CN104507483A - 益生元组合物及使用方法 - Google Patents

Abstract

本文提供了包含低聚糖组合(例如唾液酸化低聚糖和岩藻糖基化低聚糖)的益生元组合物，以及其在刺激有益的肠道微生物群(例如双歧杆菌)增殖和/或减小肠道病原体丰度中的用途。所述益生元组合物可进一步包含益生菌，其可为双歧杆菌、乳酸杆菌、脆弱类杆菌、多形类杆菌、粪肠球菌(其益生菌菌株)、表皮葡萄球菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌或具有类似功能的相关细菌。

Description

益生元组合物及使用方法

相关申请

本PCT申请要求于2012年4月13日提交的美国临时申请号61/623,868的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

发明背景

哺乳动物消化道通常被微生物定植，所述微生物也称为微生物群，包括有益的微生物和病原微生物。细菌构成大部分哺乳动物肠道微生物群落。例如，多达60％的人类粪便干质量是由细菌构成。据信人类肠道被数百种不同微生物物种定植，少许物种通常在肠道微生物群种群中占主要地位。

有人提出肠道微生物群和宿主生物体之间的关系不仅是共存，而是共生关系。即，肠道微生物群中的有益微生物(例如，双歧杆菌)发挥有利于宿主的代谢功能，例如发酵不消化的或不易消化的能量底物、调节宿主免疫系统、预防病原菌生长、以及产生可被宿主摄取的营养素(例如，生物素和维生素K)。所述肠道微生物群失衡，例如，有益微生物的不足或病原微生物的过多，可导致宿主中的疾病。

发明概述

本发明公开内容是基于唾液乳糖和/或岩藻糖基化低聚糖的特定组合表现出预料不到的高益生元效果的发现。例如，这类组合促进肠道有益菌例如双歧杆菌，特别是消化道中发现的多种特定双歧杆菌菌株的生长，并降低发酵期间的pH。

因此，本文描述的是包含唾液酸化低聚糖(例如，唾液乳糖)和岩藻糖基化低聚糖的组合的益生元组合物及其在促进有益菌例如双歧杆菌生长和/或抑制病原微生物生长中的用途。

在一方面中，本发明公开内容提供了一种益生元组合物，其基本上由至少一种唾液乳糖和至少一种岩藻糖基化低聚糖组成。所述唾液乳糖可为3′-唾液乳糖(3’-SL)、6′-唾液乳糖(6’-SL)或其混合物(例如，比例范围从4:1至1:2)，且所述岩藻糖基化低聚糖可包含α1,2-岩藻糖基、α1,3-岩藻糖基和/或α1,4-岩藻糖基残基。在一些实施方案中，所述岩藻糖基化低聚糖是岩藻糖基化中性低聚糖。岩藻糖基化低聚糖的实例包括但不限于，2′-岩藻糖基乳糖(2-FL)、3-岩藻糖基乳糖(3-FL)、乳糖二岩藻四糖(LDFT)或其混合物(例如，2’-FL和3-FL的混合物；2’-FL和LDFT的混合物；3-FL和LDFT的混合物；或者2’-FL、3-FL和LDFT的混合物)。在一个实例中，所述组合物基本上由3’-SL、6’-SL、2’-FL、3-FL和LDFT的混合物组成。

若需要，任意上述益生元组合物可进一步含有益生菌，其可为以下种群：双歧杆菌(bifidobacteria)、乳酸杆菌(lactobacilli)、脆弱类杆菌(Bacteriodesfragilis)、多形类杆菌(Bacteriodes thetaiotaomicron)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)(其益生菌菌株)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermides)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)或者具有类似功能的相关细菌。在一些实施方案中，所述双歧杆菌种群是长双歧杆菌(B.longum)(例如，长双歧杆菌JCM7007、JCM7009、JCM7010、JCM7011、JCM1210、JCM1260、JCM1272、JCM11347或ATCC15708)、婴儿双歧杆菌(B.infantis)(例如，婴儿双歧杆菌ATCC15697)或其混合物。

在另一方面中，本发明公开内容提供了一种增加有益细菌例如双歧杆菌增殖的方法，以有效增加所述有益细菌种群(例如双歧杆菌种群)增殖的量采用包含唾液乳糖和岩藻糖基化低聚糖(例如，上述那些)的益生元组合物。所述唾液乳糖可为3′-唾液乳糖(3’-SL)、6′-唾液乳糖(6’-SL)或其混合物。所述岩藻糖基化低聚糖可包含α1,2-岩藻糖基、α1,3-岩藻糖基和/或α1,4-岩藻糖基残基。在一些实施方案中，所述岩藻糖基化低聚糖是岩藻糖基化中性低聚糖。岩藻糖基化低聚糖的实例包括但不限于，2′-岩藻糖基乳糖(2-FL)、3-岩藻糖基乳糖(3-FL)、乳糖二岩藻四糖(LDFT)或其混合物(例如，上述那些)。

刚才描述的方法可在体外或体内进行。例如，所述接触步骤可通过给予本文所述益生元组合物至有此治疗需求的受试者进行。在一些实施方案中，将所述益生元组合物口服给予至所述受试者。

需要通过如本文所述益生元组合物治疗的受试者可为人(例如人婴儿例如新生儿)。在一些实施方案中，所述受试者(例如人)患有或疑似具有与肠内有益微生物不足或病原菌存在或过多相关的疾病，或者处于所述疾病的风险中。在其它实施方案中，所述受试者患有或疑似具有肠易激综合征或炎性肠病，或者处于其风险中。

若需要，可以以有效降低有益细菌(例如双歧杆菌种群，例如长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌或其混合物)微环境内pH的量将所述益生元组合物给予至如本文所述受试者。或者，可以以有效降低病原菌(例如大肠杆菌或产气荚膜梭菌)增殖速率的量将所述益生元组合物给予至所述受试者。用于本文所述方法中的益生元组合物可进一步包含益生菌，例如双歧杆菌，例如长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌或其混合物。在一些实施方案中，双歧杆菌种群是长双歧杆菌JCM7007、JCM7009、JCM7010、JCM7011、JCM1210、JCM1260、JCM1272、JCM11347、ATCC15708，婴儿双歧杆菌ATCC15697，或其混合物。

还在本发明公开内容范围内的是(i)药物组合物，用于促进受试者中有益菌的生长，用于治疗与肠内有益微生物不足或病原菌存在或过多相关的疾病，或者用于治疗肠易激综合征或炎性肠病，以及(ii)所述药物组合物在制造用于治疗上述疾病的药物中的用途。所述药物组合物可包含任意本文所述的益生元组合物以及药学上可接受的载体。在一些实例中，所述益生元组合物包含如本文所述的唾液酸化(例如，唾液乳糖)和岩藻糖基化低聚糖的组合以及一种或多种益生菌。

本发明特定示例性、非限制性实施方案的细节在以下说明书中阐明。由以下附图和数个实例的详细说明，以及由所附权利要求，本发明的其它特征和优势将显而易见。

附图简述

图1是显示存在或不存在人乳低聚糖(HMOS)或低聚果糖(FOS)情况下的发酵培养基中pH(图A)和乳酸盐浓度(图B)变化的图表。

图2是显示存在HMOS和FOS情况下的粪便样品中微生物群分布的图表。在补充或未补充有HMOS的发酵培养中通过qPCR测定不同细菌物种的数目。图A：双歧杆菌。图B：产气荚膜梭菌。图C：大肠杆菌。

图3是显示如使用LC-MS测定的不同供体粪便微生物群的人乳低聚糖消耗特点的图表。

图4是显示采用岩藻糖基化低聚糖2’-FL、3-FL、LDFT，HMOS以及低聚果糖阳性对照，FOS的不同细菌的生长增加(图A)和pH降低(图B)百分数的柱状图。

图5是显示如采用岩藻糖基化低聚糖2’-FL、3-FL和/或LDFT；唾液乳糖3’-SL和/或6’-SL；其组合；HMOS；以及FOS所指示的不同细菌的生长增加(图A)和pH降低(图B)百分数的柱状图。

