CN104155438A - 一种总胆汁酸的测定试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种总胆汁酸的测定试剂，该试剂包含两个组份：试剂1：磷酸盐缓冲液、Thio-NAD、EMULGENB-66 CTAB、NaCl 、2-羟基吡啶-N-氧化物；试剂2：甘氨酸盐缓冲液、硫酸葡聚糖、EGTA、3α-HSD、EMULGENB-66、NADH、2-羟基吡啶-N-氧化物。本发明通过加入阳离子和非离子表面活性剂EMULGENB-66 的组合，有效消除了胆红素的干扰；本品加入选定的稳定剂，使试剂在2-8度保存1年而不影响其性能；通过调整底物浓度和离子强度，使试剂的回收率到达98%以上。本发明试剂具有测定结果准确，抗干扰能力强，稳定性好等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种体外诊断试剂，特别是一种总胆汁酸的测定试剂。
背景技术
血清总胆汁酸可同时反映肝脏细胞分泌、合成、损伤三个方面状态， 实验表明总胆汁酸对肝硬化、肝癌的检测阳性率高达95%，总胆汁酸检测的普及使得各类急慢性肝炎、肝硬化，乃至肝癌病人的早期诊断有了较为有效的依据，临床诊断意义非常大。
早在上世纪70年代，挪威科明公司采用3α-羟基类固醇脱氢酶（3α-HSD）成功的生产出第一代酶法胆汁酸试剂，使胆汁酸的测定真正的进入了临床领域。随后总胆汁酸测定的方法发展较快，目前临床上应用的是第五代酶法测定试剂。其反应原理如下：胆汁酸会被3α-羟甾醇脱氢酶（亦为类固醇脱氢酶，3α-HSD）以及β-硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型（简称硫代辅酶：Thio-NAD）特异性地氧化，生成3-酮类固醇以及β-硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型（Thio-NADH）。此外生成的3-酮类固醇在3α-羟甾醇脱氢酶（3α-HSD）及β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型（NADH）存在下，生成胆汁酸及β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型（NAD）。如上所述，依据循环酶而放大微量的胆汁酸量，测定单位时间内生成的β-硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型（Thio-NADH）在405nm 处的吸光度变化，以求得胆汁酸的浓度。
目前使用的绝大部分总胆汁酸试剂的稳定性都较差，产品在冷藏条件下的有效期绝大多数都在10个月以下，37度热稳定性在5天以下，试剂开瓶稳定在两周之内（测定值不断下降）；并且多数品牌总胆汁酸试剂胆红素负干扰明显，且试剂的回收率低，多数试剂回收率在80%左右，有的甚至低达60%，以致临床样本经常出现负值。因此，目前多数厂家试剂在应用上存在很多的局限性。
发明内容
本发明的目的就是提供一种稳定性好，抗干扰能力强，回收率高的总胆汁酸测定试剂。
一种总胆汁酸的测定试剂，该试剂由试剂1和试剂 2组成，其特征在于，试剂1由磷酸盐缓冲液 、Thio-NAD 、EMULGEN B-66 、 CTAB 、NaCl 2-羟基吡啶-N-氧化物组成；试剂2由甘氨酸盐缓冲液、硫酸葡聚糖 、EGTA 、3α-HSD、EMULGEN B-66、 NADH2-羟基吡啶-N-氧化物组成。
其中该试剂的组份浓度为：
试剂1：
磷酸盐缓冲液 2-6g/L
Thio-NAD 1.3-1.7 g /L
EMULGEN B-66 0.3-2ml/L
CTAB 0.1-1.5g/L
NaCl 3-25g/L
2-羟基吡啶-N-氧化物 0.1-1.2g/L
试剂2：
甘氨酸盐缓冲液 10-20g/L
硫酸葡聚糖 1.2-7g/L
EGTA 1-5g/L
3α-HSD 10KU/L
EMULGEN B-66 1-3ml/L
NADH 3g/L
2-羟基吡啶-N-氧化物 0.1-1.2g/L。
