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CN107703288A - 提高反应稳定性的胆汁酸检测试剂 - Google Patents

提高反应稳定性的胆汁酸检测试剂 Download PDF

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CN107703288A CN201710502736.2A CN201710502736A CN107703288A CN 107703288 A CN107703288 A CN 107703288A CN 201710502736 A CN201710502736 A CN 201710502736A CN 107703288 A CN107703288 A CN 107703288A
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Abstract

本发明公开了一种提高反应稳定性的胆汁酸检测试剂，通过采用循环用辅酶Thio‑NAD、循环用酶3α‑HSD，能够提高提高反应稳定性的胆汁酸检测试剂的循环次数和循环反应速度，且检测试剂的准确度高、稳定性好、灵敏度高，线性范围更广，同时可以减少主要反应物料的用量，减少了试剂的成本。另外，通过优化Thio‑NAD与3α‑HSD的比例可以稳定反应速率，降低试剂本底反应，增强检测灵敏度，检测结果准确可靠。本发明的检测试剂无需样本预处理，在全自动生化分析仪上检测自动化，速度快。

Description

提高反应稳定性的胆汁酸检测试剂
技术领域
本发明涉及胆汁酸检测试剂领域，尤其涉及一种提高反应稳定性的胆汁酸 检测试剂。
背景技术
人体血清总胆汁酸(TBA)是由肝脏合成并分解代谢，从而维持人体胆汁 酸的相对稳定，它的调控是肝脏的一个主要功能。总胆汁酸是在肝脏内由胆固 醇合成，与甘氨酸或牛磺酸结合成为结合型胆汁酸，然后被肝细胞分泌入胆汁， 随胆汁至肠道后，在肠道内细菌作用下被水解成游离型胆汁酸，95％以上的胆汁 酸被肠壁吸收经门静脉血重返肝脏利用，称为胆汁酸肠—肝循环。故正常人血 中胆汁酸浓度很低。胆汁酸的生成和代谢与肝脏有十分密切的关系，一旦当肝 细胞发生病变，血清胆汁酸很容易升高，因而血清胆汁酸水平是反映肝实质损 伤的一项重要指标。
各类肝胆疾病的TBA升高：急性肝炎与肝癌均为100％，肝硬化为87.5％， 慢性肝炎、胆道疾病也达65％以上。说明了肝胆疾病中TBA测定比传统肝功能 指标任何一项都敏感。
急性肝炎与慢性肝炎的TBA有差异：急性肝炎时患者血清TBA与丙氨酸 转氨基酶(ALT)一样，呈显著增高，平均增高幅度是正常的31倍，说明TBA 对急性肝炎早期诊断价值与ALT(阳性率100％)测定相同，经积极治疗后随肝细 胞损害的控制很快转为正常，而TBA则随肝功能的恢复逐渐转为正常。慢性肝 炎时，TBA阳性率为65.7％，平均升高幅度为正常的10倍。
肝癌、肝硬化时，由于肝脏对TBA代谢功能下降，故血清TBA在不同阶 段都增高。当肝癌时，TBA阳性率为100％，而肝硬化TBA阳性率为88％，亦 高于其他指标。
目前检测胆汁酸的方法主要为循环酶法。但是此法不同浓度的样本，循环 次数控制不一致，导致检测结果重复性差，影响测定的准确度。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种胆汁酸测试剂，检测准确度高。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种提高反应稳定性的胆汁酸检测试剂，包括试剂R1和试剂R2；
每升所述胆汁酸检测试剂中所述试剂R1的组分为：
每升所述胆汁酸检测试剂中所述试剂R2的组分为：
优选地，所述试剂R1中，所述缓冲液为Hepes、Tris-HCL、三乙醇胺或 MOPS；所述缓冲液的PH值为3.0～5.5。
优选地，所述试剂R1中，所述酶稳定剂为牛血清白蛋白、丙三醇、甘露醇、 山梨醇或乙二醇。
优选地，所述试剂R1中，所述表面活性剂为Triton450、Triton100、Tween20 或Tween80。
优选地，所述试剂R1中，所述防腐剂为叠氮钠或PC300。
优选地，所述试剂R2中，所述缓冲液为Hepes、Tris-HCL、三乙醇胺或 MOPS；所述缓冲液的PH值为8.0～9.5。
优选地，所述试剂R2中，所述酶稳定剂为牛血清白蛋白、丙三醇、甘露醇、 山梨醇或乙二醇。
优选地，所述试剂R2中，所述表面活性剂为Triton450、Triton100、Tween20、Tween80或PEG2000。
优选地，所述试剂R2中，所述防腐剂为叠氮钠或PC300。
本发明提供的一种提高反应稳定性的胆汁酸检测试剂，通过采用循环用辅 酶Thio-NAD、循环用酶3α-HSD，能够提高提高反应稳定性的胆汁酸检测试剂 的循环次数和循环反应速度，且检测试剂的准确度高、稳定性好、灵敏度高， 线性范围更广，同时可以减少主要反应物料的用量，减少了试剂的成本。另外， 通过优化Thio-NAD与3α-HSD的比例可以稳定反应速率，降低试剂本底反应， 增强检测灵敏度，检测结果准确可靠。本发明的检测试剂无需样本预处理，在 全自动生化分析仪上检测自动化，速度快。
