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CN104059134B - 败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白及其应用 - Google Patents

败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白及其应用 Download PDF

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CN104059134B CN201410106983.7A CN201410106983A CN104059134B CN 104059134 B CN104059134 B CN 104059134B CN 201410106983 A CN201410106983 A CN 201410106983A CN 104059134 B CN104059134 B CN 104059134B
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Abstract

本发明关于一种败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白及其应用，包含至少一个败血性巴氏杆菌毒素蛋白的抗原决定位；当该抗原决定位为复数个时，各抗原决定位的间可由连接子连接。该重组蛋白进一步可包含至少一个单元的补体裂解片段C3d的氨基酸序列，且该抗原决定位与该补体裂解片段C3d的氨基酸序列可以连接子连接。本发明并关于一种编码如上述败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的核苷酸序列，以及一种含有上述败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的猪萎缩性鼻炎免疫组合物。

Description

败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白及其应用
技术领域
本发明关于败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白在动物保健领域上的应用，特别是关于含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的猪萎缩性鼻炎免疫组合物在动物保健领域上的应用。
背景技术
猪萎缩性鼻炎(Atrophic Rhinitis,AR)为猪只呼吸系统的三大主要传染病之一。猪萎缩性鼻炎会造成受感染的猪只的颜面骨畸形及慢性化脓性鼻炎，而引起鼻甲介骨的萎缩。在严重感染时，鼻腔、颔骨、上颔骨亦会发生病变。下鼻甲骨的下游窝状部位最常受感染。上鼻甲、下鼻甲骨、鼻中膈或筛骨等部位均会被感染。
猪萎缩性鼻炎(AR)是由支气管败血性博德氏杆菌(Bordetella bronchiseptica)以及败血性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)A型菌(PmA)及D型菌(PmD)所引起，尤其是败血性巴氏杆菌D型菌(PmD)所产生的毒素(Pasteurella multocida toxin,PMT)。取PMT毒素分别以肌肉、腹腔及鼻腔接种等方式接种于四周龄小猪，均可以引致鼻甲介骨萎缩的病变产生，此外也会波及全身性骨骼发育而使生长迟缓，甚至高剂量接种时，会导致肝脏受损而造成猪只黄疸及死亡。
猪萎缩性鼻炎(AR)遍及世界各养猪地区，患猪生长缓慢，饲料利用效率降低。单独感染时虽然死亡率不高，但污染率却很大，而且容易诱发其他合并症或病原的感染，造成高死亡率，增加生产成本。在猪萎缩性鼻炎(AR)严重感染的养猪场，其经济损失约为15-38%，且在重度感染的养猪场有较明显的生长障碍情形，平均日增重约较正常猪只少5-8%。因此开发有效的猪萎缩性鼻炎疫苗，以预防猪只罹患猪萎缩性鼻炎(AR)可以说是刻不容缓且极为重要的事。
发明内容
本发明于第一部分提供一种败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(recombinant PMT,rPMT)，该重组蛋白包含至少一个败血性巴氏杆菌毒素蛋白(PMT)的抗原决定位(epitopes)，以诱导动物产生抗败血性巴氏杆菌毒素蛋白(PMT)的抗体。该败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)可进一步含有补体裂解片段C3d的全长或部分氨基酸序列，以增加特异性免疫反应。且各个该败血性巴氏杆菌毒素蛋白(PMT)的抗原决定位之间、各个该补体裂解片段C3d的全长或部分氨基酸序列之间、以及败血性巴氏杆菌毒素蛋白(PMT)的抗原决定位与补体裂解片段C3d的全长或部分氨基酸序列之间可进一步由连接子连接。
本发明所提供的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)，可以由下式所表示：
(A)m-(C3d片段)n；
其中每一个A代表一个独立的败血性巴氏杆菌毒素蛋白的抗原决定位，每一个A系各自独立选自于由SEQ ID NOs:2、3、4、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41及42所组成的群组；
其中每一个C3d片段代表一个独立的补体裂解片段C3d的氨基酸序列，每一个C3d片段系各自独立选自于SEQ ID NOs:6、7、8及9所组成的群组；
其中m是代表从1至约30的整数；
其中n是代表从0至约10的整数。
本发明于第二部分提供一种编码一败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)的核苷酸序列。该败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)包含至少一个败血性巴氏杆菌毒素蛋白(PMT)的抗原决定位，以及重复0至10个单元的补体裂解片段C3d的部分氨基酸序列。
本发明于第三部分提供一种猪萎缩性鼻炎免疫组合物。该猪萎缩性鼻炎免疫组合物含有一败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)以及一药学上可接受的载剂。该败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)包含至少一个败血性巴氏杆菌毒素蛋白(PMT)的抗原决定位(epitopes)，以及重复0至10个单元的补体裂解片段C3d的部分氨基酸序列。该猪萎缩性鼻炎免疫组合物可进一步含有支气管败血性博德氏杆菌(B.bronchiseptica)、败血性巴氏杆菌A型菌(PmA)以及败血性巴氏杆菌D型菌(PmD)。
本发明于第四部分中提供一种动物对抗猪萎缩性鼻炎的方法，包含使用有效量的上述免疫组合物以施予动物，以增强该动物对抗猪萎缩性鼻炎的免疫力，进而提升、改善其临床症状、存活率、及增重趋势。
本发明于第五部分中提供一种抗败血性巴氏杆菌D型菌毒素(PMT)的抗体，系藉由本发明所提供的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)所制备或衍生而得；该抗体包括但不限于：单株抗体、多株抗体，以及经基因重组的抗体。
本发明于第六部分中提供一种猪萎缩性鼻炎的检测套组，该检测套组系用以侦测检验样本是否含有败血性巴氏杆菌D型菌毒素(PMT)或侦测检验样本内是否含有抗败血性巴氏杆菌D型菌毒素(PMT)的抗体。
本发明所提供的猪萎缩性鼻炎免疫组合物，与其他习用技术相互比较时，更具有下列的优点：
本发明所提供的猪萎缩性鼻炎免疫组合物含有一败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)。该败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)包含至少一个败血性巴氏杆菌毒素蛋白(PMT)的抗原决定位(epitopes)以及补体裂解片段C3d的部分氨基酸序列。该败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)远比败血性巴氏杆菌毒素蛋白(PMT)的全长氨基酸序列短，在生物表现系统中较容易表达，且重组蛋白的产率较高，可降低制造疫苗的成本。
