JP2965502B2 - 表面増強ラマン散乱測定による分析方法 - Google Patents
表面増強ラマン散乱測定による分析方法Info
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Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明は、例えば、臨床検
査、生化学分析、医薬品の品質管理等の分野において微
量成分の検出や定量に使用される分析方法であり、詳し
くは、酵素反応を利用した表面増強ラマン散乱測定によ
る分析方法に関するものである。
査、生化学分析、医薬品の品質管理等の分野において微
量成分の検出や定量に使用される分析方法であり、詳し
くは、酵素反応を利用した表面増強ラマン散乱測定によ
る分析方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】臨床検査、生化学分析、医薬品の品質管
理等の分野において微量成分の検出や定量に使用される
分析方法としては、抗原抗体反応を利用した免疫学的分
析法（イムノアッセイ）が汎用されている。また、この
イムノアッセイの方法として、表面増強ラマン散乱測定
を利用する方法が報告されている。この方法は、金属粒
子等の表面にラマン活性物質を吸着させると、ラマン散
乱が増幅されるという現象を利用するものであり、例え
ば、特開平６−１７４７２３号公報および特開平７−１
４６２９５号公報に記載の方法がある。
理等の分野において微量成分の検出や定量に使用される
分析方法としては、抗原抗体反応を利用した免疫学的分
析法（イムノアッセイ）が汎用されている。また、この
イムノアッセイの方法として、表面増強ラマン散乱測定
を利用する方法が報告されている。この方法は、金属粒
子等の表面にラマン活性物質を吸着させると、ラマン散
乱が増幅されるという現象を利用するものであり、例え
ば、特開平６−１７４７２３号公報および特開平７−１
４６２９５号公報に記載の方法がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の
分析方法では、検出感度に一定の限界がある。例えば、
前記特開平６−１７４７２３号公報に記載の方法は、被
分析物質やその特異的結合物質を特有のラマン散乱パタ
ーンを有するラマン活性標識で標識し、これからのラマ
ン散乱を検出することにより、被分析物質を検出しある
いはその量を測定するものである。しかし、この方法
は、表面増強ラマン散乱を利用するが、ラマン活性標識
自体のラマン散乱のみを検出するため、その測定感度
は、前記標識のラマン散乱の検出感度に限定され、それ
以上の感度にすることは理論上不可能となる。例えば、
現在報告されている中で、表面増強ラマン散乱強度が最
も高い色素であるローダミン６Ｇの検出感度は１０-14
Ｍであり（Applied Spectroscopy,49,6,1985）、これに
準ずるクリスタルバイオレットは３×１０-11Ｍ（Anal.
Chem. 58,1116,1986）であると報告されている。よっ
て、特開平６−１７４７２３号公報に記載の方法に、こ
れらの色素をラマン活性標識として用いたとしても、そ
れ以上の検出感度を望むことはできない。また、特開平
６−１７４７２３号公報には、実際に表面増強ラマン散
乱をイムノアッセイに適用した例が示されているが、こ
の方法でも検出感度は、最高で、１０-11 Ｍである。そ
して、被分析物質をラマン活性標識で標識すると、フリ
ーの状態のラマン活性標識に比べ、検出感度が低下する
傾向がある。このため、表面増強ラマン散乱をイムノア
ッセイに適用しても、ラマン活性標識自身の検出感度以
下となり、高感度分析に十分対応できるとは言えない。
分析方法では、検出感度に一定の限界がある。例えば、
前記特開平６−１７４７２３号公報に記載の方法は、被
分析物質やその特異的結合物質を特有のラマン散乱パタ
ーンを有するラマン活性標識で標識し、これからのラマ
ン散乱を検出することにより、被分析物質を検出しある
いはその量を測定するものである。しかし、この方法
は、表面増強ラマン散乱を利用するが、ラマン活性標識
自体のラマン散乱のみを検出するため、その測定感度
は、前記標識のラマン散乱の検出感度に限定され、それ
以上の感度にすることは理論上不可能となる。例えば、
現在報告されている中で、表面増強ラマン散乱強度が最
も高い色素であるローダミン６Ｇの検出感度は１０-14
Ｍであり（Applied Spectroscopy,49,6,1985）、これに
準ずるクリスタルバイオレットは３×１０-11Ｍ（Anal.
Chem. 58,1116,1986）であると報告されている。よっ
て、特開平６−１７４７２３号公報に記載の方法に、こ
れらの色素をラマン活性標識として用いたとしても、そ
れ以上の検出感度を望むことはできない。また、特開平
６−１７４７２３号公報には、実際に表面増強ラマン散
乱をイムノアッセイに適用した例が示されているが、こ
の方法でも検出感度は、最高で、１０-11 Ｍである。そ
して、被分析物質をラマン活性標識で標識すると、フリ
ーの状態のラマン活性標識に比べ、検出感度が低下する
傾向がある。このため、表面増強ラマン散乱をイムノア
ッセイに適用しても、ラマン活性標識自身の検出感度以
下となり、高感度分析に十分対応できるとは言えない。
【０００４】本発明は、前記従来の問題点を解決するた
めに、表面増強ラマン散乱を増幅することにより高感度
の分析方法を提供することを目的とする。
めに、表面増強ラマン散乱を増幅することにより高感度
の分析方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、本発明の第１番目の分析方法は、第１の特異的結合
物質と、ラマン活性物質生成酵素を備えた第２の特異的
結合物質と、被分析物質とを結合反応させて前記三者の
複合体を形成し、この複合体と前記複合体の形成に関与
しない前記第２の特異的結合物質とを分離した後、前記
複合体に対しラマン活性物質生成基質を供給して前記第
２の特異的結合物質の前記酵素と反応させ、ついで生成
したラマン活性物質を表面増強ラマン散乱生起基質に捕
捉し、この状態で前記ラマン活性物質に対し励起光を照
射し、発生する表面増強ラマン散乱を測定するという構
成をとる。
に、本発明の第１番目の分析方法は、第１の特異的結合
物質と、ラマン活性物質生成酵素を備えた第２の特異的
結合物質と、被分析物質とを結合反応させて前記三者の
複合体を形成し、この複合体と前記複合体の形成に関与
しない前記第２の特異的結合物質とを分離した後、前記
複合体に対しラマン活性物質生成基質を供給して前記第
２の特異的結合物質の前記酵素と反応させ、ついで生成
したラマン活性物質を表面増強ラマン散乱生起基質に捕
捉し、この状態で前記ラマン活性物質に対し励起光を照
射し、発生する表面増強ラマン散乱を測定するという構
成をとる。
【０００６】また、本発明の第２番目の分析方法は、特
異的結合物質に対し被分析物質と競合結合反応する競合
物質として、第２の非活性サブユニットと会合すると活
性型のラマン活性物質生成酵素が生成し、前記競合物質
が前記特異的結合物質と結合すると前記第２の非活性サ
ブユニットと会合しない第１の非活性サブユニットを備