附图说明
图1为日立7100与AU400检测实施例5的提高反应稳定性的胆汁酸检测 试剂的相关图；
图2为日立7100与东芝40检测实施例5的提高反应稳定性的胆汁酸检测 试剂的相关图；
图3为AU400与东芝40检测实施例5的提高反应稳定性的胆汁酸检测试 剂的相关图；
图4为提高反应稳定性的胆汁酸检测试剂检测胆汁酸的原理图。
具体实施方式
为了进一步了解本发明，下面结合实施例对本发明的优选实施方案进行描 述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点而不是对 本发明专利要求的限制。
本发明提供了一种提高反应稳定性的胆汁酸检测试剂，包括试剂R1和试剂 R2；
每升胆汁酸检测试剂中所述试剂R1的组分为：
每升胆汁酸检测试剂中所述试剂R2的组分为：
上述技术方案中，通过采用循环用辅酶Thio-NAD、循环用酶3α-HSD，能 够提高提高反应稳定性的胆汁酸检测试剂的循环次数和循环反应速度，且检测 试剂的准确度高、稳定性好、灵敏度高，线性范围更广，同时可以减少主要反 应物料的用量，减少了试剂的成本。另外，通过优化Thio-NAD与3α-HSD的比 例可以稳定反应速率，降低试剂本底反应，增强检测灵敏度，检测结果准确可 靠。本发明的检测试剂无需样本预处理，在全自动生化分析仪上检测自动化， 速度快。
结合图4说明本发明的提高反应稳定性的胆汁酸检测试剂的检测原料：
胆汁酸被3α-羟甾醇脱氢酶(3α-HSD)以及氧化型β-硫代烟酰胺脲嘌呤二 核苷酸(Thio-NAD)特异性氧化，生成3-酮类固醇以及还原型β-硫代烟酰胺脲 嘌呤二核苷酸(Thio-NADH)。生成的3-酮类固醇在3α-羟甾醇脱氢酶及还原型 β-烟酰胺脲嘌呤二核苷酸(NADH)存在下，再生成胆汁酸及氧化型β-烟酰胺脲 嘌呤二核苷酸(Thio-NAD)。
说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的提高反应稳定性的胆汁酸检 测试剂进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1～5
本实施例1～5涉及一种稳定的总提高反应稳定性的胆汁酸检测试剂盒，试 剂盒包括试剂R1及试剂R2，试剂R1、R2的各组分及含量见表1所示：
表1 实施例1～5中试剂R1、R2的各组分及含量
以实施例5的提高反应稳定性的胆汁酸检测试剂为例，测试准确度、灵敏 度、稳定性和一致性。
一、准确度的测试
用实施例5的胆汁检测试剂检测两个不同水平质控品，检测结果见表2。
表2 检测结果
从表2可知，均值与靶值比较，偏差均小于5％，因此实施例5的提高反应 稳定性的胆汁酸检测试剂准确度高。
二、灵敏度的测试
根据美国临床和实验室标准协会EP17-A文件，进行空白检出限LOB，检 出限LOD，定量检出限LOQ的检测。
依据EP17-A，重复检测水空白60遍及10个低浓度样本60遍，得到实施 例5的提高反应稳定性的胆汁酸检测试剂的空白检测限LOB为0.06μmol，检出 限LOD为0.11μmol，定量检出限LOQ为0.50μmol。由此可知，实施例5的提 高反应稳定性的胆汁酸检测试剂灵敏度高
三、稳定性的测试
冷藏前检测实施例5得到的提高反应稳定性的胆汁酸检测试剂的吸光度， 再将实施例5的提高反应稳定性的胆汁酸检测试剂放置在4℃的冷藏室中冷藏 18个月，检测冷藏后提高反应稳定性的胆汁酸检测试剂的吸光度，结果见表3。
表3 检测结果
由表3可知，冷藏前后提高反应稳定性的胆汁酸检测试剂的吸光度下降值 在5.24％以下，因此本发明的提高反应稳定性的胆汁酸检测试剂稳定性高。
将实施例5的提高反应稳定性的胆汁酸检测试剂放在空气中，每天检测， 连续检测1个月，偏差不大于5％。
四、一致性的测试
选取市场上有代表性的3个厂家全自动生化分析仪：日立7100，AU400， 东芝40，使用实施例5的提高反应稳定性的胆汁酸检测试剂、校准和质控，检 测40份临床血清样本，进行两两相关比较，日立7100系统与AU400系统比较 相关系数r为09954，见图1。日立7100系统与东芝40系统比较相关系数r为 0.9970，见图2。AU400系统与东芝40系统比较相关系数r为0.9990，见图3。 三个系统间均具有良好的相关性。由此可知，实施例5的提高反应稳定性的胆 汁酸检测试剂在不同仪器系统结果一致性良好，适用范围广。
以上对本发明提供的一种提高反应稳定性的胆汁酸检测试剂进行了详细的 介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实 施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想，应当指出，对于本 技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发 明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (9)

