CN104116572A

CN104116572A - 大鼠脊髓损伤模型建立方法

Info

Publication number: CN104116572A
Application number: CN201410408369.6A
Authority: CN
Inventors: 李夏青; 齐超; 王志茹; 王晨亮; 张宏
Original assignee: Shanxi Medical University
Current assignee: Shanxi Medical University
Priority date: 2014-08-19
Filing date: 2014-08-19
Publication date: 2014-10-29

Abstract

本发明涉及一种制作大鼠脊髓损伤模型的一种新方法；主要解决现有模型中操作复杂，重复性差，大鼠的出血量大，感染死亡高、并发症多、存活时间短等诸多问题；采用的技术方案是：运用自制的针头在不打开髓腔的前提下对大鼠脊髓造成准确定位的一侧腰髓离断性损伤，为采用了一种新方法制作的脊髓损伤模型，同时可以在损伤的同时进行药物及制剂的注射干预损伤及损伤后的再生修复过程。

Description

大鼠脊髓损伤模型建立方法

技术领域

本发明涉及脊髓损伤模型的建立方法，具体涉及一种大鼠脊髓损伤模型建立方法。

背景技术

脊髓损伤是一种致残率很高的疾病，是临床上至今未能解决的问题，可造成无法恢复的运动感觉功能障碍。随着社会各行业的快速发展，脊髓损伤的发病率也随之增加。因此，对脊髓损伤的研究与关注仍是国内外共同探索的课题。而脊髓损伤模型为脊髓损伤的研究提供了科研基础。理想的脊髓损伤模型应具备以下几个条件。一、要能够反应实验动物脊髓损伤的神经生理、运动行为的情况。二、可以提供与临床脊髓损伤一致或相似的动物模型，即具有良好的临床相关性。三、模型要具有可复制性。研究脊髓损伤需大量的实验动物，这就需要制造模型的标准化。

现有技术常见的脊髓损伤模型有下列几种：

1、挫伤型脊髓损伤模型

Allen首次设计的脊髓背侧打击模型，利用不同重量的砝码从不同高度沿着套管垂直落下打击大鼠脊髓背侧造成不同程度的损伤。该模型的不足之处：操作起来重复性较差，影响因素很多，如同样的势能造成的损伤时常相差会很大，且在打击瞬间撞击锤与脊髓相接触的形状与面积不一。

2、钳夹型脊髓损伤

该模型为满足急性脊髓挤压等多种损伤类型的研究需要。具体操作流程：手术打开SD大鼠椎板，用动脉瘤夹钳夹对应于T10的脊髓段。该模型的不足：该模型建立中对大鼠的损伤较大，需要咬除T10椎板，使对应于T10的脊髓段充分暴露，大鼠感染机率较大，容易感染死亡。且钳夹对脊髓损伤的力度不同，容易造成大鼠下肢全瘫。对大鼠术后护理造成很多不便。

3、切割型脊髓损伤模型

流程：打开椎板，暴露相应脊髓，使用锐利的虹膜刀片或者显微剪全横断或半横断脊髓，或切除一段脊髓。该方法的不足：手术步骤较复杂，对大鼠的损伤较大，且用刀片对脊髓的横断面较整齐，与临床实际病例有一定差异。

4、脊髓缺血及再灌注模型

是经股动脉插管或直接关闭降主动脉的方法制作模型。该方法的不足：手术在阻断动脉造成缺血的同时也引起了灌流区其他组织器官的损伤，影响了对行为学的观察。

发明内容

本发明克服现有技术的不足，所要解决的技术问题是现有技术脊髓损伤模型中操作复杂，重复性差，大鼠的出血量大，感染死亡高、并发症多、存活时间短等诸多问题，进而提供一种操作简单、重复性好、功能障碍显著的大鼠脊髓损伤模型建立方法。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：大鼠脊髓损伤模型建立方法，按照如下步骤进行：

（1）对大鼠称重，1%戊巴比妥钠注射液，按每100g体重0.4ml进行腹腔注射；

（2）大鼠麻醉后，背部备皮，消毒皮肤；

（3）确定T₉-T₁₂位置，SD大鼠腰段棘突突出，且胸段棘突后倾，腰段棘突前倾，根据这个标志很容易准确定位。在T₉-T₁₂正上方切口，做一2~3cm皮肤切口，分离肌肉和筋膜，暴露T₉~T₁₂棘突和椎板；

