CN104072493B

CN104072493B - 一类含2-巯基苯并噻唑和三唑杂环的萘酰亚胺化合物，其制备方法及其应用

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Publication number: CN104072493B
Application number: CN201410246653.8A
Authority: CN
Inventors: 李晓莲; 尹方敏; 张英利; 刘馨月; 赵赫; 门泽宇
Original assignee: Dalian University of Technology
Current assignee: Dalian University of Technology
Priority date: 2014-06-05
Filing date: 2014-06-05
Publication date: 2017-01-04
Anticipated expiration: 2034-06-05
Also published as: CN104072493A

Abstract

本发明涉及一类含2‑巯基苯并噻唑和三唑杂环的萘酰亚胺化合物及其应用。所述化合物具有通式Y的结构。本发明以“非萘并”的方式引入五元三氮唑环来增大萘酰亚胺母体的共轭面积，同时连接活性基团巯基苯并噻唑，设计合成了一类具有广泛的抗肿瘤活性的化合物，该类化合物对宫颈癌、肝癌、乳腺癌等多种不同组织来源的肿瘤细胞的正常生长具有较好的抑制作用。

Description

一类含2-巯基苯并噻唑和三唑杂环的萘酰亚胺化合物，其制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物有机合成领域中的一类含2-巯基苯并噻唑和三唑杂环的萘酰亚胺化合物，其制备方法及其应用。

背景技术

20世纪70年代初，研究小组第一次设计并合成了一系列3-硝基萘酰亚胺衍生物，并对这些化合物进行了体外和体内的抗肿瘤测试。其中安奈菲特(Amonafide)和米托萘胺(Mitonafide)是非常著名的两个化合物。Amonafide是最早进行临床研究的萘酰亚胺衍生物之一，对人宫颈癌Hela，人鼻咽癌KB及白血病P388，HL-60表现出良好的抑制作用。Mitonafide对人宫颈癌Hela和人鼻咽癌KB细胞有强烈的抑制效果。Mitonafide和Amonafide作用机理比较相似，同样为DNA嵌入剂，在拓扑异构酶Ⅱ的介入下诱导DNA链的断裂，影响DNA正常的生理功能，从而达到一致癌细胞增殖的作用。目前Amonafide处于临床Ⅱ期，临床表现出骨髓抑制的毒副作用。虽然Costanza等人报道Amonafide对晚期乳腺癌有治疗作用，但是由于其强烈的毒副作用不得不中止其进一步的研究。Mitonafide在临床上的不良反应是造成较大的中枢神经毒性，目前终止了该化合物的临床研究。

含硫杂环在靶向分子的设计中有重要的作用。Ott在萘酰亚胺中引入巯基苯并噻唑，合成了一系列硫取代的萘酰亚胺衍生物，测试表明该系列物质主要作用于拓扑异构酶I，或者II型并且有光毒性，这在光动力学治疗癌症上有着重要的意义。

三唑类化合物可以通过干扰内皮细胞增殖来抑制血管生成，故而作为血管生成抑制剂用于恶性血液病、前列腺癌、肾癌、肺癌、神经胶质瘤等疾病的辅助治疗中。例如化合物E4896目前正处于临床III期试验，可用于乳腺癌、肺癌、晚期卵巢癌、肾癌的治疗，另外对小分子肺癌活性实验结果表明：其可以减少51％的血管生成。

发明内容

本发明的目的是以4-溴-1,8萘酐为起始原料，以“非萘并”的方式引入五元三氮唑环来增大萘酰亚胺母体的共轭面积，同时连接活性基团巯基苯并噻唑，设计合成了一类含2-巯基苯并噻唑和三唑杂环的萘酰亚胺化合物。扩展萘酰亚胺衍生物的多样性，改善分子的生物学活性，从而提高其抗肿瘤性能。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一类含2-巯基苯并噻唑和三唑杂环的萘酰亚胺化合物，其特征在于所述化合物具有通式Y的结构：

通式Y中：R选自-CH₂CH₂N(CH₃)₂、-CH₂CH₂N(CH₂CH₃)₂、-CH₂CH₂CH₂N(CH₃)₂、-CH₂CH₂N(CH₂CH₂)₂NH、-CH₂CH₂OH、-CH₂CH₂CH₃、-CH₂CH₂CH₂N(CH₂CH₃)₂或-CH₂CH₂CH₂CH₃。

