，或修改植物特征(例如产量、粮食品质、营养成分、淀粉品质和量、固氮和/或氮利用，含油量和/或成分)的序列。

本发明的更多特异性目的基因包括但不限于提高农作物产量的基因，提高作物必要性的基因，对赋予非生物胁迫(例如干旱、温度、盐浓度、有毒金属物或微量元素)耐受性的蛋白质进行编码的基因，或对毒素(例如杀有害生物剂和除草剂)产生抗性的基因，或对生物胁迫(例如真菌、病毒、细菌、昆虫，以及线虫的攻击)产生抗性的基因，以及对这些生物体有关病害的发展产生抗性的基因。认识到任何目的基因可以与本发明的启动子序列可操作地连接并在植物中表达。

这些异源核苷酸序列可以编码涉及提供抗病性或有害生物抗性的蛋白质。“抗病性”或“有害生物抗性”是指使植物避免植物病原体相互作用产生的有害症状。抗病性和抗虫性基因，例如用于抗菌保护的溶菌酶或杀菌肽，或蛋白质，例如用于抗真菌保护的葡聚糖酶或者壳多糖酶，或苏云金杆菌内毒素、蛋白酶抑制剂、胶原酶、外源凝集素，或用于控制线虫或昆虫的糖苷酶，均是有用基因产物的例子。目的基因的例子例如可以在www.nbiap.vt.edu/cfdocs/fieldtests2.cfm找到。

“有害生物”包括但不限于昆虫、真菌、细菌、病毒、线虫、螨虫、蜱等等。昆虫有害生物包括选自以下目的昆虫：鞘翅目、双翅目、膜翅目、鳞翅类、食毛目、同翅目、半翅目、直翅目、总翅类、革翅目、等翅目、虱属、蚤目、毛翅目等，特别地是鞘翅目、鳞翅类，以及双翅目。病毒包括但不仅限于烟草或黄瓜花叶病毒、环斑病毒、坏死病毒、玉米矮花叶病毒等等。线虫包括但不仅限于寄生线虫，例如根癌、囊肿，以及病变线虫，其包括异皮虫，根结线虫，以及球异皮线虫；特别地，囊线虫的成员，包括但不限于胞囊线虫(大豆胞囊线虫)；甜菜异皮线虫(甜菜胞囊线虫)；禾谷异皮线虫(禾谷胞囊线虫)；以及马铃薯金线虫和马铃薯白线虫(马铃薯胞囊线虫)。病变线虫包括但不仅限于短体线虫。真菌有害生物包括引起叶锈病、黄锈病、条锈病以及茎锈病的真菌有害生物。

“抗除草剂蛋白”源自“抗除草剂编码核酸分子”的蛋白包括，与不表达该蛋白的细胞相比，赋予细胞耐受更高浓度的除草剂的蛋白，或与不表达该蛋白的细胞相比，耐受一定浓度的除草剂时间更长的蛋白。除草剂抗性性状通过基因编码可以被引入植物，基因编码用于获得对除草剂抗性，这种除草剂可抑制乙酰乳酸合酶(ALS)的作用，特别地磺酰脲类除草剂，可以抑制谷氨酰胺的作用，例如膦苏菌素或basta(例如，bar基因)、草甘膦(例如，EPSP合酶基因和GAT基因)，或对本领域已知的其他类似基因编码。

提高农作物产量的基因包括矮小基因，例如Rht1和Rht2(彭等人(1999)自然400:256-261)(Pengetal.(1999)Nature400:256-261)，以及加快植物生长的基因，例如铵诱导的谷氨酸脱氢酶。提高作物必要性的基因包括，例如，允许植物减少饱合脂肪含量的基因、提高植物的营养价值的基因、增加籽粒蛋白的基因。提高耐盐性的基因是增加或允许植物在比植物的天然环境更高盐浓度的环境中生长的基因，在这些基因中引入耐盐基因。

