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CN104380105A - 生物样品中的分析物的检测和/或定量方法 - Google Patents

生物样品中的分析物的检测和/或定量方法 Download PDF

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Abstract

一种基于适体的SERS检测技术，该技术通过产生与已经结合所述适体的来自复杂生物样品的分析物的身份有关的光谱信息来直接监测适体-分析物捕获事件。对于在金属表面上形成的适体-分析物复合物测量其可再现的SERS光谱，该光谱信息直接用于鉴定特定的适体-分析物复合物，并还可选地用于定量样品中的分析物，从而能够在对复杂生物样品的定量分析物测定中区分真、假阳性。在一个实施方式中，适体直接附着在金属表面上并被两亲性分子的自组装单层(SAM)包围。在替代性实施方式中，金属表面被覆有SAM，并且适体附着在SAM的两亲性分子上。

Description

生物样品中的分析物的检测和/或定量方法
技术领域
本发明涉及生物传感器，特别涉及表面增强拉曼散射和适体在直接检测和/或定量各种分析物中的应用。
背景技术
复杂生物样品中特定生物分子的定量测量是许多分子诊断测试的关键部分。然而，以与廉价、读取结果快速、手持式、用电池运行的护理现场(point-of-care)用设备的开发相容的方式来适当地测量多种不同分析物类型仍然是很大的挑战。
例如，在传染病领域中，急需能够在诊断诸如结核(TB)、疟疾、HIV等疾病时提供有用的信息的快速的护理现场用设备。在TB领域(和更通常的领域)，现有的潜在护理现场诊断测试有多种局限，其中包括：
·在检测所需的分析物浓度方面，测定灵敏度不足，导致假阴性结果；
·检测试剂缺少特异性，导致假阳性结果；
·检测试剂的温度稳定性差，导致假阴性和假阳性结果。
为了说明这些局限，Dheda等观察到，对于结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,M.tb)来源的脂阿拉伯甘露聚糖(LAM，一种复杂的糖脂)，现有的基于抗体的酶联免疫测定(ELISA)在尿中进行时有99％的特异性，但仅有13％的灵敏度，这使得对于临床应用而言有不可接受的高假阴性率1。相比之下，痰液中的同一测试得到～86％的灵敏度，但仅有～15％的特异性，这导致了不可接受的高假阳性率。Dheda等确定，痰液中的假阳性是由于测定中所使用的抗LAM抗体与共居于口腔中的其他微生物(致病性和非致病性)所产生的LAM样聚合物有交叉反应性1。相反，假阴性结果的原因可能是固有的抗体-抗原亲和力，以及生物样本中的低抗原浓度和ELISA方法的固有检测极限。因此，在消除假阴性结果(通过提高检测极限)和假阳性结果(通过提供与所捕获的分析物的身份有关的直接信息)的同时快速准确地测量患者样本中的特定M.tb来源的化合物(例如LAM)的浓度的能力将是TB诊断测试中的重大进步，但现在还尚未实际可行。
在另一实例中，外科领域中的一个重要挑战是对患者施用正确剂量的麻醉剂。众所周知，个体患者对大部分药物样分子(包括麻醉剂)的代谢速率差异极大，这是因为在例如细胞色素P450酶方面存在个体间多态变化2。结果，诸如麻醉剂(例如，二异丙酚)等药物的活性形式的血浆浓度在高代谢者和空代谢者之间可能差异极大，进而导致对药物施用的响应不同，外科手术过程中的极端结果是患者因施用剂量对其基因型来说过低而在手术中醒来，或者是患者因施用剂量对其基因型来说过高而死亡。因此，在缺乏各个个体患者的能够用来预先计算确切最佳剂量的定量药物基因组学数据时，在手术室中实时地快速准确地测量和监测个体患者的化合物(例如二异丙酚)血浆浓度的能力将是麻醉学的重大进步，不过这种能力实际上还不能实现。
上文发现的现有的潜在护理现场诊断测试中的多种缺点可通过使用如下所述的新型表面增强拉曼散射(SERS)测定平台来解决。
表面增强拉曼散射是公知的振动光谱技术，其因超灵敏、极具特异性和对生物分子的低检测极限而引起了相当大的关注3；据报道，与传统拉曼光谱相比，SERS的系宗平均拉曼信号提高了8个数量级，使其基本上能够检测单个分子4。SERS现象利用强烈的局部倏逝波(一种电磁场，可通过表面电浆子的光学激发而在金属表面和接合处产生)来获得表面所吸附的分子的拉曼光谱或“标志性特征(signature)”。传统上，SERS测量是对具有“拉曼活性”的单独的纯化合物进行，这些化合物定位于在倏逝波有效范围内的适当金属表面上。通常使用诸如金或银等贵金属作为SERS表面，但也可以使用诸如铜、铁、钴、镍、钯和铂等其它过渡金属5。由于倏逝波的传播从形成波的边界开始随距离呈指数衰减，SERS测量通常对定位于金属表面20nm内的化合物进行3,6，不过已有报道称在最多120nm的距离处有SERS增强7。重要的是，由于入射光子的拉曼位移与所研究的分子结构有直接关系，SERS技术具有高度选择性，并且每种分子都具有可量化的独特的拉曼标志性特征。因此，SERS基本上可用于确定化合物的身份(通过将所测得的SERS光谱与参比SERS光谱数据库进行比较)并测量其浓度。
因此，通过提供被检测分子的身份的定量信息，用SERS检测生物分子(包括生物标志物)可以潜在地大大提高诊断性测定的灵敏度和特异性，同时还提供了更低的检测极限。然而，当应用于不同分子的复杂混合物时，源自该混合物的不同组分的重叠SERS光谱使得在没有进行一些预先分离或划分步骤的情况下鉴定和定量该混合物中单个组分的任务基本不可能完成；这种考虑迄今一直在限制着SERS在医学诊断中的应用。
许多研究已经表明，微流控(micro-fluidics)技术与SERS的组合可以用于检测痕量爆炸物8。还已经报道，SERS可用于各种应用，包括检测污染物和DNA，并且已经设计出了能够准确检测非常低浓度的血糖的SERS纳米生物传感器9,10。