えた被分析物質を用いる分析方法であり、前記特異的結
合物質に対し前記競合物質と被分析物質とを競合結合反
応させて複合体を形成し、ついで前記第２の非活性サブ
ユニットを供給して前記複合体の形成に関与しなかった
競合物質の第１の非活性サブユニットに前記第２の非活
性サブユニットを会合させて活性型のラマン活性物質生
成酵素を形成させ、このラマン活性物質生成酵素にラマ
ン活性物質生成基質を供給して反応させ、ついで生成し
たラマン活性物質を表面増強ラマン散乱生起基質に捕捉
し、この状態で、前記ラマン活性物質に対し励起光を照
射し、発生する表面増強ラマン散乱を測定するという構
成をとる。
異的結合物質に対し被分析物質と競合結合反応する競合
物質として、第２の非活性サブユニットと会合すると活
性型のラマン活性物質生成酵素が生成し、前記競合物質
が前記特異的結合物質と結合すると前記第２の非活性サ
ブユニットと会合しない第１の非活性サブユニットを備
えた被分析物質を用いる分析方法であり、前記特異的結
合物質に対し前記競合物質と被分析物質とを競合結合反
応させて複合体を形成し、ついで前記第２の非活性サブ
ユニットを供給して前記複合体の形成に関与しなかった
競合物質の第１の非活性サブユニットに前記第２の非活
性サブユニットを会合させて活性型のラマン活性物質生
成酵素を形成させ、このラマン活性物質生成酵素にラマ
ン活性物質生成基質を供給して反応させ、ついで生成し
たラマン活性物質を表面増強ラマン散乱生起基質に捕捉
し、この状態で、前記ラマン活性物質に対し励起光を照
射し、発生する表面増強ラマン散乱を測定するという構
成をとる。
【０００７】そして、本発明の第３番目の分析方法は、
特異的結合物質に、被分析物質とラマン活性物質生成酵
素を備えた競合物質とを競合結合反応させて複合体を形
成し、この複合体と前記複合体の形成に関与しなかった
前記ラマン活性物質生成酵素を備えた競合物質とを分離
した後、前記複合体に対しラマン活性物質生成基質を供
給して前記競合物質のラマン活性物質生成酵素と反応さ
せ、生成したラマン活性物質を表面増強ラマン散乱生起
基質に捕捉し、この状態で前記ラマン活性物質に対し励
起光を照射し、発生する表面増強ラマン散乱を測定する
という構成をとる。
特異的結合物質に、被分析物質とラマン活性物質生成酵
素を備えた競合物質とを競合結合反応させて複合体を形
成し、この複合体と前記複合体の形成に関与しなかった
前記ラマン活性物質生成酵素を備えた競合物質とを分離
した後、前記複合体に対しラマン活性物質生成基質を供
給して前記競合物質のラマン活性物質生成酵素と反応さ
せ、生成したラマン活性物質を表面増強ラマン散乱生起
基質に捕捉し、この状態で前記ラマン活性物質に対し励
起光を照射し、発生する表面増強ラマン散乱を測定する
という構成をとる。
【０００８】すなわち、本発明の分析方法は、ラマン活
性物質生成酵素とラマン活性物質生成基質とを用い、被
分析物質の量に比例（正比例あるいは反比例）した量の
ラマン活性物質を生成させる方法である。このようにす
れば、表面増強ラマン散乱を著しく増幅させることが可
能となる。この結果、従来の分析方法をはるかに上回る
感度で分析することが可能となる。
性物質生成酵素とラマン活性物質生成基質とを用い、被
分析物質の量に比例（正比例あるいは反比例）した量の
ラマン活性物質を生成させる方法である。このようにす
れば、表面増強ラマン散乱を著しく増幅させることが可
能となる。この結果、従来の分析方法をはるかに上回る
感度で分析することが可能となる。
【０００９】なお、本発明において、第１の特異的結合
物質および第２の特異的結合物質ならびに特異的結合物
質とは、被分析物質のみに選択的に結合するものをい
い、例えば、抗体、オリゴＤＮＡ、レクチン、レセプタ
ーがあげられる。また、前記抗体の具体例としては、臨
床検査で用いられる抗インスリン抗体、抗α−フェトプ
ロテイン抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗Ｔ4 抗体等があげられ
る。
物質および第２の特異的結合物質ならびに特異的結合物
質とは、被分析物質のみに選択的に結合するものをい
い、例えば、抗体、オリゴＤＮＡ、レクチン、レセプタ
ーがあげられる。また、前記抗体の具体例としては、臨
床検査で用いられる抗インスリン抗体、抗α−フェトプ
ロテイン抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗Ｔ4 抗体等があげられ
る。
【００１０】また、本発明において、「ラマン活性」と
は、励起光を照射すればラマン散乱が生じることをい
い、「ラマン活性物質」とは、前記ラマン活性を有する
物質をいう。そして、「ラマン活性物質生成酵素」と
は、酵素反応により特定の基質をラマン活性物質に変換
する酵素をいい、「ラマン活性物質生成基質」とは、前
記特定の基質をいう。
は、励起光を照射すればラマン散乱が生じることをい
い、「ラマン活性物質」とは、前記ラマン活性を有する
物質をいう。そして、「ラマン活性物質生成酵素」と
は、酵素反応により特定の基質をラマン活性物質に変換
する酵素をいい、「ラマン活性物質生成基質」とは、前
記特定の基質をいう。
【００１１】また、「表面増強ラマン散乱生起基質」と
は、その表面にラマン活性物質を捕捉すると、ラマン散
乱を増強させる性質を有する物質をいう。そして、「ラ
マン活性物質を表面増強ラマン散乱生起基質に捕捉し」
とは、ラマン活性物質を表面増強ラマン散乱生起基質に
接近させ、両者の距離を、通常０〜１００ｎｍ、好まし
くは０〜５０ｎｍとすることをいう。また、捕捉の手段
は、例えば、吸着現象を利用する方法や、電位をかけて
電気的に吸着させる方法、ラマン活性物質と反応結合す
る官能基をつけた表面増強ラマン散乱生起基質質に反応
させる方法がある。
は、その表面にラマン活性物質を捕捉すると、ラマン散
乱を増強させる性質を有する物質をいう。そして、「ラ
マン活性物質を表面増強ラマン散乱生起基質に捕捉し」
とは、ラマン活性物質を表面増強ラマン散乱生起基質に
接近させ、両者の距離を、通常０〜１００ｎｍ、好まし
くは０〜５０ｎｍとすることをいう。また、捕捉の手段
は、例えば、吸着現象を利用する方法や、電位をかけて
電気的に吸着させる方法、ラマン活性物質と反応結合す
る官能基をつけた表面増強ラマン散乱生起基質質に反応
させる方法がある。
【００１２】前記本発明の第２番目の分析方法におい
て、競合物質として、第１の非活性サブユニットを備え
た被分析物質に代えて、第１の非活性サブユニットを備
えた被分析物質類似物を用いてもよい。
て、競合物質として、第１の非活性サブユニットを備え
た被分析物質に代えて、第１の非活性サブユニットを備
えた被分析物質類似物を用いてもよい。
【００１３】前記本発明の第３番目の分析方法におい
て、操作の簡易性や迅速性の理由から、競合物質がラマ
ン活性物質生成酵素を備えた被分析物質であり、前記競
合物質中のラマン活性物質生成酵素は、前記競合物質中
の被分析物質と特異的結合物質とが結合すると失活する
酵素であり、複合体と前記複合体の形成に関与しなかっ
た前記ラマン活性物質生成酵素を備えた競合物質とを分
離することなく前記ラマン活性物質生成酵素の反応を行
うことが好ましい。