为了解决总胆汁酸的试剂稳定性不好的问题，本发明在试剂2组份中添加了稳定剂硫酸葡聚糖、EGTA以及聚氧乙烯基衍生物类表面活性剂来增强3α-HSD及NADH的稳定性；为了消除胆红素的干扰，本发明通过在试剂1中添加非离子表面活性剂EMULGEN B-66和阳离子表面活性剂CTAB的组合来提高试剂的抗干扰能力；本发明研究表明，提高试剂1中Thio-NAD的含量及加入电解质，能显著的提高试剂的回收率，因此我们把试剂1中Thio-NAD的含量由以前文献报道的1g/L左右提高到1.5g/L，并加入了较多的NaCl，有效的解决了总胆汁酸的测定试剂回收率低的问题。
上述添加剂的浓度范围为：
硫酸葡聚糖：1.2-7g/L
EGTA：1-5g/L
EMULGEN B-66：0.3-3ml/L
CTAB：0.1-1.5g/L
NaCl：3-25g/L Thio-NAD 1.3-1.7 g /L 。
上述试剂的使用方法：
（1）样品准备：样本为及时分离的空腹血清（或肝素抗凝血浆）。样本收集后应尽快测定，必须避光保存，避免溶血和污染；血清中总胆汁酸在4℃可稳定一周，冷冻可保存3个月。
（2）采用全自动生化仪对步骤（1）的样品进行检测，步骤如下：
试验条件：
操作步骤：
﹡试剂和样本量可根据不同生化分析仪要求按比例适当增减。
计算：
样本中TBA含量（μmol/L）=(ΔA样品/min－ΔA空白/min)×C标准/（ΔA标准/min－ΔA空白/min）
式中：
C标准 标准品TBA含量
ΔA样品/min 样品管平均每分钟的吸光度变化
ΔA标准/min 标准管平均每分钟的吸光度变化
ΔA空白/min 空白管平均每分钟的吸光度变化
本发明人对本发明试剂的稳定性、抗胆红素干扰能力和回收率分别进行了检测，结果如下：
1、增强试剂的稳定性
配制试剂A：
R1（3g/L的磷酸盐缓冲液，1.6g/L的Thio-NAD，1ml/L的EMULGEN B-66，1g/L的CTAB，15g/L的NaCl以及0.3g/L的2-羟基吡啶-N-氧化物）；
R2（15g/L的甘氨酸盐缓冲液，10KU/L的3α-HSD，3g/L的NADH，0.3g/L的2-羟基吡啶-N-氧化物）。
配制试剂B: R1与试剂A一致；往试剂A的R2中加入5g/L的硫酸葡聚糖，2ml/L的EMULGEN B-66，2g/L的EGTA，即得试剂B的R2。
分别检测试剂A、B稳定性，结果如下：
结果表明在试剂2中添加了硫酸葡聚糖，EGTA以及EMULGEN B-66有效的提高了试剂的稳定性。
2、抗胆红素干扰
配制试剂C：
R1（4.5g/L的磷酸盐缓冲液，1.4g/L的Thio-NAD，12g/L的NaCl以及0.3g/L的2-羟基吡啶-N-氧化物）；
R2（10g/L的甘氨酸盐缓冲液，10KU/L的3α-HSD，3g/L的NADH，5g/L的硫酸葡聚糖，2ml/L的EMULGEN B-66，2g/L的EGTA ，0.3g/L的2-羟基吡啶-N-氧化物）。
配制试剂D: 往试剂C的R1中加入1g/L的CTAB和1ml/L的EMULGEN B-66即得试剂D的R1；试剂D的R2与试剂C一致。
分别检测试剂C、D抗胆红素干扰能力，结果如下：
结果表明，阳离子表面活性剂CTAB和EMULGEN B-66的组合能有效的消除胆红素对测定结果的干扰。
3、回收率实验
配制试剂E: R1(4.5g/L的磷酸盐缓冲液，1.0g/L的Thio-NAD，2ml/L的EMULGEN B-66，0.8g/L的CTAB以及0.3g/L的2-羟基吡啶-N-氧化物)；
R2（10g/L的甘氨酸盐缓冲液，4.2g/L的硫酸葡聚糖，1.9g/L的EGTA，1.8ml/L的EMULGEN B-66，
10KU/L的3α-HSD，3g/L的NADH以及0.3g/L的2-羟基吡啶-N-氧化物）。
配制试剂F:往试剂E的R1中加入0.5g/L的Thio-NAD及15g/L的NaCl即为试剂F的R1； R2与试剂E的R2一致。
分别检测试剂E、F的回收率，结果如下：
结果表明添加较高浓度的NaCl和加大Thio-NAD的浓度，能有效的提高试剂的回收率。