一些学术小组已经试图通过将SERS与作为特定分子的分离和富集基质的适体(aptamer)结合来增强SERS的检测能力11,12。适体是结合特定靶分子并且在靶分析物的存在下折叠为3D构象的寡聚核酸或肽13。特别是，DNA适体是高度稳定的核酸类多聚物，其可以以高亲和力和高度辨识的方式结合蛋白、核酸、糖、脂质和小分子；因此，它们的分子识别性质与抗体相当，并可能超过抗体，同时由于其更小的物理尺寸(DNA适体长度通常≤100nt，其分子量≤35kDa)而可能比抗体与SERS更相容。DNA适体通常通过使用体外选择方法生成，并且通常表现出比抗体更大的对热和湿度的耐受性，这是因为其较小的尺寸、磷酸二酯键的内在稳定性，而且因为其在响应于同种抗原的存在时通常采取可逆的折叠构象。
Cho等11使用基于适体的SERS传感器来检测凝血酶。在他们的方法中，首先将亚甲基蓝标记的抗凝血酶适体物理吸附至金纳米颗粒上；在亚甲蓝标记的适体位于金表面附近时，可出现亚甲基蓝(具有拉曼活性的染料)的SERS。然而，在凝血酶的存在下，所述抗凝血酶适体发生了构象变化，这种构象变化削弱了与金表面的物理缔合，使得所述适体-分析物复合物(因此使得亚甲基蓝标记)扩散离开该表面，并淬灭了SERS信号。因而，认为所产生的亚甲基蓝SERS信号减少间接地指示了适体与凝血酶结合11。
在一个不同的方法中，Huh和Erickson12首次用拉曼活性染料FITC标记了蛋白质加压素；当FITC标记的加压素结合了固定化的抗加压素适体时，FITC标记被带到表面的附近，使得可测量FITC染料的强SERS信号，从而给出加压素与适体结合的间接数据12。
值得注意的是，上述两种适体-SERS测定法均涉及从金表面上置换带拉曼标记的适体11或使带拉曼标记的蛋白与固定化的适体结合12。因此从根本上说，这两种方法均监测拉曼标记的移动，而不是直接监视特定的适体-配体捕获事件本身。因此，这些测定不提供适体所结合的分析物的身份的相关信息，而只是提供已经结合了某物质的信息，所以与现有的ELISA测试或其他荧光检测技术在信息内容上没有根本区别。
Neumann等14描述了对由适体与靶分子(例如蛋白质或有机配体)结合引起的适体构象变化的SERS类检测。在这项工作中，Neumann等人证明，存在于C6-烷基硫醇自组装单层(“SAM”，“适体-SAM”)上的未结合的热变性适体的SERS光谱可再现地以适体的腺嘌呤环呼吸模式为主导，但注意到在结合特定配体时，适体-SAM的SERS光谱以再现性明显较差的模式改变14。于是Neumann等致力于通过测量未结合的热变性适体-SAM的适体-SAM SERS光谱、然后确定所产生的适体-SAM SERS光谱在配体结合时发生的再现性明显丧失，来推测靶分子与固定化的适体的结合14。利用圆二色光谱，Neumann等证明，例如在抗可卡因适体-SAM中，特定靶分子可卡因可以诱导出可测量的构象变化，但这种变化也可由相关但不同的分子苯佐卡因和咖啡因诱导14。因此，正如之前一样，Neumann等的SERS法不能对适体-分析物复合物本身的身份提供直接的光谱信息；相反，Neumann等只是推断某物质已经结合了适体-SAM(例如其实例中的可卡因、苯佐卡因或咖啡因)并诱导出适体-SAM SERS光谱的再现性明显较差的变化。
仍然需要检测和测量复杂生物样品中给定分析物的量，所述生物样品例如可还包含能够与给定分析物交叉反应从而在其他测定中产生假阳性数据的其他分子。
发明内容
因此，在本发明的第一方面，提供了一种鉴定生物样品中的分析物分子的方法，所述方法包括以下步骤：利用分析物特异性适体将所述分析物分子捕获在表面上，测量所得到的特异性适体-分析物复合物的SERS光谱和SERS信号强度，和将所测得的SERS光谱与参比SERS光谱数据库比较，从而验证所捕获的分析物分子的身份。
还可以将所测得的SERS信号强度与标准曲线比较，从而对所捕获的分析物的丰度进行定量。
本发明因此提供了一种新型的基于适体的SERS检测技术，该技术通过产生与已结合至适体的分析物的身份有关的鉴定和定量用光谱信息来直接监测适体-分析物捕获事件。根据该发明，测量在表面上形成的适体-分析物复合物的可再现SERS光谱，并将该光谱信息直接用于推导出与特定的适体-分析物复合物的身份有关的定量信息，因此，基于利用适体-分析物复合物的拉曼光谱对所捕获的分析物分子身份的验证，能够区分真、假阳性。
所述生物样品可以是其中所述分析物只是多种其他组分中的一种组分的复杂生物样品。
所述适体可以是DNA适体。
所述分析物分子可以是蛋白、肽、核酸、脂质、糖脂、糖、麻醉剂、药物、完好的细胞、细菌病原体或病毒病原体。优选的是，所述分析物分子可以是指示受试对象的感染、疾病或医学状况的分析物，或者可以是麻醉剂化合物或其代谢物。
所述表面可包含两亲性分子的自组装单层(SAM)，并且所述SAM可以直接或间接地被所述适体分子衍生化(derivatized)。
所述适体可直接附着在所述SAM的两亲性分子上，或可以直接附着在所述表面上并被SAM包围。所述SAM可以以共价方式被覆有低聚乙二醇分子层。
所述低聚乙二醇分子可具有暴露的末端，并且其中的约1％～80％可以直接或间接地被适体分子衍生化。所述适体可存在于所述表面上的未衍生化的低聚乙二醇聚合物层之上。
根据本发明的第二方面，提供了一种传感器，所述传感器用于从复杂生物样品中捕获所关注的分析物以测量所捕获的分析物的SERS光谱，所述传感器包括：附着在基体的金属(例如，金或银)表面上的两亲性分子的自组装单层(SAM)，和对所关注的分析物具有特异性的适体；其中，所述SAM被覆有与所述SAM的两亲性分子结合的低聚乙二醇分子层。
所述SAM的两亲性分子中的一部分可以直接或间接地被适体分子衍生化。
本发明还包含了包括本发明的传感器的检测器。所述检测器适当地还可包含激光器和SERS检测器。
附图说明
图1显示了AgFON表面上的6-巯基己醇SAM的偏移SERS光谱。(a)制备SAM后立即获取的SERS光谱；(b)制备SAM后2.5周获取的SERS光谱。注意，需要将信号相对于光谱(a)放大200倍才能观察到相似特征；(c)制备SAM之后14周获取的SERS光谱。注意，其代表相对于光谱(a)有10倍信号放大。
图2显示了Oligo1官能化的AgNP表面的SERS光谱。(a)在如Y轴所示的不同的阴极电势下获取的偏移SERS光谱；(b)在如Y轴所示的阳极阶梯电压下随后获得的偏移SERS光谱。