本发明所述的化合物选自：

N-(N’,N’-二甲基胺基乙基)-6-(4-((苯并噻唑-2-巯基)甲基)-[1,2,3]-三唑)萘酰亚胺；

N-(N’,N’-二乙基胺基乙基)-6-(4-((苯并噻唑-2-巯基)甲基)-[1,2,3]-三唑)萘酰亚胺；

N-(N’,N’-二甲基胺基丙基)-6-(4-((苯并噻唑-2-巯基)甲基)-[1,2,3]-三唑)萘酰亚胺；

N-(2’-哌嗪基乙基)-6-(4-((苯并噻唑-2-巯基)甲基)-[1,2,3]-三唑)萘酰亚胺；

N-(2’-羟基乙基)-6-(4-((苯并噻唑-2-巯基)甲基)-[1,2,3]-三唑)萘酰亚胺；

或N-丁基-6-(4-((苯并噻唑-2-巯基)甲基)-[1,2,3]-三唑)萘酰亚胺。

本发明所述化合物的制备方法，包括以下步骤：先以4-溴-1,8萘酐与叠氮钠反应得中间体4-叠氮-1,8-萘酰亚胺，溴丙炔与2-巯基苯并噻唑反应得到中间体2-(2-炔-1-丙基硫代)苯并[d]噻唑，两个中间体在抗坏血酸钠和五水硫酸铜催化下反应得到4-(4-((苯并噻唑-2-巯基)甲基)-[1,2,3]-三唑)-1,8萘酐，4-(4-((苯并噻唑-2-巯基)甲基)-[1,2,3]-三唑)-1,8萘酐再与相应的胺基烃经过氨基缩合得到所述化合物。

合成路线如下：

其中在第一步反应中，化合物1(4-溴-1,8萘酐)与叠氮钠的最佳摩尔比为1:1.5，以DMF为溶剂，经过叠氮化反应得中间体2(4-叠氮-1,8-萘酰亚胺)，冷却，过滤，干燥得黄色固体；第二步反应中，溴丙炔与2-巯基苯并噻唑的最佳摩尔比为1:1，再加入三乙胺(溴丙炔：2-巯基苯并噻唑：三乙胺＝1:1:1)，以丙酮为溶剂超声震荡后得到中间体3(2-(2-炔-1-丙基硫代)苯并[d]噻唑)，过滤，蒸馏除溶剂，得褐色油状固体；第三步反应中，中间体2和中间体3以叔丁醇和水和混合液为溶剂，加入抗坏血酸钠和五水硫酸铜，经Cu(I)催化的“Clickchemistry”反应，在N₂保护下，70℃避光反应24h得到中间体4(4-(4-((苯并噻唑-2-巯基)甲基)-[1,2,3]-三唑)-1,8萘酐)冷却，过滤，干燥得固体；第四步反应中，中间体4再与相应的胺基烃以最佳摩尔比为1:1.2反应，经过氨基缩合得到本发明所述化合物。

本发明所述化合物具有抑制肿瘤细胞生长的作用，所述肿瘤细胞包括MCF-7乳腺癌细胞、Hela子宫颈癌细胞和SMMC-7721肝癌细胞。

将本发明所述的化合物用四氮唑盐还原法对MCF-7乳腺癌细胞、Hela子宫颈癌细胞和SMMC-7721肝癌细胞进行体外抑制肿瘤细胞生长活性的测定，结果表明，该类化合物对宫颈癌、肝癌、乳腺癌等多种不同组织来源的肿瘤细胞具有抑制生长的活性。

所述四氮唑盐还原法实验步骤如下：

1、接种细胞

分别将乳腺癌MCF-7细胞、人宫颈癌Hela细胞和肝癌SMMC-7721细胞收集到培养基中，将细胞稀释后每孔接种200μL细胞悬液，保证每孔中约2000～5000个细胞，最外围加入200μLPBS，提供充足的水分保证细胞的生长环境，将培养板放至37℃、5％CO₂的环境中温育温育24h～48h。

2、添加药物

用培养基将本发明所述化合物分别稀释成10^-8、10^-7、10^-6、10^-5M四个梯度浓度，吸去96孔板中2-11列的培养基，此处要小心不要吸走细胞；然后加入药物，设置6个复孔，减小误差；处理完成后，将96孔板放回CO₂培养箱中，培育48h。

3、存活细胞数的检测

在所有孔中均加入20μL MTT，放到CO₂培养箱中温育4h；弃去孔中的培养基和MTT，加入200μL DMSO，溶解残留的MTT-甲臜结晶。在酶标仪上测定各孔吸光度记录结果，按下列公式计算被测物对癌细胞生长的抑制率：