て、操作の簡易性や迅速性の理由から、競合物質がラマ
ン活性物質生成酵素を備えた被分析物質であり、前記競
合物質中のラマン活性物質生成酵素は、前記競合物質中
の被分析物質と特異的結合物質とが結合すると失活する
酵素であり、複合体と前記複合体の形成に関与しなかっ
た前記ラマン活性物質生成酵素を備えた競合物質とを分
離することなく前記ラマン活性物質生成酵素の反応を行
うことが好ましい。
【００１４】また、前記競合結合反応を利用する本発明
の第３番目の分析方法において、ラマン活性物質生成酵
素を備えた競合物質として、ラマン活性物質生成酵素を
備えた被分析物質に代えて、ラマン活性物質生成酵素を
備えた被分析物質類似物であってもよい。
の第３番目の分析方法において、ラマン活性物質生成酵
素を備えた競合物質として、ラマン活性物質生成酵素を
備えた被分析物質に代えて、ラマン活性物質生成酵素を
備えた被分析物質類似物であってもよい。
【００１５】なお、本発明において、「被分析物質類似
物」とは、その一部の構造が被分析物質と近似し、この
結果、前記特異的結合物質と結合するものをいう。ま
た、この被分析物質と被分析物質類似物の具体例として
は、エストラジオールとエストラジオール−６−カルボ
キシメチルオキシム、テストステロンとテストステロン
−２１−ヘミサクシネート等があげられる。
物」とは、その一部の構造が被分析物質と近似し、この
結果、前記特異的結合物質と結合するものをいう。ま
た、この被分析物質と被分析物質類似物の具体例として
は、エストラジオールとエストラジオール−６−カルボ
キシメチルオキシム、テストステロンとテストステロン
−２１−ヘミサクシネート等があげられる。
【００１６】そして、操作の容易性や迅速性の理由か
ら、第１の特異的結合物質、あるいは前記競合結合反応
を利用する分析方法における特異的結合物質は、固相に
固定されていることが好ましい。
ら、第１の特異的結合物質、あるいは前記競合結合反応
を利用する分析方法における特異的結合物質は、固相に
固定されていることが好ましい。
【００１７】高い測定精度を確保するという理由から、
前記本発明全てに共通して使用するラマン活性物質生成
酵素は、その基質がラマン活性を有せずかつ酵素反応生
成物のみがラマン活性を有するもの、または前記酵素基
質がラマン活性を有するが酵素反応生成物のラマン活性
シグナルと区別できるものであることが好ましい。そし
て、このラマン活性物質生成酵素およびラマン活性物質
生成基質の具体的好適例は、以下に示すとおりである。
これらの酵素および基質は、ラマン散乱シグナルが強い
ことはもちろんであるが、生成するラマン活性物質が着
色物質であることから共鳴ラマン効果も期待でき、これ
らを用いることにより、さらに高感度の検出や測定が可
能となる。
前記本発明全てに共通して使用するラマン活性物質生成
酵素は、その基質がラマン活性を有せずかつ酵素反応生
成物のみがラマン活性を有するもの、または前記酵素基
質がラマン活性を有するが酵素反応生成物のラマン活性
シグナルと区別できるものであることが好ましい。そし
て、このラマン活性物質生成酵素およびラマン活性物質
生成基質の具体的好適例は、以下に示すとおりである。
これらの酵素および基質は、ラマン散乱シグナルが強い
ことはもちろんであるが、生成するラマン活性物質が着
色物質であることから共鳴ラマン効果も期待でき、これ
らを用いることにより、さらに高感度の検出や測定が可
能となる。
【００１８】まず、ラマン活性物質生成酵素がペルオキ
シダーゼであり、ラマン活性物質生成基質が、２，２´
−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−サ
ルフォニックアシッド）［２，２−Ａｚｉｎｏ−ｂｉｓ
（３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−
ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）］、ｏ−フェニレンジア
ミン［ｏ−Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＯＰ
Ｄ）］、３，３´，５，５´−テトラメチルベンジジン
［３，３′，５，５′−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎ
ｚｉｄｉｎｅ］、ｏ−ジアニシジン［ｏ−Ｄｉａｎｉｓ
ｉｄｉｎｅ］、５−アミノサリシリックアシッド［５−
Ａｍｉｎｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ］、３，３´
−ジアミノベンゼン［３，３′−Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎ
ｚｅ］、３−アミノ−９−エチルカルバゾール［３−Ａ
ｍｉｎｏ−９−ｅｔｈｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ］、４−
クロロ−１−ナフトール［４−Ｃｈｌｏｒｏ−１−ｎａ
ｐｈｔｈｏｌ］からなる群から選択された少なくとも一
つであることが好ましい。
シダーゼであり、ラマン活性物質生成基質が、２，２´
−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−サ
ルフォニックアシッド）［２，２−Ａｚｉｎｏ−ｂｉｓ
（３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−
ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）］、ｏ−フェニレンジア
ミン［ｏ−Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＯＰ
Ｄ）］、３，３´，５，５´−テトラメチルベンジジン
［３，３′，５，５′−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎ
ｚｉｄｉｎｅ］、ｏ−ジアニシジン［ｏ−Ｄｉａｎｉｓ
ｉｄｉｎｅ］、５−アミノサリシリックアシッド［５−
Ａｍｉｎｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ］、３，３´
−ジアミノベンゼン［３，３′−Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎ
ｚｅ］、３−アミノ−９−エチルカルバゾール［３−Ａ
ｍｉｎｏ−９−ｅｔｈｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ］、４−
クロロ−１−ナフトール［４−Ｃｈｌｏｒｏ−１−ｎａ
ｐｈｔｈｏｌ］からなる群から選択された少なくとも一
つであることが好ましい。
【００１９】また、ラマン活性物質生成酵素が、アルカ
リフォスファターゼであり、ラマン活性物質生成基質
が、ｐ−ニトロフェニルフォスフェイト［ｐ−Ｎｉｔｒ
ｏｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ］、５−ブロモ−
４−クロロ−３−インドリルフォスフェイト［５−Ｂｒ
ｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ ｐｈ
ｏｓｐｈａｔｅ］、ファーストレッドフォスフェイト
［Ｆａｓｔ ｒｅｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ］、４−メチ
ルアンベリフェリルホスフェイト［４−Ｍｅｔｈｙｌｕ
ｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ］からな
る群から選択された少なくとも一つであることが好まし
い。
リフォスファターゼであり、ラマン活性物質生成基質
が、ｐ−ニトロフェニルフォスフェイト［ｐ−Ｎｉｔｒ
ｏｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ］、５−ブロモ−
４−クロロ−３−インドリルフォスフェイト［５−Ｂｒ
ｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ ｐｈ
ｏｓｐｈａｔｅ］、ファーストレッドフォスフェイト
［Ｆａｓｔ ｒｅｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ］、４−メチ
ルアンベリフェリルホスフェイト［４−Ｍｅｔｈｙｌｕ
ｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ］からな
る群から選択された少なくとも一つであることが好まし
い。
【００２０】そして、ラマン活性物質生成酵素が、グル
コシダーゼであり、ラマン活性物質生成基質が、ｐ−ニ
トロフェニルグルコサイド［ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙ
ｌｇｌｕｃｏｓｉｄｅ］および４−メチルアンベリフェ
リルグルコサイド［４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆ
ｅｒｙｌｇｌｕｃｏｓｉｄｅ］の少なくとも一つである
ことが好ましい。
コシダーゼであり、ラマン活性物質生成基質が、ｐ−ニ
トロフェニルグルコサイド［ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙ
ｌｇｌｕｃｏｓｉｄｅ］および４−メチルアンベリフェ
リルグルコサイド［４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆ
ｅｒｙｌｇｌｕｃｏｓｉｄｅ］の少なくとも一つである
ことが好ましい。
【００２１】また、ラマン活性物質生成酵素が、ガラク
トシダーゼであり、ラマン活性物質生成基質が、ｐ−ニ
トロフェニルガラクトサイド［ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎ
ｙｌｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ］および４−メチルアンベ
リフェリルガラクトサイド［４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅ
ｌｌｉｆｅｒｙｌｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ］の少なくと
も一つであることが好ましい。
トシダーゼであり、ラマン活性物質生成基質が、ｐ−ニ
トロフェニルガラクトサイド［ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎ
ｙｌｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ］および４−メチルアンベ
リフェリルガラクトサイド［４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅ
ｌｌｉｆｅｒｙｌｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ］の少なくと
も一つであることが好ましい。
【００２２】そして、ラマン活性物質生成酵素が、サル
ファターゼであり、ラマン活性物質生成基質が、ｐ−ニ
トロフェニルサルフェイト［ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙ
ｌｓｕｌｆａｔｅ］および４−メチルアンベリフェリル
サルフェイト［４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒ
ｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ］の少なくとも一つであることが
好ましい。
ファターゼであり、ラマン活性物質生成基質が、ｐ−ニ
トロフェニルサルフェイト［ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙ
ｌｓｕｌｆａｔｅ］および４−メチルアンベリフェリル
サルフェイト［４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒ
ｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ］の少なくとも一つであることが
好ましい。
【００２３】さらに、ラマン活性物質生成酵素が、ウレ
アーゼであり、ラマン活性物質生成基質が、尿素および
ブロモクレゾールパープル［Ｂｒｏｍｏｃｒｅｓｏｌ
ｐｕｒｐｌｅ］の少なくとも一つであることが好まし
い。
アーゼであり、ラマン活性物質生成基質が、尿素および
ブロモクレゾールパープル［Ｂｒｏｍｏｃｒｅｓｏｌ
ｐｕｒｐｌｅ］の少なくとも一つであることが好まし
い。
【００２４】前記本発明に共通して用いられる表面増強
ラマン散乱生起基質としては、導電性物質が表面増強ラ
マン散乱を生起しやすいという理由から、金属コロイ
ド、金属フィルム、金属フォイル、電極、導電体および
半導体からなる群から選択された少なくとも一つである
ことが好ましい。具体的には、銀コロイド、金コロイ
ド、銀電極、銀フィルム、ＣａＰ等があげられる。
ラマン散乱生起基質としては、導電性物質が表面増強ラ
マン散乱を生起しやすいという理由から、金属コロイ
ド、金属フィルム、金属フォイル、電極、導電体および
半導体からなる群から選択された少なくとも一つである
ことが好ましい。具体的には、銀コロイド、金コロイ
ド、銀電極、銀フィルム、ＣａＰ等があげられる。
【００２５】
【発明の実施の形態】つぎに、本発明を具体的に説明す
る。
る。
【００２６】本発明の第１番目の分析方法の一例を図１
に基づき説明する。この例は、抗原抗体反応を利用した
例である。
に基づき説明する。この例は、抗原抗体反応を利用した
例である。
【００２７】すなわち、まず、第１の特異的結合物質で
ある抗体１を、固相７に固定する。この固相７として
は、ポリスチレン、ラテックス、セファロース、ポリア
クリルアミド、アミノ基導入ラテックス等があげられ
る。また、固定の方法は、例えば、物理的吸着法、化学
結合法等があげられる。そして、抗体１に対し、被分析
物質である抗原８を添加し、抗体１に結合させる。そし
て、第２の特異的結合物質である抗体２を添加し、抗原
８に結合させる。この抗体２は、ラマン活性物質生成酵