图3显示了在同一Oligo1官能化的AgNP表面上间隔6个月获取的两个偏移SERS光谱。这些光谱在相对于Ag/AgCl为-0.4V下获取。
图4显示了在结合Oligo2之前和之后获取的Oligo1官能化的AgNP表面的偏移SERS光谱。作为参考，还偏移显示了AgNP表面上的脱氧腺苷单磷酸酯的SERS光谱。
图5显示了在结合了乱序Oligo3后获取的Oligo1官能化的AgNP表面的SERS光谱。该偏移光谱在如Y轴所示的相对于Ag/AgCl的不同阴极电势下获取。
图6显示了在如Y轴所示的相对于Ag/AgCl的不同阴极电势下获取的Oligo1官能化C12-SAM衍生化的AgNP表面的SERS光谱。(a)与互补Oligo2温育后获取的偏移SERS光谱；与乱序Oligo3温育后获取的偏移SERS光谱。
图7显示了在AgNP表面上为区分活细菌而获取的偏移的可再现SERS光谱。这些SERS光谱可用于形成参比SERS光谱的代表性数据库。(a)金黄色葡萄球菌(S.aureus)的SERS光谱；(b)大肠杆菌的SERS光谱；(c)表皮葡萄球菌(S.epidermis)的SERS光谱；(d)蜡状芽孢杆菌(B.cereus)的SERS光谱。
图8是典型的AgFON表面的扫描电子显微镜(SEM)图像。
图9是在银表面上形成适体官能化的SAM的示意图(R-NH2＝5’-氨基修饰的DNA适体)。
图10是适体官能化SAM衍生化的AgFON SERS传感器表面的示意图。
图11是描绘具有可再现3D结构的位于适体官能化SAM衍生化的AgFON表面上的适体-分析物复合物的示意图。
图12是用于实时监测麻醉剂血浆浓度的SERS生物传感器的设置的示意图。
图13是放置在流动池中的SERS生物传感器的示意图。
图14是与SERS生物传感器连接的微流控系统的示意图。
图15是在尖端具有SERS传感器的纤维光学探针的示意图。
具体实施方式
本文描述了一种基于适体的SERS检测技术，该技术通过产生与已结合了适体的分析物的身份有关的光谱学信息来直接监测适体-分析物捕获事件。测量了在表面上形成的适体-分析物复合物的可再现SERS光谱，并将该光谱信息直接用于推导出与特定的适体-分析物复合物的身份有关的鉴定和/或定量用信息。这使得能够在对复杂生物样品的定量分析物测定中区分真、假阳性。
所要检测的分析物可以是大分子，例如蛋白质(例如γ-干扰素、结核分枝杆菌6kDa早期分泌抗原[ESAT-6]、前列腺特异性抗原、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)乳酸脱氢酶、簇连蛋白)、肽(例如胰岛素、NMDA受体肽、B-型利尿钠肽)、核酸(例如结核分枝杆菌rpoB基因片段(包括其抗药性编码突变形式)、HIV病毒RNA、恶性疟原虫基因组DNA片段、鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)DNA片段、甲型流感病毒RNA)、脂质(例如胆固醇、分枝菌素、分枝菌酸、结核菌醇双结核蜡酸酯)、糖脂(例如脂阿拉伯甘露聚糖、脂多糖、鞘氨醇、半乳糖神经酰胺硫酸酯)、糖(例如Thomsen-Friedenreich抗原、葡萄糖)、麻醉剂(例如二异丙酚、地西泮、硫喷妥、吗啡、芬太尼、瑞芬太尼、利多卡因)、药物(例如伊马替尼、吉非替尼、依法韦伦、利福平、青蒿素、甲基苯丙胺)，或者可以是完好的细胞(例如恶性疟原虫、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、循环癌细胞)、细菌病原体(例如结核分枝杆菌、鼠伤寒沙门菌、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、大肠杆菌、幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)、单核细胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae))或病毒病原体(例如B或C亚型的HIV-1、甲型流感病毒、乙型肝炎病毒、登革热病毒、人乳头状瘤病毒)。在特定实施方式中，分析物是二异丙酚或脂阿拉伯甘露聚糖。在优选的实施方式中，分析物在分离状态下具有固有的强SERS光谱(即分析物本身具有拉曼活性)(例如葡萄糖、乳酸脱氢酶、二异丙酚、DNA、RNA、吉非替尼、6-硫鸟嘌呤、吉西他滨、完好的结核分枝杆菌、完好的HIV-1病毒粒子)，不过还可以对其他分析物执行该方法。
分析物可以存在于包含复杂混合物的生物样品(例如血液(包括全血和血浆)、唾液、痰、尿、脑脊液或粪便)中，其中所关注的分析物只是许多组分之一。对样品中的分析物的鉴定和/或定量例如可以用来诊断或监测疾病、感染或医学状况(例如肺结核、疟疾、HIV病毒/艾滋病)，或可用来监控对患者的麻醉药施用。
自组装单层(SAM)是两亲性分子的有组织层，其中所述分子的一端(“头部基团”)显示出对表面的特殊亲和力15。通常，在本发明的SAM中，表面可以是金属，例如金、银、铜、铁、钴、镍、钯或铂，并且头部基团可以是巯基。优选地，所述表面可以是金或银纳米颗粒，或可以是被覆金膜或银膜的纳米球。
除了头部基团外，SAM的两亲性分子还包含可在末端具有官能团的疏水性尾部。所述官能团的实例包括N-羟基琥珀酰亚胺酯、环氧化物、胺、羧酸、酰肼或氨基氧基基团。在头部基团与表面结合时，两亲性分子的疏水尾部经历缓慢的2D自组织。疏水性尾部一般可以是烷基链，长度通常为约6至约16个碳。例如，所述烷基链的长度可为6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个碳。所得的SAM的有序化程度取决于许多因素，包括烷基链的长度：烷基链越长，组织程度越高并且SAM的稳定性越高。良好形成的SAM通常对温度、溶剂和电势显示出高稳定性。良好形成的SAM例如可以由11-巯基十一醇、12-巯基十二烷酸或16-巯基十六烷酸的溶液制备，但用于制备SAM的其他试剂也是本领域公知的。