此外，本发明所提供的猪萎缩性鼻炎免疫组合物所含的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)具有补体裂解片段C3d的部分氨基酸序列，因此可以增加特异性免疫反应，经试验结果显示，本发明所提供的猪萎缩性鼻炎免疫组合物可提高动物对抗猪萎缩性鼻炎的免疫性及效率。
本发明系以下面的实施例予以示范阐明，但本发明不受下述实施例所限制。
附图说明
图1为以酵素连结免疫分析(ELISA)测定抗败血性巴氏杆菌毒素(PMT)抗体力价的结果；第1组为负对照组；第2组为含有实施例二所得的支气管败血性博德氏杆菌、败血性巴氏杆菌A型菌及败血性巴氏杆菌D型的免疫组合物(B.b+PmA+PmD组)；第3组为实施例一所得的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT组)；第4组为含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的猪萎缩性鼻炎免疫组合物(B.b+PmA+PmD+rPMT组)；第5组为市售猪萎缩性鼻炎疫苗(Bayovac组)。符号**代表两组之间具有显著差异(p<0.01)
图2为中和抗体试验分析结果；图2A为以含胎牛血清(FBS)的DMEM培养液培养Vero细胞的细胞形态(负对照组)；图2B为以含4倍最小毒性剂量(MTD)的败血性巴氏杆菌毒素(PMT)处理Vero细胞的细胞形态(正对照组)，可见到细胞呈现典型的结节样；图2C为以免疫含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的猪萎缩性鼻炎免疫组合物(B.b+PmA+PmD+rPMT组)的小鼠血清稀释40倍后与4倍最小毒性剂量(MTD)的败血性巴氏杆菌毒素(PMT)中和后，加入Vero细胞共培养的细胞形态。
图3为以酵素连结免疫分析(ELISA)测定抗败血性巴氏杆菌毒素(PMT)抗体力价的结果；第1组为负对照组；第2组为含有实施例二所得的支气管败血性博德氏杆菌、败血性巴氏杆菌A型菌及败血性巴氏杆菌D型的免疫组合物(B.b+PmA+PmD组)；第3组为含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的猪萎缩性鼻炎免疫组合物(B.b+PmA+PmD+rPMT组)。符号**代表两组之间具有显著差异(p<0.01)。
具体实施方式
本发明提供一种败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)，包含至少一个败血性巴氏杆菌毒素蛋白(PMT)的抗原决定位，以诱导动物产生抗败血性巴氏杆菌毒素蛋白(PMT)的抗体。
于一实施例中，该败血性巴氏杆菌毒素蛋白(PMT)的抗原决定位系分别具有如SEQID NOs:20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41及42所示的氨基酸序列，该败血性巴氏杆菌毒素蛋白(PMT)的抗原决定位可为1至约30个，且各抗原决定位氨基酸序列自蛋白质N端到C端的排列顺序并不限于依照序列辨识号(SEQ IDNO)的顺序排列。
于一较佳实施例中，分别以三段较长的抗原决定位氨基酸序列涵盖部分上述败血性巴氏杆菌毒素蛋白(PMT)的抗原决定位，该三段较长的抗原决定位氨基酸序列系分别如SEQ ID NOs:2、3、4所示。于一实施例中，本发明的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)含有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列所涵盖的抗原决定位。于另一实施例中，该败血性巴氏杆菌毒素蛋白(PMT)含有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列所涵盖的抗原决定位。于另一实施例中，该败血性巴氏杆菌毒素蛋白(PMT)含有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列所涵盖的抗原决定位。于再一实施例中，该败血性巴氏杆菌毒素蛋白(PMT)含有如SEQ ID NOs:2及/或3及/或4所示的氨基酸序列所涵盖的抗原决定位。于一较佳实施例中，本发明的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)含有二个以上该较长的抗原决定位氨基酸序列。此外，各抗原决定位氨基酸序列自蛋白质N端到C端的排列顺序并不限于依照序列辨识号(SEQ ID NO)的顺序排列。
于一较佳实施例中，当该败血性巴氏杆菌毒素蛋白(PMT)的抗原决定位及/或该较长的抗原决定位氨基酸序列为复数个(≥2)时，各败血性巴氏杆菌毒素蛋白(PMT)的抗原决定位及/或该较长的抗原决定位氨基酸序列之间可进一步由连接子(linker)连接，该连接子至少含有一个以上的甘氨酸(Glycine,Gly)，该连接子包含但不限于：Gly-Gly、Gly-Ser、SEQ ID NOs:5、12、13、14、15、16、17、18、19。于一实施例中，该连接子具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。然而，该复数个败血性巴氏杆菌毒素蛋白(PMT)的抗原决定位及/或该复数个较长的抗原决定位氨基酸序列之间，不必然要由连接子所连接。
于一实施例中，本发明所提供的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)进一步含有补体裂解片段C3d的全长或部分氨基酸序列，以增加特异性免疫反应。于一实施例中，该补体裂解片段C3d的全长氨基酸序列为小鼠补体裂解片段C3d的全长序列(mC3d)，具有如SEQID NO:8所示的氨基酸序列。于一较佳实施例中，该补体裂解片段C3d的部分氨基酸序列为小鼠补体裂解片段C3d第211个氨基酸至第238个氨基酸片段序列(mC3d-p28)，具有如SEQID NO:6所示的氨基酸序列。于另一实施例中，该补体裂解片段C3d的全长氨基酸序列为猪补体裂解片段C3d的全长序列(pC3d)，具有如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。于另一较佳实施例中，该补体裂解片段C3d的部分氨基酸序列为猪补体裂解片段C3d第201个氨基酸至第231个氨基酸片段序列(pC3d-p31)，具有如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。本发明所提供的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)具有1至10个单元重复的上述补体裂解片段C3d的全长或部分氨基酸序列，该补体裂解片段C3d的全长或部分氨基酸序列较佳为1至重复10个单元，更佳为重复4至8个单元。
当该补体裂解片段C3d的全长或部分氨基酸序列为数个时，各补体裂解片段C3d的全长或部分氨基酸序列之间可由连接子连接，该连接子至少含有一个以上的甘氨酸(Gly)，该连接子包含但不限于：Gly-Gly、Gly-Ser、SEQ ID NOs:5、12、13、14、15、16、17、18、19。于一实施例中，该连接子的氨基酸序列为Gly-Ser。然而，该复数个补体裂解片段C3d的全长或部分氨基酸序列之间，不必然要由连接子所连接。
本发明的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)，可以由下式所表示：
(A)m-(C3d片段)n； 式(I)
其中每一个A代表一个独立的败血性巴氏杆菌毒素蛋白的抗原决定位，每一个A系各自独立选自于由SEQ ID NOs:2、3、4、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41及42所组成的群组；