还提供了用于识别调控元件(例如，启动子、终止子以及增强子)的方法。“调控元件”或“调控区”是指基因上游或下游发现的核酸的一部分，该核酸的一部分可以由DNA或RNA组成，或都包括DNA和RNA以及参与基因表达的物质。调控元件可以能够调解器官特异性，或控制发展基因激活或暂时基因激活，并包括启动子元件、核心启动子元件，可诱导以响应外刺激的元件、构建体激活的元件、转录终止子、多腺苷酸化信号，减小或增大启动子活性的元件，例如分别为负调控元件或转录增强子。“顺式作用”是指物理上与转录序列连续的序列。顺式作用序列典型地与蛋白质或其他分子相互作用以执行(开/关、调控、调整等等)转录。“转录增强子”是指如下核酸序列，当该核酸序列靠近启动子并存在于能够支持转录的转录介质中，与在没有增强子的情况下启动子产生的相比，其赋予更多的转录活性。增强子可以在基因的上游、内里，或下游，甚至距离转录起始位点长达50千碱基产生作用。增强子也可独立地产生作用，与其方向无关。“转录终止子”是指脱氧核糖核酸序列，该序列包括减少或消除转录所必要的核苷酸碱基对序列。“多腺苷酸化信号”是指控制转录和翻译终止的序列。

通过基于植物基因或调控元件设计一种或多种PCR引物，用于植物中使用的调控顺序可以从大豆中克隆。该方法可以包括设计能够与植物的核苷酸序列杂交的至少一种引物，使用引物扩增来自大豆植物的DNA以产生扩增DNA，以及测试用于调控序列活性的扩增DNA。“调控序列活动”是指实现基因转录或翻译的能力。它包括启动子活性、转录增强子活性、终止转录活性，以及聚腺苷酸化活性。测量或测试启动子活性的方法是本领域中公知的(参见题为“启动子活性评估”的部分)。测量或测试增强子活性的方法是本领域中公知的(参见例如，美国专利号6,806,064、6,818,757以及6,784,289)。测量或测试终止子活性的方法是本领域中公知的(参见例如，美国专利号5,093,252)。测量或测试多聚腺苷酸活性的方法是本领域中公知的(参见例如，美国专利号6,632,637)。

作为替代方案，调控元件可以通过其他方法被识别并克隆。例如，大豆基因组或次基因组文库能够使用BAC、粘端质粒或λ载体构建。可通过使用植物中的启动子元件来探测库。作为替代方案，可以通过使用来自植物的基因编码区域来探测文库。由此产生的克隆能够被测序，并确定围绕大豆编码区域的顺式作用元件。作为替代方案，来自不同大豆基因的编码区域的片段可通过PCR从基因组DNA进行扩增，使用从植物基因的保守区设计的引物，例如玉米的保守区。如前所述，随后大豆编码区片段能够用于探测基因组文库。

可使用反向PCR克隆顺式作用元件。如上所述，可获得大豆基因编码区的序列，然后使用设计的PCR引物和反向PCR，以本领域所公知的技术克隆编码区两侧的DNA。

反义的

可操作地连接到本文所披露的大豆启动子的异源核苷酸序列可以是用于靶基因的反义核苷酸序列。“反义核苷酸序列”是指处于与该核苷酸序列的5'-至-3'正常方向相反的方向的序列。反义DNA序列在植物细胞中的表达防止了靶基因的正常表达。反义核苷酸序列编码RNA转录物，该RNA转录物与由靶基因转录产生的内源性信使RNA(mRNA)互补且能够杂交到该内源性信使RNA(mRNA)。以这种方式，抑制通过靶基因编码的天然蛋白的产生，并实现预期的表型反应。只要序列杂交至相应mRNA并干扰其表达，反义序列的修饰就可以被实现。可使用与相应反义序列具有大约70％、80％、85％、90％或95％序列同一性的反义构建体。此外，可使用一部分反义核苷酸中断靶基因的表达。通常，可使用至少50个连续核苷酸、100个连续核苷酸、200个连续核苷酸或更多核苷酸的序列。因而，本文所披露的启动子序列可以可操作地连接到反义DNA序列，以减少或抑制在植物中的天然蛋白的表达。

植物表达盒和转化载体

植物细胞的转化可以通过本领域内已知的多种技术之一实现。“植物”指整个植物、植物器官(例如，叶、茎、根等)、种子、植物细胞、无性繁殖体、胚及其后代。植物细胞可以是分化的或未分化的(例如愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、叶细胞、根细胞、韧皮部细胞、花粉)。“转基因植物”或“转化植物”或“稳定转化的”植物或细胞或组织是指已经将外源核酸序列或DNA片段结合到或整合到植物细胞中的植物。“稳定转化的”意指引入植物的核苷酸构建体整合到植物的基因组，并能够由后代继承。