可利用多种分子来使该官能团化学衍生化，包括但不限于以所关注的特定分析物为目标的DNA适体、RNA适体或肽适体，以及抵抗大分子非特异性吸附的聚合物。该聚合物的实例包括乙二醇聚合物、乙烯亚胺聚合物、透明质酸或羧甲基葡聚糖。这种化学衍生化通常在SAM形成后进行，但在一些实施方式中，也可以在SAM形成之前对两亲性分子进行化学衍生化15。
SAM可以以共价方式被覆有低聚乙二醇分子层。所述低聚乙二醇聚合物的长度可以适当地是3至12个乙二醇单元(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个单位长)，并且其可以与形成SAM的两亲性分子尾部的官能团结合。例如，可以使用2-{2-[2-(1-巯基十一烷-11-基氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙醇(HS-(CH2)11-(OC2H4)3-OH；1-巯基十一烷基-11-三(乙二醇)；HS-C11-EG3)、2-(2-{2-[2-(1-巯基十一烷-11-基氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醇(HS-C11-EG4)、2-{2-[2-(2-{2-[2-(1-巯基十一烷-11-基氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙醇(HS-C11-EG6)、11-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-十一烷-1-巯基(HS-(CH2)11-(OC2H4)3-OCH3；HS-C11-EG3-OMe)或11-{2-[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-十一烷-1-巯基(HS-C11-EG6-OMe)来形成共价被覆有低聚乙二醇分子层的稳定SAM。
在一些实施方式中，低聚乙二醇封端的烷基硫醇类SAM可以在由银或金纳米颗粒构成的表面上或者在由被覆有银膜或金膜的纳米球构成的表面上组装。
适当地，适体可以使低聚乙二醇封端的SAM衍生化，从而使得形成SAM的底层两亲性分子中的一部分(适宜地为约1％～80％)直接或间接地被适体分子衍生化。在一些实施方式中，超过约2％、约5％或约10％且小于约70％、约60％或约50％的形成SAM的底层两亲性分子可以直接或间接地被适体分子衍生化。
一些或全部低聚乙二醇分子可以在其暴露的末端被对所关注的分析物有特异性的适体衍生化。
作为另一选择，适体可以直接附着在SAM的两亲性分子上。
在一些实施方式中，适体可以存在于未衍生化的低聚乙二醇聚合物层上。
在其他实施方式中，适体可以直接附着在表面上，并且可以可选地被低聚乙二醇封端的SAM包围。
适体可以适当地是对所关注的分析物有特异性的DNA适体、RNA适体或肽适体。适体可以是先前描述的适体(如果有的话)或可通过本领域公知的方法来鉴定，例在US5,475,096和US5,843,653中描述的将固定化的分析物分子用于富集步骤的体外选择法或SELEX(凭借指数富集的配体系统进化)法。对本领域技术人员显而易见的是，所关注的分析物的适体无需限于以下实施例中描述的具有特定序列的寡核苷酸。
根据本发明，使适体-低聚乙二醇-SAM表面与含有分析物的样品接触，从而在表面上形成适体-分析物复合物，之后可以可选地洗涤表面以除去未结合的物质，并且可以可选地对表面施加可变电压。然后测量所得到的适体-分析物复合物的SERS光谱和SERS信号强度。而后可以将所测得的SERS光谱与参比SERS光谱数据库比较，从而确定所捕获的分析物的身份。通过将所测得的SERS信号强度与标准曲线比较，可以确定原始样品中该分析物的量。
适体官能化的SAM充当分隔层，使得分析物能够在距离银膜足够近的地方被捕获和富集，从而能够基于电浆子共振而充分激发适体-分析物复合物，从适体-分析物复合物产生强SERS信号。适当的是，官能化的SAM(例如，低聚乙二醇封端的SAM)还可以减少对表面(以及对SAM本身)的非特异性大分子吸附，从而降低下游SERS光谱中的背景信号，由此提高了信噪比。根据本发明，通过使适体呈现于低聚乙二醇分子层之上并同时使适体保持在表面倏逝波的有效范围内，适体官能化的SAM最大限度地减少了适体和SAM表面之间的物理相互作用；在分析物与适体结合时，这种适体官能化的SAM产生了针对特定适体-分析物复合物的可再现的独特SERS光谱，从而能够确定已结合至适体的分析物的身份，并且能够确定样品中存在的分析物的量。
在实时监控诸如麻醉剂等分析物时，必须选择适体以使分析物可以在对于所需的测量频率而言适当的时间尺度上进行可逆的结合/分离。这可以通过使用以下抗分析物适体来实现，该适体的结合亲和力(Kd)在微摩尔至纳摩尔范围内，从而使分析物从适体-分析物复合物上解离的半衰期(t1/2)的时间尺度为数分钟，而不是数小时。
图10绘出了这样一种官能化的生物传感器表面，并且示出了处于解折叠状态的适体。当SERS生物传感器与目标分析物接触时，如图11所示，适体通常发生构象变化以采取能够以高亲和力和特异性结合分析物分子的“活性”构象。
本发明的传感器表面上的适体-分析物复合物的SERS光谱因被捕获的分析物中以及结合有分析物的适体中的独特振动模式而产生。因此，适体-分析物复合物的SERS光谱与分离的适体或分析物的SERS光谱均不同。
在优选实施方式中，DNA适体的精确核苷酸序列以及适体-分析物复合物的精确的可再现的三维形状导致了特定适体-分析物复合物的独特的可极化性，并由此导致了独特的振动模式，从而产生具有独特的可测量的SERS标志性特征的适体-分析物复合物，而不论该分析物本身是否具有强的SERS标志性特征。
可以将拉曼传感器的激发波长调至对每种特定适体-分析物复合物而言是最佳的。也可使用傅立叶变换法来对以宽谱光源照射纳米颗粒时获得的SERS光谱进行去卷积(deconvolute)。
因此，本发明的方法和传感器在以下两种情况中有效：所要检测的分析物分子在分离状态下具有固有的强SERS光谱(例如葡萄糖、乳酸脱氢酶、二异丙酚、DNA、RNA、吉非替尼、6-硫鸟嘌呤、吉西他滨、完好的结核分枝杆菌、完好的HIV-1病毒粒子)；和，所要检测的分析物分子在分离状态下没有固有的强SERS光谱(例如ESAT-6、γ-干扰素、胰岛素)。
