CN114728028A - 包括具有增强的持久性的新微生物的组合物、新微生物和益生元的协同组合 - Google Patents
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Abstract
提供了特别有效的益生元‑益生菌组合以及鉴别协同益生菌‑益生元组合的方法,该组合包括新益生菌长双歧杆菌长亚种和XOS以及假链状双歧杆菌与低聚木糖。此外,还提供了包括益生菌和益生元的试剂盒。
Description
背景技术
现在已经普遍接受的是,胃肠道微生物组的组成和功能在维持宿主健康方面发挥重要作用。饮食如何影响人类肠道微生物组是食品、营养和生物医学科学中最重要的研究领域之一。特别是,受到破坏或失调的微生物群被认为会导致多种胃肠道疾病和全身疾病。研究人员现在对开发纠正或恢复这些不平衡的治疗方法或饮食方法特别感兴趣。
许多生物医学报告和临床试验的常见结果是,观察到具体治疗可能对一些个体有效,但对其他个体无效。这种反应者/无反应者现象在使用益生菌、益生元和其他肠道健康干预措施的试验中也很常见。例如,虽然许多临床研究显示益生元补充剂可诱发双歧杆菌反应,但经常有研究参与者不会发生这种预期反应。根据定居微生物群鉴别或预测反应者和无反应者仍然是一项重大挑战。
有几种解释可以解释无反应者表型。对于益生元,无反应者可能缺乏在生理或生化上具备利用具体基质的相关菌株。或者,即使存在此类菌株,微生物群的其他成员也可能在与这些菌株竞争基质方面完全胜出。同样,益生菌也受宿主特异性作用的影响。为了到达结肠,摄入的菌株可能无法幸免于胃和小肠消化。在结肠中,它们可能被其他肠道共生体抑制或取代。
在肠道中富集有益微生物的一种方法是,以合生元的形式引入具体菌株。理想的是,这些合生元应由益生元-益生菌组合组成,使得益生元被益生菌特异性且优先发酵。这种方法的理由基于经典的生态理论。具体而言,蒂尔曼(Tilman)的资源比率竞争模型指出,某些分类群的优势取决于具体资源的可利用性和需求以及养份消耗率。因此,如果合生元被配制为使得益生元特异性地刺激伴随益生菌的生长,后者会有更大的机会在肠道中建立。事实上,之前的研究描述了益生菌作为合生元施用时可能的持久性。
适当设计的合生元也有可能通过将无反应者转化为反应者来提高反应率。十多年前就设想了这些所谓的协同合生元,但成功的协同合生元制剂的报道很少。这很可能是由于缺乏可阐明协同作用的、使益生元和益生菌配对的战略方法。
最近,我们描述了一种称为体内选择(in vivo selection)或IVS的方法。简而言之,青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)的土著菌株(即胃肠道的正常定居者)通过益生元低聚半乳糖(GOS)在体内富集,然后通过培养方法回收。当将富集菌株(青春双歧杆菌IVS-1)与GOS重组为合生元,并引入啮齿动物中时,IVS-1的丰度增加到37%。IVS-1菌株的丰度增加被认为是由于该菌株能够比其竞争对手(包括其他定居的双歧杆菌)更快速地消耗GOS所致。尽管当与人类个体中的益生元组合时,IVS-1的丰度没有增加,但与双歧杆菌(Bifidobacterium)的外源菌株(即胃肠道的非定居者)相比,该菌株仍达到了更高的丰度水平(Krumbeck et al.,2018)。
尽管IVS方法对分离具有推定的有益特性的土著协同菌株有潜力,但该方法至少需要进行人类个体研究。相比之下,如果可以设计出模拟IVS方法的可重复体外策略,就有可能以更快、更具成本效益的方式获得类似菌株。
本公开提出体外富集(in vitro enrichment,IVE)概念,作为选择可能的协同的推定益生菌菌株的替代策略。使用靶向方法,通过逐步分批粪便发酵模型富集了双歧杆菌的土著菌株。当与同源益生元组合时,通过IVE获得的此类菌株有望在肠道环境中具有竞争力。在这项研究中,我们使用了益生元低聚木糖(XOS),并成功获得了当与XOS一起重新引入来自多个供体的体外粪便环境中时表现出协同作用的双歧杆菌菌株。
发明概述
在本公开的一方面,提供了益生菌物种和益生元(“互补合生元”或“合生元”)的协同组合。在一些形式中,益生菌物种选自由以下组成的组:假链状双歧杆菌(B.pseudocatenulatum)、长双歧杆菌(B.longum)及其任何组合或提取物。在一些形式中,益生元是低聚木糖(XOS)。在一些形式中,益生元是长双歧杆菌长亚种(B.longum subsplongum)CR15或假链状双歧杆菌CR16,优选长双歧杆菌长亚种CR15。在一些形式中,益生元包括有助于益生元利用的酶。在一些形式中,酶包括糖基水解酶家族的至少一种成员。在一些形式中,酶优先利用XOS。在一些形式中,酶包括至少两种不同的糖基水解酶家族成员。在一些形式中,长双歧杆菌长亚种CR15或假链状双歧杆菌CR16的核苷酸序列与SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6分别具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。CR15也可以称为NCBI提交号#PRJNA540282。在一些形式中,长双歧杆菌或假链状双歧杆菌的连续核苷酸序列包括至少1000、950、900、850、800、750、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、225、200、175、150、140、130、120、110、105、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、24、23、22、21、20、19或18个与来自SEQ ID NO.5或6的连续核苷酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%的序列同一性的连续核苷酸。优选SEQ ID NO.5或6的连续核苷酸序列和长双歧杆菌或假链状双歧杆菌的连续核苷酸序列来自相同的基因组区。在一些形式中,连续核苷酸序列选自SEQ ID.NOs.15-99及其任何组合。在一些形式中,通过16S测序将细菌物种分类为长双歧杆菌或假链状双歧杆菌。在一些形式中,16S测序会与长双歧杆菌长亚种的16S序列或假链状双歧杆菌的16S序列具有至少95%、96%、97%、98%、98.1%、98.2%、98.3%、98.4%、98.5%、98.6%、98.7%、98.8%、98.9%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%的序列同源性。在一些形式中,长双歧杆菌长亚种的16S序列可以是或对应于由SEQ ID NO.3和4的引物对生成的序列。在一些形式中,假链状双歧杆菌的16S序列可以是或对应于由SEQ ID NO.9和10的引物对生成的序列。在一些形式中,长双歧杆菌长亚种的16S序列与SEQ ID NO.13会具有至少95%、96%、97%、98%、98.1%、98.2%、98.3%、98.4%、98.5%、98.6%、98.7%、98.8%、98.9%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%的序列同源性。在一些形式中,假链状双歧杆菌的16S序列与SEQ ID NO.14会具有至少95%、96%、97%、98%、98.1%、98.2%、98.3%、98.4%、98.5%、98.6%、98.7%、98.8%、98.9%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%的序列同源性。在一些形式中,益生元和益生菌彼此的施用在6小时内,更优选5小时内,仍然更优选4小时内,甚至更优选3小时内,仍然更优选2小时内,甚至更优选1小时内,仍然更优选45分钟内,甚至更优选30分钟内,仍然更优选15分钟内,甚至更优选5、4、3、2、1分钟内,并且最优选同时进行。在一些形式中,以约100:1至1:100的重量比范围施用益生菌和益生元。在一些形式中,将益生菌和益生元组合在组合物中。在一些形式中,组合物的形式选自由以下组成的组:液体、明胶、胶囊、小药囊(sachet)、吸管、片剂、粉末,或与包含一定量的益生菌和一定量的益生元以及施用或食用说明的食品或试剂盒组合,或引入该食品或试剂盒中。在一些形式中,益生菌和益生元呈不同的形式,并附有施用或食用说明。在一些形式中,益生菌和益生元各自施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次。在一些形式中,益生元在益生菌初始施用后施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次。在一些形式中,益生菌在益生元初始施用后施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次。在一些形式中,口服、通过栓剂或通过微生物组移植施用益生菌和/或益生元。在一些形式中,每次施用的益生菌的量包含约106至约1012CFU,更优选108至1011CFU,最优选约109-1010CFU。在一些形式中,将益生菌和益生元施用于动物,优选哺乳动物或家禽,尤其包括人、猪、牛、狗、猫、山羊、绵羊、火鸡和鸡。