1.一种提高反应稳定性的胆汁酸检测试剂，其特征在于，包括试剂R1和试剂R2；
每升所述胆汁酸检测试剂中所述试剂R1的组分为：
每升所述胆汁酸检测试剂中所述试剂R2的组分为：
2.如权利要求1所述的提高反应稳定性的胆汁酸检测试剂，其特征在于，所述试剂R1中，所述缓冲液为Hepes、Tris-HCL、三乙醇胺或MOPS；所述缓冲液的PH值为3.0～5.5。
3.如权利要求1所述的提高反应稳定性的胆汁酸检测试剂，其特征在于，所述试剂R1中，所述酶稳定剂为牛血清白蛋白、丙三醇、甘露醇、山梨醇或乙二醇。
4.如权利要求1所述的提高反应稳定性的胆汁酸检测试剂，其特征在于，所述试剂R1中，所述表面活性剂为Triton450、Triton100、Tween20或Tween80。
5.如权利要求1所述的提高反应稳定性的胆汁酸检测试剂，其特征在于，所述试剂R1中，所述防腐剂为叠氮钠或PC300。
6.如权利要求1所述的提高反应稳定性的胆汁酸检测试剂，其特征在于，所述试剂R2中，所述缓冲液为Hepes、Tris-HCL、三乙醇胺或MOPS；所述缓冲液的pH值为8.0～9.5。
7.如权利要求1所述的提高反应稳定性的胆汁酸检测试剂，其特征在于，所述试剂R2中，所述酶稳定剂为牛血清白蛋白、丙三醇、甘露醇、山梨醇或乙二醇。
8.如权利要求1所述的提高反应稳定性的胆汁酸检测试剂，其特征在于，所述试剂R2中，所述表面活性剂为Triton450、Triton100、Tween20、Tween80或PEG2000。
9.如权利要求1所述的提高反应稳定性的胆汁酸检测试剂，其特征在于，所述试剂R2中，所述防腐剂为叠氮钠或PC300。
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