本发明的一个重要特征是能够对每种适体-分析物复合物产生可再现的SERS光谱的能力。这在本发明一个实施方式中通过以下方式来实现：在金属表面上提供形成良好(即高度组织化)的稳定SAM，在所述形成良好的SAM上覆盖能抵抗非特异性大分子吸附的聚合物层，并用适体使所述形成良好的SAM的一部分进一步衍生化。因此，在适体捕获特定的分析物时，抵抗大分子非特异性地吸附本发明的SAM表面的聚合物层还用于使所得到的适体-分析物复合物与SAM表面之间的非特异性非共价相互作用最小化，并使所得到的适体-分析物复合物能够埋入或穿透SAM的程度最小化。这是重要的，因为适体-分析物复合物和SAM表面之间的非特异性非共价相互作用，以及适体-分析物复合物在SAM表面中或穿透SAM表面的任何包埋，都能够以可再现性差的方式扭曲适体-分析物复合物的SERS光谱。在没有这样的扭曲的情况下，特定的适体-分析物复合物的SERS标志性特征由此独特地并可再现地代表了相关的适体-配体捕获事件，并由此提供了与所关注的分析物的确切身份有关的定量信息。
作为另一选择，对每种适体-分析物复合物产生可再现SERS光谱的能力可以在本发明另一实施方式中通过以下方式来实现：用适体直接官能化金属表面，然后用抵抗非特异性大分子吸附的良好形成的SAM包围固定化的适体。在所述适体捕获特定分析物时，周围的SAM用于使所得的适体-分析物复合物与SAM表面之间的非特异性非共价相互作用最小化，并使所得到的适体-分析物复合物能够埋入或穿透SAM的程度最小化。SAM还用于抵抗大分子对本发明的SAM表面的非特异性吸附。
本发明的方法没有使用指示剂。本发明的方法还可以在不使用将光束分为多个光束的结构体的情况下和在不使用包括低分辨率衍射光栅色散元件以接受散射辐射并将其分为不同波长分量的装置的情况下实施。
本发明各方面的优选特征在进行必要的变更后如在各其他方面中所定义的相同。
本发明其它特征和细节将通过以下非限制性实例而变得清楚可见。
实施例
1.自组装单层衍生化的SERS传感器表面的制备和分析
为了制备自组装单层(SAM)衍生化的SERS传感器表面，将玻璃盖片在食人鱼洗液中清洁并在去离子水中洗涤。将600nm二氧化硅颗粒以5％(重量/体积)悬浮在去离子水中，然后滴涂在盖片上。然后将玻璃盖片上的所得的密集堆积的二氧化硅颗粒插入到气相沉积室中，并以0.24nm s-1的速率沉积200nm银，从而形成适合于SERS的位于纳米颗粒上的银膜(AgFON)，基本如3所述。然后将复制的各AgFON表面浸没在6-巯基己醇溶液(乙醇中的1mM溶液)或12-巯基十二烷酸溶液(乙醇中的1mM溶液；目录号705241，Sigma Aldrich)中，并于室温温育过夜，从而在纳米结构银表面上形成各个自组装单层。温育后，用乙醇反复清洗SAM衍生化的AgFON表面。
在纳米结构银表面上制备SAM后，利用DeltaNu台式色散型拉曼光谱仪(空气冷却的CCD，785nm二极管激光器)在14周的时间内通过SERS定期监测SAM的稳定性。这些SERS测定清楚地表明，在2.5周的时间内，“C6 SAM”(即，使用6-巯基己醇形成的SAM)已大量降解(图1)。然而，观察到“C12 SAM”(即，使用12-巯基十二烷酸形成的SAM)的SERS光谱(图2)在相同时间内是稳定的(数据未示出)。
这些数据符合基于文献的预期，即，链越长的SAM应当越稳定。因此值得注意的是，现有技术中，Neumann等经由C6-连接体将DNA适体固定在银表面上，并观察到再现性差的适体SERS光谱，这可能是由于形成了不完整的、不均匀的和不稳定的SAM。
2.DNA官能化的胶体银SERS传感器表面的制备和分析
加入1％(重量/体积)柠檬酸钠溶液(10ml；纯度>99.5％)来还原1mM的硝酸银(500ml；纯度>99.9％)沸腾溶液，从而产生银纳米颗粒(AgNP)胶体(预期NP直径为30nm～60nm)。沸腾30分钟后，离心收集胶体银NP(3600×g，15分钟)，然后以3份5μL的等分试样滴涂在市售丝网印刷电极(SPE)的碳漆工作电极上，然后使电极完全干燥，从而产生适合于SERS的AgNP表面。
将二硫化物形式的5’-巯基封端的DNA寡核苷酸(Oligo1；5’-HS-(CH2)6-TCCTGG GCT GGC GGG TCG CTT CC-3’(SEQ ID NO:1))重悬在50mM Na2PO4pH7.4中至浓度为2mM，并与AgNP表面温育过夜，从而经由5’-巯基将寡核苷酸固定在纳米结构银表面上；二硫键的还原(以释放巯基)自发地原位出现。
然后将SPE上的DNA官能化的胶体银SERS传感器表面插入电化学电池中，该电池由玻璃伏安电池以及固定丝网印刷电极的迷你USB适配器组成。该电极与恒压仪偶接，然后以不同的阴极电位对固定化的寡核苷酸进行电化学SERS测量，其中以100mV的增加幅度使在阴极方向上施加的电势从0.0V至-1.0V逐步变化。丝网印刷电极包括内置的反电极(碳)和参比电极(Ag/AgCl)，并且所有的电位都相对于Ag/AgCl测量。使用DeltaNu台式色散型拉曼光谱仪(空气冷却的CCD，785nm二极管激光器)以中高功率(46.5mW)和30秒的采集时间获得SERS光谱。所得到的SERS光谱清楚地表明该DNA寡核苷酸已经固定在银NP表面上，并且还表明，通过将阴极电势改变为相对于Ag/AgCl为负电势，可以调节DNA官能化的AgNP表面的SERS信号强度，从而使固定化的DNA寡核苷酸的SERS光谱不再以柠檬酸的光谱为主导(图2a)。当随后使电压逐步阳极化时，保留了DNA官能化的AgNP表面的SERS光谱(图2b)。
随后在6个月的时间内定期记录固定化的DNA寡核苷酸的SERS光谱，在此期间没有观察到信号的明显衰减(图3)，这表明DNA官能化的胶体银SERS传感器表面是稳定的。
3.利用DNA官能化SAM衍生化的SERS传感器表面对结核分枝杆菌DNA片 段进行无标记检测