其中每一个C3d片段代表一个独立的补体裂解片段C3d的氨基酸序列，每一个C3d片段系各自独立选自于SEQ ID NOs:6、7、8及9所组成的群组；
其中m是代表从1至约30的整数；
其中n是代表从0至约10的整数。
于一实施例中，每一个A之间进一步以一个连接子连接，该每一个连接子系各自独立选自于Gly-Gly、Gly-Ser、SEQ ID NOs:5、12、13、14、15、16、17、18、19。
于一实施例中，每一个C3d片段之间以一个连接子连接，该每一个连接子系各自独立选自于Gly-Gly、Gly-Ser、SEQ ID NOs:5、12、13、14、15、16、17、18、19。
于部分实施态样中，本发明所提供的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)与上述式(I)所表示的氨基酸序列具有至少大约80%序列同源性，较佳者，具有大约85%序列同源性，更佳者，具有大约90%序列同源性，甚至是大约91%、大约92%、大约93%、大约94%、大约95%、大约96%、大约97%、大约98%、大约99%序列同源性。
于一较佳实施例中，本发明所提供的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)具有三个分别如SEQ ID NO:2、3、4所示的氨基酸序列所涵盖的抗原决定位，以及重复6个单元的小鼠补体裂解片段C3d第204个氨基酸至第231个氨基酸片段序列(mC3d-p28)，且各抗原决定位(epitopes)的C端以连接子(序列如SEQ ID NO:5所示)连接，该败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)具有如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
于另一较佳实施例中，该败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)具有三个分别如SEQ ID NO:2、3、4所示的氨基酸序列所涵盖的抗原决定位，以及重复6个单元的猪补体裂解片段C3d第201个氨基酸至第231个氨基酸片段序列(pC3d-p31)，且各抗原决定位(epitopes)的C端以连接子(序列如SEQ ID NO:5所示)连接，该败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)具有如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
本发明并提供一种编码本发明的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)的核苷酸序列。该败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)包含至少一个败血性巴氏杆菌毒素蛋白(PMT)的抗原决定位，以及重复0至10个单元的补体裂解片段C3d的部分氨基酸序列。该编码本发明的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)的核苷酸序列，系由本发明的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)的氨基酸序列衍生而来。将本发明的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)氨基酸序列上的各个氨基酸置换为遗传密码表(genetic code table)所列的编码该氨基酸的核苷酸序列(包含各种简并密码子(degenerate codons，或称同义密码子，synonymous codons))，即可得到本发明所提供的该核苷酸序列。例如，本发明的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)氨基酸序列上的丝胺酸(serine)可由TCT、TCC、TCA、TCG、AGT、AGC等核苷酸序列所编码。本发明的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)氨基酸序列上的各个氨基酸，可由以下各核苷酸序列所编码：
此外，本发明亦提供一种猪萎缩性鼻炎免疫组合物。该猪萎缩性鼻炎免疫组合物含有一败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)。该败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)包含至少一个败血性巴氏杆菌毒素蛋白(PMT)的抗原决定位(epitopes)，以及重复0至10个单元的补体裂解片段C3d的部分氨基酸序列。于一实施例中，该败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)具有如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。于另一实施例中，该败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)具有如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
本发明所提供的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)包含但不限于由基因选殖方式或以胜肽合成仪(peptide synthesizer)合成而得；以基因选殖方式获得该重组蛋白的方式可为，但不限于：将编码败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)的DNA序列选殖到表现载体中，各形成含有编码败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)的核苷酸序列的质体，再将该质体转殖到生物表现宿主中，经蛋白质表现后而得到的抗原蛋白。
该表现载体系统包含但不限于pET载体系统以及pGEX载体系统等；该生物表现系统(宿主)包含但不限于：原核表现系统(如：大肠杆菌(E.coli))、真核表现系统(如：动物细胞(昆虫细胞或哺乳类动物细胞)、植物细胞)。
于一实施例中，本发明所提供的猪萎缩性鼻炎免疫组合物进一步含有支气管败血性博德氏杆菌(B.bronchiseptica)、败血性巴氏杆菌A型菌(PmA)以及败血性巴氏杆菌D型菌(PmD)。于一较佳实施例中，该支气管败血性博德氏杆菌(B.bronchiseptica)、败血性巴氏杆菌A型菌(PmA)以及败血性巴氏杆菌D型菌(PmD)由行政院农业委员会家畜卫生试验所(台湾)分让而来。然而，该支气管败血性博德氏杆菌(B.bronchiseptica)、败血性巴氏杆菌A型菌(PmA)以及败血性巴氏杆菌D型菌(PmD)的来源不限于上述来源，其他来源的菌株亦可搭配本发明的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)，例如，该支气管败血性博德氏杆菌(B.bronchiseptica)亦可为如美国标准生物品收藏中心(American Type CultureCollection,ATCC)编号ATCC31437，该败血性巴氏杆菌A型菌(PmA)亦可为如英国国家标准生物品收藏中心(National Collection ofType Cultures,NCTC)编号NCTC12177，以及该败血性巴氏杆菌D型菌(PmD)亦可为如英国国家标准生物品收藏中心(NCTC)编号NCTC12178等菌株，或源自野外分离所得的菌株。
本发明所提供的猪萎缩性鼻炎免疫组合物可进一步包含其他病原抗原，该病原抗原系选自由下列群组所组成者：猪环状病毒第二型(PCV2)抗原、猪流感病毒(SIV)抗原、猪繁殖与呼吸症候群病毒(PRRSV)抗原、猪霉浆菌(Mycoplasma)、猪小病毒(Parvovirus,PPV)、猪丹毒(Erysipelas)、伪狂犬病(Aujeszky's disease)，以及猪胸膜肺炎放线杆菌(actinobacillus pleuropneumonia，APP)。