在本公开的另一方面,提供了确定益生菌和益生元的协同组合的方法。在一些形式中,该方法包括以下步骤:优选在浆液中用益生元发酵粪便物;将发酵的粪便物-益生元混合物转移到新鲜培养基中至少一次,并确定建立和/或维持了哪些益生菌菌株。在优选的形式中,有多种不同的粪便物-益生元混合物,每一种都具有不同的益生元,以便可以比较哪种益生菌效果最好或最成功地得以建立或维持。在一些形式中,将粪便物-益生元混合物转移至新鲜培养基中至少5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、20、30次或更多次。在一些形式中,确定哪些益生菌菌株得以建立和/或维持包括以下步骤:将粪便物-益生元混合物的样品铺板到生长培养基如琼脂上,更优选为益生菌生长而设计的琼脂,然后通过测序,例如16S rRNA测序,鉴别益生菌菌株。在一些形式中,粪便物补充有具体益生菌菌株,以便比较补充的益生菌与粪便物中天然存在的细菌菌群的生长速率。在一些形式中,粪便物补充有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种益生菌菌株。在一些形式中,益生菌菌株包括假链状双歧杆菌、长双歧杆菌及其任何提取物或组合,并且呈上述任何形式。在一些形式中,益生元是XOS。
在本公开的另一方面,提供了调节个体胃肠道微生物群的方法。通常,该方法包括施用至少一种益生菌物种和至少一种益生元的协同组合的步骤。在一些形式中,益生菌物种选自由以下组成的组:假链状双歧杆菌和长双歧杆菌及其任何组合或提取物,或呈上述任何形式。在一些形式中,益生元是低聚木糖(XOS)。在一些形式中,益生元是长双歧杆菌长亚种CR15或假链状双歧杆菌CR16,优选长双歧杆菌长亚种CR15。在一些形式中,益生元和益生菌彼此的施用在6小时内,更优选5小时内,仍然更优选4小时内,甚至更优选3小时内,仍然更优选2小时内,甚至更优选1小时内,仍然更优选45分钟内,甚至更优选30分钟内,仍然更优选15分钟,甚至更优选5、4、3、2、1分钟内,并且最优选同时进行。在一些形式中,以约100:1至1:100的重量比范围施用益生菌和益生元。在一些形式中,将益生菌和益生元组合在组合物中。在一些形式中,组合物的形式选自以下组成的组:包含一定量的益生菌和一定量的益生元以及使用或食用说明的液体、明胶、胶囊、片剂、粉末或试剂盒。在一些形式中,益生菌和益生元呈不同的形式,并附有施用或食用说明。在一些形式中,益生菌和益生元各自施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次。在一些形式中,益生元在益生菌和/或益生元初始施用后施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次。在一些形式中,益生菌在益生元和/或益生菌初始施用后施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次。在一些形式中,口服、通过栓剂或通过微生物组移植施用益生菌和/或益生元。在一些形式中,每次施用的益生菌的量包含约106至约1012CFU,更优选108至1011CFU,最优选约109-1010CFU。在一些形式中,将益生菌和益生元施用于动物,优选哺乳动物或家禽,尤其包括人、猪、牛、狗、猫、山羊、火鸡、鸡和绵羊。
在本公开的另一方面,提供了改善肠道健康和/或全身健康的方法。在一些形式中,可以通过评估胃肠道特征或参数来确定改善的肠道健康和/或全身健康。在一些形式中,通过以下中的至少一种来确定改善的肠道健康和/或全身健康:排便和规律性的改善、饱腹感改善、肠道屏障功能改善、腹胀和胀气减少、胃肠道感染风险降低、绞痛症状持续时间减少和/或特应性皮炎风险降低。在一些形式中,改善是与未施用上述益生菌和/或益生元的个体或一组个体相比。在一些形式中,改善是在施用本公开的组合物之前和之后与同一个体相比。在一些形式中,改善为至少10、20、30、40、50、60、70、80、90%或更多。通常,该方法包括施用至少一种益生菌物种和至少一种益生元的协同组合的步骤。在一些形式中,益生菌物种选自由假链状双歧杆菌和长双歧杆菌及其任何组合或提取物组成的组。在一些形式中,益生元是低聚木糖(XOS)。在一些形式中,益生元是长双歧杆菌长亚种CR15或假链状双歧杆菌CR16,优选长双歧杆菌长亚种CR15,或呈上述任何形式。在一些形式中,益生元和益生菌彼此的施用在6小时内,更优选5小时内,仍然更优选4小时内,甚至更优选3小时内,仍然更优选2小时内,甚至更优选1小时内,仍然更优选45分钟内,甚至更优选30分钟内,仍然更优选15分钟内,甚至更优选5、4、3、2、1分钟内,并且最优选同时进行。在一些形式中,以约100:1至1:100的重量比范围施用益生菌和益生元。在一些形式中,将益生菌和益生元组合在组合物中。在一些形式中,组合物的形式选自由以下组成的组:包含一定量的益生菌和一定量的益生元以及施用或食用说明的液体、明胶、胶囊、片剂、粉末或试剂盒。在一些形式中,益生菌和益生元呈不同的形式,并附有施用或食用说明。在一些形式中,益生菌和益生元各自施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次。在一些形式中,益生元在益生菌和/或益生元初始施用后施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次。
在一些形式中,益生菌在益生元和/或益生菌初始施用后施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次。在一些形式中,口服或通过微生物组移植施用益生菌和/或益生元。在一些形式中,每次施用的益生菌的量包含约106至约1012CFU,更优选108至1011CFU,最优选约109-1010CFU。
在一些形式中,将益生菌和益生元施用于动物,优选哺乳动物或家禽,尤其包括人、猪、牛、狗、猫、山羊、火鸡、鸡和绵羊。
附图简要描述
专利或申请文件至少含有一幅彩色附图。专利局会在请求和支付必要费用后提供本专利或专利申请公开的带有彩色附图的副本。
当考虑以下详细描述时,会更好地理解本公开,并且除了上述那些之外的特征、方面和优点会变得显而易见。此类详细描述参考以下附图,其中:
图1A的图表说明了在粪便环境中由XOS富集的双歧杆菌发酵实验中成功富集(绿色)和不成功富集(红色)的假设趋势,而菌株的建立依赖于菌株和宿主;
图1B的图表说明了总双歧杆菌(●)和青春双歧杆菌(■)在从中分离出青春双歧杆菌CR11的样品中的富集,其中双歧杆菌在粪便环境中被XOS富集,而菌株的建立依赖于菌株和宿主;
图1C的图表说明了在粪便环境中由XOS富集的青春双歧杆菌CR11(■)的不成功建立和总双歧杆菌(●)的相应富集,而菌株的建立依赖于菌株和宿主;
图1D的图表说明了长双歧杆菌长亚种CR15(■)和总双歧杆菌(●)的建立图。水平虚线表示检测限(104CFU/mL),在粪便环境中双歧杆菌被XOS富集,而菌株的建立依赖于菌株和宿主;
图2A的图表说明了长双歧杆菌长亚种CR15在补充有糖的基本培养基中的生长。在mMRS(◆)和含有XOS中等量残糖(■)、1%葡萄糖(▲)、1%XOS(●);1%XOS DPs 2,3,4和1%XOS DP≥4(▼)的mMRS中,在前16小时内以4小时为周期,并再次在24小时时,测量在600nm波长下的光密度。