图6是显示采用岩藻糖基化低聚糖2’-FL、3-FL和/或LDFT；唾液乳糖3’-SL和/或6’-SL；其组合；HMOS；以及FOS所指示的不同细菌的生长增加(图A)和pH降低(图B)百分数的柱状图。

图7是显示示例性唾液乳糖和岩藻糖基化低聚糖结构的图表。

发明详述

动物难以消化的膳食多糖可被有益菌利用，从而促进肠道微生物群的定植，特别是有益菌的定植，其对于健康而言是重要的。肠道定植是宿主生物体消化道内活微生物种群的建立或维持。其可为整个消化道的定植以及部分定植，例如仅肠道某一分段(例如小肠、大肠或胃)的定植。在哺乳动物中，肠道定植从出生开始且母乳喂养通常与富集有益菌例如双歧杆菌的典型微生物群相关。这表明乳液中的特定成分具有益生元效应。

有益菌或有益微生物群(还称为益生菌)，是当定植在宿主生物体肠道中时给所述宿主生物体带来有益效果的微生物(例如细菌、真菌、原生动物)。例如，它们代谢宿主生物体不消化的食物成分、以非致病方式调节宿主免疫系统、预防病原菌生长和/或产生可被宿主摄取的营养素(例如生物素和维生素K)。有益菌包括但不限于双歧杆菌、乳酸杆菌、脆弱类杆菌、多形类杆菌、粪肠球菌(粪肠球菌的益生菌菌株)、表皮葡萄球菌、产气肠杆菌和阴沟肠杆菌。

病原菌是指在受试者中可能引起和/或引起疾病或病症的任何细菌。在一些实施方案中，所述术语包括定植受试者肠道的病原菌。在一些实施方案中，所述术语包括若在受试者肠道中存在或过多则致病的物质。示例性病原菌包括但不限于大肠杆菌、产气荚膜梭菌、单核增生李斯特菌、无害李斯特菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌(粪肠球菌的毒性菌株)和屎肠球菌(Enterococcusfaecium)。

本发明公开内容基于(至少部分基于)以下发现：人乳低聚糖(HMOS)，特别是本文所述的岩藻糖基化低聚糖和唾液乳糖，可起到益生元作用，其可作为所需的细菌定植婴儿肠道的能量和营养素来源。益生元是不被受试者(例如，被哺乳动物例如人)消化，且刺激消化系统中一种或多种有益菌(例如，双歧杆菌)的生长或活性和/或抑制消化系统中一种或多种病原菌的生长或活性的食品成分，例如低聚糖。益生元可能选择性刺激受试者消化道中一种或有限种细菌的生长和/或活性。

因此，本文描述的是包含唾液酸化低聚糖(例如，唾液乳糖)和岩藻糖基化低聚糖的组合的益生元组合物及其用于促进有益菌生长/活性和/或抑制病原菌生长/活性的用途。

益生元组合物

本文所述益生元组合物包含具有益生元活性的低聚糖(例如，乳液中发现的低聚糖例如唾液酸化低聚糖和岩藻糖基化低聚糖)的组合。这类组合物因而可用于(在体内或体外)例如促进受试者中一种或多种有益肠道细菌(例如双歧杆菌，包括以下实施例中描述的特定菌株)，所述受试者可为人例如人新生儿，并抑制一种或多种病原菌的生长。

在一些实施方案中，本文所述益生元组合物基本上由至少一种唾液酸化低聚糖(例如，唾液乳糖)和至少一种岩藻糖基化低聚糖组成。此益生元组合物包含特定活性成分，例如所述特定的低聚糖，以及不会实质影响所述组合物的基础和新颖特性的其它试剂。所述特定活性成分可为所述组合物中的主要益生元剂。在一些实例中，所述特定活性成分(例如，所述指定低聚糖益生元)构成各组合物重量的至少约25％，30％，35％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或95％。在其它实例中，所述特定低聚糖益生元构成所述组合物中总糖含量重量的至少约50％，60％，70％，80％，90％或95％。在一个实例中，所述特定低聚糖是所述组合物中的唯一益生元。

低聚糖是包含两个或更多个糖单体的聚合分子。低聚糖可含有2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个糖单体。

唾液酸化低聚糖是含有一个或多个唾液酸部分的低聚糖分子。示例性唾液酸化低聚糖包括3’-SL和6’SL。参见图7。所述益生元组合物可含有3′-唾液乳糖(3’-SL)、6′-唾液乳糖(6’-SL)或二者。当本文所述益生元组合物含有3’-SL和6’-SL的混合物时，3’-SL和6’SL之间的比例(例如，重量/重量，体积/体积，mol/mol)可在10:1-1:10范围内，例如，5:1-1:5，4:1-1:2或2:1-1:2。在一些实例中，3’-SL和6’-SL之间的所述比例为约1:1，约1:2，约1:3，约1:4，约1:5，约1:6，约1:7，约1:8，约1:9，约1:10，约1:10，约1:20，约1:30，约1:40，约1:50，约1:60，约1:70，约1:80，约1:90，约1:100，约2:1，约3:1，约4:1，约5:1，约6:1，约7:1，约8:1，约9:1，约10:1，约20:1，约30:1，约40:1，约50:1，约60:1，约70:1，约80:1，约90:1或约100:1。在其它实例中，3’-SL和6’-SL之间的比例可在1000:1-1:1000范围内，例如，100:1-10:1，10:1-1:1，10:1-5:1，1:100-1:10，1:10-1:1，1:10-1:5。

岩藻糖基化低聚糖是包含一个或多个岩藻糖单体的低聚糖分子，其可为α1,2-、α1,3-或α1,4-连接。在一些实例中，包含于本发明所述益生元组合物中的岩藻糖基化低聚糖是中性低聚糖，其在生理pH下不含酸性或碱性部分。此类岩藻糖基化低聚糖包括但不限于，2′-岩藻糖基乳糖(2-FL)、3-岩藻糖基乳糖(3-FL)和乳糖二岩藻四糖(LDFT)。参见图7。本文所述益生元组合物可含有2’-FL、3-FL、LDFT或其任意组合。在一个实例中，所述组合物含有3’-SL、6’-SL、2’-FL、3-FL和LDFT。

在一些实施方案中，所述益生元组合物含有的唾液酸化低聚糖(一种或多种)和岩藻糖基化低聚糖(一种或多种)的比例范围为100:1-1:100，例如，20:1-1:20，10:1-1:10，5:1-1:5，4:1-1:2或2:1-1:2。

本文所述益生元组合物可含有一种或多种益生元低聚糖(例如，唾液酸化低聚糖例如3’-SL或6’-SL；或岩藻糖基化低聚糖例如2’-FL、3-FL或LDFT)，其构成总组合物的约0.2-98％(例如，至少0.5％，1％，5％，10％，20％，30％，50％，75％或80％)(例如，为每重量干物质或在液体制剂的情况下每体积溶剂的固体成分重量)。