素３を標識したものである。このようにすると、抗体１
および抗体２が、被分析物質（抗原）８を挟んでサンド
イッチ状に結合して、前記三者が複合体を形成する。な
お、被分析物質（抗原）８と抗体２の添加は同時に行っ
てもよい。そして、前記複合体の形成に関与しなかった
抗体２をＢ／Ｆ分離（Ｂｏｕｎｄ／Ｆｒｅｅ分離）して
除去する。この分離の方法は、イムノアッセイに適用さ
れる従来公知の方法が使用でき、例えば、緩衝液での洗
浄や、クロマト現象を利用した方法等があげられる。つ
いで、前記複合体に対し、ラマン活性物質生成基質４を
添加して酵素反応によりラマン活性物質（生成物）５を
生じさせる。そして、このラマン活性物質を表面増強ラ
マン散乱生起基質（ＳＥＲＳ化基質）６で捕捉する。こ
の捕捉は、先に述べた吸着法等により行うことができ
る。そして、この状態で、前記ラマン活性物質（生成
物）５に対し、励起光を照射し、発生する表面増強ラマ
ン散乱光を測定する。この表面増強ラマン散乱は、生成
したラマン活性物質の量に応じたものであることから、
ラマン活性物質の量が増加すれば強度を高くすることが
可能である。したがって、本発明の分析方法では、被分
析物質の量に比例して検出感度を向上させることが可能
であり、従来の方法では達成できなかったレベルの高感
度分析が可能である。
ある抗体１を、固相７に固定する。この固相７として
は、ポリスチレン、ラテックス、セファロース、ポリア
クリルアミド、アミノ基導入ラテックス等があげられ
る。また、固定の方法は、例えば、物理的吸着法、化学
結合法等があげられる。そして、抗体１に対し、被分析
物質である抗原８を添加し、抗体１に結合させる。そし
て、第２の特異的結合物質である抗体２を添加し、抗原
８に結合させる。この抗体２は、ラマン活性物質生成酵
素３を標識したものである。このようにすると、抗体１
および抗体２が、被分析物質（抗原）８を挟んでサンド
イッチ状に結合して、前記三者が複合体を形成する。な
お、被分析物質（抗原）８と抗体２の添加は同時に行っ
てもよい。そして、前記複合体の形成に関与しなかった
抗体２をＢ／Ｆ分離（Ｂｏｕｎｄ／Ｆｒｅｅ分離）して
除去する。この分離の方法は、イムノアッセイに適用さ
れる従来公知の方法が使用でき、例えば、緩衝液での洗
浄や、クロマト現象を利用した方法等があげられる。つ
いで、前記複合体に対し、ラマン活性物質生成基質４を
添加して酵素反応によりラマン活性物質（生成物）５を
生じさせる。そして、このラマン活性物質を表面増強ラ
マン散乱生起基質（ＳＥＲＳ化基質）６で捕捉する。こ
の捕捉は、先に述べた吸着法等により行うことができ
る。そして、この状態で、前記ラマン活性物質（生成
物）５に対し、励起光を照射し、発生する表面増強ラマ
ン散乱光を測定する。この表面増強ラマン散乱は、生成
したラマン活性物質の量に応じたものであることから、
ラマン活性物質の量が増加すれば強度を高くすることが
可能である。したがって、本発明の分析方法では、被分
析物質の量に比例して検出感度を向上させることが可能
であり、従来の方法では達成できなかったレベルの高感
度分析が可能である。
【００２８】なお、前記励起光の照射および表面増強ラ
マン散乱の測定は、一般的なラマン散乱測定装置を用い
ることができる。また、測定条件は、用いる酵素や基質
の種類および添加量並びに被分析物質の濃度等により適
宜決定されるが、通常は、アルゴンイオンレーザーの強
度が５０ｍＷ〜２００ｍＷで、この強度が高い程良い。
また、ラマン散乱生起基質は、前記酵素によって生成さ
れたラマン活性物質よりも大過剰であることが望まし
い。
マン散乱の測定は、一般的なラマン散乱測定装置を用い
ることができる。また、測定条件は、用いる酵素や基質
の種類および添加量並びに被分析物質の濃度等により適
宜決定されるが、通常は、アルゴンイオンレーザーの強
度が５０ｍＷ〜２００ｍＷで、この強度が高い程良い。
また、ラマン散乱生起基質は、前記酵素によって生成さ
れたラマン活性物質よりも大過剰であることが望まし
い。
【００２９】つぎに、本発明の第２番目の分析方法は、
サブユニット構造をとるラマン活性物質生成酵素を用
い、かつ競合結合反応を利用する方法である。
サブユニット構造をとるラマン活性物質生成酵素を用
い、かつ競合結合反応を利用する方法である。
【００３０】この方法の具体例を図２に示す。この具体
例は、前述の本発明の第１の方法と同様に、抗原抗体反
応を利用したものである。なお、図において、操作の流
れは、左から右へとなっている。図示のように、まず、
被分析物質（抗原）８とその競合物質である前記第１の
非活性サブユニット３ａを備えた被分析物質８とを準備
し、これに特異的結合物質である抗体１を供給する。す
ると、競合物質が多い場合は、主として競合物質と抗体
１とが複合体を形成し、被分析物質８が多い場合は、主
として被分析物質８と抗体１とが複合体を形成する。同
図では、競合物質において、複合体を形成する場合と複
合体を形成しない場合を示している。そして、これらに
第２の非活性サブユニット３ｂを供給すると、複合体を
形成しない競合物質中の第１の非活性サブユニットにの
み上記第２の非活性サブユニット３ｂが会合し、活性化
されたラマン活性物質生成酵素３が形成される。このと
き複合体における第１の非活性サブユニット３ａは立体
的な構造変化が生じて第２の非活性サブユニット３ｂと
会合不能となっている。この状態で、ラマン活性物質生
成基質を供給すると、酵素反応により、複合体形成に関
与しない競合物質の量に応じて、ラマン活性物質が生成
する。ついで、このラマン活性物質を表面増強ラマン散
乱生起基質に捕捉し、この状態で前記ラマン活性物質に
対し励起光を照射し、発生する表面増強ラマン散乱を測
定するのである。
例は、前述の本発明の第１の方法と同様に、抗原抗体反
応を利用したものである。なお、図において、操作の流
れは、左から右へとなっている。図示のように、まず、
被分析物質（抗原）８とその競合物質である前記第１の
非活性サブユニット３ａを備えた被分析物質８とを準備
し、これに特異的結合物質である抗体１を供給する。す
ると、競合物質が多い場合は、主として競合物質と抗体
１とが複合体を形成し、被分析物質８が多い場合は、主
として被分析物質８と抗体１とが複合体を形成する。同
図では、競合物質において、複合体を形成する場合と複
合体を形成しない場合を示している。そして、これらに
第２の非活性サブユニット３ｂを供給すると、複合体を
形成しない競合物質中の第１の非活性サブユニットにの
み上記第２の非活性サブユニット３ｂが会合し、活性化
されたラマン活性物質生成酵素３が形成される。このと
き複合体における第１の非活性サブユニット３ａは立体
的な構造変化が生じて第２の非活性サブユニット３ｂと
会合不能となっている。この状態で、ラマン活性物質生
成基質を供給すると、酵素反応により、複合体形成に関
与しない競合物質の量に応じて、ラマン活性物質が生成
する。ついで、このラマン活性物質を表面増強ラマン散
乱生起基質に捕捉し、この状態で前記ラマン活性物質に
対し励起光を照射し、発生する表面増強ラマン散乱を測
定するのである。
【００３１】このように競合結合反応を利用すれば、被
分析物質の量とラマン散乱強度とが正比例の関係にな