另，本发明所提供的猪萎缩性鼻炎免疫组合物可进一步包含一或多种选自于下列药学上可接受的载剂，包括：溶剂、乳化剂、悬浮剂、分解剂、黏结剂、赋形剂、安定剂、螯合剂、稀释剂、胶凝剂、防腐剂、润滑剂、界面活性剂、佐剂、生物型载体等。
该药学上可接受的载剂包含一或多种选自于下列的试剂：溶剂(solvent)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、黏结剂(bindingagent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizing agent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gelling agent)、防腐剂(preservative)、润滑剂(lubricant)、界面活性剂(surfactant)、佐剂(adjuvant)，及其他类似或适用本发明的载剂。
该药学上可接受的赋形剂可为适合于肠外、肠内或滴鼻施用的药学上可接受的有机或无机载体物质，且该赋形剂不会与活性组合物产生有害的反应。适合的赋形剂包含但不限于水、盐类溶液、蔬菜油、聚乙二醇、明胶、直链淀粉、乳糖、硬脂酸镁、滑石、硅酸、黏性石蜡、脂肪酸单甘酯和甘油、脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
该药学上可接受的佐剂包含但不限于水性氢氧化铝胶、明矾、Freund氏不完全佐剂、油质佐剂、水溶性佐剂、或水包油包水双相佐剂(water-in-oil-in-water,W/O/W)；于一实施例中，该佐剂为水性氢氧化铝胶。
进一步地，本发明提供一种动物对抗猪萎缩性鼻炎的方法，包含使用有效量的上述免疫组合物以施予动物，以增强该动物对抗猪萎缩性鼻炎的免疫力，进而提升、改善其临床症状、存活率、及增重趋势。
本发明并提供一种抗败血性巴氏杆菌D型菌毒素(PMT)的抗体，系藉由本发明所提供的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)所制备或衍生而得；该抗体包括但不限于：单株抗体、多株抗体，以及经基因重组的抗体。于一实施例中，该抗体系为经由将本发明所提供的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)施打于一动物体内而得到的多株抗体。本发明并提供一种猪萎缩性鼻炎的检测套组，该检测套组系用以侦测检验样本是否含有败血性巴氏杆菌D型菌毒素(PMT)或侦测检验样本内是否含有抗败血性巴氏杆菌D型菌毒素(PMT)的抗体。该检测套组包含但不限于：(1)一抗原，该抗原系为本发明所提供的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)，于一实施例中，该抗原系置于一抗原盘上；及/或(2)一抗体，该抗体系由该本发明所提供的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)所衍生、制备而得的单株抗体或多株抗体。
该检测套组的形式包含但不限于：酵素连结免疫分析(enzyme-linkedimmuNOsorbent assay,ELISA)套组、微晶片检验套组(Microchip kit)、免疫萤光分析法(immuNO fluorescent assay,IFA)检测套组、或其他藉由该败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)所制得的检测套组。于一实施例中，该检测套组至少包含一含有本发明所提供的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)的抗原盘，可用以检验样本中是否含有抗败血性巴氏杆菌毒素(PMT)的抗体。
于本发明中所使用的单数形式「一」、及「该」包含复数形式，除非文中另有清楚指明者。因此，例如，当提及「一样本」时，包含复数个该等样本及对该领域具有通常技艺者所知的同等物。
本文所使用的「约」、「大约」或「近乎」一词实质上代表所述的数值或范围位于20%以内，较佳为于10%以内，以及更佳者为于5%以内。于本文所提供的数字化的量为近似值，意旨若术语「约」、「大约」或「近乎」没有被使用时亦可被推得。
本说明书中所述的所有技术性及科学术语，除非另外有所定义，皆为该所属领域具有通常技艺者可共同了解的意义。
本发明系以下面的实施例予以示范阐明，但本发明不受下述实施例所限制。
实施例一败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)的构筑
1.败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白1(rPMT1)氨基酸序列的设计
首先以败血性巴氏杆菌毒素蛋白(PMT)全长氨基酸序列(如SEQ ID NO:1所示)为模板，利用抗原决定位(epitopes)预测网站(例如，但不限于BCPred(http:// ailab.cs.iastate.edu/bcpreds/))预测败血性巴氏杆菌毒素蛋白(PMT)的抗原决定位。
Epi预测出的抗原决定位如表1所示(SEQ ID NOs:20–42)，将这些抗原决定位划分为三个区段，分别编号为Epi1、Epi2及Epi3，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:2、3、4所示；Epi1、Epi2及Epi3分别含括了表1所示的各个抗原决定位。
表1败血性巴氏杆菌毒素蛋白(PMT)的抗原决定位预测结果
划分区段 序列 SEQ ID NO.
Epi1 SSDSSDGN 20
Epi1 YSVGKEGAYYPDHDYGPEYNPVWGPNEQI 21
Epi1 FSSSDSSDGNVFHYNSLSES 22
Epi1 GKEGAYYPDHDYGPEYNPVW 23
Epi1 LMNIFVERYFDDWDLLNSLA 24
Epi1 SSSDSSDGNVFHYN 25
Epi1 GKEGAYYPDHDYGP 26
Epi1 VERYFDDWDLLNSL 27
Epi1 YNPVWGPNEQIYHS 28
Epi1 VGKEGAYYPDHDYGPEYNPV 29
Epi2 HSDNSVPPFNNPYK 30
Epi2 LLNSTPGTGRPMP 31
Epi2 TVVDSDGA 32
Epi2 TPGTGRPMPGLVQYLKIPAT 33
Epi2 HSDNSVPPFNNPYKSLYYKG 34
Epi2 LNSTPGTGRPMPGL 35
Epi2 STPGTGRPMPGLVQYLKIPA 36
Epi3 LLNSTPGTGRPMP 31
Epi3 TVVDSDGA 32
Epi3 VASSR 37
Epi3 VLTPPQG 38
划分区段 序列 SEQ ID NO.
Epi3 TPGTGRPMPGLVQYLKIPAT 33
Epi3 TELENWQVLTPPQGKILGLK 39
Epi3 PDVASSRVPIEVTE 40
Epi3 LNSTPGTGRPMPGL 35
Epi3 NWQVLTPPQGKILG 41
Epi3 STPGTGRPMPGLVQYLKIPA 36
Epi3 RVPIEVTELENWQVLTPPQG 42
接着以Epi1、Epi2、Epi3不同组合的氨基酸序列设计败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)。分别在Epi1(SEQ ID NO:2)、Epi2(SEQ ID NO:3)、Epi3(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列C端各加上一段连接子序列，该连接子具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，再由N端至C端依序连接Epi1、Epi2、Epi3；并且在Epi3的连接子序列C端加上六个mC3d-p28分子佐剂(bioadjuvant)序列(SEQ ID NO:6)，每个mC3d-p28分子佐剂序列皆以GS连接子连接；得到的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，并以合成仪合成该氨基酸序列或以基因选殖表现方式进行之。