当需要时，本文所述任意益生元组合物可进一步包含益生菌(例如双歧杆菌，还称为双叉乳酸杆菌(lactobacillus bifidus))，即，当以适当量给予时给宿主带来健康益处的活微生物种群。益生双歧杆菌是本领域技术人员众所周知的，且根据本发明方面有用的示例性双歧杆菌包括但不限于，长双歧杆菌和婴儿双歧杆菌(参见，例如，Schell等人，The genome sequence of Bifidobacteriumlongum reflects its adaptation to the human gastrointestinal tract.Proc Natl AcadSci U S A 2002，99(22):14422-7；Fukuda等人，Bifidobacteria can protect fromenteropathogenic infection through production of acetate.Nature 2011，469，543–547；以及Whorwell等人，Efficacy of an encapsulated probioticBifidobacterium infantis 35624 in women with irritable bowel syndrome.American Journal of Gastroenterology 2006，Jul；101(7):1581-90，其各自整体内容在此通过引用并入)。根据本发明一些方面有用的示例性双歧杆菌菌株包括但不限于长双歧杆菌菌株JCM7007、JCM7009、JCM7010、JCM7011、JCM1210、JCM1260、JCM1272、JCM11347和ATCC15708，以及婴儿双歧杆菌菌株ATCC15697。根据本发明方面有用的额外的益生菌包括但不限于，凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、布拉氏酵母菌(Saccharomyces boulardii)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。

在一些实施方案中，所述组合物包含单一益生菌，例如，如本文所述益生菌的单一菌种或菌株。在其它实施方案中，所述组合物包含多种益生菌，例如，两种或多种如本文所述的或本领域技术人员已知的益生菌菌株或菌种的混合物。

在一些实施方案中，所述益生菌以活微生物的形式包含于所述组合物中。在一些实施方案中，所述益生菌以积极生长的和/或分裂的微生物的形式包含于所述组合物中。在一些实施方案中，所述益生菌以休眠形式，例如孢子或内孢子，包含于所述组合物中。

使用益生元组合物促进有益菌生长的方法

考虑到任意本文所述组合物的益生元活性，此类组合物可被用于在体外或体内促进一种或多种有益菌的生长和/或活性。此类组合物还可被用于在体外或体内抑制一种或多种病原菌的生长和/或活性。

在一些实施方案中，本文所述方法包括使有益微生物群(例如，双歧杆菌种群)与有效量的任意如本文所述的益生元组合物接触以增加有益微生物群的增殖。所述接触步骤可在体外，例如在培养皿中进行。或者，此步骤可在体内，例如通过给予所述益生元至需要所述治疗的受试者进行。

如本文使用的术语“增加增殖”在微生物群或微生物(例如有益肠道微生物，例如双歧杆菌)的背景下是指增加各自微生物群或微生物的细胞增殖率和/或细胞存活率。例如，增加微生物增殖的益生元组合物可为当与所述微生物种群接触时，导致微生物中的细胞分裂率和/或存活率相比于不含所述组合物情况下的比例增加至少20％、40％、60％、80％、1倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍或200倍的组合物。

类似地，如本文使用的术语“减少增殖”或“抑制生长”在病原微生物(例如病原性肠道细菌)的背景下是指降低各自微生物的细胞增殖率和/或细胞存活率。例如，增加有益微生物增殖的益生元组合物还可为相比于不含所述组合物情况下的比例降低病原微生物增殖至少20％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的组合物。所述组合物自身对于所述病原微生物可发挥直接的抗增殖效应。或者，所述抗增殖效应可为所述组合物的次级效应。一种示例性次级效应可为通过有益肠道微生物群对于所述组合物的摄取和代谢导致不利于病原微生物生长和增殖的肠道微环境改变。例如，在一些实施方案中，通过有益肠道微生物群例如双歧杆菌对本文所述益生元组合物的摄取和代谢导致所述微生物群微环境的pH向酸性pH改变，其不利于特定病原菌的增殖和/或存活。

在一个实例中，以有效增加受试者肠道中有益微生物增殖至少约25％，至少约50％，至少约75％，至少约1倍，至少约2倍，至少约3倍或至少约5倍的量将益生元组合物给予至有此需要的受试者。所述组合物的所述量可有效促进一种或多种有益菌，例如双歧杆菌、乳酸杆菌、脆弱类杆菌、多形类杆菌、粪肠球菌(粪肠球菌的益生菌菌株)、表皮葡萄球菌、产气肠杆菌或阴沟肠杆菌种群的生长和/或活性。在一些实施方案中，双歧杆菌种群是长双歧杆菌(例如，长双歧杆菌JCM7007、JCM7009、JCM7010、JCM7011、JCM1210、JCM1260、JCM1272、JCM11347或ATCC15708)、婴儿双歧杆菌(例如，婴儿双歧杆菌ATCC15697)或其混合物。

或者，可以有效降低病原菌(例如大肠杆菌或产气荚膜梭菌)增殖率的量将所述益生元组合物给予至受试者。在一些实施方案中，以有效降低所述病原菌增殖率至少约25％，至少约30％，至少约40％，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，至少约95％，至少约98％或至少约99％的量将所述益生元组合物给予至受试者。

本文所述方法可进一步包括监测受试者中所述有益微生物的增殖，例如，通过粪便检查。用于监测微生物群并评估受试者肠道中特定有益微生物增殖的方法是本领域技术人员众所周知的，且示例性、非限制性方法描述在Moro等人，Dosage-related bifidogenic effects of Galacto-and fructooligosaccharidesin formula fed term infants.Journal of pediatric Gastroenterology andNutrition34:291-2952002，和Campbell等人，Selected indigestibleoligosaccharides affect large bowel mass,cecal and fecal short-chain fatty acids,pH and microflora in rats.J.Nutr 127:130-1361997中；二者的整体内容在此通过引用并入。适用于监测益生元组合物对于根据本发明一些方面的受试者微生物群的影响的额外的方法是本领域技术人员已知的或显而易见的，且本发明在此方面不受限制。

在又另一实例中，以有效降低所述双歧杆菌微环境中pH的量给予本文所述益生元组合物至受试者。微环境可为小的或相对小的生境或环境，例如受试者的肠道或其部分。微环境可(至少部分地)隔离于周围环境，例如通过物理屏障。在一些实施方案中，微环境包含细菌细胞或细胞种群及其周围环境，其可直接受到一种或多种细菌细胞的存在或所述细胞的代谢的影响。

测定有益肠道微生物、病原菌的增殖率以及微环境pH(例如在受试者肠道基质内)的方法是本领域技术人员众所周知的。此类方法通常包括在开始限定所述益生元组合物之前评估受试者的肠道微生物群或肠道基质，并在给予所述益生元组合物期间和/或之后监测所述受试者的肠道微生物群或肠道基质。本文描述了一些此类方法，且额外的方法将是熟练技术人员所显而易见的。对于一些示例性、非限制性方法的描述参见例如，Moro等人，Dosage-related bifidogenic effects of Galacto-and fructooligosaccharides informula fed term infants.Journal of pediatric Gastroenterology andNutrition34:291-2952002，和Campbell等人，Selected indigestibleoligosaccharides affect large bowel mass,cecal and fecal short-chain fatty acids,pH and microflora in rats.J.Nutr 127:130-1361997；二者的整体内容在此通过引用并入。应当理解本发明在此方面不受限制。

在另一实例中，以相比于给予开始时的有益微生物的丰度，有效增加受试者肠道中有益微生物例如双歧杆菌的丰度至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍或至少1000倍的量将益生元组合物给予至受试者。此治疗可持续适当时间直至达到所需的结果。在治疗前，所述受试者在他(她)的肠道可具有不可检测水平的有益微生物。可以以足以使得所述有益微生物定植在受试者肠道的量和时间将益生元组合物给予至所述受试者，所述益生元组合物优选含有至少一种益生菌。

在又另一实例中，以相比于给予开始时的病原微生物的丰度，有效减小受试者肠道中的病原微生物例如肠道病原体例如产气荚膜梭菌丰度至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍或至少1000倍的量和时段将益生元组合物给予至受试者。可采用有效量的所述组合物治疗所述受试者适当时段从而使得病原微生物在治疗后的丰度低于可测水平。