る。前述のように、被分析物質が競合物質より多けれ
ば、主として被分析物質が特異的結合物質と結合し、複
合体形成に関与しない競合物質が増加して発生するラマ
ン散乱強度が強くなる。これとは逆に、被分析物質の量
が競合物質より少なければ、主として競合物質が特異的
結合物質と結合するため、複合体形成に関与しない競合
物質が少なくなりラマン散乱強度が低くなるのである。
分析物質の量とラマン散乱強度とが正比例の関係にな
る。前述のように、被分析物質が競合物質より多けれ
ば、主として被分析物質が特異的結合物質と結合し、複
合体形成に関与しない競合物質が増加して発生するラマ
ン散乱強度が強くなる。これとは逆に、被分析物質の量
が競合物質より少なければ、主として競合物質が特異的
結合物質と結合するため、複合体形成に関与しない競合
物質が少なくなりラマン散乱強度が低くなるのである。
【００３２】また、この分析方法では、サブユニット構
造をとるラマン活性物質生成酵素を用い、複合体と複合
体形成に関与しなかった物質との分離操作を省略可能と
しており、分析操作が簡単である。
造をとるラマン活性物質生成酵素を用い、複合体と複合
体形成に関与しなかった物質との分離操作を省略可能と
しており、分析操作が簡単である。
【００３３】なお、この分析方法に使用されるサブユニ
ット構造をとるラマン活性物質生成酵素としては、例え
ば、β−ガラクトシダーゼがあげられる。
ット構造をとるラマン活性物質生成酵素としては、例え
ば、β−ガラクトシダーゼがあげられる。
【００３４】つぎに、本発明の第３番目の分析方法は、
前述の本発明第２の方法と同様に競合結合反応を利用す
る方法である。この方法は、特異的結合物質に対し、被
分析物質とラマン活性物質生成酵素を備えた競合物質と
を競合結合反応させて複合体を形成し、この複合体と前
記複合体の形成に関与しなかった前記ラマン活性物質生
成酵素を備えた競合物質とを分離した後、前記複合体に
対しラマン活性物質生成基質を供給して前記ラマン活性
物質生成酵素と反応させ、生成したラマン活性物質を表
面増強ラマン散乱生起基質に捕捉し、この状態で前記ラ
マン活性物質に対し励起光を照射し、発生する表面増強
ラマン散乱を測定する方法である。
前述の本発明第２の方法と同様に競合結合反応を利用す
る方法である。この方法は、特異的結合物質に対し、被
分析物質とラマン活性物質生成酵素を備えた競合物質と
を競合結合反応させて複合体を形成し、この複合体と前
記複合体の形成に関与しなかった前記ラマン活性物質生
成酵素を備えた競合物質とを分離した後、前記複合体に
対しラマン活性物質生成基質を供給して前記ラマン活性
物質生成酵素と反応させ、生成したラマン活性物質を表
面増強ラマン散乱生起基質に捕捉し、この状態で前記ラ
マン活性物質に対し励起光を照射し、発生する表面増強
ラマン散乱を測定する方法である。
【００３５】この方法では、前述の本発明の第２の方法
とは逆に、被分析物質の量とラマン散乱強度とが反比例
の関係になる。すなわち、被分析物質が競合物質より多
ければ、主として被分析物質が特異的結合物質と結合
し、発生するラマン散乱強度が弱くなる。これとは逆
に、被分析物質の量が競合物質より少なければ、主とし
て競合物質が特異的結合物質と結合するため、ラマン散
乱強度が高くなるのである。
とは逆に、被分析物質の量とラマン散乱強度とが反比例
の関係になる。すなわち、被分析物質が競合物質より多
ければ、主として被分析物質が特異的結合物質と結合
し、発生するラマン散乱強度が弱くなる。これとは逆
に、被分析物質の量が競合物質より少なければ、主とし
て競合物質が特異的結合物質と結合するため、ラマン散
乱強度が高くなるのである。
【００３６】そして、この競合結合法を利用した分析方
法において、ラマン活性物質生成酵素として、ラマン活
性物質生成酵素を備えた被分析物質において、この被分
析物質が特異的結合物質と結合すると失活する酵素を用
いれば、複合体と複合体形成に関与しなかった競合物質
の分離操作を省略することができることは、先に述べた
とおりである。このような酵素としては、例えば、β−
ガラクトシダーゼがあげられる。
法において、ラマン活性物質生成酵素として、ラマン活
性物質生成酵素を備えた被分析物質において、この被分
析物質が特異的結合物質と結合すると失活する酵素を用
いれば、複合体と複合体形成に関与しなかった競合物質
の分離操作を省略することができることは、先に述べた
とおりである。このような酵素としては、例えば、β−
ガラクトシダーゼがあげられる。
【００３７】つぎに、実施例について説明する。なお、
以下にいう「ＳＥＲＳ］とは、表面増強ラマン散乱をい
う。
以下にいう「ＳＥＲＳ］とは、表面増強ラマン散乱をい
う。
【００３８】
【実施例１】 （銀コロイド溶液の調製）１ｍＭ硝酸銀５０ｍｌと２ｍ
Ｍ水素化ホウ素ナトリウム１５０ｍｌを氷冷下にて攪拌
しながら混和し還元させて、銀コロイド溶液を調製し
た。この最大吸収波長は、３９０ｎｍであった。なお、
使用したビーカ等の器具類は、精製水または蒸留水で洗
浄し、極力、塩類等のコンタミネーションを避けるよう
に注意した。
Ｍ水素化ホウ素ナトリウム１５０ｍｌを氷冷下にて攪拌
しながら混和し還元させて、銀コロイド溶液を調製し
た。この最大吸収波長は、３９０ｎｍであった。なお、
使用したビーカ等の器具類は、精製水または蒸留水で洗
浄し、極力、塩類等のコンタミネーションを避けるよう
に注意した。
【００３９】（酵素反応条件）１０-6ｍｏｌ／ｍｌｏ−
フェニレンジアミン１０ｍｌ（１００ｍＭ燐酸緩衝液・
ｐＨ５に溶解）に３０％過酸化水素１３．６μｌを添加
した。これに５μｇ／ｍｌペルオキシダーゼ（ＰＯＤ，
オリエンタル酵母社製）１０μｌを添加し、３０℃で２
０分間酵素反応させたところ、最大吸収波長４２０nmの
アゾ化合物が生成した。このアゾ化合物の生成反応を図
３に示す。
フェニレンジアミン１０ｍｌ（１００ｍＭ燐酸緩衝液・
ｐＨ５に溶解）に３０％過酸化水素１３．６μｌを添加
した。これに５μｇ／ｍｌペルオキシダーゼ（ＰＯＤ，
オリエンタル酵母社製）１０μｌを添加し、３０℃で２
０分間酵素反応させたところ、最大吸収波長４２０nmの
アゾ化合物が生成した。このアゾ化合物の生成反応を図
３に示す。
【００４０】（ＳＥＲＳ生起条件）前記銀コロイド溶液
と酵素反応液を９：１の体積割合で混合し、アルゴンレ
ーザー（励起波長５１４ｎｍ、出力５０ｍＷ）でＳＥＲ
Ｓ測定（波数１４４２cm-1）を行った。なお、このとき
の測定装置は、プリンストン社製のものを用いた。その
ＳＥＲＳスペクトルを図４に示す。なお、酵素反応前の
各試薬は、ＳＥＲＳが生起しないことを予め確認した。
すなわち、酵素反応時と同じ濃度の０．１３６％過酸化
水素、０．１％ＰＯＤ及び１０-6ｍｏｌ／ｍｌｏ−フェ
ニレンジアミンのＳＥＲＳを測定した。その結果、それ
ぞれ図５、図６および図７のグラフに示すように、いず
れもＳＥＲＳの生起は認められなかった。
と酵素反応液を９：１の体積割合で混合し、アルゴンレ
ーザー（励起波長５１４ｎｍ、出力５０ｍＷ）でＳＥＲ
Ｓ測定（波数１４４２cm-1）を行った。なお、このとき
の測定装置は、プリンストン社製のものを用いた。その
ＳＥＲＳスペクトルを図４に示す。なお、酵素反応前の
各試薬は、ＳＥＲＳが生起しないことを予め確認した。