将复制的DNA官能化的胶体银SERS传感器表面(利用Oligo1根据实施例2制备)与互补性DNA寡核苷酸(Oligo2；5’-GGA AGC GAC CCG CCA GCC CAG GA-3’(SEQ ID NO:2)；在50mM Na2PO4pH7.4中为2mM)或与乱序序列DNA寡核苷酸(Oligo3；5’-ACC GAG CCA GGC AGC CAG GGC AC-3’(SEQ ID NO:3)；在50mMNa2PO4pH7.4中为2mM)在室温下温育1小时，以使DNA杂交。然后按照实施例2的方式为每种DNA官能化SAM衍生化的SERS传感器表面记录SERS光谱。所得光谱显示，通过SERS，可以以无标签并且无扩增的方式检测到Oligo2(其序列源自结核分枝杆菌的IS6110基因组DNA序列，并且与固定化的Oligo1的序列完美互补)与固定化的Oligo1的杂交(图4)。
然而，SERS光谱还表明，可观察到Oligo3的非特异性结合，据推测是因为Oligo3与AgNP表面的直接物理吸附(图5)。
为了消除这一非特异性结合，将DNA官能化的胶体银SERS传感器表面(利用Oligo1根据实施例2制备)在12-巯基十二烷酸溶液(乙醇中的1mM溶液)中于室温温育过夜，从而形成自组装单层(SAM)，其回填在纳米结构银表面上；该“C12 SAM”包围但未替代预先固定化的Oligo1分子，从而产生了适合于SERS的DNA官能化SAM衍生化的AgNP表面。
随后将复制的DNA官能化C12 SAM衍生化的胶体银SERS传感器表面与Oligo2或Oligo3(DNA浓度和缓冲液如前所述)在室温下温育1小时，以使DNA杂交。然后记录每种上述DNA官能化SAM衍生化的SERS传感器表面的SERS光谱。所得光谱表明，通过SERS可以以无标签且无扩增的方式检测到Oligo2与固定化的Oligo1的序列特异性杂交(图6a；注意～730cm-1和～1328cm-1的峰是杂交的寡核苷酸的特征)，但再不能观察到Oligo3的非特异性结合(图6b；注意～730cm-1和～1328cm-1的峰消失)，据推测这是因为C12 SAM现在阻止了Oligo3与AgNP表面的物理吸附。此外，还观察到在DNA官能化C12 SAM衍生化的胶体银SERS传感器表面上与固定化的Oligo1杂交的Oligo2的SERS光谱在重复实验中和在复制的传感器表面上可以再现。此外，在尿或似尿缓冲液中进行杂交时，可以记录到Oligo2与固定化的Oligo1杂交的等同的SERS光谱，这表明尿液中存在的其它无机分子(例如氯离子)或生物分子(例如，任何非互补性经肾DNA片段)不会干扰在这种DNA官能化C12 SAM衍生化的胶体银SERS传感器表面上进行的SERS测定。
利用这种DNA官能化C12 SAM衍生化的胶体银SERS传感器系统，观察到了以下结果：通过使阴极电压逐步变为相对于Ag/AgCl为负的电势，由Oligo2与Oligo1的特异性杂交导致的SERS光谱的强度可增加3～5倍，但在该过程中SERS光谱中的峰的分布没有变化(图6a)。
本实施例展示了在本发明的SAM衍生化表面上获得DNA适体-分析物结合事件的可再现SERS光谱的能力。在纳米结构银表面上，固定化的DNA寡核苷酸与良好形成的稳定SAM的组合使得能够均匀地呈现固定化的DNA寡核苷酸，从而使它们能够在接近表面的地方选择性地结合所关注的分析物(在此情况下，为互补性DNA寡核苷酸)，由此产生更强的可再现SERS信号。此外，SAM还用于降低纳米结构银表面上的非特异性大分子吸附，从而提高了下游SERS光谱的信噪比，这也是对生物传感器应用的要求。
4.利用DNA适体官能化SAM衍生化的SERS传感器表面检测恶性疟原虫乳酸 脱氢酶
基本按照实施例3所述在丝网印刷电极上制备DNA官能化SAM衍生化的胶体银SERS传感器表面，不同之处如下：使用体外选择的5’-巯基-抗恶性疟原虫乳酸脱氢酶的DNA适体17(适体4；5’-HS-(CH2)6-GTT CGA TTG GAT TGT GCC GGA AGT GCTGGC TCG AAC-3’(SEQ ID NO:4)；在50mM Na2PO4pH7.4中为2mM)来代替Oligo1；并使用1-巯基十一烷基-11-三(乙二醇)(HS-(CH2)11-(OC2H4)3-OH；HS-C11-EG3；ProChimia Surfaces,Poland)(在乙醇中为1mM)来代替12-巯基十二烷酸。
将重组恶性疟原虫乳酸脱氢酶(pfLDH；在10mM HEPES pH7.5中为1μg/ml)在适体4官能化C11-EG3-SAM衍生化的AgNP表面上温育30分钟；然后用1ml10mMHEPES pH7.5洗涤该表面3次，以去除未结合的pfLDH，并按前述方式记录SERS光谱。然后将所记录的光谱与参比SERS光谱数据库比较，以确认所捕获的生物分子的身份。
该实施例中，低聚乙二醇封端的C11 SAM增强了对传感器表面上的非特异性大分子吸附的抗性，同时DNA适体提供了对pfLDH蛋白的特异性识别；这些的组合使得能够测量所得适体-分析物复合物的可再现SERS光谱，这包括获自疑似疟疾患者的血液或血浆样品中的pfLDH被适体所捕获的情况。
由于产生分析物-特异性适体的体外选择程序通常可鉴定数种能够选择性地紧密结合目标分析物的独特核酸序列，因此还可以利用替代性的经体外选择的5’-巯基-抗恶性疟原虫乳酸脱氢酶DNA适体(例如5’-HS-(CH2)6-GAA CTC ATT GGC TGG AGGCGG CAG TAC CGC TTG AGT TC-3’(SEQ ID NO:5),17)来代替适体4以用于对恶性疟原虫乳酸脱氢酶进行基于SERS的检测。
5.利用RNA适体官能化SAM衍生化的SERS传感器表面检测病毒病原体
基本按照实施例4所述在丝网印刷电极上制备RNA官能化SAM衍生化的胶体银SERS传感器表面，并作如下改变：使用5’-巯基-抗gp120 RNA适体(适体5；5’-HS-(CH2)6-GGG AGG ACG AUG CGG AAU UGA GGG ACC ACG CGC UGC UUGUUG UGA UAA GCA GUU UGU CGU GAU GGC AGA CGA CUC GCC CGA-3′(SEQID NO:6))18来代替抗恶性疟原虫乳酸脱氢酶的DNA适体；如前文所述，使用1-巯基十一烷基-11-三(乙二醇)形成回填的SAM以包围固定化的RNA适体。注意，在适体5中，将所有胞嘧啶(C)和尿嘧啶核苷分别替换为2′-脱氧-2’-氟-胞嘧啶和2′-脱氧-2’-氟-尿嘧啶，以提供对核酸酶的抗性18。