本文所述有治疗需求的受试者可为患有、疑似具有与肠内有益微生物不足或病原菌存在或过多相关的疾病或者处于所述疾病的风险中的受试者。此受试者可展现出指示所述受试者肠内有益微生物不足或病原菌存在或过多的临床症状。或者，所述受试者可具有与所述受试者肠内有益微生物不足或病原菌存在或过多相关的疾病的感染风险。例如，在一些实施方案中，所述受试者是具有此类疾病史的受试者。可在候选受试者中检查肠道微生物群中有益微生物的不足或者病原菌和/或有益菌的存在或过多以确定是否需要治疗。

所述受试者还可为患有、疑似具有消化道疾病例如肠易激综合征或炎性肠病或者处于所述消化道疾病风险中的受试者。

如本文使用的术语"受试者"是指哺乳动物，例如灵长类、非人灵长类、人、狗、猫、绵羊、山羊、牛、马、猪、小鼠、大鼠、豚鼠、家畜、野生动物、农场动物或实验动物。在一些实例中，所述受试者是婴儿，例如新生儿。在其它实例中，所述受试者是青少年或成人。在一些实施方案中还包括其它发育阶段例如产前阶段和围产期阶段。

疑似具有或者处于某疾病的风险中的受试者是指相比于平均风险水平的平均怀疑水平，具有提升的存在所述疾病的怀疑水平或者提升的感染所述疾病的风险水平的受试者。例如，显示特定疾病临床症状的受试者具有提升的存在所述疾病的怀疑水平，即便缺乏客观的临床诊断。再如，所述受试者可能易患特定疾病，例如，因为所述受试者的基因组成，或者因为暴露至环境病原体，或者因为存在行为危险因素，例如饮食或其它行为习惯。

本文所述方法可进一步包括在开始给予所述益生元组合物之前评估受试者的肠道微生物群。或者或此外，所述方法可包括在给予所述益生元组合物期间和/或之后监测受试者的肠道微生物群。若已开始给予适当时期，例如1周、2周、3周或约1月后，未在所述受试者中检测到有益微生物例如双歧杆菌的增殖增加，则之后可增加益生元组合物剂量。若检测到受试者肠道微生物群的有益变化，例如有益微生物增殖的增加，则之后可减小益生元组合物的剂量或给予可逐步完全结束。

在一些实施方案中，给予本文所述益生元组合物至受试者以治疗所述受试者中的疾病或病症，例如肠易激综合征或炎性肠病，或者与所述受试者肠道中病原微生物存在或过多相关的疾病(例如，腹泻、胃肠道感染、坏死性小肠结肠炎、克罗恩氏病或憩室炎)。如本文使用的术语“治疗”是指施用或给予包含一种或多种活性剂的组合物至具有任何本文所述疾病、疾病症状或疾病倾向的受试者，目的在于治愈、愈合、缓解、减轻、改变、纠正、改进、改善或影响所述疾病、疾病症状或疾病倾向。

例如，在一些实施方案中，给予如本文所述益生元组合物至呈现至少一种肠易激综合征或炎性肠病的临床表现症状，并在其肠内具有过多病原菌例如产气荚膜梭菌的受试者。在一些实施方案中，在开始采用益生元组合物治疗时进行粪便检查，并在治疗1周后和4周后进行随后的粪便检查，将病原菌细胞计数与初始检查中观测到的病原菌细胞计数进行比较以监测治疗计划的有效性。若一周后未检测到产气荚膜梭菌数目的显著减少，则增加所述益生元组合物剂量。

本文所述方法可应用于已接受或正经历另一治疗例如抗生素治疗的受试者。在一些实施方案中，在抗生素治疗计划结束后立即开始给予所述益生元组合物。在其它实施方案中，在抗生素治疗计划结束约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约1周、约2周、约3周或约1月后开始给予所述益生元组合物。在一些实施方案中，与抗生素治疗同时将益生元组合物给予至受试者。在一些此类实施方案中，在抗生素治疗终点之外继续给予。

在一些实施方案中，提供了一种方法，其中给予如本文所提供的益生元组合物至有需要的或处于肠道微生物群定植阶段的受试者。包含益生菌例如活双歧杆菌种群的益生元组合物特别适用于给予至此类受试者，其包括新生儿，以及经历了造成受试者微生物群失衡或根除了大多数或所有受试者微生物群的治疗例如口服抗生素治疗的受试者。

制剂、给予途径和剂量

可以以本领域技术人员已知的任何适当的形式配制及给予本文所述益生元组合物。对于肠内给予，本发明益生元组合物可配制为固体、半固体、凝胶或液体形式的制剂，例如片剂、胶囊剂、粉末剂、颗粒剂、溶液剂、贮库剂(depository)、凝胶剂和注射剂。适于口服给予的组合物可呈现为离散单元，例如胶囊、片剂、糖锭，各自含有预定量的活性剂。其它组合物包括水性液体或非水性液体中的混悬液例如糖浆剂、酏剂、凝胶剂或乳剂。

在一些实施方案中，本文所述组合物通过肠内途径给予至受试者，例如，以粉末、粉末饮料、液体、胶囊或丸剂的形式口服。在一些实施方案中，以单一剂量将益生元组合物给予至受试者，而在其它实施方案中，在特定时段给予多剂量。例如，在一些实施方案中，每天给予本文所述益生元组合物1、2、3、4或5剂，优选每天一剂。在一些实施方案中，给予持续约1周、约2周、约3周、约4周、约1月、约5周、约6周、约2月、约3月、约4月、约5月、约6月或约1年时间。在一些实施方案中，持续给予直至受试者中的临床症状改善。在一些实施方案中，持续给予直至在受试者肠道微生物群中检测到有益微生物例如双歧杆菌，或者在受试者肠道微生物群中检测到有益微生物细胞数目的增加。

应当理解，在一些实施方案中，本文所述益生元组合物的不同组分通过相同途径(例如口服)给予，而在其它实施方案中，益生元组合物的不同组分可通过不同途径给予。例如，在一些实施方案中，益生元低聚糖可通过一种肠内途径给予，而益生菌可通过不同的肠内途径给予。在一些实施方案中，如本文提供的组合物被配制为固态组合物，其包含一种或多种组分的粉末、颗粒、微丸、丸剂或结晶形式。在一些实施方案中，此固态组合物包含两种或多种固体形式的低聚糖的混合物。适于口服给予的组合物可呈现为离散单元，例如胶囊、片剂、糖锭，各自含有预定量的活性剂。其它组合物包括水性液体或非水性液体中的混悬液例如糖浆、酏剂或乳剂。

对于口服给予，可通过与本领域众所周知的药学上可接受的载体组合容易地将试剂配制。此类载体使得本发明试剂可配制为片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、混悬液等，用于被待治疗受试者口服摄取。可以通过在固体赋形剂加入适当助剂后(若需要该助剂的话)，任选研磨所得混合物，并加工所述颗粒混合物而获得片剂或糖衣丸核，从而获得用于口服使用的药物制剂。适当的赋形剂具体为填充剂例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制品，例如玉米淀粉、小麦淀粉、水稻淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。若需要，可加入崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐例如海藻酸钠。所述口服制剂还可任选地在盐水或缓冲液中配制，用于中和内部酸性条件或可在无任何载体情况下给予。

提供具有适当包衣的糖衣丸核。为此目的，可使用浓缩糖溶液，其可任选含有阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液(lacquer solutions)、以及适当的有机溶剂或溶剂混合物。可往所述片剂或糖衣丸包衣中加入染料或色素用于鉴别或表征活性化合物剂量的不同组合。