2.败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白2(rPMT2)氨基酸序列的设计
败血性巴氏杆菌毒素蛋白(PMT)的的抗原决定位(epitopes)的预测如上述。以Epi1、Epi2、Epi3的氨基酸序列设计败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)。分别在Epi1(SEQID NO:2)、Epi2(SEQ ID NO:3)、Epi3(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列C端各加上一段连接子序列，该连接子具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，再由N端至C端依序连接Epi1、Epi2、Epi3；并且在Epi3的连接子序列C端加上六个pC3d-p31分子佐剂(bioadjuvant)序列(如SEQID NO:7所示)，每个pC3d-p31分子佐剂序列皆以GS连接子连接；得到的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白2(rPMT2)氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，并以合成仪合成该氨基酸序列或以基因选殖表现方式进行之。
实施例二支气管败血性博德氏杆菌(Bordetella bronchiseptica)及败血性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)的培养
1.支气管败血性博德氏杆菌(B.bronchiseptica)的培养
于本实施例中，支气管败血性博德氏杆菌(B.bronchiseptica)由行政院农业委员会家畜卫生试验所(台湾)分让而来。
先将该支气管败血性博德氏杆菌(B.bronchiseptica)接种于TSB固体培养基上[含5%(v/v)酵母抽出液(yeast extract)、10%(v/v)血清、大豆分解蛋白质干酪素培养基(tryptic soy broth,TSB，BD公司，美国)]，于37℃下培养隔夜后，挑选单一菌落接种于脑心浸出液(brain heartinfusion,BHI)液体培养基内(BD公司，美国)，于37℃下震荡培养隔夜；接着取菌液再接种于BHI液体培养基内，于37℃下震荡培养隔夜，并计算菌落形成单位(colony forming unit,CFU)值；最后加入甲醛(formaldehyde)，于室温下震荡24至36小时，对菌液进行不活化作用。
2.败血性巴氏杆菌(P.multocida)的培养
于本实施例中，败血性巴氏杆菌A型菌(PmA)及败血性巴氏杆菌D型菌(PmD)由行政院农业委员会家畜卫生试验所(台湾)分让而来，且该败血性巴氏杆菌D型菌(PmD)具有产生毒素能力。
先将败血性巴氏杆菌A型菌(PmA)及败血性巴氏杆菌D型菌(PmD)分别接种于TSB固体培养基上[含5%(v/v)酵母抽出液、10%(v/v)血清、大豆分解蛋白质干酪素培养基(TSB，BD公司，美国)]，于37℃下培养隔夜后，挑选单一菌落接种于脑心浸出液(BHI)液体培养基内(BD公司，美国)，于37℃下震荡培养隔夜；接着取0.1%(v/v)菌液再接种于BHI液体培养基内，于37℃下震荡培养隔夜，并计算菌落形成单位(CFU)值；最后加入甲醛对菌液进行不活化作用。
实施例三含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)的猪萎缩性鼻炎免疫组合物的配制
将实施例一所得到的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)(SEQ ID NO:10或11)(最终浓度为65μg/ml)与实施例二所得到的不活化的支气管败血性博德氏杆菌(B.bronchiseptica)(最终浓度为1x109CFU/ml)、不活化的败血性巴氏杆菌A型菌(PmA)(最终浓度为1x109CFU/ml)及不活化的败血性巴氏杆菌D型菌(PmD)(最终浓度为1x109CFU/ml)以磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution,PBS)混和均匀，并加入铝胶[最终浓度为30%(v/v)]作为佐剂，以配制成为猪萎缩性鼻炎免疫组合物。
实施例四含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)的猪萎缩性鼻炎免疫组合物的免疫原性(immunogenicity)分析–小鼠免疫试验
1.试验小鼠
取26只4周龄健康的BALB/c雄性小鼠(国家实验动物中心，台湾)作为试验动物，所有小鼠的败血性巴氏杆菌毒素蛋白(PMT)、支气管败血性博德氏杆菌(B.bronchiseptica)、败血性巴氏杆菌A型菌(PmA)及败血性巴氏杆菌D型菌(PmD)的酵素结合免疫吸附分析(ELISA)抗体皆呈阴性。
2.免疫计画
将这些小鼠随机分为5组，第1组(负对照组)有6只小鼠，而第2至5组则每组有5只小鼠。每只小鼠分别以腹腔注射(intraperitoneal injection,ip.)注射0.2ml以下物质：
第1组：含30%(v/v)铝胶的PBS缓冲溶液(负对照组)；
第2组：实施例二所得的支气管败血性博德氏杆菌(B.bronchiseptica)(1x109CFU/ml)、败血性巴氏杆菌A型菌(PmA)(1x109CFU/ml)及败血性巴氏杆菌D型菌(PmD)(1x109CFU/ml)的免疫组合物(含30%(v/v)铝胶佐剂)(B.b+PmA+PmD组)；
第3组：实施例一所得的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(序列如SEQ ID NO:10所示，浓度为65μg/ml)(rPMT组)；
第4组：实施例三所得的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT，序列如SEQ IDNO:10所示)的猪萎缩性鼻炎免疫组合物(B.b+PmA+PmD+rPMT组)；以及
第5组：市售猪萎缩性鼻炎疫苗(台湾拜耳公司，台湾)(Bayovac组)。
每只小鼠分别于首次免疫前24小时采血保存，首次免疫后第13天再进行采血，首次免疫后第14天以相同免疫剂量再进行第二次免疫，第二次免疫后第10天采血，并分离血液样本中的血清，以进行毒素抗体的酵素连结免疫分析(Enzyme-linked immunosorbentassay,ELISA)。
3.毒素抗体的酵素连结免疫分析(ELISA)
以商品化的败血性巴氏杆菌毒素(PMT)(Merck公司，美国)作为抗原，并将抗原涂布(coating)于ELISA用96孔盘(Thermo公司，美国)，于4℃下静置16小时。去除多余抗原后加入清洗缓冲液(wash buffer；0.9%NaCl；0.1%Tween20)，清洗3次后倒干。接着加入阻隔缓冲液(blocking buffer；含有1%BSA的wash buffer)，于室温下静置1小时后，以清洗缓冲液清洗，接着将上述各组小鼠采集到的血清样品以PBS缓冲溶液稀释后，每孔加入稀释的小鼠血清，于室温下静置1小时后，去除血清样品，并以清洗缓冲液清洗，然后加入辣根过氧化酵素(Horseradish peroxidase,HRP)标定的山羊抗小鼠的二级抗体(goat anti-mouseconjugatedHRP，Gene Tex公司，美国)，该二级抗体先以阻隔缓冲液稀释5000倍后再加入96孔盘(100μl/孔)，于室温下静置1小时后，去除二级抗体，并以清洗缓冲液清洗后，每孔加入100μl3,3’,5,5’-四甲基联苯胺二盐酸(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine,TMB，KPL公司，美国)溶液避光呈色10分钟，并以酵素连结免疫分析测读仪(M2/M2ELISAReader，Molecular Devices公司，美国)读取波长650nm的吸光值。