本发明的启动子序列可在表达盒中提供，表达盒使其能够驱动植物细胞中的目的异源序列的表达。“表达盒”意指能够引起来自细胞中的开放阅读框的蛋白质表达的DNA构建体。盒将沿5'-3'的转录方向，包括转录起始区，以及在植物中起作用的翻译和转录终止区(即终端区)，该转录起始区包括本文所披露的启动子核苷酸序列之一，或其变体或片段，其可操作地连接至目的异源序列。此外，盒可以含有至少一个附加基因以被共转化为生物体，例如可选择的标记基因。作为替代方案，附加基因可以设置于多表达盒上。这样的表达盒设有多个限制位点，用于在调控区的转录调控作用下插入目的异源序列。

这些构建体通常还含有5'和3'端非翻译区。这些构建体可以含有被翻译的“信号序列”或“前导序列”，以促进目的肽向某些细胞内结构的共翻译或翻译后转运，或促使其分泌，这些结构为例如叶绿体(或其它质体)、内质网或高尔基体。例如，基因可利用工程方法加工使其含有信号肽，以促进肽向内质网的转移。还可以优选地加工植物表达盒，使之含有内含子，从而其表达需要内含子的mRNA加工。“信号序列”是指已知的或可能导致穿过细胞膜的共翻译或翻译后肽转运的序列。在真核细胞中，其典型地涉及向高尔基体中的分泌，有些会导致糖基化。“前导序列”是指在翻译时产生足以触发肽链向亚细胞细胞器共翻译转运的氨基酸序列的序列。因而，其包括通过进入内质网、液泡通道、包括叶绿体、线粒体等质体而靶向转运和/或糖基化的前导序列。

“3'非翻译区”是指位于编码序列下游的核苷酸序列。多腺苷酸化信号序列，以及编码能够影响将多腺苷酸片段添加到mRNA前体3'端的调控信号的其他序列，都是3'非翻译区。“5'非翻译区”是指位于编码序列上游的核苷酸序列。其他上游或下游的非翻译元件包括增强子。增强子是作用是提高启动子区的表达的核苷酸序列。增强子是本领域中公知的，且包括但不限于SV40增强子区和35S增强子元件。

终止区域可以是与包括本发明启动子核苷酸序列的转录起始区原生的，可以是与目的DNA序列原生的，或可以来自另一来源。合适的终止区可以从根癌农杆菌的Ti-质粒得到，例如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。参见格里诺等人(1991)分子遗传学与普通遗传学262:141-144(Guerineauetal.(1991)Mol.Gen.Genet.262:141-144)；普劳德富特(1991)细胞64:671-674(Proudfoot(1991)Cell64:671-674)；桑斯法冈等人(1991)基因发育5:00141-149(Sanfaconetal.(1991)GenesDev.5:141-149)；莫根等人(1990)植物细胞2:1261-1272(Mogenetal.(1990)PlantCell2:1261-1272)；芒罗等人(1990)基因91:151-158(Munroeetal.(1990)Gene91:151-158)；巴拉斯等人(1989)核酸研究17:7891-7903(Ballasetal.(1989)NucleicAcidsRes.17:7891-7903)；以及乔希等人(1987)核酸研究15:9627-9639(Joshietal.(1987)NucleicAcidRes.15:9627-9639)。

在适当情况下，可优化目的基因以增加在转化宿主细胞中的表达。也就是说，可以使用宿主细胞优选的密码子合成基因以改进表达，或者可以根据宿主优选的密码子使用频率用密码子合成基因。通常，基因的GC含量将增加。参见例如，卡贝尔和格里(1990)植物生理学92:1-11(CampbellandGowri(1990)PlantPhysiol.92:1-11)，用于讨论宿主优选的密码子使用。用于合成植物优选基因的方法是本领域已知的。参见例如，美国专利号6,320,100、6,075,185、5,380,831以及5,436,391；美国公布申请号20040005600和No.20010003849；以及默里等人(1989)核酸研究17:477-498(Murrayetal.(1989)NucleicAcidsRes.17:477-498)，这些通过引用结合在此。

在一个实施例中，将目的核酸靶向定位在叶绿体中进行表达。以此方式，当目的核酸不是直接插入到叶绿体中时，表达盒将额外含有编码转运肽的核酸或将目的基因产物引导至叶绿体的信号序列。这些转运肽是本领域已知的。参见例如，冯海耶等人(1991)植物分子生物学导报9:104-126(VonHeijneetal.(1991)PlantMol.Biol.Rep.9:104-126)；克拉克等人(1989)生物化学杂志264:17544-17550(Clarketal.(1989)J.Biol.Chem.264:17544-17550)；黛拉-塞奥帕等人(1987)植物生理学84:965-968(Della-Cioppaetal.(1987)PlantPhysiol.84:965-968)；罗默等人(1993)生物化学与生物物理学研究通讯196:1414-1421(Romeretal.(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196:1414-1421)；沙阿等人(1986)科学233:478-481(Shahetal.(1986)Science233:478-481)。