图2B是CR15在1%的XOS上生长后剩余XOS片段的TLC。
图3的一系列图表说明了在存在(▲)或不存在(●)XOS的情况下接种到20个个体粪便样品中后,长双歧杆菌长亚种CR15的建立。对于每个实验,菌株以107CFU/mL接种,并使用菌株特异性引物通过RT-qPCR量化。水平虚线表示检测限(104CFU/mL);
图4A的图表说明了,在存在(▲)或不存在(●)XOS的情况下,长双歧杆菌长亚种CR15在所有20个样品中的建立趋势的总结,并表明在7个样品中明确建立了长双歧杆菌长亚种CR15。在接种107CFU/mL的测试菌株之前采集0时间样品。水平虚线表示检测限(104CFU/mL);
图4B的图表说明了在11个样品中可能建立长双歧杆菌长亚种CR15。在接种107CFU/mL的测试菌株之前采集0时间样品。水平虚线表示检测限(104CFU/mL);
图4C的图表说明了在2个样品中长双歧杆菌长亚种CR15被取代或淘汰。在接种107CFU/mL的测试菌株之前采集0时间样品。水平虚线表示检测限(104CFU/mL);
图4D的图表说明了在不存在XOS的情况下,长双歧杆菌长亚种CR15菌株无法在任何样品中建立。在粪便样品中观察到长双歧杆菌长亚种CR15建立的不同趋势。在接种107CFU/mL的测试菌株之前采集0时间样品。水平虚线表示检测限(104CFU/mL);
图5A的图表说明了使用α-多样性香农测量对各处理间微生物群落组成和多样性的分析;
图5B的图表说明了使用α-多样性ASV测量的数量对各处理间微生物群落组成和多样性的分析;
图5C的图表说明了主坐标分析(Principal Coordinate Analysis,PCoA);并揭示了在具有(绿色)或没有(红色)XOS的情况下,基线(蓝色)和发酵期结束时各组之间的不同群落谱(PERMANOVA,p=0.001)。*表示0小时与24小时之间的显著差异。表示在具体时间点的各处理之间的显著差异;
图5D的图表说明了主成分分析(Principal Component Analysis,PCA),并揭示了在具有(绿色)或没有(红色)XOS的情况下,基线(蓝色)和发酵期结束时各组之间不同的群落谱(PERMANOVA,p=0.001)。*表示0小时与24小时之间的显著差异。表示在具体时间点的各处理之间的显著差异;
图6说明了在长双歧杆菌长亚种CR15的建立实验中,XOS驱动的分类群的显著变化。FDR调整的Wilcoxon秩和检验用于鉴别存在(A)和不存在(B)XOS的情况下显著不同的分类群(FDR<0.05)。橙色节点表示与96小时相比基线丰度更高,而绿色和红色节点表示与基线相比96小时丰度更高;
图7A的图表说明了在存在XOS的情况下对应于长双歧杆菌的ASV的丰度显示为每个时间点的相对丰度。0;发酵开始时样品的基线;NX,无XOS下的发酵;X,存在XOS下的发酵;
图7B的图表说明了在存在XOS的情况下对应于假链状双歧杆菌的ASV的丰度显示为每个时间点的相对丰度。0;发酵开始时样品的基线;NX,无XOS下的发酵;X,存在XOS下的发酵;
图7C的图表说明了在存在XOS的情况下青春双歧杆菌的丰度显示为每个时间点的相对丰度。0;发酵开始时样品的基线;NX,无XOS下的发酵;X,存在XOS下的发酵;
图8A的图表说明了在存在XOS的情况下长双歧杆菌长亚种CR15(▲)的富集;
图8B的图表说明了在存在IOS的情况下假链状双歧杆菌的富集。当在基线存在时(9个样品),假链状双歧杆菌在发酵结束时达到高细胞数(A)。当假链状双歧杆菌在基线低于检测水平时(11个样品),该物种在96小时后仍然未检测到;
图9的一组图表说明了分类群和预测的S/BCFA基因的平均相对丰度以及微生物发酵代谢物与在发酵样品中鉴别的属的相关性。仅绘制了与代谢物具有至少一个显著相关性的属。+属丰度与代谢物浓度之间存在显著相关性(FDR<0.05)。SCFA;短链脂肪酸,BCFA;支链脂肪酸,X;XOS,NX;没有XOS;
图10A的图表说明了,在测试的4个样品中,在具有(▲)和不具有(●)XOS的情况下,整个发酵过程中长双歧杆菌长亚种CR15的qPCR定量;
图10B的图表说明了,在各时间点,在存在XOS的情况下,长双歧杆菌的相对丰度图,其中0为发酵开始时样品的基线,NX为无XOS下的发酵,X为有XOS下的发酵,以及其中S14的第4天样品未测序且为▲;+XOS,●;-XOS;和
图10C的图表说明了,在各时间点,在存在XOS的情况下,假链状双歧杆菌的相对丰度图,其中0为发酵开始时样品的基线,NX为无XOS下的发酵,X为有XOS下发酵,以及其中S14的第4天样品未测序且为▲;+XOS,●;-XOS。
图10D的图表说明了,在各时间点,在存在XOS的情况下,青春双歧杆菌的相对丰度图,其中0为发酵开始时样品的基线,NX为无XOS下的发酵,X为有XOS下的发酵,以及其中S14的第4天样品未测序且为▲;+XOS,●;-XOS。
发明详述
除非另有定义,本文所用的所有技术和科学术语与本公开所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同含义。尽管在本公开的实践或测试中可以使用与本文中描述的那些相似或等效的任何方法和材料,但是下文描述了优选的方法和材料。
在一些形式中,本公开的方法涉及,向个体,优选有需要的个体施用至少一种益生菌,优选地选自由以下组成的组:假链状双歧杆菌、长双歧杆菌和任何提取物或组合。本文所用“有需要的个体”是指需要改善胃肠道微生物群和/或肠道健康和/或全身健康的个体的子集。在一个实施方案中,有需要的个体可以包括动物、哺乳动物、家禽,更优选人、猪、牛、狗、猫、山羊、火鸡、鸡和绵羊。此外,该方法包括施用益生元,优选与施用的益生菌或需要在肠道微生物群内建立和增殖的一种细菌菌株或多种细菌菌株协同作用的益生元。在一些优选形式中,益生菌是长双歧杆菌长亚种。
本文所用术语“施用”包括将本文所述细菌菌株和/或其提取物以及益生元引入个体的所有方式,包括但不限于口服(po)、吸入、口腔、舌下、通过栓剂、微生物组移植等。可以以含有常规无毒药学上可接受的载体、佐剂和赋形剂的单位剂型和/或制剂施用本文所述菌株和/或提取物以及益生元。益生菌和/或其提取物和益生元不需要以相同的方式或相同的形式施用。
口服给药的说明性形式包括液体、固体、片剂、丸剂、胶囊、液体介质中的固体、粉末、锭剂、吸管、小药囊、扁囊剂、溶液、酏剂、悬浮液、乳剂、溶液、糖浆、气雾剂、软和硬明胶胶囊、无菌包装粉末,或与食品组合或引入食品中。
在特别合适的实施方案中,本公开的方法包括将益生菌或其提取物和益生元掺入个体的饮食中。在一些形式中,益生菌可以包括活培养物或冻干制剂。
在一些实施方案中,治疗有效量的本文所述各种形式中任何形式的益生菌或其提取物可以与一种或多种赋形剂混合,被一种或多种赋形剂稀释,或封装在这样的载体中,该载体可以呈胶囊、小药囊、纸或其他容器的形式。赋形剂可以用作稀释剂,并且可以是固体、半固体或液体材料,它们充当活性成分的媒介、载体或介质。因此,例如假链状双歧杆菌、长双歧杆菌及其任何提取物或组合可以以液体、固体、片剂、丸剂、胶囊、液体介质中的固体、粉末、锭剂、吸管、小药囊、扁囊剂、溶液、酏剂、悬浮液、乳剂、溶液、糖浆、气雾剂(作为固体或在液体介质中)、软和硬明胶胶囊、无菌包装粉末的形式施用,或与食品组合或引入食品中。
本文所用术语“治疗有效量”是指活性化合物或药剂在研究人员、兽医、医生或其他临床医生探索的组织系统、动物或人中引发生物学或医学反应的量,其包括减轻正在治疗的疾病、疾病状况或小病的症状。一方面,治疗有效量是可以以适用于任何医学治疗的合理收益/风险比治疗或减轻疾病状况、疾病或疾病症状的量。任何具体患者的具体治疗有效剂量水平会取决于多种因素,包括所治疗疾病状况的严重程度;采用的具体成分;患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食;施用时间、给药途径和治疗持续时间;与益生菌或其提取物和益生元联合使用或同时使用的药物;以及医生、研究人员、兽医或其他具有普通技能的临床医生所熟知的因素。
还应当理解,有利地参考在施用诸如假链状双歧杆菌、长双歧杆菌及其任何提取物或组合等益生菌期间可能发生的任何毒性或其他不期望的副作用来选择治疗有效量。