可口服使用的药物制剂包括由明胶制成的推入配合(push fit)胶囊以及由明胶和增塑剂例如甘油或山梨醇制成的软的、密封胶囊。所述推入配合胶囊可含有活性成分，掺合有填充剂例如乳糖、粘合剂例如淀粉和/或润滑剂例如滑石或硬脂酸镁，以及任选的稳定剂。在软胶囊中，活性化合物可溶于或混悬于适当液体中，例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。此外，可加入稳定剂。还可使用经配制用于口服给予的微球。此类微球在现有技术中是明确定义的。用于口服给予的所有制剂应为适于此种给予的剂量。

在一些实施方案中，益生元组合物包含两种或多种组分，例如如本文所述的两种或多种益生元低聚糖或者一种益生元低聚糖和一种益生菌，可配制为所有组分的组合或混合物，例如，所有低聚糖和/或益生菌的混合物，例如，形式为固体、液体、粉末、凝胶或本文所述的其他形式。在一些实施方案中，包含两种或多种益生元低聚糖的益生元组合物可以以单独试剂或化合物配制和/或给予，或者以单独任意亚组合以及一种或多种附加组分的混合物配制和/或给予。应当理解本文所述组合物的益生元试剂可同时、同期或在疗程期间给予。因此，在一些实施方案中，本文所述的两种或多种益生元低聚糖的组合制剂可被提供用于在如本文所述治疗中同时、单独或顺序使用。

在一些实施方案中，给予固定比例的本文所述益生元低聚糖和/或益生菌比例，例如在含有特定比例的所有低聚糖和益生菌(若有的话)的固体或液体制剂中，或通过组合各别低聚糖和/或益生菌以导致特定比例。比例可基于例如重量、体积和/或特定益生元或益生菌试剂的生物活性，或其组合。

本发明的一些方面提供了包含本文所述益生元和/或益生菌试剂的药物组合物。根据本发明一些方面的药物组合物包含有效量的如本文所述的益生元和/或益生菌试剂，其为固体形式，或者溶于或分散于药学上可接受的载体中。优选地，药物组合物是无菌的，或者在包含益生菌的情况下，包含无任何病原微生物或致炎试剂的分离益生菌种群。短语“药学上或药理学上可接受的”是指当适当地给予至动物例如人时通常不会产生不利的、过敏的或其它不良反应的分子实体和组合物。此外，对于动物(例如人)给予，应当理解制剂应满足如FDA生物标准办公室所要求的无菌、产热原性、一般安全和纯度标准。

在此方面中术语“药学上可接受的盐”是指本发明试剂的相对无毒的、无机或有机酸加成盐。这些盐可在给予媒介物中或剂型制造过程中原位制备，或通过将本发明的纯化益生元试剂与适当的有机或无机酸单独反应，并在随后纯化期间分离如此形成的盐。代表性盐包括溴化盐、氯化盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、膦酸盐、硝酸盐、醋酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘酸盐(napthylate)、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖醛酸盐以及月桂基磺酸盐等。参见，例如，Berge等人(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19。

在其它情况下，本发明试剂可含有一种或多种酸性官能团且因此可与药学上可接受的碱形成药学上可接受的盐。在这些情况下术语“药学上可接受的盐”是指本发明试剂的相对无毒的、无机和有机碱加成盐。这些盐同样可在给予媒介物中或剂型制造过程中原位制备，或通过将游离酸形式的纯化化合物与适当的碱，例如氢氧化物、药学上可接受的金属阳离子的碳酸盐或碳酸氢盐，与氨，或与药学上可接受的有机伯、仲或叔胺单独反应制备。代表性碱金属或碱土金属盐包括锂、钠、钾、钙、镁和铝盐等。用于形成碱加成盐的代表性有机胺包括乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等。参见，例如，Berge等人(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19。

在益生元组合物是液体形式的实施方案中，载体可为溶剂或分散介质，包括但不限于水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、脂质(例如，甘油三酯、植物油、脂质体)及其组合。适当流动性的维持例如可通过使用包衣，例如卵磷脂；通过在载体例如液体多元醇或脂质中的分散液维持所需粒径；通过使用表面活性剂例如羟丙基纤维素；或其组合。在多种情况下，包含等渗剂是适当的，所述等渗剂例如糖、氯化钠或其组合。在一些实施方案中，在药学上可接受的液体溶液中给予的本发明制剂，所述液体溶液通常可含有药学上可接受浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、相容载体、佐剂以及任选的其它治疗成分。

如本文使用的，“药学上可接受的载体”包括任意的和所有的溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料，与此类似的材料及其组合，如本领域普通技术人员所已知的(参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences(1990)，在此通过引用并入)。任意常规载体除与所述活性成分不相容外，其在治疗或药物组合物中的用途是预期的。组合物可包含不同类型载体，取决于其是否以固体、液体或气溶胶形式给予，以及其是否需要无菌。

在某些实施方案中，药物组合物可包含例如，至少约0.1％的益生元和/或益生菌化合物，或此类化合物的混合物。在其它实施方案中，所述益生元和/或益生菌化合物或此类化合物的混合物例如可构成所述组合物的约2％至约75％(重量/重量或重量/体积)，或构成所述组合物的约25％至约60％，或高达99％，以及本文可推导的任意范围。

本发明所述益生元试剂可以各种方式衍生化。如本文使用的本文所提供试剂的“衍生物”包括盐(例如，药学上可接受的盐)、复合物、酯(例如体内可水解的酯)、游离酸或碱、化合物多晶形、溶剂合物(例如，水合物)、前药、偶合伴侣(coupling partner)和保护基。“前药”是指例如在体内转化为生物活性化合物的任意化合物，例如通过胃环境而转化。

在一些实施方案中，益生元组合物可包含抗氧化剂以延迟一种或多种组分的氧化。此外，通过防腐剂例如抗菌剂和抗真菌剂可控制或阻止不必要的微生物作用，所述防腐剂包括但不限于尼泊金类(例如尼泊金甲酯、尼泊金丙酯)、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或其组合。

药学上可接受的载体包括稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂及本领域众所周知的其它材料。具体用于肽的示例性药学上可接受的载体描述在美国专利号5,211,657中。此类制剂可通常含有盐、缓冲剂、防腐剂、相容载体以及任选的其它治疗剂。当用于药物中时，所述盐应为药学上可接受的，但非药学上可接受的盐可便利用于制备其药学上可接受的盐且未从本发明范围中排除。此类药理学上和药学上可接受的盐包括但不限于由以下酸制备的盐：盐酸，氢溴酸，硫酸，硝酸，磷酸，马来酸，醋酸，水杨酸，柠檬酸，甲酸，丙二酸，琥珀酸等。而且，药学上可接受的盐还可制备为碱金属或碱土金属盐，例如钠、钾或钙盐。

可制备本发明中有用的治疗制剂用于贮存，所述制备通过混合具有所需纯度的试剂与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington'sPharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.编(1980))，形式为冻干制剂或水溶液。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用剂量和浓度下对于接受者是无毒的，且包括缓冲剂例如磷酸(phosphate)、柠檬酸(citrate)及其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵，苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；尼泊金烷基酯类例如尼泊金甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖及其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂例如EDTA；糖类例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子例如钠；金属复合物(例如，Zn-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂例如TWEEN TM、PLURONICS TM或聚乙二醇(PEG)。

本文所述益生元低聚糖、益生菌和组合物的剂量将取决于特定临床状况。影响实际剂量的因素为，例如，临床场景，例如受试者中诊断的疾病类型和疾病阶段、年龄、重量、性别和受试者的总体健康状况等。作为一般指南，本文所述益生元组合物的给予范围可为0.1-1000mg(总活性成分)/kg(受试者体重)/天。在一些实施方案中，所述益生元组合物的给予范围可为1-300mg/kg/天。在一些实施方案中，所述益生元组合物的给予范围可为5-20mg/kg/天。在一些实施方案中，所述益生元组合物的给予剂量可为约5mg/kg/天。在一些实施方案中，所述益生元组合物的给予剂量可为约10mg/kg/天。在一些实施方案中，所述益生元组合物的给予剂量可为约20mg/kg/天。