可以优化要靶向定位至叶绿体的目的核酸，以在叶绿体中表达，说明在植物核和该细胞器之间的密码子使用差异。以此方式，可以使用叶绿体偏好的密码子合成目的核酸。参见例如，美国专利号5,380,831，其通过引用结合在此。

“植物表达盒”典型地将被插入到“植物转化载体”。“转化载体”是指对于有效转化植物细胞必需的DNA分子。这样的分子可以包括一个或多个植物表达盒，且可以组织成一个以上“载体”DNA分子。例如，二元载体是使用2个非连续DNA载体编码转化植物细胞的所有必需的顺式和反式作用功能的植物转化载体(海伦斯和姆林内克斯(2000)植物科学发展趋势，5:446-451)(HellensandMullineaux(2000)TrendsinPlantScience,5:446-451)。“载体”是指设计成在不同的宿主细胞之间进行转移的核酸构建体。“表达载体”是指能在外来细胞中结合、整合和表达异源DNA序列或片段的载体。“引入”是指将核苷酸构建体提供给正在被转化的生物体，其方式为使得构建体能够到达生物体的至少一个细胞的内部。

此植物转化载体可以包括实现植物转化所需要的一种或多种DNA载体。例如，本领域的通常作法是使用包括一个以上的连续DNA片段的植物转化载体。这些载体在本领域通常称为‘二元载体’。二元载体以及带有辅助质粒的载体最常用于农杆菌介导转化，在这种转化中，实现有效转化所需的DNA片段相当大、相当复杂，因而将功能分开到各个DNA分子上是有好处的。二元载体典型地含有质粒载体、可选标记和“目的基因”；质粒载体含有T-DNA转移(例如左边界和右边界)所需的顺式作用序列；可选标记设计成能在植物细胞中表达；“目的基因”指该基因设计成能在植物细胞中表达，以期形成一代转基因植物。此质粒载体上还存在细菌复制所需要的序列。

顺式作用序列以适宜方式排列，使其能向植物细胞内有效转移并在细胞中表达。例如，可选标记基因和目的基因位于左右边界之间。通常，第二质粒载体含有反式作用因子，这些反式作用因子介导从农杆菌到植物细胞的T-DNA转移。此质粒通常含有毒性作用(病毒基因)，使植物细胞被农杆菌属感染，并且通过在边界序列切割转移DNA以及使病毒介导的DNA转移，这一点是在本领域了解的(海伦斯和姆林内克斯(2000)植物科学趋势，5:446-451)(HellensandMullineaux(2000)TrendsinPlantScience,5:446-451)。几种类型的农杆菌菌株(例如LBA4404、GV3101、EHA101、EHA105等等)可以用于植物转化。对于通过其他方法转化植物，例如显微映像、显微注射、电穿孔、聚乙二醇等等，第二质粒载体并非必要。

植物转化

本发明的方法涉及将核苷酸构建体引入植物。“引入”是指将核苷酸构建体提供给植物，其方式为使得构建体能够到达植物细胞的内部。本发明的方法不要求使用某个具体方法将核苷酸构建体引入植物，只要求核苷酸构建体能够到达植物的至少一个细胞的内部。本领域已知的用于将核苷酸构建体引入植物的方法包括但不限于稳定转化法、瞬间转化法以及病毒介导法。

“植物”指整个植物、植物器官(例如，叶、茎、根等)、种子、植物细胞、无性繁殖体、胚及其后代。植物细胞可以是分化的或未分化的(例如愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、叶细胞、根细胞、韧皮部细胞、花粉)。

“转基因植物”或“转化植物”或“稳定转化的”植物或细胞或组织是指已经将外源核酸序列或DNA片段结合到或整合到植物细胞中的植物。这些核酸序列包括那些外源的或者未转化的植物细胞中不存在的序列，以及那些或许是内源的或者未转化的植物细胞中或许已经存在的序列。“异源的”通常是指核酸序列对于所在细胞或天然基因组片段不是内源的，而是通过感染、转染、显微注射、电穿孔、显微映像等添加到细胞中的。