すなわち、酵素反応時と同じ濃度の０．１３６％過酸化
水素、０．１％ＰＯＤ及び１０-6ｍｏｌ／ｍｌｏ−フェ
ニレンジアミンのＳＥＲＳを測定した。その結果、それ
ぞれ図５、図６および図７のグラフに示すように、いず
れもＳＥＲＳの生起は認められなかった。
【００４１】（ＳＥＲＳ−酵素イムノアッセイ）免疫測
定用マイクロプレートに１０μｇ／ｍｌヤギ抗マウスＩ
ｇＧ（ポリクローナル抗体、ＭＢＬ社製）１００μｌを
添加し、室温で２時間インキュベートした後、０．５％
ＢＳＡ（牛血清アルブミン）でブロッキングを４℃で１
２時間行った。この感作プレートに、１０、５、２．
５、１.２５、０．６２５、０.３１５、０.１５７５ｎ
ｇ／ｍｌのマウスＩｇＧ（ダコ社製）を１００μｌずつ
添加し、室温で１時間反応させた後、Ｂ／Ｆ分離後、洗
浄した。これに、抗マウスＩｇＧ−ＰＯＤ標識抗体（ダ
コ社製）１００μｌ添加して、１時間反応させた後、Ｂ
／Ｆ分離洗浄した。ついで、０.１Ｍ燐酸クエン酸緩衝
液（ｐＨ５.０）に溶解した１２ｍＭｏ−オルトフェニ
レンジアミン−０.１３６％過酸化水素００μｌを添加
し、２０分間反応させた。その反応液について、前記の
ＳＥＲＳ生起条件と同様にしてＳＥＲＳ測定を行った。
その強度とマウスＩｇＧ（抗原）の濃度との関係をプロ
ットしたところ、図８に示す検量線が得られた。
定用マイクロプレートに１０μｇ／ｍｌヤギ抗マウスＩ
ｇＧ（ポリクローナル抗体、ＭＢＬ社製）１００μｌを
添加し、室温で２時間インキュベートした後、０．５％
ＢＳＡ（牛血清アルブミン）でブロッキングを４℃で１
２時間行った。この感作プレートに、１０、５、２．
５、１.２５、０．６２５、０.３１５、０.１５７５ｎ
ｇ／ｍｌのマウスＩｇＧ（ダコ社製）を１００μｌずつ
添加し、室温で１時間反応させた後、Ｂ／Ｆ分離後、洗
浄した。これに、抗マウスＩｇＧ−ＰＯＤ標識抗体（ダ
コ社製）１００μｌ添加して、１時間反応させた後、Ｂ
／Ｆ分離洗浄した。ついで、０.１Ｍ燐酸クエン酸緩衝
液（ｐＨ５.０）に溶解した１２ｍＭｏ−オルトフェニ
レンジアミン−０.１３６％過酸化水素００μｌを添加
し、２０分間反応させた。その反応液について、前記の
ＳＥＲＳ生起条件と同様にしてＳＥＲＳ測定を行った。
その強度とマウスＩｇＧ（抗原）の濃度との関係をプロ
ットしたところ、図８に示す検量線が得られた。
【００４２】これによれば、検出限界は、０．５ｎｇ／
ｍｌ未満であり、従来の分析方法に比べ、高感度である
ことがわかる。
ｍｌ未満であり、従来の分析方法に比べ、高感度である
ことがわかる。
【００４３】
【発明の効果】以上のように、本発明の分析方法は、従
来の表面増強ラマン散乱を利用した分析方法がなし得な
かった高いレベルの検出および測定が可能な分析方法で
ある。また、その操作も簡便なものであることから、実
施が容易である。したがって、本発明の分析方法の適用
により、臨床検査、生化学分析、医薬品の品質管理等の
分野において、検査や分析の信頼性が向上するようにな
る。
来の表面増強ラマン散乱を利用した分析方法がなし得な
かった高いレベルの検出および測定が可能な分析方法で
ある。また、その操作も簡便なものであることから、実
施が容易である。したがって、本発明の分析方法の適用
により、臨床検査、生化学分析、医薬品の品質管理等の
分野において、検査や分析の信頼性が向上するようにな
る。
【図１】本発明の一例における概念を説明する模式図で
ある。
ある。
【図２】本発明のその他の例における概念を説明する模
式図である。
式図である。
【図３】本発明の一実施例におけるＰＯＤによるｏ−フ
ェニレンジアミンと過酸化水素の酸化縮合反応を示す図
である。
ェニレンジアミンと過酸化水素の酸化縮合反応を示す図
である。
【図４】前記実施例における酵素反応生成物のＳＥＲＳ
スペクトル図である。
スペクトル図である。
【図５】前記実施例における過酸化水素液のＳＥＲＳス
ペクトル図である。
ペクトル図である。
【図６】前記実施例におけるペルオキシダーゼのＳＥＲ
Ｓスペクトル図である。
Ｓスペクトル図である。
【図７】前記実施例におけるｏ−フェニレンジアミンの
ＳＥＲＳスペクトル図である。
ＳＥＲＳスペクトル図である。
【図８】前記実施例におけるＳＥＲＳー酵素イムノアッ
セイにおけるマウスＩｇＧ濃度とＳＥＲＳ強度との関係
を示すグラフである。
セイにおけるマウスＩｇＧ濃度とＳＥＲＳ強度との関係
を示すグラフである。
１ 抗体 ２ 抗体 ３ 酵素 ４ 酵素基質 ５ 生成物 ６ ＳＥＲＳ化基質 ７ 固相 ８ 抗原
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平３−164195（ＪＰ，Ａ) 特開 平７−146295（ＪＰ，Ａ) Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．182（1989）ｐ 388−398 Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ．Ｃｈｅ ｍ．Ｖｏｌ．308（1991）ｐ227−237 ＡｃｔａＢｉｏｃｈｉｍｉｉｃａＰｏ ｌｏｎｉｃａ Ｖｏｌ．26，Ｎｏ．４ （1979）ｐ327−333 Ａｄｖ．Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃ．Ｖｏ ｌ．16（1988）ｐ91−153 化学の領域増刊号Ｎｏ．140（1983) ｐ83−100 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 21/64 - 21/65 G01N 33/543 G01N 33/566 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＷＰＩ／Ｌ（ＱＵＥＳＴＥＬ)
Claims (16)
- 【請求項１】 第１の特異的結合物質と、ラマン活性物
質生成酵素を備えた第２の特異的結合物質と、被分析物
質とを結合反応させて、前記三者の複合体を形成し、こ
の複合体と前記複合体の形成に関与しない前記第２の特
異的結合物質とを分離した後、前記複合体に対しラマン
活性物質生成基質を供給して前記第２の特異的結合物質
の前記酵素と反応させ、ついで生成したラマン活性物質
を表面増強ラマン散乱生起基質に捕捉し、この状態で前
記ラマン活性物質に対し励起光を照射し、発生する表面
増強ラマン散乱を測定する分析方法。 - 【請求項２】 第１の特異的結合物質が、固相に固定さ
れている請求項１記載の分析方法。 - 【請求項３】 特異的結合物質に対し被分析物質と競合
結合反応する競合物質として、第２の非活性サブユニッ
トと会合すると活性型のラマン活性物質生成酵素が生成
し、前記競合物質が前記特異的結合物質と結合すると前
記第２の非活性サブユニットと会合しない第１の非活性
サブユニットを備えた被分析物質を用いる分析方法であ
り、前記特異的結合物質に対し前記競合物質と被分析物
質とを競合結合反応させて複合体を形成し、ついで前記
第２の非活性サブユニットを供給して前記複合体の形成
に関与しなかった競合物質の第１の非活性サブユニット
に前記第２の非活性サブユニットを会合させて活性型の
ラマン活性物質生成酵素を形成させ、このラマン活性物
質生成酵素にラマン活性物質生成基質を供給して反応さ