肿瘤抑制率＝(对照组OD值-治疗组OD值)/对照组OD值×100％

本发明的有益效果：

第一，本发明在4-溴-1,8萘酐母体上以“非萘并”的方式引入五元三氮唑环来增大萘酰亚胺母体的共轭面积，同时连接活性基团巯基苯并噻唑，设计合成了一类含2-巯基苯并噻唑和三唑杂环的萘酰亚胺化合物；

第二，本发明的化合物扩展萘酰亚胺衍生物的多样性，改善了分子的生物学活性，从而提高了其抗肿瘤性能。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

N-(N’,N’-二甲基胺基乙基)-6-(4-((苯并噻唑-2-巯基)甲基)-[1,2,3]-三唑)萘酰亚胺(化合物M1)的合成：

(1)4-叠氮-1.8-萘酰亚胺(中间体2)

在50mL双口瓶中加入2.5g(9mmol)4-溴-1,8萘酐，用35mL DMF搅拌溶解，将0.87g(13.5mmol)叠氮钠缓慢加入反应体系，加热至55℃，回流下磁力搅拌1h，冷却，反应液倒入水中，析出大量黄色沉淀，过滤，干燥，得2.04g黄色固体，产率：95.1％。

(2)2-(2-炔-1-丙基硫代)苯并[d]噻唑(中间体3)

称取2-巯基苯并噻唑4.02g(24mmol)巯基苯并噻唑，用40mL丙酮溶解，加入3.34mL(24mmol)三乙胺，此时反应液呈橙色透明液体，加入1.88mL(24mmol)溴丙炔，超声震荡10分钟，停止反应，过滤，得褐色滤液，将滤液减压蒸馏除去溶剂。得褐色油状固体4.82g，产率：98.0％。熔点：58.6-59.1℃。

(3)4-(4-((苯并噻唑-2-巯基)甲基)-[1,2,3]-三唑)-1,8萘酐(中间体4)

在100mL双口瓶中，加入2.40g(10mmol)4-叠氮-1.8-萘酰亚胺，2.05g(10mmol)中间体3，用38mL叔丁醇和水的1:1的混合溶液搅拌溶解，再加入催化剂5.94g抗坏血酸钠(VC钠)和2.5g五水硫酸铜，N₂保护下，在70℃避光反应24h，TLC跟踪至反应完全。反应结束后，将体系冷却至室温后倒入冷水中，静置，过滤，干燥。得4.41g中间体4，产率99.3％。

(4)N-(N’,N’-二甲基胺基乙基)-6-(4-((苯并噻唑-2-巯基)甲基)-[1,2,3]-三唑)萘酰亚胺(化合物M1)

在50mL双口瓶中，加入1.5g(3.4mmol)化合物4-(4-((苯并噻唑-2-巯基)甲基)-[1,2,3]-三唑)-1,8萘酐，N,N-二甲基乙二胺0.5mL(4.0mmol)，30mL无水乙醇，搅拌，加热回流3h，TLC跟踪至反应完全。将反应体系冷却至室温，倒入冰水中，抽滤，用水洗涤，干燥。硅胶柱层析分离(柱层析洗脱液为CH₂Cl₂:CH₃OH＝12:1)，得到目标产物0.8g M1，淡褐色固体，产率45.8％。熔点：118.3-121.4℃。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.65(dd,J＝7.3,4.0Hz,2H),8.18–8.06(m,2H),7.87(d,J＝8.0Hz,1H),7.78(dd,J＝10.8,4.1Hz,2H),7.68(dd,J＝8.4,7.5Hz,1H),7.47–7.38(m,1H),7.37–7.28(m,1H),4.85(s,2H),4.34(t,J＝6.3Hz,2H),2.69(s,2H),2.37(s,6H).