（4）用组织剪和蚊式钳将T₉-T₁₀棘突左侧的肌肉和韧带剥离彻底暴露T₉-T₁₀的棘突和横突，确定T₉-T₁₀间隙；

（5）避开脊髓正中，稍偏左侧，将磨平的1ml注射器针头从T₉-T₁₀间隙垂直插入髓腔并进入相应段脊髓。由于髓腔内为负压，椎间隙为软组织，因此进针时不需太用力，针头很容易进入髓腔及脊髓。当针头进入脊髓后，大鼠会剧烈抖动、垂直上下抽插针头，感觉有较大的活动空间，表明针头在髓腔内；

拔出针头，将弯曲的破髓针针头从进针点垂直插入，进针时弯曲的针尖朝向左侧。待破髓针针头进入髓腔后小幅左右摆动针头，注意要绝对避免弯曲的针头超过棘突中线进入右半侧脊髓，由此只破坏左侧脊髓。进行此项操作时，左侧（损伤侧）后肢出现抽搐，轻缓地并仍以垂直角度拔出针头，此时脊髓半离断损伤模型建立步骤基本完成；

（6）术毕缝合肌肉及皮肤。大鼠清醒后于干燥，安静，自然光条件下普通饲料喂养，并定期用碘伏清洁消毒。

上述建立脊髓损伤模型的方法亦可对右侧脊髓进行操作，操作条件与上述对左侧脊髓进行的操作相对应。

所述直针的针头为平而无尖的针头；能够用于确定破髓针的进针点。

所述直针优选将注射器的针头磨平制成，得到的直针除可确定破髓针的进针点外，还能够用于向脊髓损伤部位注射神经营养因子或神经干细胞等干预损伤、并促进损伤后再生的制剂。

所述破髓针的针头为直角针头，所述破髓针在垂直下针时，所述直角针头的自由端水平。

所述破髓针优选为将注射器的针头斜面向后弯曲90°制成。

本发明所需材料与器械如下：

实验动物

健康雄性大鼠，体重180-200克；

实验器械

11号手术刀片、持针钳、蚊式钳、血管钳、手术镊、组织剪、缝针、直针（自制的1毫升注射器针头：一支将1毫升注射器针头磨平制成，如图1所示）、破髓针（将1毫升注射器针头向针头斜面背侧弯曲90度制成，如图2所示）。

与现有技术相比本发明具有以下有益效果。

用针头造成的脊髓损伤模型操作简便，损伤较小，重复性高，功能障碍显著，并为研究刺激或促进脊髓再生的药物或制剂提供了良好的条件及环境；为探索临床药物的分子作用机理提供实验基础。同时，由于模型动物术后感染机率低、并发症少、存活率高、可重复性好，有良好的推广使用前景。

附图说明

图1为本发明直针的结构示意图。

图2为本发明破髓针的结构示意图。

图3为大鼠脊髓损伤部位示意图。

图4为大鼠脊髓损伤部位脊髓纵断面示意图。

图5为大鼠脊髓损伤部位脊髓横断面示意图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。

造模方法：

（1）对大鼠称重，1%戊巴比妥钠注射液，按每100g体重0.4ml进行腹腔注射。

（2）大鼠麻醉后，背部备皮，消毒皮肤。

（3）确定T9-T12位置，SD大鼠腰段棘突突出，且胸段棘突后倾，腰段棘突前倾，根据这个标志很容易准确定位。在T9-T12正上方切口，做一2~3cm皮肤切口，分离肌肉和筋膜，暴露T9~T12棘突和椎板。

（4）如图3所示用组织剪和蚊式钳将T9-T10棘突左侧的肌肉和韧带剥离彻底暴露T9-T10的棘突和横突，确定T9-T10间隙。

（5）如图4所示避开脊髓正中，稍偏左侧，将磨平的1ml注射器针头从T9T10间隙垂直插入髓腔并进入相应段脊髓。由于髓腔内为负压，椎间隙为软组织，因此进针时不需太用力，针头很容易进入髓腔及脊髓。当针头进入脊髓后，大鼠会剧烈抖动、垂直上下抽插针头，感觉有较大的活动空间，表明针头在髓腔内。

拔出针头，如图5所示将弯曲的破髓针针头从进针点垂直插入，进针时弯曲的针尖朝向左侧。待针头进入髓腔后小幅左右摆动针头，但绝对避免弯曲的针头超过棘突中线进入右半侧脊髓，由此只破坏左侧脊髓。进行此项操作时，左侧（损伤侧）后肢出现抽搐，轻缓地并仍以垂直角度拔出针头，此时脊髓半离断损伤模型建立步骤基本完成。

实验结果如下。

大鼠行为学观察

正常大鼠四脚触地，可直立。清醒后的脊髓半离断术模型大鼠术后3-5日手术切口处红肿，数日后恢复正常。与正常大鼠进行对比，模型动物左侧后肢瘫痪、拖地行走，且不能直立。但大鼠可进行正常日常活动，饮食及排泄均正常，术后并发症少，且存活时间较长。对侧后肢活动正常。