本文所用“益生元”是指发挥健康益处的基质,健康益处可包括但不限于选择性刺激一种或有限数量的有益肠道细菌的生长和/或活性、刺激摄入的益生菌微生物的生长和/或活性、选择性减少肠道病原体,以及有利地影响肠道短链脂肪酸谱。诸如假链状双歧杆菌、长双歧杆菌及其任何提取物或组合等益生菌和/或诸如XOS等至少一种益生元的一些组合,会彼此协同作用。这种益生元可以是天然存在的、合成的或通过生物体和/或植物的基因操作开发的,无论这种新来源现在是已知的还是后来开发的。可用于本公开的益生元可包括可溶性淀粉、酵母提取物、寡糖、多糖和其他含有果糖、木糖、大豆、半乳糖、葡萄糖和甘露糖的益生元。对于一些形式而言,XOS是特别优选的。
更具体而言,可用于本公开的益生元可包括可溶性淀粉、酵母提取物、聚葡萄糖、聚葡萄糖粉末、乳果糖、低聚乳果糖(lactosucrose)、棉子糖、低聚葡萄糖(gluco-oligosaccharide)、菊粉、低聚果糖、低聚异麦芽糖、大豆寡糖、低聚乳果糖、低聚木糖、低聚壳糖(chito-oligosaccharide)、低聚甘露糖(manno-oligosaccharide)、低聚阿拉伯糖(aribino-oligosaccharide)、唾液酸寡糖、低聚岩藻糖(fuco-oligosaccharide)、低聚半乳糖(galacto-oligosaccharide)和低聚龙胆糖(gentio-oligosaccharide)。
在实施方案中,组合物中存在的益生元的总量可以为约1.0g/L至约30.0g/L组合物,包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30g/L。更优选地,营养组合物中存在的益生元的总量可以为约2.0g/L至约8.0g/L组合物。在一些实施方案中,营养组合物中存在的益生元的总量可以为约0.1g/100kcal至约1g/100kcal。在某些实施方案中,营养组合物中存在的益生元的总量可为约0.3g/100kcal至约0.7g/100kcal。
本公开的益生元可以与益生菌处于同一胶囊或制剂中,或处于单独的剂型中。在一些形式中,益生元和益生菌在组合物中彼此接触。本公开的益生元和组合物也可以与碳水化合物或纤维一起服用以增加它们的效果。
本公开的组合物还可以包括一种或多种其他活性成分、赋形剂、溶解剂、表面活性剂、抗氧化剂、消毒剂(antiseptics)、防腐剂、渗透剂、渗透保护剂、冷冻保护剂及其组合。
如本领域技术人员已知的,可以将各种赋形剂与组合物混合。合适的赋形剂包括例如微晶纤维素、麦芽糖糊精、胶体二氧化硅、乳糖、淀粉、山梨醇、环糊精及其组合。
合适的溶解剂包括例如有机酸,例如柠檬酸、富马酸、乳酸、酒石酸、琥珀酸、抗坏血酸、乙酸、苹果酸、戊二酸和己二酸,并且可以单独或组合使用。这些试剂也可以与酸的盐组合,例如柠檬酸钠与柠檬酸组合,以产生缓冲体系。
合适的表面活性剂包括,例如,十二烷基硫酸钠、聚乙烯分离物、聚乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚氧乙烯烷基醚、苯甲酸苄酯、溴棕三甲胺、鲸蜡醇、多库酯钠、单油酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、棕榈硬脂酸甘油酯、卵磷脂、中链甘油三酯、单乙醇胺、油酸、泊洛沙姆、聚乙烯醇和山梨糖醇酐脂肪酸酯。
合适的抗氧化剂包括例如焦亚硫酸钠、生育酚例如α、β、δ-生育酚酯和α-生育酚乙酸酯、抗坏血酸及其药学上可接受的盐、抗坏血酸棕榈酸酯、没食子酸烷基酯(例如没食子酸丙酯、S-1)、其亚硫酸盐和药学上可接受的盐、丁基化羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯和单硫代甘油。
合适的消毒剂包括例如葡萄糖酸氯己定、葡萄糖酸δ-内酯、对羟基苯甲酸甲酯、氢氧化钠及其组合。
合适的防腐剂包括对羟基苯甲酸酯。合适的对羟基苯甲酸酯包括例如对羟基苯甲酸甲酯(E编号E218)、对羟基苯甲酸乙酯(E214)、对羟基苯甲酸丙酯(E216)、对羟基苯甲酸丁酯和对羟基苯甲酸庚酯(E209)。不太常见但仍然合适的对羟基苯甲酸酯包括对羟基苯甲酸异丁酯、对羟基苯甲酸异丙酯、对羟基苯甲酸苄酯及其钠盐。
合适的渗透剂包括,例如,亚砜(例如,二甲基亚砜、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺)、氮酮(1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮或月桂氮酮(laurocapran))、吡咯烷酮(例如,N-甲基-2-吡咯烷酮)、脂肪酸(例如油酸、月桂酸、肉豆蔻酸、癸酸)、精油(例如桉树、藜、依兰、L-薄荷醇)、萜烯(例如倍半萜烯)、萜类化合物、噁唑烷酮(例如4-癸基噁唑烷-2-酮)和脲。
当生产用于本公开的冻干形式的益生菌时,将益生菌菌株在室温以3000X g离心15分钟,并将所得细胞团块悬浮于10ml 20%甘油的废培养基(spent media)重悬浮溶液中(将离心后收集的培养基与50%无菌甘油混合以生成20%重悬溶液)。将所得细胞悬液在液氮中速冻,然后冷冻干燥以获得冻干的活细胞产品。将10毫克冻干细胞悬浮在蛋白胨水中,并铺在脑心浸液琼脂平板上,以确定每毫克冻干产品的可行菌落形成单位(CFU)。或者,可以在适当的工业或商业制造过程中扩大冻干,其中通过连续离心从高细胞密度发酵罐中收获细胞并且将浆液冷冻和冻干。
以下实施例进一步说明了本发明的具体实施方案;然而,以下说明性实施例不应以任何方式解释为限制本公开。
实施例
实施例1
在本实施例中,进行了逐步体外发酵以富集能够使用XOS的菌株,并鉴别和表征了最成功的菌株.
方法
样品采集
在整个研究期间,总共从志愿者那里收集了20个粪便样品。要求每位参与者都签署一份同意书,表明没有已知的胃肠道疾病,年龄在19岁或以上,在过去6个月内没有服用抗生素或益生菌补充剂,不是酸奶的常客,并且愿意在三个月内提供1-3个粪便样品。参与者获得了一个马桶标本采集试剂盒(Fisher Scientific,New Hampshire,USA)以及详细的采集和保存说明。该研究获得了UNL机构审查委员会的批准(IRB 20160616139)。
在厌氧室(Bactron IV Anaerobic Chamber,Sheldon Manufacturing,Cornelius,OR USA,5%H2,5%CO2,90%N2)中收集和处理样品。将样品在pH 7的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释(1:10),匀质化,并在-80℃以2ml等分试样储存。
逐步粪便发酵
对于所有富集和建立实验,使用XOS95TM,即聚合度为DP 2至DP20的95%纯益生元基质(Prenexus Health,Arizona,US)。对于所有发酵,每个粪便样品都被视为一个单独的实验单元。在富集实验中,进行了逐步体外分批发酵。将稀释的粪便浆液均质化、过滤并与发酵液以6:3的比例(v/v)混合,总体积为9.0ml。添加时,存在的XOS的浓度为1%。所有发酵都在37℃厌氧孵育。24小时后,通过将100μl样品转移到9.9ml含有XOS的发酵液中进行100倍稀释。每24小时进行3次后续转移,总共96小时。收集0、24、48、72和96小时的样品并储存在-20℃,用于DNA提取和SCFA分析。在四个发酵周期(96小时)结束时,将样品铺板于双歧杆菌选择性碘乙酸莫匹罗星(Selective Iodoacetate Mupirocin,BSIM)上并挑取菌落。每个分离的菌落都在改良的de Man、Rogosa和Sharpe(mMRS)中生长,其中省略了葡萄糖,但补充了1%XOS(mMRS-XOS)。将分离株储存在-20℃,用于后续的DNA提取和16S Sanger测序和鉴别。
对于建立实验,进行了类似的分批发酵,不同之处在于,在发酵周期开始时接种了从上面获得的富集XOS的菌株。首先将测试菌株在MRS肉汤中孵育24小时,然后用于接种(1%)具有或不具有1%XOS的新鲜粪便发酵培养基。随后的转移同以前一样进行。每24小时收集样品,持续最多7天,从BISM平板中挑取分离株,将其在mMRS-XOS中生长并储存。最初的富集实验用3个粪便样品进行,20个样品用于随后的长双歧杆菌长亚种CR15的建立实验。