将完好的HIV假病毒的悬浮液在适体5官能化C11-EG3-SAM衍生化的AgNP表面上温育30分钟，然后用1ml10mM HEPES pH7.5洗涤该表面3次，以去除未结合的HIV假病毒，并按照前文所述记录可再现的SERS光谱。然后将所记录的光谱与参比SERS光谱数据库比较，从而确认所捕获的病毒病原体的身份。
在该实例中，低聚乙二醇封端的C11 SAM增强了对传感器表面上的非特异性大分子吸附的抗性，同时DNA适体提供了对HIV假病毒表面上的gp120蛋白的特异性识别；这些因素的组合使得能够测量所得适体-HIV假病毒复合物的可再现SERS光谱，这包括获自疑似HIV感染患者的血液或血浆样品中的HIV假病毒被适体所捕获的情况。
如前述，可使用显示出充分亲和力和特异性的体外选择的其他抗gp120 RNA适体来代替适体5，例如5’-HS-(CH2)6-GGG AGG ACG AUG CGG ACA UAG UAA UGACAC GGA GGA UGG AGA AAA AAC AGC CAU CUC UUG ACG GUC AGA CGACUC GCC CGA-3’(SEQ ID NO:7)18。
6.利用DNA适体官能化SAM-衍生化的SERS传感器表面来检测完好的细菌病 原体
基本按照实施例5所述在丝网印刷电极上制备DNA官能化SAM衍生化的胶体银SERS传感器表面，并作如下改变：使用体外选择的5’-巯基-抗CFP10.ESAT6 DNA适体(适体6；例如参考文献19中的CSIR2.11或CSIR2.19)来代替抗恶性疟原虫乳酸脱氢酶的DNA适体；如前文所述，使用1-巯基十一烷基-11-三(乙二醇)形成回填的SAM以包围固定化的DNA适体。
将活的结核分枝杆菌H37Rv的悬浮液(M.tb；106个杆菌/ml)在适体6官能化C11-EG3-SAM衍生化的AgNP表面上温育30分钟，然后用1ml10mM HEPES pH7.5洗涤该表面3次，以去除未结合的M.tb，并按照前文所述记录可再现的SERS光谱。然后将所记录的光谱与参比SERS光谱数据库比较(例如见图7)，从而确认所捕获的细菌病原体的身份。
在该实例中，低聚乙二醇封端的C11 SAM增强了对传感器表面上的非特异性大分子吸附的抗性，同时DNA适体提供了对结核分枝杆菌细胞壁中存在的CFP10ESAT6异源二聚体的特异性识别；这些因素的组合使得能够测量所得的适体-M.tb复合物的可再现SERS光谱，这包括获自疑似结核(TB)病患者的液化痰样品中的M.tb杆菌被适体所捕获的情况。根据TB疾病状态，这种液化痰样品可含有多达约104个M.tb杆菌/ml，并且还会含有可能表达ESAT6直系同源蛋白并因此可能被抗CFP10.ESAT6适体交叉识别的其他未鉴定微生物(例如，其它放线菌，例如非结核性分枝杆菌，或葡萄球菌，例如金黄色葡萄球菌)的混合物19；这些微生物可通过将所记录的适体-分析物复合物的SERS光谱与参比数据库比较而与M.tb区分开，从而在本发明的针对痰中M.tb杆菌的存在的SERS测定中能够区分真、假阳性结果。
7.制备DNA适体官能化SAM衍生化的SERS传感器表面以检测麻醉剂二异丙 酚
图8示出了按实施例1所述制备的AgFON表面的扫描电子显微镜图像。然后可以按如下方式在AgFON表面上形成混合适体官能化的SAM：
在二甲亚砜中，将羧酸封端的六(乙二醇)十六烷硫醇(HSC16EG6CH2COOH)和三(乙二醇)十六烷硫醇(HSC16EG3OH)的50:50摩尔比混合物制备成最终浓度为0.1mg mL-1，并与AgFON表面在室温下温育过夜，从而形成SAM。然后将SAM衍生化的AgFON表面用去离子水洗涤，然后用乙醇洗涤，并在氮气流中干燥。然后，将SAM衍生化的AgFON表面在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和NHS的溶液(在无水二甲基甲酰胺中的终浓度分别为0.2M和0.05M)中温育2小时，从而将SAM的羧酸部分活化为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯，然后用去离子水洗涤，然后用乙醇洗涤，并在氮气流中干燥。
在富集步骤中利用固定化形式的麻醉剂化合物二异丙酚和标准SELEX程序13分离出抗二异丙酚的DNA适体。然后利用DNA合成来产生该抗二异丙酚DNA适体的5’氨基修饰形式。
然后将100mM的5'-氨基修饰的抗二异丙酚DNA适体溶液与NHS活化的SAM衍生化的AgFON表面在磷酸盐缓冲盐水溶液(pH8.0)中于室温下温育过夜，从而在5'-氨基修饰的抗二异丙酚DNA适体与NHS活化的SAM之间形成酰胺键。最后，用去离子水洗涤在AgFON表面上形成的适体官能化的SAM，然后用乙醇洗涤，并在氮气流中干燥。这个过程示于图9中。
8.对麻醉剂血浆浓度的实时监测
下面的实例描述了SERS生物传感器在实时监测麻醉剂(例如二异丙酚)中的体外应用。图12示出了将SERS生物传感器用于此类应用的设置。SERS生物传感器可以封装在诸如流动池(2)等装置中。在流量调节器(1)的控制下，使血液以合适的流速(10～100μl分钟-1)流过流动池。将包括拉曼光谱仪(3)(其带有集成的激光源、检测器和相关的光学器件以及嵌入式计算机)的装置放置在流动池上，流动池具有光学窗口以允许激发激光和所产生的SERS信号穿过，然后该信号被拉曼检测器(3)检测、在嵌入(3)中的板载计算机中得到处理、并在监视器(4)上实时显示。当二异丙酚结合了抗二异丙酚适体时，适体的构象发生变化。通过实时监测适体-二异丙酚复合物的SERS信号并将信号强度与标准曲线比较，可以高度准确地确定血液中的二异丙酚浓度。对于这种应用，适体-SAM分隔层必须可逆地结合二异丙酚，以使得接近AgFON表面的二异丙酚浓度在任何给定时间均通过建立动态平衡而反映出当时流经传感器流动池的血样中的分析物浓度。此外，将所测得的SERS光谱与参比SERS光谱数据库比较，可以确认所测量的分析物的身份。