大鼠后肢在不同时间的抓力（运动功能）和热痛（感觉功能）反应

我们通过对脊髓半离断术后的大鼠进行抓力和热痛反应试验中可看出，（如表1、表2）术前大鼠的双后肢的感觉和运动能力均正常。手术后，随着时间的推移，患侧后肢的运动感觉和反射功能均无恢复，而健侧后肢运动功能正常，对热痛反应消失后渐渐有所恢复。这说明半离断术对大鼠造成了神经障碍。

脊髓组织形态学观察

肉眼观察：术后24h大鼠伤口处肿胀，打开髓腔后可见腰膨大处左侧脊髓明显的断裂，脊髓充血肿胀。1周后皮肤伤口愈合，肿胀消失。显微镜下观察：术后大鼠脊髓的损伤区可见纵行脊髓纤维断裂。

以上结果可以看出本发明的优点在于：

（1）本发明运用1ml注射器针头更容易操作、损伤位置准确，且半离断完全，脊髓损伤断端更接近于临床实际情况。

（2）本发明运用针头进行损伤，对大鼠的损伤小，伤口自愈时间短，并对脊髓造成的感染机率小，出血量少，对实验器材要求不高，操作相对容易，且造成的运动感觉障碍明确。

（3）本发明最大的特点是可以通过注射针头所连接的注射器在损伤的部位注射药物，神经营养因子或神经干细胞等干预损伤、并促进损伤后再生的制剂。同时，通过脊髓半离断术可以观察及探讨神经递质、神经营养因子、药物及神经干细胞等对脊髓损伤及再生过程的影响及其分子机制。由于本发明的模型可以与健侧对照并可利用针头在脊髓腔内注药，因此具有独特的优越性。

本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制发明，权利要求书指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何变化，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

Claims

1.大鼠脊髓损伤模型建立方法，其特征在于按照如下步骤：

（1）对大鼠称重，按每100g体重用0.4ml戊巴比妥钠注射液进行腹腔注射；

（2）大鼠麻醉后，背部备皮，消毒皮肤；

（3）确定T₉-T₁₂位置，在T₉-T₁₂正上方切口，做一2-3cm皮肤切口，分离肌肉和筋膜，暴露T₉-T₁₂的棘突和椎板；

（4）将T₉T₁₀棘突左侧或右侧的肌肉和韧带剥离彻底暴露T₉-T₁₀的棘突和横突，确定T₉-T₁₀间隙；

（5）避开脊髓正中，稍偏左侧或右侧，将直针从T₉-T₁₀间隙垂直插入髓腔并进入相应段脊髓，拔出针头，形成进针点；将破髓针的针头从进针点垂直插入，进针点在左侧时，进针时，弯曲的针尖朝向左侧；进针点在右侧时，进针时，弯曲的针尖朝向右侧；待针头进入髓腔后小幅左右摆动针头，但绝对避免弯曲的针头超过棘突中线进入另半侧脊髓，由此只破坏左侧或右侧脊髓；然后轻缓地并仍以垂直角度拔出破髓针的针头；

（6）缝合肌肉及皮肤，大鼠清醒后于干燥、安静、自然光条件下普通饲料喂养，并定期清洁消毒。

2.根据权利要求1所述的大鼠脊髓损伤模型建立方法，其特征在于：所述戊巴比妥钠注射液的浓度为1%。

3.根据权利要求1所述的大鼠脊髓损伤模型建立方法，其特征在于：所述直针的针头为平而无尖的针头。

4.根据权利要求3所述的大鼠脊髓损伤模型建立方法，其特征在于：所述直针用于确定破髓针的进针点。

5.根据权利要求3所述的大鼠脊髓损伤模型建立方法，其特征在于：所述直针为将注射器的针头磨平制成。

6.根据权利要求5所述的大鼠脊髓损伤模型建立方法，其特征在于：所述直针用于确定破髓针的进针点，亦能用于向脊髓腔内注射药物。

7.根据权利要求1所述的大鼠脊髓损伤模型建立方法，其特征在于：所述破髓针的针头为直角针头，所述破髓针在垂直下针时，所述直角针头的自由端水平。

8.根据权利要求7所述的大鼠脊髓损伤模型建立方法，其特征在于：所述破髓针为将注射器的针头斜面向后弯曲90°制成。

9.根据权利要求5或8所述的大鼠脊髓损伤模型建立方法，其特征在于：所述注射器为普通1ml一次性注射器。