せ、ついで生成したラマン活性物質を表面増強ラマン散
乱生起基質に捕捉し、この状態で、前記ラマン活性物質
に対し励起光を照射し、発生する表面増強ラマン散乱を
測定する分析方法。 - 【請求項４】 競合物質として、第１の非活性サブユニ
ットを備えた被分析物質に代えて、第１の非活性サブユ
ニットを備えた被分析物質類似物を用いる請求項３記載
の分析方法。 - 【請求項５】 特異的結合物質に、被分析物質とラマン
活性物質生成酵素を備えた競合物質とを競合結合反応さ
せて複合体を形成し、この複合体と前記複合体の形成に
関与しなかった前記ラマン活性物質生成酵素を備えた競
合物質とを分離した後、前記複合体に対しラマン活性物
質生成基質を供給して前記競合物質のラマン活性物質生
成酵素と反応させ、生成したラマン活性物質を表面増強
ラマン散乱生起基質に捕捉し、この状態で前記ラマン活
性物質に対し励起光を照射し、発生する表面増強ラマン
散乱を測定する分析方法。 - 【請求項６】 競合物質がラマン活性物質生成酵素を備
えた被分析物質であり、前記競合物質中のラマン活性物
質生成酵素は、前記競合物質中の被分析物質と特異的結
合物質が結合すると失活する酵素であり、複合体と前記
複合体の形成に関与しなかった前記ラマン活性物質生成
酵素を備えた競合物質とを分離することなく前記ラマン
活性物質生成酵素の反応を行う請求項５に記載の分析方
法。 - 【請求項７】 競合物質として、ラマン活性物質生成酵
素を備えた被分析物質に代えて、ラマン活性物質生成酵
素を備えた被分析物質類似物を用いる請求項６記載の分
析方法。 - 【請求項８】 特異的結合物質が固相に固定されている
請求項５〜７のいずれか一項に記載の分析方法。 - 【請求項９】 ラマン活性物質生成酵素が、その基質が
ラマン活性を有せずかつ酵素反応生成物のみがラマン活
性を有するもの、または前記酵素基質がラマン活性を有
するが酵素反応生成物のラマン活性シグナルと区別でき
るものである請求項１〜８のいずれか一項に記載の分析
方法。 - 【請求項１０】 ラマン活性物質生成酵素がペルオキシ
ダーゼであり、ラマン活性物質生成基質が、２，２´−
アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−サル
フォニックアシッド）、ｏ−フェニレンジアミン、３，
３´，５，５´−テトラメチルベンジジン、ｏ−ジアニ
シジン、５−アミノサリシリックアシッド、３，３´−
ジアミノベンゼン、３−アミノ−９−エチルカルバゾー
ル、４−クロロ−１−ナフトールからなる群から選択さ
れた少なくとも一つのラマン活性物質生成基質である請
求項１〜９のいずれか一項に記載の分析方法。 - 【請求項１１】 ラマン活性物質生成酵素が、アルカリ
フォスファターゼであり、ラマン活性物質生成基質が、
ｐ−ニトロフェニルフォスフェイト、５−ブロモ−４−
クロロ−３−インドリルフォスフェイト、ファーストレ
ッドフォスフェイト、４−メチルアンベリフェリルホス
フェイトからなる群から選択された少なくとも一つのラ
マン活性物質生成基質である請求項１〜９のいずれか一
項に記載の分析方法。 - 【請求項１２】 ラマン活性物質生成酵素が、グルコシ
ダーゼであり、ラマン活性物質生成基質が、ｐ−ニトロ
フェニル−グルコサイドおよび４−メチルアンベリフェ
リルグルコサイドの少なくとも一つのラマン活性物質生
成基質である請求項１〜９のいずれか一項に記載の分析
方法。 - 【請求項１３】 ラマン活性物質生成酵素が、ガラクト
シダーゼであり、ラマン活性物質生成基質が、ｐ−ニト
ロフェニル−ガラクトサイドおよび４−メチルアンベリ
フェリルガラクトサイドの少なくとも一つのラマン活性
物質生成基質である請求項１〜９のいずれか一項に記載
の分析方法。 - 【請求項１４】 ラマン活性物質生成酵素が、サルファ
ターゼであり、ラマン活性物質生成基質が、ｐ−ニトロ
フェニルサルフェイトおよび４−メチルアンベリフェリ
ルサルフェイトの少なくとも一つのラマン活性物質生成
基質である請求項１〜９のいずれか一項に記載の分析方
法。 - 【請求項１５】 ラマン活性物質生成酵素が、ウレアー
ゼであり、ラマン活性物質生成基質が、尿素およびブロ
モクレゾールパープルの少なくとも一つのラマン活性物
質生成基質である請求項１〜９のいずれか一項に記載の
分析方法。 - 【請求項１６】 表面増強ラマン散乱生起基質が、金属
コロイド、金属フィルム、金属フォイル、電極、導電体
および半導体からなる群から選択された少なくとも一つ
である請求項１〜１５のいずれか一項に記載の分析方
法。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP3174396A JP2965502B2 (ja) | 1996-02-20 | 1996-02-20 | 表面増強ラマン散乱測定による分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3174396A JP2965502B2 (ja) | 1996-02-20 | 1996-02-20 | 表面増強ラマン散乱測定による分析方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09222395A JPH09222395A (ja) | 1997-08-26 |
| JP2965502B2 true JP2965502B2 (ja) | 1999-10-18 |
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ID=12339519
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
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-
1996
- 1996-02-20 JP JP3174396A patent/JP2965502B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (5)
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|---|
| ＡｃｔａＢｉｏｃｈｉｍｉｉｃａＰｏｌｏｎｉｃａ Ｖｏｌ．２６，Ｎｏ．４（１９７９）ｐ３２７−３３３ |
| Ａｄｖ．Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃ．Ｖｏｌ．１６（１９８８）ｐ９１−１５３ |
| Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．１８２（１９８９）ｐ３８８−３９８ |
| Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．３０８（１９９１）ｐ２２７−２３７ |
| 化学の領域増刊号Ｎｏ．１４０（１９８３）ｐ８３−１００ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH09222395A (ja) | 1997-08-26 |
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