DNA提取和16S Sanger测序和分析
按照Martínez et al.(2015)的描述,使用苯酚-氯仿从收集的样品(发酵培养基和分离株)中提取DNA,不同之处在于孵育时间为30分钟,并且将DNA沉淀重悬浮于100μl无DNA酶的水中。对于分离株,采用16S引物8F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)(SEQ ID NO.1)和1391R(5’-GACGGGCGGTGTGTRCA-3’)(SEQ ID NO.2)进行PCR;PCR产物使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen,Hilden,德国)纯化并使用NanoDrop ND-1000分光光度计(ThermoFisher,马萨诸塞州,美国)量化。纯化的PCR产物由密歇根州立大学(Michigan StateUniversity)的Genomics Core Facility测序。
使用NCBI BLASTn对潜在的IVE益生菌分离株进行了初步鉴定。分离株根据这次blast搜索被指定属和种,并且如果从不同的个体中分离,则视为独特的菌株。
使用qRT-PCR量化双歧杆菌
对于所有体外发酵实验,使用Mastercycler Realplex2(Eppendorf AG,Hamburg,德国)通过定量PCR(qPCR)对发酵样品中的细菌群进行量化。每个反应混合物都含有12.5μlqPCR Master Mix(2X Maxima SYBR green;Thermo Fisher Scientific,Massachusetts,USA)、0.4μM针对每个靶生物体的特异性引物、8.5μl水和3μl模板DNA,最终体积为25μl。每个样品使用双孔。重新分析标准偏差大于0.5的样品。对于每个测定,使用从通过平板计数确定计数的纯培养物中分离的DNA制作标准曲线。对DNA标准品进行10倍系列稀释,并将标准品的循环阈值(ct)值针对log10 CFU/ml值作图。下面提供了用于长双歧杆菌CR15引物设计的双歧杆菌基因组。来自密切相关菌株的全基因组序列用于鉴别长双歧杆菌长亚种CR15中的独特靶序列。选择腺嘌呤特异性甲基转移酶PaeR71基因作为长双歧杆菌长亚种CR15的靶扩增子。
表1
长双歧杆菌长亚种KACC 91563,全基因组 | CP002794.1 |
长双歧杆菌长亚种菌株AH1206,全基因组 | CP016019.1 |
长双歧杆菌长亚种JCM 1217DNA,全基因组 | AP010888.1 |
长双歧杆菌长亚种NCIMB809,全基因组 | CP011964.1 |
长双歧杆菌长亚种GT15,全基因组 | CP006741.1 |
长双歧杆菌长亚种BBMN68,全基因组 | CP002286.1 |
长双歧杆菌长亚种CCUG30698,全基因组 | CP011965.1 |
长双歧杆菌长亚种JDM301,全基因组 | CP002010.1 |
长双歧杆菌长亚种CR15的基因组测序和组装
对于全基因组测序,使用QIAamp DNA微型试剂盒(Qiagen,Hilden,德国)进行DNA提取,并使用Nextera XT DNA Library Prep Kit制备基因组文库。在Illumina MiSeq上对长双歧杆菌长亚种CR15的基因组进行测序,产生603,691个配对读段,所述读段使用SSPAdes Genome Assembler(ver3.11)从头组装并使用Mauve与参考基因组比对。组装后获得了由63个重叠克隆群(contig)组成的基因组草图,覆盖度为123倍。
使用PROKKA进行基因注释。此外,针对CAZy数据库,使用dbCAN和transportDB 2.0数据库通过TransAAP对基因组草图进行注释,以分别鉴别碳水化合物活性酶簇和糖转运蛋白。
菌株特异性引物设计和验证
使用RUCS(rapid identification of PCR primers for unique coresequences,针对独特核心序列的PCR引物的快速鉴别)鉴别长双歧杆菌长亚种CR15基因组草图中的独特靶标,并用于计算机PCR(in-silico PCR)。通过与8个从NCBI数据库中检索到的密切相关的长双歧杆菌长亚种菌株完整基因组比对,鉴别了独特的靶序列。
表2
用于引物验证的双歧杆菌菌株 | 16S rRNA基因水平的同一性% |
长双歧杆菌长亚种AH120 | 100% |
长双歧杆菌长亚种(ATCC15707) | 99% |
长双歧杆菌长亚种F8 | 100% |
长双歧杆菌长亚种JDM301 | 99% |
长双歧杆菌DJ010A | 100% |
双歧杆菌12_1_47BFAA | 100% |
双歧杆菌113 | 95% |
双歧杆菌HMLN14 | 96% |
通过使用NCBI Primer Blast对细菌的NCBI RefSeq代表性基因组数据库进行blast来确认引物特异性。针对Gelidibacter algens菌株只有1次命中与引物对匹配,该菌株是人类肠道的非定居者。随后选择腺嘌呤特异性甲基转移酶PaeR71基因作为靶扩增子,其具有引物对的长度为210个碱基对;正向(F)CCGCATCACAACTGCTATTGG(SEQ ID NO.3)和反向(R)CGAAAGCCCCAATTTGTTCGT(SEQ ID NO.4)(Invitrogen,California,USA)。使用梯度PCR确定合适的退火温度为58℃。使用我们的培养物保藏中的11株菌株进行了PCR和qPCR的实验引物验证,这些菌株在16SrRNA水平上的同一性为95-100%。
表3用于靶向不同双歧杆菌群的引物序列和PCR程序。
生长测量
在含有1%XOS的mMRS中进行所选菌株在XOS上生长的能力。在mMRS中制备对照,其中具有1%葡萄糖(mMRS-葡萄糖)或等量的存在于95%纯XOS中的残余碳水化合物(约0.035%,最终浓度;mMRS-res)。根据制造商的规格表,预计残糖为等比例的葡萄糖、果糖和蔗糖。此外,以半强度(即,仅使用标准MRS中存在的成分的一半量)制备mMRS培养基,以最大限度地减少在背景碳水化合物上的生长。
首先将测试菌株从冷冻原种培养物划线接种到BSIM平板上,并在37℃厌氧孵育48小时。分离单个菌落并接种到MRS肉汤中,于37℃持续24小时。然后,将1%(v/v)的培养物转移到新鲜的MRS中。将这些继代培养物孵育12小时过夜,然后以1%(v/v)接种到预热、预还原的mMRS、mMRS-XOS、mMRS-葡萄糖或mMRS-res中。然后将培养物在37℃厌氧孵育,通过使用读板仪(Synergy HTX Plate Reader,BioTek,Vermont,USA),在前12小时内每4小时,然后再次在24小时,测量600nm处的光密度,测定生长。所有实验一式三份进行。
16S rRNA扩增子测序和分析
对从粪便发酵提取的DNA进行16S rRNA扩增子测序。使用针对16S序列V4区的引物在2x 250bp MiSeq测序仪上对样品进行测序。总共获得了4,397,582个序列,每个样品平均有36,954个序列。
使用QIIME2分析序列。配对端序列在导入QIIME之前被解复用。FastQC用于检查每个样品序列的质量。使用DADA2工作流程(可在网站benjjneb.github.io/dada2/上找到),去除嵌合序列,并将正向和反向读段分别截短为240bp和200bp。使用DADA2将序列去复制为独特的扩增子序列变体(amplicon sequence variant,ASV),并创建了确切的代表性序列的列表。如前所述,ASV是指通过DADA2管线(pipeline)解析的确切序列。所得产品是ASV表,记录了在每个样品中观察到ASV的次数。共鉴别出974个特征。使用Greengenes数据库和基于99%序列同一性的预训练分类器分配分类。使用5171个序列的样品深度计算α多样性度量。