酵素连结免疫分析结果如图1所示，免疫含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的猪萎缩性鼻炎免疫组合物的小鼠(第4组，即B.b+PmA+PmD+rPMT组)血清中含有的抗败血性巴氏杆菌毒素(PMT)抗体力价最高，其次为免疫市售猪萎缩性鼻炎疫苗(第5组，即Bayovac组)的小鼠血清；而只免疫实施例一所得的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(第3组，即rPMT组)的小鼠血清中也含有的抗败血性巴氏杆菌毒素(PMT)抗体，且其所含的抗体力价高于免疫实施例二所得的支气管败血性博德氏杆菌、败血性巴氏杆菌A型菌及败血性巴氏杆菌D型菌(第2组，即B.b+PmA+PmD组)的小鼠血清。由此可知，本发明所提供的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)可以在动物体内有效地诱导出抗败血性巴氏杆菌毒素(PMT)抗体，具免疫原性。
4.中和抗体力价试验
以Vero细胞作为试验材料，测试免疫含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的猪萎缩性鼻炎免疫组合物的小鼠(第4组，即B.b+PmA+PmD+rPMT组)血清中所含的抗败血性巴氏杆菌毒素(PMT)抗体，是否为可中和PMT毒性的中和抗体。进行中和抗体力价测试的前，先进行Vero细胞的最小毒性剂量(minimum toxin dose，MTD)测定。
(a)Vero细胞的最小毒性剂量(MTD)测定
将Vero细胞接种于96孔培养盘中，待细胞长成单层后，去除培养液，并加入以不含血清的DMEM培养液(GIBCO公司，美国)连续2倍稀释的PMT处理。以含胎牛血清(FBS)的DMEM培养液作为负对照组，培养后并观察细胞的型态变化，以能诱导Vero细胞产生细胞病变(cytopathic effect，CPE)的最低PMT浓度为最小毒性剂量(MTD)。试验结果显示，Vero细胞的败血性巴氏杆菌毒素(PMT)的最小毒性剂量为60ng。
(b)中和抗体力价试验
中和抗体力价试验方法系参考Liao等人(2006)与Lee等人(2012)所提出的方法并进行适当修饰(Liao,C.M.,Huang,C.,Hsuan,S.L.,Chen,Z.W.,Lee,W.C.,Liu,C.I.,Winton,J.R.,and Chien,M.S.(2006).Immunogenicity and efficacy of threerecombinant subunit Pasteurella multocida toxin vaccines against progressiveatrophic rhinitis in pigs.Vaccine.24,27-35；Lee,J.,Kang,H.E.,and Woo,H.J.(2012).Protective immunity conferred by the C-terminal fragment ofrecombinant Pasteurella multocida toxin.Clin Vaccine Immunol.19,1526-1531.)。首先将免疫含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的猪萎缩性鼻炎免疫组合物的小鼠(第4组，即B.b+PmA+PmD+rPMT组)血清稀释10倍后，再做连续两倍的稀释(2-1～2-6)。于96孔培养盘中，分别加入上述稀释的小鼠血清，并于各孔中加入含4倍最小毒性剂量(MTD)的败血性巴氏杆菌毒素(PMT)，然后置于37℃中反应1小时。接着将上述反应液加入培养于96孔盘的Vero细胞中，于37℃、5%CO2培养箱中培后，并观察该血清是否能够抑制Vero细胞产生细胞病变(CPE)。
结果如图2所示。以含4倍最小毒性剂量(MTD)的败血性巴氏杆菌毒素(PMT)处理Vero细胞作为正对照组，其细胞形态如图2B所示，可见到细胞呈现典型的结节样。相较之下，以含胎牛血清(FBS)的DMEM培养液培养Vero细胞作为负对照组，其细胞形态如图2A所示；而以免疫含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的猪萎缩性鼻炎免疫组合物的小鼠(第4组，即B.b+PmA+PmD+rPMT组)血清稀释40倍后与4倍最小毒性剂量(MTD)的败血性巴氏杆菌毒素(PMT)中和后，加入Vero细胞共培养的细胞形态如图2C所示。图2A与图2C所示的细胞皆未出现如图2B所示的典型的结节样，显示免疫含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的猪萎缩性鼻炎免疫组合物的小鼠(第4组，即B.b+PmA+PmD+rPMT组)血清中含有抗败血性巴氏杆菌毒素(PMT)的中和抗体。
实施例五含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)的猪萎缩性鼻炎免疫组合物的免疫原性及保护效力分析1–台湾猪萎缩性鼻炎菌苗检验标准(巴氏杆菌效力试验)
根据台湾猪萎缩性鼻炎菌苗检验标准，选取败血性巴氏杆菌抗体阴性3周龄BALB/c小鼠(国家实验动物中心，台湾)32只，随机分为3组，第1组为对照组(n=9)，第2组为rPMT免疫试验组(n=12)，第3组为免疫试验组(n=11)；每只小鼠分别以腹腔注射(ip.)注射0.5ml的10倍稀释待测物，各组分别为：
第1组：含30%(v/v)铝胶的PBS缓冲溶液(对照组)；
第2组：实施例三所得的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT，序列如SEQ IDNO:10所示)的猪萎缩性鼻炎免疫组合物(B.b+PmA+PmD+rPMT组)；以及
第3组：市售猪萎缩性鼻炎疫苗(台湾拜耳公司，台湾)(Bayovac组)。
免疫试验组(第2组及第3组)于免疫后第14日各分为3小组，依组序分别以具有生产毒素能力的败血性巴氏杆菌D型菌(PmD)强毒菌株[同实施例二，由行政院农业委员会家畜卫生试验所(台湾)分让而来]1x103CFU/ml、1x104CFU/ml、1x105CFU/ml三种浓度活菌液0.1ml腹腔注射。同时对照组(第1组)12只小鼠亦分为三小组，依组序分别以巴氏杆菌强毒菌株1x102CFU/ml、1x103CFU/ml、1x104CFU/ml三种浓度活菌液0.1ml腹腔注射。观察10天后，各免疫试验组与对照组分别以贝卡二氏法(Beherens-Karber)计算其LD50，且各免疫试验组的防御指数须高于对照组1x100.5以上。贝卡二氏法防御指数计算法如下：
LD50=攻毒剂量的最低稀释倍数-[(各组死亡率的总和/100)-0.5]x1
防御指数=【对照组攻毒剂量的最低稀释倍数-[(各组死亡率的总和/100)-0.5]x1】-【免疫组攻毒剂量的最低稀释倍数-[(各组死亡率的总和/100)-0.5]x1】。
结果如表2所示，含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的猪萎缩性鼻炎免疫组合物(第2组，即B.b+PmA+PmD+rPMT组)确实能诱发小鼠产生保护效力，并耐过败血性巴氏杆菌D型菌(PmD)强毒菌株的攻毒，且其防御指数高达102.06，远高于台湾检验标准(100.5)以及市售猪萎缩性鼻炎疫苗(台湾拜耳公司，台湾)(Bayovac组)的防御指数(101.74)。
表2含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)的猪萎缩性鼻炎免疫组合物的免疫原性及保护效力分析1结果
实施例六含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)的猪萎缩性鼻炎免疫组合物的免疫原性及保护效力分析2