本发明中的转基因植物表达了本文所披露的一个或多个新型毒素序列。在不同的实施例中，转基因植物进一步包括一个或多个抗虫性附加基因(例如，Cry1，诸如Cry1A、Cry1B、Cry1C、Cry1D、Cry1E以及Cry1F族中的成员；Cry2，诸如Cry2A族中的成员；Cry9，诸如Cry9A、Cry9B、Cry9C、Cry9D、Cry9E以及Cry9F族中的成员；等等)。本领域的技术人员将会理解，转基因植物可以包括能够表达目的农艺性状的任何基因。在不同的实施例中，本发明的启动子可以用于表1所列专利公开书中描述的一个或一个以上基因的驱动表达，专利公开书中的内容通过引用以其全文结合在此。

表1.

植物细胞的转化可以通过本领域内已知的多种技术之一实现。本发明的杀有害生物基因可以被修饰，以获得或增强在植物细胞中的表达。典型地，表达这样的蛋白的构建体会含有启动子以驱动基因转录，并含有3’非翻译区以使转录终止和多腺苷酸化。这些构建体的组织是本领域中公知的。在某些情况下，设计基因可以是有用的，使得分泌由此产生的肽，或以其他方式将其靶向定位在植物细胞内。例如，基因可利用工程方法加工使其含有信号肽，以促进肽向内质网的转移。还可以优选地加工植物表达盒，使之含有内含子，从而其表达需要内含子的mRNA加工。

典型地，该“植物表达盒”将被插入到“植物转化载体”中。此植物转化载体可以包括实现植物转化所需要的一种或多种DNA载体。例如，本领域的通常作法是使用包括一个以上的连续DNA片段的植物转化载体。这些载体在本领域通常称为“二元载体”。二元载体以及带有辅助质粒的载体最常用于农杆菌介导转化，其中实现高效转化所需的DNA片段的大小和复杂度都是非常大的，且将功能分离到分离的DNA分子上是有利的。二元载体典型地含有质粒载体、可选标记和“目的基因”；质粒载体含有T-DNA转移(例如左边界和右边界)所需的顺式作用序列；可选标记设计成能在植物细胞中表达；“目的基因”指该基因设计成能在植物细胞中表达，以期形成一代转基因植物。此质粒载体上还存在细菌复制所需要的序列。顺式作用序列以适宜方式排列，使其能向植物细胞内有效转移并在细胞中表达。例如，可选择的标记基因和杀有害生物基因位于左右边界之间。通常，第二质粒载体含有反式作用因子，这些反式作用因子介导从农杆菌到植物细胞的T-DNA转移。此质粒通常含有毒性作用(病毒基因)，使植物细胞被农杆菌属感染，并且通过在边界序列切割转移DNA以及使病毒介导DNA转移，这一点是在本领域了解的(海伦斯和姆林内克斯(2000)植物科学趋势，5:446-451)(HellensandMullineaux(2000)TrendsinPlantScience,5:446-451)。几种类型的农杆菌菌株(例如LBA4404、GV3101、EHA101、EHA105等等)可以用于植物转化。对于通过其他方法转化植物，例如显微映像、显微注射、电穿孔、聚乙二醇等等，第二质粒载体并非必要。

一般来说，植物转化方法涉及将异源DNA转移进入靶植物细胞(例如不成熟的或成熟的胚、悬浮培养物、无差别的愈伤组织、原生质，等等)，接着是应用适当的选择(取决于可选择的标记基因)的最大阈值水平以从一组未转化成形的细胞团块恢复转化植物细胞。典型地，将外植体转移到新供应的相同培养基中，并常规培养。随后，在放置于补充最大阈值水平的选择试剂的再生培养基上之后，使转化细胞分化成嫩芽。然后将嫩芽转移到选择性生根培养基中，用于回收生根的嫩芽或小植株。然后转基因的小植株成长为成熟植物并产生稔性种子(例如比睿等人(1994)植物学报6:271-282(Hieietal.(1994)ThePlantJournal6:271-282)；石田等人(1996)自然生物技术14:745-750(Ishidaetal.(1996)NatureBiotechnology14:745-750))。典型地，将外植体转移到新供应的相同培养基中，并常规培养。用于产生转基因植物的技术与方法的一般说明可参见艾尔斯和帕克(1994)植物科学评论性综述13:219-239(AyresandPark(1994)CriticalReviewsinPlantScience13:219-239)以及博米尼尼和裘哈(1997)玉米42:107-120(BommineniandJauhar(1997)Maydica42:107-120。由于转化物质含有许多细胞；在任何一片目的愈伤组织或组织或细胞群中同时存在转化细胞和未转化细胞。杀死未转化细胞并允许转化细胞增殖产生转化植物培养物。通常，去除未转化细胞的能力限制转化植物细胞的快速恢复和转基因植物的成功生成。