分析在QIIME和RStudio(版本3.4.3)中完成群落测序数据的统计。计算两种不同的α多样性测量,即香农指数(Shanon index)和观察到的ASV。使用Kruskal-Wallis检验进行每个处理与时间点之间的成对比较。所有统计检验均纳入FDR校正,并使用0.05的显著性截止值确定显著性。对于β多样性,准备了主坐标分析(PCoA)和主成分分析(PCA)图来比较群落组成。Vegan(可在网站github.com/vegandevs/vegan上找到)包用于计算Bray Curtis距离并进行PERMANOVA分析。使用Wilcoxon秩和检验对96小时XOS各处理之间特定ASV的相对丰度进行比较,并使用Metacoder进行可视化。分析中仅包括相对丰度大于0.1%的分类群。
短链/支链脂肪酸(S/BCFA)分析
类似于Yang和Rose,使用气相色谱法测定所有20个粪便样品在所有采样时间的S/BCFA浓度。简而言之,将0.4ml发酵上清液与大约0.16g NaCl和0.2ml 9M硫酸涡旋。随后,加入0.5ml乙醚,摇动试管并短暂离心。然后,将1μl提取物注入带有熔融石英毛细管柱(Nukol30m x 0.25mm内径x 0.25μm膜厚度;Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)的气象色谱仪(Clarus 580;PerkinElmer,Waltham,MA,USA)中。如前所述进行S/BCFA的量化。六个样品由于分析物的量不足而无法量化。移除包含任何这些样品的个体,并将20名个体中14名的S/BCFA浓度用于最终统计分析。为了在每个时间点的各处理之间进行比较,进行了KruskalWallis检验以及带有FDR调整的Wilcoxon秩和检验。
基于京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)本体数据库,使用PICRUSt将16S数据的分类丰度与功能性S/BCFA代谢基因相关联。还使用16S测序数据和所有可用的S/BCFA浓度进行分类群与S/BCFA之间的相关性分析。此外,可视化每个处理的分类群和S/BCFA预测代谢基因的平均相对丰度。
结果
富集利用XOS的双歧杆菌菌株
最初从使用3个不同粪便供体样品的富集实验中获得了总共60株双歧杆菌分离株。每次逐步稀释100倍后,具体细菌物种的增加或恢复会预测成功的富集(图1A)。预计未富集的菌株会在四个发酵周期(约25代)结束时以低丰度存在或完全被淘汰(低于检测水平)。通过基于16S rRNA Sanger的序列的BLASTn鉴定从获得的60株分离株中产生了7株独特的双歧杆菌菌株。这些包括5株青春双歧杆菌菌株以及假链状双歧杆菌和长双歧杆菌各一株。使用qPCR在属水平上进行的量化揭示了所有3个样品中总双歧杆菌的富集。具体而言,从显示富集青春双歧杆菌物种的样品中获得了一株青春双歧杆菌分离株(图1B),并且选择该分离株即青春双歧杆菌CR11用于后续的建立实验。
青春双歧杆菌CR11的建立和长双歧杆菌长亚种CR15的惊人发现
在建立实验中,以类似于XOS富集的方式评估菌株在体外粪便环境中建立的能力,不同之处在于包括测试菌株与益生元。测试菌株在测试期间的持久性表示成功建立,而测试菌株在测试期间丰度减少或淘汰表示失败的建立。当在发酵开始时将青春双歧杆菌CR11与益生元一起重新引入新的粪便样品中时,通过属特异性qPCR进行的量化揭示,最初观察到双歧杆菌的富集(图1C)。令人惊讶的是,基于物种特异性qPCR,很明显青春期双歧杆菌已被其他双歧杆菌取代。实际上,通过16S Sanger测序将随后通过培养回收的所有分离株(n=10)均鉴别为长双歧杆菌。
随后将长双歧杆菌菌株(鉴定并命名为长双歧杆菌长亚种CR15)引入另一个粪便样品。量化揭示了长双歧杆菌的稳定富集,100%的分离株(n=10)被鉴定为长双歧杆菌(图1D)。长双歧杆菌长亚种CR15在mMRS-XOS中的生长表明,该菌株能够利用XOS并优先利用低聚合度的聚合物。
长双歧杆菌长亚种CR15的基因组组装和注释
生成了全基因组序列数据(总共296Mbp),并组装了2.4Mbp的基因组草图,针对参考基因组的覆盖度为96%。针对CAZy数据库的注释鉴别了几种与XOS利用相关的蛋白质,包括糖基水解酶GH43和GH120以及碳水化合物结合分子CBM6和CBM22。此外,用Prokka和TransAAP将相关糖转运和利用基因注释为D-木酮糖5-磷酸(xfp)、木糖异构酶(xylA)、木酮糖激酶(xylB)、β-木糖苷酶(xynB)、木糖导入ATP结合蛋白(xylG)、木糖转运系统通透酶蛋白(xylH)和ABC型木糖转运系统(xylF)。随后根据基因组设计了靶向腺嘌呤特异性甲基转移酶PaeR71基因的菌株特异性引物。
长双歧杆菌长亚种CR15的建立是宿主依赖性的
使用20个个体供体样品进行长双歧杆菌长亚种CR15和XOS的额外建立实验。并行进行没有XOS的实验,并作为对照。在存在XOS的情况下,菌株特异性qPCR量化揭示了CR15菌株在7个样品中明确建立;另有11个样品证明了中间建立(图3、4A-B)。后者包括CR15水平在发酵开始和结束之间波动或下降少于2个对数的样品(图4C)。只有在两个样品中CR15菌株未能建立(图4D)。在不含益生元的对照中,长双歧杆菌长亚种CR15减少或完全被淘汰。
XOS处理差异性地改变了粪便微生物群落
接下来,进行16S扩增子测序以研究10个样品子集中群落结构的变化。为了评估样品随时间的α多样性,计算了香农指数和观察到的扩增子序列变体(ASV)。从0到24小时,两种处理的多样性最初显著降低(FDR<0.05)(图5A-B)。然而,在第一个24小时时间点之后没有观察到进一步的变化。在整个发酵期间,补充了XOS的样品的多样性显著低于不含益生元的对照(FDR<0.05)。使用基于Bray-Curtis距离的主坐标分析(PCoA)可视化于基线和发酵结束时样品的β多样性分析。基线样品聚类在一起,而96小时时的发酵样品根据处理明显分别聚类(图5C)。主成分分析(PCA)揭示,长双歧杆菌、假链状双歧杆菌和屎肠球菌(Enterococcus faecium)是XOS组中的驱动因素(图5D)。
16S rRNA序列的分类学分析揭示了在存在XOS的情况下的高度双歧杆菌反应以及在无XOS对照中未观察到的乳酸杆菌(Lactobacillus)的明显富集(图6A)。对于XOS处理和无XOS处理,96小时后都观察到肠球菌的富集(图6A-B)。研究了三种特异性双歧杆菌ASV在整个发酵过程中对双歧杆菌反应的贡献(图7A-C)。这些特异性序列变体针对NCBI nr数据库的BLASTn揭示,它们属于物种长双歧杆菌、假链状双歧杆菌和青春双歧杆菌。这些物种之前也从发酵后获得的分离株的16S Sanger测序中观察到。
长双歧杆菌长亚种CR15和青春双歧杆菌的共富集
其他分析揭示了各处理之间长双歧杆菌和假链状双歧杆菌ASV的平均丰度存在差异。在前24小时内,长双歧杆菌ASV的平均百分比相对丰度在XOS发酵中从4%增加到43%,但在无益生元的对照中仅增加到11%(图7A)。虽然在两种处理中都观察到长双歧杆菌ASV丰度随后下降,但在96小时时对照组中仅剩余1%,相比之下在XOS发酵中剩余10%(图7A)。此外,96小时后,在补充了XOS的发酵中,假链状双歧杆菌ASV平均从4%增加到29%(图7B)。在XOS和无XOS处理中,在整个发酵过程中都观察到低丰度的青春双歧杆菌ASV(图7C)。
通过物种水平的qPCR确定假链状双歧杆菌对CR15持久性的影响。在大多数情况下(n=11),当基线粪便样品中不存在假链状双歧杆菌(即低于检测)时,在整个发酵过程中保持低水平,并观察到长双歧杆菌长亚种CR15的成功建立(图8B)。相比之下,如果在基线(n=9)时存在可检测水平的该生物体,则假链状双歧杆菌能够持续存在并与CR15共存(图8A)。
为了进一步研究长双歧杆菌长亚种CR15的持久潜力,使用20个粪便样品中4个的子集进行了7天的淘汰实验(washout experiment)。在2个样品(个体3和4)中,大量长双歧杆菌长亚种CR15维持到第7天。然而,在其他2个样品(个体14和16)中,即使在存在XOS的情况下,在第7天长双歧杆菌长亚种CR15也减少或被淘汰(图10A、B)。随后对这些第7天样品进行的16S扩增子测序揭示了对应于青春双歧杆菌和假链状双歧杆菌的两种ASV的高丰度(图10C、D)。这个7天的发酵实验进一步证明了长双歧杆菌长亚种CR15对XOS的依赖性以及宿主依赖性反应。样品首先补充了XOS,并在前3天进行逐步转移。在第3天进行拆分(split),并行转移到含XOS的发酵罐和不含XOS的发酵罐中。在拆分时分别进行处理后,从第4天到第7天进行随后的逐步转移。对第0、3、4和7天的样品进行16S测序。长双歧杆菌长亚种CR15的16S RNA序列是SEQ ID NO.13,假链状双歧杆菌CR16的16S RNA序列是SEQ ID NO.14。