益生元组合物的给予绝对量将取决于各种因素，包括任何同步治疗、剂量数目、治疗计划长度以及个体患者参数，包括年龄、身体状况、健康、大小和重量。这些是本领域普通技术人员众所周知的因素，其可被评估并用于通过不超过常规实验而确定适当剂量或剂量范围。在一些实施方案中，优选使用最大剂量，即，根据正确的医学判断的最高安全、无毒剂量。在一些实施方案中，优选使用不与受试者中任意或任意严重不良反应相关的最高剂量。在一些实施方案中，优选使用提供所需的临床结果的最小剂量，所述临床结果例如肠道微环境的酸化、肠内病原微生物丰度的减小、肠内有益微生物群丰度的增加和/或与肠内病原微生物过多相关的症状的改善。

在一些实施方案中还涉及如本文所述的多剂量的益生元组合物。在一些情况下，本发明益生元组合物与另一药物一起给予，所述药物例如为在肠内抑制病原微生物生长的药物。在一些此类实施方案中，在具有与肠内病原菌存在或过多相关的疾病或病症、或者处于发展所述疾病或病症的风险中的受试者的治疗中使用亚治疗剂量的益生元组合物或其它药物，或者亚治疗剂量的二者。如本文使用的“亚治疗剂量”是指剂量，其小于若在不存在其它一种或多种试剂的情况下给予将在受试者中产生治疗结果的剂量。因此，某试剂的亚治疗剂量是在缺少给予本发明试剂的情况下，将不会在受试者中产生所需的治疗结果的剂量。许多临床使用试剂的治疗剂量是医药领域众所周知的，且另外的治疗剂量可由技术人员无需过度实验下测得。治疗剂量已广泛描述于参考文献中，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，1990；以及许多被医疗职业人员依赖作为疾病和紊乱治疗指南的其它医学参考文献。

在一些实施方案中，给予本文提供的益生元组合物至受试者，所述受试者正在经历或疑似经历与肠道微生物群失衡(例如，所述受试者肠内病原菌存在或过多)相关的症状。在一些实施方案中，以足以预防、减小或改善所述受试者正在经历的至少一种临床症状的量给予本文提供的活性益生元和/或益生菌试剂，或组合物。

在本文所述方法中还可使用持续释放策略。一些此类方法使用聚合物以影响试剂从组合物持续释放。生物不可降解以及生物可降解聚合物基质均可用于递送本发明益生菌组合物至受试者。此类聚合物可为天然或合成聚合物。基于所需的释放时段(通常约几个小时)选择聚合物。在一些实施方案中，使用在肠内缓慢分解，从而经时释放所述益生元组合物的聚合物。所述聚合物任选为可在水中吸收达其重量约90％的水凝胶形式且进一步任选地与多价离子或其它聚合物交联。可用于形成生物可降解递送系统的示例性合成聚合物包括：聚酰胺、聚碳酸酯、聚烯烃、聚亚烷基二醇、聚环氧烷、聚对苯二甲酸烯烃酯、聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚卤乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙交酯、聚硅氧烷、聚氨酯及其共聚物、烷基纤维素、羟烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、丙烯酸和甲基丙烯酸酯聚合物、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、醋酸纤维素、丙酸纤维素、醋酸丁酸纤维素、醋酸邻苯二甲酸纤维素、羧乙基纤维素、三醋酸纤维素、硫酸纤维素钠盐、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)、聚(丙烯酸十八酯)、聚乙烯、聚丙烯、聚(乙二醇)、聚(环氧乙烷)、聚(对苯二甲酸乙二酯)、聚(乙烯醇)、聚乙酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯和聚乙烯吡咯烷酮。生物不可降解聚合物的实例包括乙烯醋酸乙烯酯、聚(甲基)丙烯酸、聚酰胺、其共聚物和混合物。生物可降解聚合物的实例包括合成聚合物例如乳酸和羟基乙酸聚合物、聚酸酐、聚(邻)酯、聚氨酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)和聚(交酯-共己内酯)，以及天然聚合物例如海藻酸盐和其它多糖，包括葡聚糖和纤维素、胶原，其化学衍生物(化学基团例如烷基、亚烷基的取代、加成，羟基化，氧化以及本领域技术人员常规进行的其它修饰)、白蛋白和其它亲水蛋白、玉米蛋白和其它醇溶谷蛋白和疏水蛋白、其共聚物和混合物。通常，这些材料通过酶解或暴露至体内水，通过表面或本体溶蚀而降解。

本文描述了给予受试者益生元组合物用于治疗疾病或病状的数种方法。应理解在本发明各个方面中，本发明具体还包括所述益生元组合物在该疾病或病状的治疗或预防中的用途，以及所述化合物在制造用于治疗或预防该疾病或病状的药物中的用途。

给予途径、频率、剂量和期限可根据受试者中确认的状况而变化。例如，本文所述试剂和组合物的单一给予可能足以减小、预防或改善受试者中的急性状况，然而在经历慢性疾病或病状例如慢性炎性肠病的受试者中，可能指示延伸一段时间的多剂量给予。

在一些实施方案中，给予可持续直至达到所需的终点，例如特定肠道pH、或者肠内有益微生物群的数目或存在、或者肠内病原微生物不存在或丰度减小、或者临床症状的改善或逆转。在其它实施方案中，例如，在预防性实施方案中，益生元组合物可给予特定时间且给予可未达到特定终点而结束。

无需进一步阐述，相信本领域技术人员基于以上描述可最大程度进行和利用本发明。因此，以下特定实施方案仅可被解释为示例性的，且无论如何不会以任何方式限制本发明公开内容的其余部分。本文引用的所有出版物通过引用并入，用于本文所引用的目的或主题。

实施例

材料和方法

体外发酵

依据休斯法(Hughes’method)(Hughes SA，S.P.，Gibson GR，McCleary BV，Rastall RA.2008)在无糖基础培养基中培养粪便细菌。此培养基每升含有：2 g蛋白胨、2g酵母提取物、0.1g NaCl、0.04g K₂HPO₄、0.01g MgSO₄·7H₂O、0.01g CaCl₂·6H₂O、2g NaHCO₃、0.005g氯化血红素(Sigma-Aldridge)、0.5g L-半胱氨酸HCl、0.5g胆盐、2mL Tween 80、10μl维生素K和4mL的0.025％(w/v)刃天青溶液。使用Bryant的厌氧培养法(Bryant，M.P.1972)，所述方法使用Hungate培养管，采用丁基橡胶隔膜将其密封并使用无O₂的CO₂维持厌氧。

新鲜粪便样品收集自十个健康婴儿，所述婴儿在之前6个月未接受抗生素或益生元/益生菌，且没有近期肠胃失调史。在搅拌器中在磷酸盐缓冲的无菌厌氧盐溶液中均化新获得的人类粪便60s(粪便:盐水＝1:10)，并过滤通过双层无菌粗棉布。为实现在1％粪便浆液中5g/L终浓度的试验聚糖，将聚糖部分溶于9mL培养基中1h，然后加入1mL的10％粪便浆液。所有培养管在37℃下培养。48h后取培养液用于分析，我们已确定HMOS处理和阴性对照种群在所述时间下已进入最大稳定期数小时。所有实验一式三份进行。在-20℃贮存样品直至分析完成。