转化方法和将核苷酸序列引入植物的方法可以进行靶向定位以便转化的植物或植物细胞的类型，即单子叶植物或双子叶植物而变化。可通过许多方法中的一种来生成转基因植物，这些方法包括但不限于显微注射、电穿孔、直接基因转移、通过农杆菌将异源DNA引入植物细胞(农杆菌介导转化)、用粘附于颗粒的异源外源DNA轰击植物细胞、弹道的颗粒加速、气溶胶束转化(美国公布申请号20010026941、美国专利号4,945,050、国际公布号WO91/00915、美国公布申请号2002015066)、引导转化以及转化DNA的其他不同的非微粒直接介导方法。

转化叶绿体的方法是本领域已知的。参见例如，什瓦布等人(1990)美国国家科学院院刊87:8526-8530(Svabetal.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:8526-8530)、什瓦布和马利加(1993)美国国家科学院院刊90:913-917(SvabandMaliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:913-917)、什瓦布和马利加(1993)欧洲分子生物学学会杂志12:601-606(SvabandMaliga(1993)EMBOJ.12:601-606)。该方法依赖于基因枪递送含有选择标记的DNA，且通过同源重组将DNA靶向定位到质体基因组中。另外，通过对核编码的、质体定位RNA聚合酶的组织偏爱型表达，实现沉默质体载行转基因的反式激活，可以完成质体转化。这样的系统已经在麦克布雷德等人(1994)美国国家科学院院刊91:7301-7305(McBrideetal.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:7301-7305)中报道。

异源的外来DNA整合到植物细胞中后，然后在培养基中选择时应用最大阈值水平，以杀死未转化细胞，并通过定期地转移到新鲜培养基中，分离和繁殖能在该选择处理中存活并推定已转化的细胞。通过连续传代和用合适选择挑战，可以鉴别和繁殖经质粒载体转化的细胞。然后，可以用分子和生物化学方法来确认异源的目的基因是否整合到转基因植物的基因组中。

可根据常规方法将已经转化的细胞培养成植物。参见例如，麦考密克等人(1986)植物细胞报告5:81-84(McCormicketal.PlantCellReports5:81-84)。之后这些植物生长，并且用相同的转化品系或不同的品系对它授粉，并且所得的杂种具有鉴定的所需表型特征组成型表达。可以培养两代或多代，以确保理想表型特征的表达得到稳定维持和遗传，然后收获种子，以确保已经实现了理想表型特征的表达。以此方式，本发明提供了具有稳定地结合到在其基因组中的本发明核苷酸构建体(例如本发明的表达盒)的转化种子(也称作“转基因种子”)。

植物

本发明可以用于任何植物种的转化，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。目的植物的实例包括但不限于玉米、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、马铃薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦和油籽油菜、芸苔属、苜蓿、黑麦、粟类、红花、花生、甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠萝、柑桔树、可可、茶叶、香蕉、油桃、无花果、番石榴、芒果、橄榄、木瓜、腰果、澳洲坚果、杏、燕麦、蔬菜、观赏植物以及针叶树。

蔬菜包括但不限于番茄、莴苣、青豆、菜豆、豌豆以及香瓜属的成员(例如黄瓜、哈密瓜以及甜瓜)。观赏植物包括但不限于杜鹃花、锈球花、芙蓉、玫瑰、郁金香、黄水仙、矮牵牛、康乃馨、一品红以及菊花。优选地，本发明的植物是作物植物(例如，玉米、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科的植物、胡椒、土豆、棉花、稻谷、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦、油籽油菜等等)。

本发明特别适合于单子叶植物系的任何成员，包括但不限于玉米、稻谷、大麦、燕麦、小麦、高粱、黑麦、甘蔗、菠萝、白薯、洋葱、香蕉、椰子以及枣。

植物转化的评估

将异源的外来DNA引入植物细胞后，通过不同的方法，例如分析核酸或蛋白质以及与整合的DNA有关的代谢物，可以确认异源DNA在植物基因组中的转化或整合。

PCR分析是在移植到土壤中之前的早期阶段，筛选转化的细胞、组织或芽是否存在所结合的DNA的快速方法(萨姆布鲁克和拉塞尔，2001，分子克隆：实验手册，纽约冷泉港冷泉港实验室出版社)(SambrookandRussell,2001.MolecularCloning:ALaboratoryManual.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)。使用对目的基因或农杆菌载体背景等具有特异性的寡核苷酸引物进行PCR。