图13示出了在上述麻醉剂实时检测系统实例中提到的流动池和封装的SERS生物传感器的细节。通过流动池上的光学窗口，单光路将激光激发与生物传感器偶接，并将来自生物传感器的SERS信号与检测器偶接。位于激发激光波长中心的陷波滤波器可以减少背散射的激光激发。还可以采用“正面(head-on)”设置，其中激发路径来自流动池底部，并且从顶部检测SERS。这样的设置的灵敏度将更高。常见的便携式拉曼光谱仪系统将激光激发、相关光学器件和检测器整合成单一装置16。
可以使用微流控系统代替流动池，在微流控系统中，微流控芯片贴附在SERS生物传感器上。如图14所示，微流控系统以所需流速(例如20μl分钟-1)将少量血液泵送到SERS生物传感器上。
另一种可能的设置是如图15所示将SERS生物传感器贴附至光纤电缆上。通过将这样的光纤探针直接放入介质(例如血液)中，可用该探针来检测SERS，从而检测所关注的分析物。
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序列表

Claims (30)

1.一种鉴定生物样品中的分析物分子的方法，所述方法包括以下步骤：
利用分析物分子特异性适体将所述分析物分子捕获在金属表面上，
测量所得到的特异性适体-分析物分子复合物的SERS光谱和SERS信号强度，和
将所测得的SERS光谱与参比SERS光谱数据库比较，从而验证所捕获的分析物分子的身份。
2.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括将所测得的SERS信号强度与标准曲线比较以对所捕获的分析物的丰度进行定量的步骤。
3.如权利要求1或2所述的方法，所述方法在对生物样品的定量分析物测定中区分真、假阳性结果。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述分析物只是所述生物样品中多种其他组分中的一种组分。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述适体是DNA适体。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述分析物分子是蛋白、肽、核酸、脂质、糖脂、糖、麻醉剂、药物、完好的细胞、细菌病原体或病毒病原体。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述表面包含两亲性分子的自组装单层(SAM)，并且所述SAM直接或间接地被所述适体分子衍生化。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述适体直接附着在所述SAM的两亲性分子上。
9.如权利要求7或8所述的方法，其中，所述SAM以共价方式被覆有低聚乙二醇分子层。
10.如权利要求9所述的方法，其中，所述低聚乙二醇分子具有暴露的末端，并且在所述末端被所述适体衍生化。
11.如权利要求10所述的方法，其中，所述适体使低聚乙二醇封端的SAM衍生化，从而使形成所述SAM的底层两亲性分子中的约1％～80％直接或间接地被适体分子衍生化。
12.如权利要求7至11中任一项所述的方法，其中，所述适体存在于所述表面上的未衍生化的低聚乙二醇聚合物层之上。
13.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述适体直接附着在所述表面上并被SAM包围。
14.如权利要求13所述的方法，其中，所述SAM以共价方式被覆有低聚乙二醇分子层。
15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，所述方法用于对所述样品所采集自的受试对象的感染、疾病或医学状况进行诊断或定量。
16.如权利要求1至14中任一项所述的方法，所述方法用于监测麻醉过程中的受试对象。
17.一种传感器，所述传感器用于从生物样品中捕获所关注的分析物以测量所捕获的分析物的SERS光谱，所述传感器包括：附着在基体的金属表面上的两亲性分子的自组装单层(SAM)，和对所关注的分析物具有特异性的适体；其中，所述SAM被覆有抵抗大分子的非特异性吸附的聚合物层，所述聚合物与所述SAM的两亲性分子结合。
18.如权利要求17所述的传感器，其中，所述SAM的两亲性分子中的一部分直接或间接地被适体分子衍生化。
19.如权利要求17或18所述的传感器，其中，所述适体直接附着在所述SAM的两亲性分子上。
20.如权利要求17至19中任一项所述的传感器，其中，所述SAM以共价方式被覆有低聚乙二醇分子层。
21.如权利要求20所述的传感器，其中，所述低聚乙二醇分子具有暴露的末端，并且在所述末端被所述适体衍生化。
22.如权利要求20或21所述的传感器，其中，所述适体使低聚乙二醇封端的SAM衍生化，从而使形成所述SAM的底层两亲性分子中的约1％～80％直接或间接地被适体分子衍生化。
23.如权利要求20至22中任一项所述的传感器，其中，所述适体存在于所述表面约5nm内的未衍生化的低聚乙二醇聚合物层之上。
24.如权利要求17所述的传感器，其中，所述适体直接附着在所述传感器表面上并被SAM包围。
25.如权利要求24所述的传感器，其中，所述SAM以共价方式被覆有低聚乙二醇分子层。
26.如权利要求17至25中任一项所述的传感器，其中，所述适体是DNA适体。
27.如权利要求17至26中任一项所述的传感器，其中，所述适体对指示受试对象的感染、疾病或医学状况的分析物具有特异性。
28.如权利要求17至26中任一项所述的传感器，其中，所述适体对作为麻醉剂化合物或其代谢物的分析物具有特异性。
29.一种检测器，所述检测器包括权利要求17至28中任一项所述的传感器。
30.如权利要求29所述的检测器，所述检测器还包括激光器和SERS检测器。
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