依据Zhang等人(Zhang G，M.D.，Block DE.2009)制备无糖基础培养基ZMB1，研究中性低聚糖存在下的细菌菌株生长。细菌菌株(表1)获自日本微生物保藏中心(Japanese Collection of Microorganism)(RIKEN生物资源中心，日本)、美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(Manassas，VA)。使用强化梭状芽孢杆菌培养基(RCM)用于生长双歧杆菌和产气荚膜梭菌。使用LB用于生长大肠杆菌。过夜培养所有细菌的菌种培养物并在600nm下达到光密度0.5，然而产气荚膜梭菌需要培养2天。使用厌氧培养室(DG250Anaerobic Workstation，Don Whitley Scientific Limited，West Yorkshire，UK)，在37℃下厌氧条件中生长所有细菌。使用2’-FL(2g/L)(Glycosyn，Inc.USA)、3-FL(2g/L)(Glycosyn，Inc.USA)、LDFT(1g/L)(Glycosyn，Inc.USA)及其组合或者HMOS作为唯一碳源。将所有试验材料溶解在培养基中1小时，然后接种如上10％(v/v)细菌培养物。采用细菌培养物接种含有以上试验材料的ZMB1作为处理组。采用细菌培养物接种不含基质的ZMB1作为对照。还采用细菌培养物接种含有FOS(2g/L)的ZMB1作为阳性对照。所有培养管在37℃下培养。48h后取培养液。通过微量滴定板中的光密度(OD＝600nm)测定生长。

pH和乳酸水平的测定

细菌发酵48h后使用pH计(Corning，pH计240，USA)记录培养基pH。使用乳酸分析试剂盒(试剂盒编号K607-100；BioVision Inc.，CA，USA)测定培养基中的乳酸浓度。所有实验一式三份进行。

通过实时PCR对微生物种群的分析

在12，000xg离心一部分发酵培养物(2mL)30min。然后遵循Zhu等人的方法(Zhu，W.Y.，Williams，B.A.等人.2003)从所述培养物提取DNA。使用实时PCR以测定发酵培养结束时存在的细菌DNA。为此目的，依据Collado等人(Collado，M.C.，S.Delgado，A.Maldonado和J.M.Rodríguez.2009)使用一系列种属特异性引物对(表1)。

表1 本研究中使用的寡核苷酸引物

依据Collado等人的方法(Collado,M.C.，S.Delgado，A.Maldonado和J.M.Rodríguez.2009)使用实时PCR检测系统(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)进行PCR扩增和检测。各反应混合物(25μL)的组成为：iQ^TM Green Supermix(Bio-Rad Laboratories)、1μL浓度为0.25μM的各特异性引物以及1μL的模板DNA。在各自循环的最后一步检测荧光产物。扩增后进行熔解曲线分析以区分靶向PCR产物和非靶向PCR产物。标准曲线是提取自各以下所选代表物种的介于2-9个log₁₀菌落形成单位(CFU)之间的纯培养物的细菌DNA的8次10倍稀释：婴儿双歧杆菌S12 ATCC 15697、产气荚膜梭菌ATCC13124、大肠杆菌H10407 ATCC 35401。

各低聚糖消耗的测定

解冻样品并在4℃4000×g离心15分钟。采用0.25mL新制硼氢化钠水溶液(0.5M)处理澄清的上清液(0.5mL)。剧烈混合后，保持所述还原混合物在4℃过夜，然后用0.25mL醋酸(0.5M)处理。在一血清移液管(5×0.5cm)中，从下往上装入玻璃棉、沙子、经处理的0.6g(3meq)AG50W-X8阳离子交换树脂(BioRad)、0.9g(3meq)AG1-X8阴离子交换树脂(醋酸盐形式，BioRad，Hercules CA)、硅藻土。所述AG50W-X8阳离子交换树脂(氢形式，BioRad，Hercules CA)经1M吡啶处理，1h×3次，导致吡啶盐形式。用0.5mL水活化上柱，然后将还原样品(1mL)施加至所述柱。用水(0.5mL)冲洗样品管，并用另外的18mL水洗涤所述树脂柱。洗出液是中性低聚糖，然后在冻干前采用乙醇中的干冰将其冻结。通过Agilent HPLC(1200系列)和配有25℃设置的多孔石墨柱(3μm，100x 2.1mm，Hypercarb，Thermo Scientific，Waltham，MA)的三重-四级杆质谱仪(6460)分析样品中的所述中性低聚糖。通过来自GlycoSeparations(Moscow，Russia)(Newburg，D.S.2001)的真正低聚糖对方法进行验证。

统计分析

数据以均值±SEM表示。通过单因素方差分析(one-way ANOVA)测定组间差异的统计显著性。当发现差异时，使用学生t检验用于成对比较；P≤0.05考虑为显著。

结果

发酵培养物中的pH和乳酸变化

人乳聚糖通过选择使用此独特聚糖的细菌而直接影响定植，并当发酵为乳酸和短链脂肪酸时，使得肠道酸性并刺激一些细菌生长，同时抑制多种病原生物体的定植而间接影响定植。检测发酵培养中的pH和乳酸以确定所述HMOS是否被粪便微生物群发酵。图1显示补充有HMOS的组中的pH显著低于未补充的对照组和补充有FOS的阳性对照组中的pH(P<0.05)。且HMOS补充组中的乳酸盐浓度显著高于对照组(P<0.05)。

细菌种群变化

为确定HMOS的存在是否可以改变肠道微生物群的分布，在存在HMOS和FOS的情况下测定微生物的相对量。在存在HMOS和FOS的情况下通过实时PCR表征供体粪便样品中细菌物种的相对量。图2显示HMOS增加双歧杆菌的数目，而大肠杆菌和产气荚膜梭菌的数目下降。

各低聚糖的消耗

为确定被粪便细菌物种消耗的特定HMOS结构，发酵后从粪便培养物回收上清液，并将残留的HMOS纯化、还原，并通过如之前由Newburg(Newburg，D.S.2001)描述的LC-MASS表征。监测主要的中性低聚糖(包括2’-FL、3-FL和LDFT)。图3。所有供体粪便微生物群的2’-FL和LDFT的平均消耗超过90％，而对于3-FL，所述消耗为约53％。这些数据表明2’-FL和LDFT被粪便细菌分解代谢而3-FL似乎对这些生物体的分解代谢更具抵抗力，因为发现其仅被少量存在的生物体分解代谢。

HMOS和低聚糖组合对于不同细菌菌株生长的影响

本研究中使用的十种不同双歧杆菌(参见下表2)可在图4和5所示浓度利用2’-FL、3-FL、LDFT、其组合，3’-SL、6’-SL、3’-SL和6’-SL的组合，以及所有这些岩藻糖基化低聚糖和唾液乳糖的组合作为主要碳源。

图4显示所有岩藻糖基化低聚糖，2’-FL、3-FL、LDFT和HMOS可显著增加双歧杆菌的生长并降低培养物中的pH。对于大肠杆菌和和产气荚膜梭菌，没有显著地增加其生长以及降低pH。因此，三种各别岩藻糖基化低聚糖的组合对于生长增加以及pH降低具有累积效应。且所述效应等价于总HMOS。这些数据显示所述中性低聚糖可被这些益生生物体用作碳源并抑制病原生物体的生长。

表2 本研究中使用的细菌菌株

总而言之，所述岩藻糖基化中性低聚糖的组合相比于单独个体显示出促进双歧杆菌生长并降低细菌微环境中pH的更高活性。如图4中所示，相比于以重量计的来自人乳的总低聚糖的益生效应，所述三种试验的岩藻糖基化低聚糖的组合显示出促进某些双歧杆菌菌株生长和/或降低其pH的相等或更高的活性。这些低聚糖不刺激不与人类共生的大肠杆菌和产气荚膜梭菌。

唾液低聚糖与其它纯低聚糖组合显示出类似活性。单独的唾液乳糖例如3’-SL和6’-SL对于一些双歧杆菌菌株显示出益生效应。图5。出人意料地，这两种唾液乳糖与岩藻糖基化低聚糖(2’-FL、3-FL和LDFT)的组合显示出等价或更高于总天然HMOS混合物的活性的促进生长和降低pH的活性水平。在含有所述唾液乳糖的混合物中所述降低pH活性尤其显著；其显著超出天然HMOS混合物的活性。图5。