补充了XOS的发酵富集乙酸
在存在和不存在XOS下的所有20个长双歧杆菌长亚种CR15建立实验都获得了短链和支链脂肪酸(S/BCFA)谱。在所有时间点,乙酸水平最高,其次是水平较低的丙酸和丁酸(表4)。24小时后,益生元组的乙酸和总SCFA水平显著更高,而到48小时,对照组的丁酸和丙酸水平显著更高。到96小时,对照组的BCFA、异丁酸和异戊酸显著更高。24小时后,两种处理的SCFA产量普遍保持稳定。
表4.长双歧杆菌长亚种CR15建立实验发酵上清液中S/BCFA的浓度
SEM;均值的标准误
*表示与前一个时间点有显著差异
SCFA;短链脂肪酸,BCFA;支链脂肪酸
使用PICRUSt来评估处理之间预测参与乙酸和丁酸产生的代谢基因丰度的差异。具体而言,研究了丁酸激酶、乙酸激酶和乙酰辅酶A转移酶基因。正如预期的那样,宏基因组预测表明XOS组中乙酸激酶基因水平较高。同样,还预测了对照组中较高水平的丁酸激酶和乙酰辅酶A转移酶基因(图9)。对这些基因的家族级分类学贡献的进一步研究表明,普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、副普雷沃氏菌科(Paraprevotellaceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)和理研菌科(Rikenellaceae)对丁酸激酶有贡献。总共确定了11个和46个分类群分别对乙酰辅酶A转移酶和乙酸激酶有贡献。其中,对乙酸激酶有贡献的分类群是双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)和乳杆菌科(Lactobacillaceae),而肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)被确定为乙酰辅酶A转移酶的贡献者。属丰度与S/BCFA浓度之间的相关性分析证实了双歧杆菌和乳杆菌与乙酸之间的显著正相关(图9)。伊格尔兹氏菌属(Eggerthella)、拟杆菌属(Bacteroides)和毛螺菌科是与丁酸和丙酸呈正相关的几个属。
长双歧杆菌长亚种CR15的全基因组序列(SEQ ID NO.5)分别上传到NCBI数据库的PRJNA540282和PRJNA540304,发酵样品的16S rRNA测序上传到NCBI数据库,可以分别在PRJNA540282和PRJNA540304找到。
讨论
在这项研究中,我们开发了体外富集(IVE)平台,用于分离可与同源益生元组合形成协同合生元的富集益生元的菌株。使用双歧杆菌和高选择性基质XOS进行富集。总的来说,获得了15株独特的双歧杆菌分离株。所有这些分离株都属于三个物种即假链状双歧杆菌、长双歧杆菌以及假链状双歧杆菌和长双歧杆菌的任何提取物或组合之一,它们属于在成人中发现的主要定居双歧杆菌物种。在这3个物种中,青春双歧杆菌和长双歧杆菌的益生菌特性以及它们在XOS上的生长潜力已得到充分研究。相比之下,假链状双歧杆菌的益生菌潜力尚未得到很好的探索。然而,已知使包括XOS在内的膳食纤维发酵。
与益生元的菌株富集相比,菌株建立是更复杂和更具挑战性的过程。事实上,益生菌微生物在补充期结束后很少会持续存在。这部分是由于肠道微生物组的个体性和高度竞争性以及缺乏开放的生态位所致。这些因素可能导致饮食干预研究中常见的反应者/无反应者现象。因此,缺乏可用的生态或功能生态位可能会抑制或阻止具体菌株的建立。
相比之下,提供益生元或其他专门的养份以及合适的益生菌,可以提供新的营养生态位,增强持久性,并减少无反应者表型的频率。在这项体外研究中,将富集XOS的长双歧杆菌长亚种CR15菌株与XOS的组合,促进了在20个独特粪便样品的大多数样品中的菌株建立,稳态种群保持在约107CFU/ml。尽管观察到持久性表型的变化,但CR15菌株仅在两个样品中无法持续存在。通过在没有益生元的情况下CR15在发酵过程中的快速淘汰证实了XOS依赖性的建立。
虽然qPCR可用于测量具体属、物种或菌株的种群,但群落测序为评估微生物组成的变化提供了独立的基础。分类学结果证实,长双歧杆菌的富集是由于补充了XOS而发生。这一观察结果还表明,以高丰度存在的特定长双歧杆菌ASV代表了CR15菌株,尽管它可能由其他共有高度16S序列相似性的密切相关的长双歧杆菌菌株组成。
有趣的是,群落分析还揭示,长双歧杆菌ASV/CR15菌株并不总是占优势的双歧杆菌。在一些样品中,由另外两种独特的ASV为代表的假链状双歧杆菌和假链状双歧杆菌在发酵过程中是普遍的,它们的生长明显受到XOS存在的支持。特别是,在多个样品中假链状双歧杆菌以高丰度存在。qPCR进一步证实了这一点,表明当在基线存在时,假链状双歧杆菌在整个发酵过程中保持高水平。两种方法都表明假链状双歧杆菌也被XOS富集。在一些样品中,假链状双歧杆菌的丰度高时观察到的长双歧杆菌的丰度相对较低/不存在表明,这两种微生物是生态位竞争者。
合生元处理导致α多样性度量显著较低,这可能是由于双歧杆菌的富集所致。这在PCA图中得到了进一步证实,其中双歧杆菌是区分两种处理的主要驱动因素。先前在纤维发酵的体外研究中观察到多样性降低。
当逐步发酵延长至7天时,在存在XOS的情况下,CR15在前4天再次持续存在。然而,在第4天之后,持久性的变化更大。当CR15被淘汰时,观察到青春双歧杆菌和假链状双歧杆菌种群增加。
SCFA是与碳水化合物发酵相关的有益肠道代谢副产物。与其他短链脂肪酸一样,乙酸是上皮细胞的能源,占肠道产生的总SCFA的百分比很高。在存在XOS的情况下,尽管富集的乳杆菌(图6A)也可能产生乙酸,但较高浓度的乙酸可能是由于双歧杆菌发酵所致。然而,低丁酸水平出乎意料。这是因为高丰度的双歧杆菌通常与经由产生乙酸的双歧杆菌与消耗乙酸的丁酸生产者之间的代谢交叉供给产生丁酸相关。特别是,Rivière et al.(2015)在长双歧杆菌和直肠真杆菌(Eubacterium rectale)菌株的共培养发酵中证明了低聚阿拉伯木聚糖(arabinoxylan oligossacharide,AXOS)的双歧杆菌和丁酸效应。通过16S序列数据的基因预测靶向特异性乙酸和丁酸基因证实了,与丁酸激酶和乙酰辅酶A转移酶相比,体外系统中存在的乙酸激酶的丰度更高,并且与无益生元的对照相比,在XOS发酵中观察到相同的趋势。此外,属于毛螺菌科和瘤胃球菌科的丁酸生产者,包括瘤胃球菌(Ruminococcus)、粪球菌(Coprococcus)和颤螺菌(Oscillospira),在无益生元的对照中也以较高的丰度存在。这表明丁酸生产者可能在连续转移期间已经被淘汰。在使用婴儿粪便样品的体外发酵模型中也观察到了类似的发现。然而,在体内条件下,CR15产生的高乙酸水平预计会交叉供给丁酸生产者,增加丁酸水平,并为宿主提供健康益处。
在后一项研究中,用GOS补充婴儿粪便发酵发挥了双歧杆菌效应,具有高浓度的乙酸、低浓度的丁酸和低粪便pH值。有趣的是,先前已报道pH值会影响细菌群落并在体外产生SCFA。这意味着在设计批量体外模型以研究粪便群落及其代谢副产物时,应考虑改进缓冲或pH控制。
益生元的定义部分取决于宿主微生物对它们的利用。尽管尚未建立双歧杆菌中发生XOS转运和利用的具体机制的功能演示,但已提出了两种模型。在一种模型中,细胞外的木糖裂合酶降解XOS,然后木糖单体被转运到细胞中。或者,XOS通过ABC转运系统转运,细胞内XOS被水解。产生的木糖单体被磷酸化形成木酮糖-5-P,然后木酮糖-5-P进入双歧杆菌分流。已经鉴定了编码推定的糖基水解酶的基因簇,包括GH8、GH43和GH120。这些簇包括编码非还原性末端β-木糖苷酶、还原性末端木糖释放外切寡木聚糖酶和内切1,4-β-木聚糖酶的基因,每个基因都具有优选的寡聚体长度。基于当前的基因组注释,在长双歧杆菌长亚种CR15中存在GH43和GH120簇以及编码ABC型通透酶的基因表明,该菌株能够在细胞内降解XOS。