本发明试剂与日本进口试剂同时对40例临床样本进行检测，结果如下：
其中 X: 横座标 表示日本进口试剂
Y：纵座标 表示本发明试剂
回归方程： Y=1.0152X-0.2949
相关系数 r=0.999
结果表明本发明试剂与日本进口试剂相符，符合临床检验要求。
本发明提供的总胆汁酸的测定试剂回收率高，抗胆红素干扰能力强，稳定性好，测定结果准确，符合临床检验要求。
具体实施方式
实例一：
试剂1：
磷酸盐缓冲液 2g/L
Thio-NAD 1.3g/L
EMULGEN B-66) 1ml/L
CTAB 0.8g/L
NaCl 12g/L
2-羟基吡啶-N-氧化物 0.1g/L
试剂2：
甘氨酸盐缓冲液 15g/L
硫酸葡聚糖 7g/L
EGTA 1g/L
3α-HSD 10KU/L
EMULGEN B-66 1ml/L
NADH 3g/L
2-羟基吡啶-N-氧化物 0.1g/L
实例二：
试剂1：
磷酸盐缓冲液 4g/L
Thio-NAD 1.5g/L
EMULGEN B-66) 2ml/L
CTAB 1.5g/L
NaCl 3g/L
2-羟基吡啶-N-氧化物 1.2g/L
试剂2：
甘氨酸盐缓冲液 10g/L
硫酸葡聚糖 1.2g/L
EGTA 3g/L
3α-HSD 10KU/L
EMULGEN B-66 3ml/L
NADH 3g/L
2-羟基吡啶-N-氧化物 0.7g/L
实例三：
试剂1：
磷酸盐缓冲液 6g/L
Thio-NAD 1.7g/L
EMULGEN B-66) 0.3ml/L
CTAB 0.1g/L
NaCl 25g/L
2-羟基吡啶-N-氧化物 0.18g/L
试剂2：
甘氨酸盐缓冲液 20g/L
硫酸葡聚糖 3g/L
EGTA 5g/L
3α-HSD 10KU/L
EMULGEN B-66 2ml/L
NADH 3g/L
2-羟基吡啶-N-氧化物 1.2g/L
实施例四
试剂1：
磷酸盐缓冲液 3g/L
Thio-NAD 1.6g/L
EMULGEN B-66 1ml/L
CTAB 1g/L
NaCl 15g/L
2-羟基吡啶-N-氧化物 0.3g/L ；
试剂2：
甘氨酸盐缓冲液 15g/L
硫酸葡聚糖 5g/L
EGTA 2g/L
3α-HSD 10KU/L
EMULGEN B-66 2ml/L
NADH 2g/L
2-羟基吡啶-N-氧化物 0.3g/L。
Claims (3)
1.一种总胆汁酸的测定试剂，该试剂由试剂1和试剂 2组成，其特征在于，试剂1由磷酸盐缓冲液 、Thio-NAD 、EMULGEN B-66 、 CTAB 、NaCl 2-羟基吡啶-N-氧化物组成；试剂2由甘氨酸盐缓冲液、硫酸葡聚糖 、EGTA 、3α-HSD、EMULGEN B-66、 NADH2-羟基吡啶-N-氧化物组成。
2.如权利要求1所述的总胆汁酸的测定试剂，其特征在于，所述的试剂组成的各组份浓度为：
试剂1：
磷酸盐缓冲液 2-6g/L
Thio-NAD 1.3-1.5g/L
EMULGEN B-66 0.3-2ml/L
CTAB 0.1-1.5g/L
NaCl 3-25g/L
2-羟基吡啶-N-氧化物 0.1-1.2g/L ；
试剂2：
甘氨酸盐缓冲液 10-20g/L
硫酸葡聚糖 1.2-7g/L
EGTA 1-5g/L
3α-HSD 10KU/L
EMULGEN B-66 1-3ml/L
NADH 3g/L
2-羟基吡啶-N-氧化物 0.1-1.2g/L。
3. 如权利要求1或2所述的总胆汁酸的测定试剂，其特征在于，所述的试剂组成的各组份浓度为：
试剂1：
磷酸盐缓冲液 3g/L
Thio-NAD 1.6g/L
EMULGEN B-66 1ml/L
CTAB 1g/L
NaCl 15g/L
2-羟基吡啶-N-氧化物 0.3g/L ；
试剂2：
甘氨酸盐缓冲液 15g/L
硫酸葡聚糖 5g/L
EGTA 2g/L
3α-HSD 10KU/L
EMULGEN B-66 2ml/L
NADH 3g/L
2-羟基吡啶-N-氧化物 0.3g/L。
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