选取败血性巴氏杆菌抗体阴性、体重15～20g的BALB/c小鼠(国家实验动物中心，台湾)65只，随机分为3组，第1组为对照组，共有5只小鼠，第2、3组为免疫试验组，每组30只小鼠。分别将各免疫试验再细分为3小组，每小组10只小鼠；各组小鼠分别以腹腔注射方式注射以下物质：
第1组：每只小鼠注射0.2ml PBS缓冲溶液(对照组)；
第2-1组：每只小鼠注射0.2ml实施例三所得的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT，序列如SEQ ID NO:10所示)的猪萎缩性鼻炎免疫组合物原液(B.b+PmA+PmD+rPMT组)；
第2-2组：每只小鼠注射0.2ml稀释5倍的实施例三所得的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT，序列如SEQ ID NO:10所示)的猪萎缩性鼻炎免疫组合物(1/5B.b+PmA+PmD+rPMT组)；
第2-3组：每只小鼠注射0.2ml稀释25倍的实施例三所得的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT，序列如SEQ ID NO:10所示)的猪萎缩性鼻炎免疫组合物(1/25B.b+PmA+PmD+rPMT组)；
第3-1组：每只小鼠注射0.2ml市售猪萎缩性鼻炎疫苗原液(台湾拜耳公司，台湾)(Bayovac组)；
第3-2组：每只小鼠注射0.2ml稀释5倍的市售猪萎缩性鼻炎疫苗(台湾拜耳公司，台湾)(1/5Bayovac组)；
第3-3组：每只小鼠注射0.2ml稀释25倍的市售猪萎缩性鼻炎疫苗(台湾拜耳公司，台湾)(1/25Bayovac组)。
免疫试验组(第2、3组)于首次免疫后第14日进行二次免疫，剂量同首次免疫；对照组(第1组)小鼠则再次注射0.2ml PBS缓冲溶液；二次免疫后第10天进行攻毒试验，每只小鼠以腹腔注射方式注射0.2ml具有生产毒素能力的败血性巴氏杆菌D型菌(PmD)强毒菌株[同实施例二，由行政院农业委员会家畜卫生试验所(台湾)分让而来]100LD50活菌液，观察10天记录存活率。原液免疫组(第2-1组、第3-1组)存活率须高于80%、5倍稀释免疫组(第2-2组、第3-2组)存活率须高于50%、25倍稀释免疫组(第2-3组、第3-3组)存活率须高于20%，对照组则须全部死亡。
结果如表3所示，含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的猪萎缩性鼻炎免疫组合物(第2-1组、第2-2组、第2-3组)确实能诱发小鼠产生足够的保护效力，免疫原液疫苗的小鼠存活率为90%，符合存活率80%以上的标准，免疫稀释5倍疫苗的小鼠存活率为50%，符合存活率50%以上的标准，免疫稀释25倍疫苗的小鼠存活率为30%，符合存活率20%以上的标准。
表3含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)的猪萎缩性鼻炎免疫组合物的免疫原性及保护效力分析2结果
实施例七含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)的猪萎缩性鼻炎免疫组合物的免疫原性及保护效力分析3–以败血性巴氏杆菌毒素进行攻毒的小鼠试验
1.败血性巴氏杆菌粗萃毒素的制备
先将具有生产毒素能力的败血性巴氏杆菌D型菌(PmD)强毒菌株[同实施例二，由行政院农业委员会家畜卫生试验所(台湾)分让而来]接种于脑心浸出液(BHI)液体培养基内(BD公司，美国)，于37℃下培养隔夜后，取100μl菌液平均涂布于7%血液培养基，于37℃下培养隔夜，以PBS刮洗细菌并置于离心管中，以超音波振荡器(SONOPULS，Bandelin公司，德国)处理以将细菌击碎，再以高速离心机(KUBOTA公司，日本)离心后，取上清液以0.45μm孔径过滤膜(Millipore公司，美国)过滤后，此过滤液即为败血性巴氏杆菌粗萃毒素(crudeextracted PMT)，分装后保存于-20℃备用。
2.败血性巴氏杆菌粗萃毒素对小鼠的半数致死剂量(LD50)试验
取败血性巴氏杆菌抗体阴性3周龄健康的BALB/c小鼠(国家实验动物中心，台湾)76只，随机分为5组；将上述制得的败血性巴氏杆菌粗萃毒素解冻后，依照下列毒素剂量对每组每只小鼠注射0.5ml粗萃毒素：
第1组：1x108CFU/ml萃取的毒素蛋白(n=14)；
第2组：2x108CFU/ml萃取的毒素蛋白(n=8)；
第3组：4x108CFU/ml萃取的毒素蛋白(n=12)；
第4组：6x108CFU/ml萃取的毒素蛋白(n=20)；
第5组：8x108CFU/ml萃取的毒素蛋白(n=22)；
注射粗萃毒素后，观察小鼠10天并纪录死亡数，以计算败血性巴氏杆菌粗萃毒素对小鼠的半数致死剂量(LD50)，LD50是以Calcu-Syn软体(Biosoft公司，英国)计算得出。
结果如表4所示，以上述败血性巴氏杆菌粗萃毒素对小鼠进行攻毒的半数致死剂量(LD50)为2x108CFU/ml。
表4败血性巴氏杆菌粗萃毒素对小鼠的半数致死剂量(LD50)试验结果
3.小鼠免疫及以败血性巴氏杆菌粗萃毒素攻毒试验
取败血性巴氏杆菌抗体阴性3周龄健康的BALB/c小鼠(国家实验动物中心，台湾)24只，随机分为5组；第1组为对照组，第2至5组为免疫试验组；各组每只小鼠分别以腹腔注射(ip.)注射0.2ml的以下物质：
第1组：含30%(v/v)铝胶的PBS缓冲溶液(负对照组)；
第2组：实施例二所得的支气管败血性博德氏杆菌(B.bronchiseptica)(1x109CFU/ml)、败血性巴氏杆菌A型菌(PmA)(1x109CFU/ml)及败血性巴氏杆菌D型菌(PmD)(1x109CFU/ml)的免疫组合物(含30%(v/v)铝胶佐剂)(B.b+PmA+PmD组)；
第3组：实施例三所得的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT1，序列如SEQ IDNO:10所示)的猪萎缩性鼻炎免疫组合物(B.b+PmA+PmD+rPMT1组)；
第4组：实施例三所得的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT2，序列如SEQ IDNO:11所示)的猪萎缩性鼻炎免疫组合物(B.b+PmA+PmD+rPMT2组)；以及
第5组：市售猪萎缩性鼻炎疫苗(台湾拜耳公司，台湾)(Bayovac组)。
每只小鼠分别于首次免疫后第14天以相同免疫剂量再进行第二次免疫，第二次免疫后第10天取上述制得的败血性巴氏杆菌粗萃毒素进行攻毒试验，对每只小鼠注射0.5ml的LD85剂量(即6x108CFU/ml)的败血性巴氏杆菌粗萃毒素，注射粗萃毒素后，观察小鼠10天并纪录死亡数，以计算各组存活率。
结果如表5所示，含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT1或rPMT2)的猪萎缩性鼻炎免疫组合物(即第3组及第4组)确实能诱发小鼠产生保护效力，并耐过败血性巴氏杆菌粗萃毒素的攻毒，且其存活率皆大于负对照组及仅免疫支气管败血性博德氏杆菌(B.bronchiseptica)、败血性巴氏杆菌A型菌(PmA)及败血性巴氏杆菌D型菌(PmD)的免疫组合物。
表5小鼠免疫及以败血性巴氏杆菌粗萃毒素攻毒试验的结果
实施例八含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)的猪萎缩性鼻炎免疫组合物的免疫原性分析–猪只免疫试验
1.试验猪只
自一猪场(宜兰，台湾)随机选3～4周龄健康的哺乳猪30只作为试验猪只。
2.免疫计画
将上述猪只随机分为3组，每组10只猪，每只猪分别于试验开始(第0天首次免疫)与第21天(二次免疫)各进行一次肌肉注射(2ml/只)下列物质：
第1组：含30%(v/v)铝胶的PBS缓冲溶液(负对照组)；
第2组：实施例二所得的支气管败血性博德氏杆菌(B.bronchiseptica)(1x109CFU/ml)、败血性巴氏杆菌A型菌(PmA)(1x109CFU/ml)及败血性巴氏杆菌D型菌(PmD)(1x109CFU/ml)的免疫组合物(含30%(v/v)铝胶佐剂)(B.b+PmA+PmD组)；以及