可以通过基因组DNA的Southern印迹分析确认植物转化(上文萨姆布鲁克和拉塞尔，2001(SambrookandRussell,2001))。一般而言，从转化体中提取总DNA，用合适的限制酶消化，在琼脂糖凝胶上分级分离，并转移到硝酸纤维素或尼龙膜上。然后根据标准技术(上文萨姆布鲁克和拉塞尔，2001(SambrookandRussell,2001))，用例如放射标记的³²P靶DNA片段探测膜或“印迹”，以确认所引入的基因在植物基因组中的整合。

做Northern印迹分析时，按照本领域常规使用的标准程序(上文萨姆布鲁克和拉塞尔，2001(SambrookandRussell,2001))，将RNA从转化体的特定组织中分离，在甲醛琼脂糖凝胶中分级分离，印迹到尼龙滤膜上。然后使用本领域公知的方法(上文萨姆布鲁克和拉塞尔，2001(SambrookandRussell,2001))，通过使滤膜与得自于异源基因的放射性探针杂交，检测异源基因编码的RNA的表达，该异源基因可操作地连接到TripPro5启动子。

启动子活性评估

有许多方法可用于评估植物中的启动子活性。启动子对于在其调控控制之下目的基因的表达所起的作用可以在转录或者翻译阶段进行测试。在转录阶段，RNA水平可以通过DNA-RNA杂交检验(即Northern印迹分析)、竞争性逆转录酶PCR以及RNAse保护检验来测试。在翻译阶段，启动子活性可以通过使用针对所合成蛋白质的特定功能检验来确定(例如，通过酶活性或通过蛋白质的免疫检验)。例如，报告基因活性，诸如β-葡糖醛酸酶活性、荧光素酶活性或GFP荧光可在转化后的不同时间段被监测。报告基因活性的监测可以通过酶活性，通过对具有报告基因编码的酶底物的细胞或组织进行染色，或通过在合适波长的光下直接看到(参见例如，王等人(2000)植物科学156:201-211(Wangetal.(2000)PlantScience156:201-211)。通过标准程序(上文萨姆布鲁克和拉塞尔，2001(SambrookandRussell,2001))，利用结合于蛋白质上一个或一个以上抗原的抗体，可以在转基因植物上进行蛋白质免疫印迹，以确认存在目的基因编码的蛋白质，该目的基因可操作地连接到TripPro5启动子。可以检验全长的启动子序列、启动子序列的缺失和突变，并且比较它们的表达水平。参见例如，美国专利号6,072,050；以及萨姆布鲁克等人(1989)分子克隆：实验手册(第二版，纽约冷泉港冷泉港实验室出版社)(Sambrooketal.(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual(2ded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork))，其通过引用结合在此。

以下实例是举例说明而不是任何形式的限制。

实验

实例1.来源于大豆的组成型启动子的识别

使用公共大豆转录组数据库识别在不同组织(叶、荚、花、根等等)中高度表达的基因。这些基因的启动子区(第一个ATG的上游)通过PCR扩增自大豆基因组DNA(Jack)，并被连接到荧光素酶基因编码区和PinII终止子。这些含有启动子的载体被转化进农杆菌。转化得到的农杆菌用于浸润大豆幼苗或菜豆叶片。在25摄氏度下在16小时光照下培育2天后，将叶片在PBS缓冲液中匀化，用于蛋白质提取。然后利用普洛麦格公司(Promega)的STEADY-荧光素酶测定系统测定可溶性蛋白的荧光素酶活性。图1示出了荧光素酶活性，对于每种载体，取被浸润大豆叶片三个独立组的平均值。Pbdc6和Pbdc7显示出与来自拟南芥的Pubi3相当的活性。Pbdc6(SEQIDNO:1)是从编码γ液泡膜内在蛋白的Glyma03g34310获得的。Pbdc7(SEQIDNO:2)是从编码质膜内在蛋白的Glyma23g42220获得的。