与其他体外模型一样,IVE方法也存在局限性。然而,尽管存在这些局限性,IVE模型仍可作为识别潜在的协同对,然后用于在多个样品中测试这些配对的有用工具。这种体外方法可以在验证这些制剂的体内试验之前加速菌株发现和合生元配对的过程。最后,更复杂和受控的体外模型会为更大的通量提供基础,并增加可以在短时间内收集的菌株库。
鉴别合生元组合的其他尝试通常依赖于将先前分离的益生菌菌株与一种或多种益生元配对。事实上,文献中描述的这些和许多其他合生元组合会视为互补。虽然这些方法具有将菌株表征为益生菌成分的优势,但没有先验的理由说明为什么益生元一定会在体内支持益生菌的生长。因此,本研究描述的富集方法为鉴别推定的益生菌菌株提供了基础,这些菌株预计将在与其他定居微生物竞争益生元方面胜出。如果这些益生菌-益生元组合对宿主产生健康益处,它们将满足协同合生元的定义。
Claims (43)
1.一种合生元组合物,包含:
选自由以下组成的组的益生菌物种:假链状双歧杆菌(B.pseudocatenulatum)、长双歧杆菌(B.longum)、及其任何组合或提取物;和
包含一定量低聚木糖的益生元。
2.如权利要求1所述的合生元组合物,其中所述益生菌物种是长双歧杆菌。
3.如权利要求1所述的合生元组合物,其中所述益生菌物种是长双歧杆菌长亚种(B.longum subsp.longum)。
4.如权利要求3所述的合生元组合物,其中所述长双歧杆菌长亚种的核苷酸序列与SEQID NO.5具有至少90%的序列同一性。
5.如权利要求1所述的合生元组合物,还包含至少一种酶。
6.如权利要求5所述的合生元组合物,其中所述酶是糖基水解酶家族的成员。
7.如权利要求1所述的合生元组合物,还包含来自所述糖基水解酶家族的至少两种不同的酶。
8.如权利要求1所述的合生元组合物,其中所述益生菌物种和所述益生元的重量比为100:1至1:100。
9.如权利要求1所述的合生元组合物,其中所述组合物的形式选自由以下组成的组:液体、固体、片剂、丸剂、胶囊、液体介质中的固体、粉末、锭剂、吸管、小药囊、扁囊剂、溶液、酏剂、悬浮液、乳剂、溶液、糖浆、气雾剂、软和硬明胶胶囊、无菌包装粉末、或与食品组合或引入所述食品中。
10.如权利要求1所述的合生元组合物,其中所述益生菌以约106至约1012CFU的量存在。
11.如权利要求1所述的合生元组合物,其中所述益生元还包含至少一种选自由以下组成的组的成分:可溶性淀粉、酵母提取物、寡糖、多糖和其他含有果糖、木糖、大豆、半乳糖、葡萄糖和/或甘露糖的益生元。
12.如权利要求1所述的合生元组合物,其中所述益生元还包含至少一种选自选自由以下组成的组的成分:聚葡萄糖、聚葡萄糖粉末、乳果糖、低聚乳果糖、棉子糖、低聚葡萄糖、菊粉、低聚果糖、低聚异麦芽糖、大豆寡糖、低聚乳果糖、低聚木糖、低聚壳糖、低聚甘露糖、低聚阿拉伯糖、唾液酸寡糖、低聚岩藻糖、低聚半乳糖和低聚龙胆糖。
13.如权利要求1所述的合生元组合物,其中所述益生菌和益生元彼此接触。
14.如权利要求1所述的合生元组合物,还包含一种或多种其他活性成分、赋形剂、溶解剂、表面活性剂、抗氧化剂、消毒剂、防腐剂、渗透剂、渗透保护剂、冷冻保护剂及其组合。
15.如权利要求14所述的合生元组合物,其中一种或多种赋形剂选自由以下组成的组:微晶纤维素、麦芽糊精、胶体二氧化硅、乳糖、淀粉、山梨醇、环糊精及其任何组合。
16.如权利要求14所述的合生元组合物,其中一种或多种溶解剂选自由有机酸或有机酸的盐组成的组。
17.如权利要求16所述的合生元组合物,其中一种或多种有机酸选自由以下组成的组:柠檬酸、富马酸、乳酸、酒石酸、琥珀酸、抗坏血酸、乙酸、苹果酸、戊二酸、己二酸及其任何组合。
18.如权利要求14所述的合生元组合物,其中一种或多种表面活性剂选自由以下组成的组:十二烷基硫酸钠、聚乙烯分离物、聚乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚氧乙烯烷基醚、苯甲酸苄酯、溴棕三甲胺、鲸蜡醇、多库酯钠、单油酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、棕榈硬脂酸甘油酯、卵磷脂、中链甘油三酯、单乙醇胺、油酸、泊洛沙姆、聚乙烯醇、山梨糖醇酐脂肪酸酯及其任何组合。
19.如权利要求14所述的合生元组合物,其中一种或多种抗氧化剂选自由以下组成的组:焦亚硫酸钠、生育酚例如α、β、δ-生育酚酯和α-生育酚乙酸酯、抗坏血酸及其药学上可接受的盐、抗坏血酸棕榈酸酯、没食子酸烷基酯、其亚硫酸盐和药学上可接受的盐、丁基化羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯、单硫代甘油及其任何组合。
20.如权利要求14所述的合生元组合物,其中一种或多种消毒剂选自由以下组成的组:葡萄糖酸氯己定、葡萄糖酸δ-内酯、对羟基苯甲酸甲酯、氢氧化钠及其任何组合。
21.如权利要求14所述的合生元组合物,其中一种或多种防腐剂选自由对羟基苯甲酸酯及其钠盐组成的组。
23.如权利要求1所述的合生元组合物,其中益生菌是冻干的。
24.如权利要求1所述的合生元组合物,其中所述假链状双歧杆菌益生菌的核苷酸序列与SEQ ID NO.6或SEQ ID NOs.73-99中任一条序列具有至少90%的序列同一性。
25.如权利要求1所述的合生元组合物,其中所述长双歧杆菌益生菌的16S序列与SEQID NO.13具有至少95%的序列同源性。
26.如权利要求1所述的合生元组合物,其中所述假链状双歧杆菌益生菌的16S序列与SEQ ID NO.14具有至少95%的序列同源性。
27.如权利要求1所述的合生元组合物,其中所述长双歧杆菌益生菌或假链状双歧杆菌益生菌的核苷酸序列包括至少50个与选自由SEQ ID NOs 5或6或SEQ ID NOs 15-99中任一条序列组成的组的连续核苷酸序列具有至少95%序列同一性的连续核苷酸。
28.如权利要求27所述的合生元组合物,其中所述SEQ ID NOs 5或6的连续核苷酸序列选自由SEQ ID.NOs.15-99及其任何组合中的任一个组成的组。
29.一种改善肠道健康和/或全身健康的方法,包括向有需要的个体施用治疗有效量的权利要求1所述组合物的步骤。
30.如权利要求29所述的方法,其中通过评估胃肠道特征或参数来确定对肠道健康和/或全身健康的改善。
31.如权利要求29所述的方法,通过以下中的至少一项确定对肠道健康和/或全身健康的改善:排便和规律性的改善、饱腹感改善、肠道屏障功能改善、腹胀和胀气减少、胃肠道感染风险降低、绞痛症状持续时间减少和/或特应性皮炎风险降低。
32.如权利要求29所述的方法,其中所述益生元和益生菌彼此的施用在6小时内进行。
33.如权利要求29所述的方法,其中重复所述施用。
34.如权利要求29所述的方法,其中所述有需要的个体选自由哺乳动物和家禽组成的组。
35.如权利要求29所述的方法,其中与未施用过权利要求1所述组合物的个体或个体组相比,或与施用权利要求1所述组合物之前和之后的同一个体相比,肠道健康和/或全身健康改善了至少10%。
36.如权利要求29所述的方法,其中所述组合物以选自由以下组成的组的形式施用:液体、固体、片剂、丸剂、胶囊、液体介质中的固体、粉末、锭剂、吸管、小药囊、扁囊剂、溶液、酏剂、悬浮液、乳剂、溶液、糖浆、气雾剂、软和硬明胶胶囊、无菌包装粉末,或与食品组合或引入所述食品中。
37.一种调节个体胃肠道微生物群的方法,包括向有需要的个体施用治疗有效量的权利要求1所述组合物的步骤。
38.如权利要求37所述的方法,其中通过比较施用权利要求1所述组合物之前和之后所述个体的微生物群种群来确定对胃肠道微生物群的调节。
39.如权利要求37所述的方法,其中所述益生元和益生菌彼此的施用在6小时内进行。
40.如权利要求37所述的方法,其中重复所述施用。
41.如权利要求37所述的方法,其中所述有需要的个体选自由哺乳动物和家禽组成的组。
42.如权利要求38所述的方法,其中所述组合物以选自由以下组成的组的形式施用:液体、固体、片剂、丸剂、胶囊、液体介质中的固体、粉末、锭剂、吸管、小药囊、扁囊剂、溶液、酏剂、悬浮液、乳液、溶液、糖浆、气雾剂、软和硬明胶胶囊、无菌包装粉末、或与食品组合或引入所述食品中。
43.一种增加丁酸水平的方法,包括向有需要的动物施用根据权利要求1所述的组合物的步骤。
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