+ESI MS(M+H):C₂₆H₂₂N₆O₂S₂,计算值：515.1246,实测值：515.1310。

实施例2

N-(N’,N’-二乙基胺基乙基)-6-(4-((苯并噻唑-2-巯基)甲基)-[1,2,3]-三唑)萘酰亚胺(化合物M2)的合成：

除在(4)中用N,N-二乙基乙二胺代替N,N-二甲基乙二胺外，其它合成及实验处理方法同实施例1相同。经硅胶柱层析分离(柱层析洗脱液为CH₂Cl₂:CH₃OH＝12:1)，得到目标产物M2，淡褐色固体，产率70.6％。熔点：114.3-115.9℃。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.66(dd,J＝7.4,4.1Hz,2H),8.16(s,1H),8.11(d,J＝8.6Hz,1H),7.88(d,J＝8.1Hz,1H),7.79(t,J＝7.8Hz,2H),7.69(t,J＝7.9Hz,1H),7.43(t,J＝7.6Hz,1H),7.33(t,J＝7.6Hz,1H),4.85(s,2H),4.35(t,J＝6.6Hz,2H),2.90(s,2H),2.77(s,4H),1.14(s,6H).

+ESI MS(M+H):C₂₈H₂₆N₆O₂S₂,计算值：543.1559,实测值：543.1635。

实施例3

N-(N’,N’-二甲基胺基丙基)-6-(4-((苯并噻唑-2-巯基)甲基)-[1,2,3]-三唑)萘酰亚胺(化合物M3)的合成：

除在(4)中用N,N-二甲基丙二胺代替N,N-二甲基乙二胺外，其它合成及实验处理方法同实施例1相同。经硅胶柱层析分离(柱层析洗脱液为CH₂Cl₂:CH₃OH＝12:1)，得到目标产物M3，淡褐色固体，产率80.3％。熔点：116.0-118.2℃。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.66(dd,J＝7.4,4.7Hz,2H),8.16(s,1H),8.12(d,J＝8.5Hz,1H),7.88(d,J＝8.1Hz,1H),7.80(t,J＝8.5Hz,2H),7.74–7.62(m,1H),7.43(t,J＝7.6Hz,1H),7.33(t,J＝7.6Hz,1H),4.86(s,2H),4.27(t,J＝6.9Hz,2H),2.65(s,2H),2.42(s,6H),2.05(s,2H).

+ESI MS(M+H):C₂₇H₂₄N₆O₂S₂,计算值：529.1402,实测值：529.1462。

实施例4

N-(2’-哌嗪基乙基)-6-(4-((苯并噻唑-2-巯基)甲基)-[1,2,3]-三唑)萘酰亚胺(化合物M4)的合成：

除在(4)中用1-(2-氨基乙基)哌嗪代替N,N-二甲基乙二胺外，其它合成及实验处理方法同实施例1相同。经硅胶柱层析分离(柱层析洗脱液为CH₂Cl₂:CH₃OH:三乙胺＝12:1:1)，得到目标产物M4，黄褐色固体，产率75.7％。熔点：143.5-144.6℃。

¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.66(dd,J＝7.3,4.0Hz,2H),8.15(s,1H),8.11(d,J＝8.0Hz,1H),7.88(d,J＝8.1Hz,1H),7.83–7.76(m,2H),7.72–7.66(m,1H),7.43(t,J＝7.2Hz,1H),7.33(t,J＝7.2Hz,1H),4.86(s,2H),4.34(t,J＝6.4Hz,2H),2.97(dd,J＝14.4,7.1Hz,5H),1.31(t,J＝7.3Hz,6H).

+ESI MS(M+H):C₂₈H₂₅N₇O₂S₂,计算值：556.1511,实测值：556.1572。

实施例5

N-(2’-羟基乙基)-6-(4-((苯并噻唑-2-巯基)甲基)-[1,2,3]-三唑)萘酰亚胺(化合物M5)的合成：

除在(4)中用乙醇胺代替N,N-二甲基乙二胺外，其它合成及实验处理方法同实施例1相同。经硅胶柱层析分离(柱层析洗脱液为CH₂Cl₂:CH₃OH＝20:1)，得到目标产物M5，淡橙色固体，产率83.2％。熔点：120.1-122.7℃。

¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.76–8.63(m,2H),8.20–8.11(m,2H),7.88(d,J＝8.1Hz,1H),7.81(dd,J＝12.2,7.9Hz,2H),7.71(dd,J＝8.5,7.4Hz,1H),7.47–7.39(m,1H),7.34(dd,J＝11.2,4.1Hz,1H),5.30(s,1H),4.86(s,2H),4.48(t,J＝5.3Hz,2H),4.00(t,J＝5.3Hz,2H).

¹³C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.46,163.91,152.90,138.23,132.49,130.98,129.59,129.09,128.62,126.30,126.23,124.64,123.61,122.69,121.46,121.27,61.49,53.46,42.95,27.45.