还测试了个体低聚糖及其混合物对于病原体及其它定植微生物群的影响。图6。使用FOS(5g/L)作为阳性对照。因此获得的结果显示一些试验细菌菌株未利用这些低聚糖，一些良好使用FOS，但许多使用HMOS以及所述低聚糖的混合物。图6。所述结果还显示所述混合物对于某些细菌菌株的影响高于HMOS对于相同菌株的影响。

总体而言，上述研究显示通过体外发酵，补充有HMOS、岩藻糖基化低聚糖(2’-FL、3-FL、LDFT或其混合物)、唾液乳糖(3’-SL、6’-SL或其混合物)以及岩藻糖基化低聚糖和唾液乳糖组合的双歧杆菌数目显著高于对照组数目。同时，所有测试的低聚糖组合以及HMOS在所有十种双歧杆菌培养中可显著刺激生长并降低pH。这些结果显示HMOS的益生、促双歧杆菌生长(bifidogenic)效应是结构特异性的并可根据不同个体母乳中的HMOS组成或者哺乳期内变化而变化。喂食母乳的婴儿中双歧杆菌的定植增加可通过利于共生厌氧菌并抑制肠内病原体定植来增强随后的稳定微生物生态系统的长期形成，预防婴儿疾病。

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其它实施方案

本说明书中公开的所有特征可在任何组合中组合。本说明书中公开的各特征可被用于相同、相等或相似目的的替代特征所代替。因此，除非另有明确说明，否则所公开的各特征仅为相等或相似特征通用系列的一个实例。

由以上描述，本领域技术人员可轻易确定本发明的本质特征，并在不脱离其精神和范围的情况下，可对本发明进行各种改变和修饰以使其适应各种用法和条件。因此，其它实施方案也在请求保护的范围内。

Claims (37)

1.一种益生元组合物，其基本上由唾液乳糖和岩藻糖基化低聚糖组成，其中所述唾液乳糖是3′-唾液乳糖(3’-SL)、6′-唾液乳糖(6’-SL)或其混合物，且其中所述岩藻糖基化低聚糖包含α1,2-岩藻糖基、α1,3-岩藻糖基和/或α1,4-岩藻糖基残基。

2.权利要求1所述的益生元组合物，其中所述唾液乳糖是3’-SL和6’-SL的混合物。

3.权利要求1或2所述的益生元组合物，其中所述岩藻糖基化低聚糖包含岩藻糖基化中性低聚糖。

4.权利要求1或2所述的益生元组合物，其中所述岩藻糖基化低聚糖是2′-岩藻糖基乳糖(2-FL)、3-岩藻糖基乳糖(3-FL)、乳糖二岩藻四糖(LDFT)或其混合物。

5.权利要求1-4任一项所述的益生元组合物，其中所述岩藻糖基化低聚糖是以下的组合：

2’-FL和3-FL；

2’-FL和LDFT；

3-FL和LDFT；或

2’-FL、3-FL和LDFT。

6.权利要求1所述的益生元组合物，其中所述组合物基本上由3’-SL、6’-SL、2’-FL、3-FL和LDFT的混合物组成。

7.权利要求1-6任一项所述的益生元组合物，其中所述组合物进一步含有益生菌。

8.权利要求7所述的益生元组合物，其中所述益生菌是以下种群：双歧杆菌、双歧杆菌、乳酸杆菌、脆弱类杆菌、多形类杆菌、粪肠球菌、表皮葡萄球菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌或其组合。

9.权利要求8所述的益生元组合物，其中所述双歧杆菌种群是长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌或其混合物。

10.权利要求9所述的益生元组合物，其中所述双歧杆菌种群是长双歧杆菌JCM7007、JCM7009、JCM7010、JCM7011、JCM1210、JCM1260、JCM1272、JCM11347、ATCC15708、婴儿双歧杆菌ATCC15697，或其混合物。

11.权利要求1-10任一项所述的益生元组合物，其中所述组合物包含4:1至1:2的比例范围的3’-SL和6’-SL。

12.一种增加双歧杆菌增殖的方法，所述方法包括以有效增加所述双歧杆菌种群增殖的量的益生元组合物接触双歧杆菌种群，其中所述益生元组合物包含唾液乳糖和岩藻糖基化低聚糖。

13.权利要求12所述的方法，其中所述唾液乳糖是3′-唾液乳糖(3’-SL)、6′-唾液乳糖(6’-SL)或其混合物。

14.权利要求11或12所述的方法，其中所述岩藻糖基化低聚糖包含α1,2-岩藻糖基、α1,3-岩藻糖基和/或α1,4-岩藻糖基残基。

15.权利要求12-14任一项所述的方法，其中所述岩藻糖基化低聚糖包含岩藻糖基化中性低聚糖。

16.权利要求12-15任一项所述的方法，其中所述岩藻糖基化低聚糖是2′-岩藻糖基乳糖(2-FL)、3-岩藻糖基乳糖(3-FL)、乳糖二岩藻四糖(LDFT)或其混合物。

17.权利要求12-16任一项所述的方法，其中所述接触步骤在体外进行。

18.权利要求12-16任一项所述的方法，其中所述接触步骤包括将所述益生元组合物给予至有此需要的受试者。

19.权利要求18所述的方法，其中将所述益生元组合物口服给予至所述受试者。

20.权利要求18或19所述的方法，其中所述受试者是人。

21.权利要求18-20任一项所述的方法，其中所述受试者是婴儿。

22.权利要求21所述的方法，其中所述婴儿是新生儿。

23.权利要求18-22任一项所述的方法，其中所述受试者患有或疑似具有与肠内有益微生物不足或者病原菌存在或过多相关的疾病，或者处于所述疾病的风险中。

24.权利要求18-23任一项所述的方法，其中所述受试者患有或疑似具有肠易激综合征或炎性肠病，或者处于其风险中。

25.权利要求18-24任一项所述的方法，其中以有效降低所述双歧杆菌微环境中pH的量将所述益生元组合物给予至所述受试者。

26.权利要求18-25任一项所述的方法，其中以有效降低病原菌增殖速率的量将所述益生元组合物给予至所述受试者。

27.权利要求12-26任一项所述的方法，其中所述双歧杆菌种群包含长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌或其混合物。

28.权利要求27所述的方法，其中所述病原菌是大肠杆菌或产气荚膜梭菌。

29.权利要求12-28任一项所述的方法，其中所述益生元组合物进一步包含益生菌。

30.权利要求29所述的方法，其中所述益生菌是以下种群：双歧杆菌、双歧杆菌、乳酸杆菌、脆弱类杆菌、多形类杆菌、粪肠球菌、表皮葡萄球菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌或其组合。

31.权利要求30所述的方法，其中所述双歧杆菌种群是长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌或其混合物。

32.权利要求31所述的方法，其中所述双歧杆菌种群是长双歧杆菌JCM7007、JCM7009、JCM7010、JCM7011、JCM1210、JCM1260、JCM1272、JCM11347、ATCC15708、婴儿双歧杆菌ATCC15697，或其混合物。

33.权利要求12-32任一项所述的方法，其中所述益生元组合物包含4:1至1:2的比例范围的3’-SL和6’-SL。

34.一种用于治疗肠胃失调的药物组合物，所述组合物包含权利要求1-11任一项所述的益生元组合物。

35.权利要求34所述的药物组合物，其中所述肠胃失调与有益微生物不足或病原微生物过多相关。

36.权利要求34或35所述的药物组合物，其中所述肠胃失调是肠易激综合征或炎性肠病。

37.权利要求1-11任一项所述的益生元组合物在制造用于治疗肠胃失调的药物中的用途。