实例2.植物原位分析

将携带启动子Pbdc6和Pbdc7的DNA序列分别克隆入pSZ8133以将这些启动子与grg23Ace5连接起来。由此生成的二元载体(pSZ8806和pSZ8807)被转化进农杆菌LBA4404并用于产生转基因大豆植物。通过喷洒4X草甘膦测定每种载体的大约150个转基因事件。在喷洒一星期后对4X草甘膦的抗性评分(表2，0代表没有抗性而4代表抗性最强)。使用UBQ3作为对照。再一次，Pbdc6和Pbdc7显示出与Pubi3At相当的强度。

表2.对4x草甘膦的抗性(表示为每个分类中植物得分的百分率)

载体

启动子

0

1+

2+

3+

2+或3+

pSZ8133

Pubi3At

50％

14％

20％

16％

36％

pSZ8806

Pbdc6

54％

8％

24％

14％

39％

pSZ8807

Pbdc7

44％

13％

21％

22％

43％

说明书中提到的所有出版物和专利申请都表明了本发明相关领域技术人员的技术水平。所有出版物和专利申请以相同程度通过引用结合在此，如同这些出版物或专利申请中的每一个都是特定地和单独地通过引用结合在此的。

尽管为了清楚地理解，本发明通过插图和实例加以详细描述，显而易见的是，可以在随附的权利要求书的范围内作出一定的改变和修改。

Claims (20)

1.一种表达盒，包括以下核酸分子，该核酸分子包括一个核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组，其组成为：

(a)SEQIDNO:1或2中所示的核苷酸序列；

(b)包括SEQIDNO:1或2中所示序列的至少50个连续核苷酸的核苷酸序列，其中所述序列启动植物细胞中的转录；以及

(c)与SEQIDNO:1或2中所示序列具有至少95％的序列一致性的核苷酸序列，其中所述序列启动植物细胞中的转录。

2.如权利要求1所述的表达盒，其中所述核苷酸序列可操作地连接到目的异源核苷酸序列。

3.一种植物细胞，已稳定地将如权利要求2所述的表达盒结合到其基因组中。

4.如权利要求4所述的植物细胞，其中所述植物细胞来自双子叶植物。

5.如权利要求5所述的植物细胞，其中所述双子叶植物是大豆。

6.一种植物，已稳定地将如权利要求1所述的表达盒结合到其基因组中，其中所述核苷酸序列可操作地连接到目的异源核酸。

7.如权利要求6所述的植物，其中所述植物是双子叶植物。

8.如权利要求7所述的植物，其中所述双子叶植物是大豆。

9.转基因种子，包括如权利要求1所述的表达盒。

10.如权利要求6所述的植物，其中该目的异源核酸编码基因产物，该基因产物赋予对除草剂、盐、病原体或者有害生物的抗性。

11.一种用于在植物中表达核苷酸序列的方法，所述方法包括将一个表达盒引入植物细胞中，该表达盒包括一个可操作地连接到目的异源核酸的启动子，其中所述启动子包括一个核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组，其组成为：

(a)SEQIDNO:1或2中所示的核苷酸序列；

(b)包括SEQIDNO:1或2中所示序列的至少50个连续核苷酸的核苷酸序列，其中所述序列启动植物细胞中的转录；以及

(c)与SEQIDNO:1或2中所示序列具有至少95％的序列一致性的核苷酸序列，其中所述序列启动在植物细胞中的转录；并且，

由所述植物细胞再生出转化植物，其中所述植物已稳定地将所述表达盒结合到其基因组中。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述植物是单子叶植物。

13.如权利要求11所述的方法，其中所述植物是双子叶植物。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述单子叶植物是玉米。

15.如权利要求11所述的方法，其中所述异源核酸编码基因产物，该基因产物赋予对除草剂或者有害生物的抗性。

16.一种用于在植物细胞中表达核苷酸序列的方法，所述方法包括将一个表达盒引入植物细胞中，该表达盒包括一个可操作地连接到目的异源核酸的启动子，其中所述启动子包括一个核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组，其组成为：

(a)SEQIDNO:1或2中所示的核苷酸序列；

(b)包括SEQIDNO:1或2中所示序列的至少50个连续核苷酸的核苷酸序列，其中所述序列启动植物细胞中的转录；以及

(c)与SEQIDNO:1或2中所示序列具有至少95％的序列一致性的核苷酸序列，其中所述序列启动植物细胞中的转录。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述植物是单子叶植物。

18.如权利要求16所述的方法，其中所述植物是双子叶植物。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述单子叶植物是玉米。

20.如权利要求16所述的方法，其中该异源核酸编码基因产物，该基因产物赋予对除草剂或者有害生物的抗性。