+ESI MS(M+H):C₂₄H₁₇N₅O₃S₂,计算值：488.0733,实测值：488.0836。

实施例6

N-丁基-6-(4-((苯并噻唑-2-巯基)甲基)-[1,2,3]-三唑)萘酰亚胺(化合物M6)的合成：

除在(4)中用正丁胺代替N,N-二甲基乙二胺外，其它合成及实验处理方法同实施例1相同。经硅胶柱层析分离(柱层析洗脱液为CH₂Cl₂:CH₃OH＝10:1)，得到目标产物M6，淡橙色固体，产率85.9％。熔点：146.8-148.3℃。

¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.71–8.64(m,2H),8.14(s,1H),8.10(dd,J＝8.6,0.9Hz,1H),7.88(d,J＝8.0Hz,1H),7.80(t,J＝7.5Hz,2H),7.69(dd,J＝8.5,7.4Hz,1H),7.48–7.39(m,1H),7.38–7.29(m,1H),4.85(s,2H),4.24–4.14(m,2H),1.73(ddd,J＝12.7,8.6,6.6Hz,2H),1.46(dd,J＝15.2,7.5Hz,2H),0.99(t,J＝7.3Hz,3H).

+ESI MS(M+H):C₂₆H₂₁N₅O₂S₂,计算值：500.1137,实测值：500.1193。

应用例

体外抑制肿瘤细胞生长活性测定：

用四氮唑盐(microculture tetrozolium，MTT)还原法对MCF-7乳腺癌细胞、Hela子宫颈癌细胞和SMMC-7721肝癌细胞进行体外抑制肿瘤细胞生长活性测定。

以化合物M1为例，四氮唑盐(MTT)还原法的具体操作是：

1、接种细胞

将一定数量处于对数生长期的肿瘤细胞收集到培养基中，将细胞稀释后每孔接种加入200μL细胞悬液，约2000～5000个细胞，最外围加入200μL PBS，提供充足的水分保证细胞的生长环境，将培养板放至37℃、5％CO₂环境的培养箱中温育24h。

2、添加药物

用培养基将实施例1制备的化合物M1分别稀释成10^-8、10^-7、10^-6、10^-5M四个梯度浓度；吸去96孔板中2-11列的培养基，此处要小心不要吸走细胞，然后加入药物，每个浓度设置6个复孔，减小误差；处理完成后，将96孔板放回CO₂培养箱中，培育48h。

3、存活细胞数的检测

在所有孔中均加入20μL MTT，放到CO₂培养箱中温育4h；弃去孔中的培养基和MTT，加入200μL DMSO，溶解形成的结晶。在酶标仪上测定各孔吸光度记录结果，按下列公式计算被测物对癌细胞生长的抑制率：

肿瘤抑制率＝(对照组OD值-治疗组OD值)/对照组OD值×100％。

化合物M2～M6的检测方法同上。

根据化合物M1～M6的肿瘤抑制率，计算其IC₅₀值，结果如下表：

表1.化合物M1～M6对Hela、MCF-7和7721癌细胞的IC₅₀值

从表1可以数据分析可以证明：合成的六个化合物M1-M6对三种肿瘤细胞都有明显的抑制增殖作用，该系列化合物侧链两个氮原子隔两个碳的化合物M1的抑制活性显著，对MCF-7、Hela和7721的IC50值分别为2.33μM、0.35μM、0.49μM。M3、M4的对MCF-7和Hela的选择性好于7721细胞，且M3、M4对MCF-7、Hela细胞的IC₅₀值分别为0.35μM、0.12μM和0.66μM、0.19μM。

Claims

1.含2-巯基苯并噻唑和三唑杂环的萘酰亚胺化合物，其特征在于该化合物具有以下的化学分子结构通式：

通式(A)中：

R＝N’,N’-二甲基胺基乙基、N’,N’-二乙基胺基乙基、N’,N’-二甲基胺基丙基、2’-哌嗪基乙基、2’-羟基乙基、丙基、N’,N’-二乙基胺基丙基、丁基。

2.如权利要求1所述的含2-巯基苯并噻唑和三唑杂环的萘酰亚胺化合物在制备抑制SMMC-7721肝癌细胞生长药物中的用途。

3.如权利要求1所述的含2-巯基苯并噻唑和三唑杂环的萘酰亚胺化合物在制备抑制Hela子宫颈癌细胞生长药物中的用途。

4.如权利要求1所述的含2-巯基苯并噻唑和三唑杂环的萘酰亚胺化合物在制备抑制MCF-7乳腺癌细胞生长药物中的用途。