第3组：实施例三所得的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT，序列如SEQ IDNO:11所示)的猪萎缩性鼻炎免疫组合物(B.b+PmA+PmD+rPMT组)。
每只猪分别于首次免疫前、二次免疫前，以及在二次免疫后第14天采血保存，并且记录体重，并分离血液样本中的血清，以进行毒素抗体的酵素连结免疫分析(ELISA)。
3.酵素连结免疫分析(ELISA)
以败血性巴氏杆菌毒素(PMT)(Merck公司，美国)作为抗原，并将抗原涂布(coating)于ELISA用96孔盘(Thermo公司，美国)，于4℃下静置16小时。去除多余抗原后加入清洗缓冲液(0.9%NaCl；0.1%Tween20)，清洗后倒干。接着加入阻隔缓冲液(含有1%BSA的清洗缓冲液)，于室温下静置1小时后，以清洗缓冲液清洗，接着将上述各组猪采集到的血清样品以PBS缓冲溶液稀释后，每孔加入稀释的猪血清，于室温下静置1小时后，去除血清样品，并以清洗缓冲液清洗，然后加入辣根过氧化酵素(HRP)标定的山羊抗小鼠的二级抗体(Gene Tex公司，美国)，该二级抗体先以阻隔缓冲液稀释1000倍后再加入96孔盘(100μl/孔)，于室温下静置1小时后，去除二级抗体，并以清洗缓冲液清洗6次后，每孔加入100μl3,3’,5,5’-四甲基联苯胺二盐酸(KPL公司，美国)溶液避光呈色10分钟，并以酵素连结免疫分析测读仪(Labsystem multiskan MCC/340Microplate Reader，Labsystem公司，美国)读取波长650nm的吸光值。
酵素连结免疫分析结果如图3所示，在二次免疫后第14天时，免疫含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的猪萎缩性鼻炎免疫组合物的猪只(第3组，即B.b+PmA+PmD+rPMT组)血清中含有的抗败血性巴氏杆菌毒素(PMT)抗体力价最高，且其相较于负对照组猪只与免疫实施例二所得的支气管败血性博德氏杆菌、败血性巴氏杆菌A型菌及败血性巴氏杆菌D型菌的猪只(第2组，即B.b+PmA+PmD组)血清中含有的抗败血性巴氏杆菌毒素(PMT)抗体力价，分别具有显著差异(**,p<0.01)。此外，这三组猪只之间的体重变化并无显著差异(结果未显示)。
由此可知，本发明所提供的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)在动物体内，特别是目标动物猪只体内，可有效地诱导出抗败血性巴氏杆菌毒素(PMT)抗体，而且对猪只的生长无不良影响，具有安全性。
实施例九抗败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)抗体的制备
1.抗败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)的多株抗体
将实施例一所得到的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)与适用的佐剂(如：铝胶)混合后施与动物(如：小鼠、大鼠、猪、山羊、兔)以进行初级免疫，经适当时间间隔后(如：2～3周)，视需要可进第二次免疫。经适当时间间隔后(如：2～3周)，采集免疫动物(如：小鼠、大鼠、猪、山羊、兔)的血清，即制得抗败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)的多株抗体。
其中该抗败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)的多株抗体，可视需要与显色剂或萤光结合。
其中该动物经施予初级免疫及第二次免疫后，可视需要增加免疫次数，以提高抗体力价。
其中施与的动物包含，但不限于：小鼠、大鼠、兔、禽(蛋)、猪、山羊、牛、水产动物。
2.抗败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)的单株抗体
将实施例一所得到的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)与适用的佐剂(如：铝胶)混合后施与动物(如：小鼠、大鼠、猪、山羊、兔)以进行初级免疫，经适当时间间隔后(如：2～3周)，视需要可进第二次免疫。经适当时间间隔后(如：2～3周)，采集免疫动物(如：小鼠)的血清，用以评估适合用以采集脾脏细胞的小鼠。从该适用的小鼠采集脾脏细胞与骨髓瘤细胞(如：FO细胞株、NS细胞株)以PEG(Polyethylene Glycol，如PEG1500)进行细胞融合。从融合细胞中筛选出具分泌能力的融合瘤并单株化后，可得一适合用以产制抗败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)的单株抗体的融合细胞系。
经上述制备所得的抗体，可用于免疫检测试剂、治疗剂、或加入食品、饲料中使食用者具有免疫力等。
上列详细说明系针对本发明的一可行实施例的具体说明，惟该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本案的专利范围中。

Claims (9)

1.一种败血性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)毒素重组蛋白，其特征在于：所述败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白如SEQ ID NO:10或11所示的氨基酸序列。
2.一种编码如权利要求1所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的核苷酸序列。
3.一种猪萎缩性鼻炎免疫组合物，包含如权利要求1所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白以及一药学上可接受的载剂。
4.如权利要求3所述的猪萎缩性鼻炎免疫组合物，其特征在于，该猪萎缩性鼻炎免疫组合物进一步包含一支气管败血性博德氏杆菌(Bordetella bronchiseptica)、一败血性巴氏杆菌A型菌(Pasteurella multocida Type A)以及一败血性巴氏杆菌D型菌(Pasteurella multocida TypeD)。
5.如权利要求4所述的猪萎缩性鼻炎免疫组合物，其特征在于，该猪萎缩性鼻炎免疫组合物进一步包含其他病原抗原，该病原抗原系选自由下列群组所组成者：猪环状病毒第二型(PCV2)抗原、猪流感病毒(SIV)抗原、猪繁殖与呼吸症候群病毒(PRRSV)抗原、猪霉浆菌(Mycoplasma)、猪小病毒(Parvovirus,PPV)、猪丹毒(Erysipelas)、猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumonia，APP)，以及伪狂犬病(Aujeszky's disease)。
6.如权利要求1所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白在制备动物对抗猪萎缩性鼻炎的药物中的应用。
7.一种抗败血性巴氏杆菌D型菌毒素的多克隆抗体，系藉由如权利要求1所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白所制备而得。
8.一种猪萎缩性鼻炎的检测试剂盒，包含一侦测单元，该侦测单元系选自于下列群组所组成中至少一者：一如权利要求1所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白以及一藉由如权利要求1所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白所制备的多克隆抗体。
9.如权利要求8所述的检测试剂盒，其中所述败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白系置于一盘上。
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