CN103007273B - 一种口蹄疫基因工程混合表位疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种口蹄疫病毒混合表位疫苗及其制备方法，该疫苗由四部分组成，由中国型、泛亚、缅甸98三个谱系O型口蹄疫病毒主要中和性抗原表位组成的串联B细胞表位重组蛋白BI，其基因序列为SEQ ID NO：1，氨基酸序列为SEQ ID NO：2；由通用T细胞表位与多个口蹄疫病毒特异性T细胞表位串联组成的T细胞表位重组蛋白TI，其基因序列为SEQ ID NO：3，氨基酸序列为SEQID NO：4；添加Toll样受体3激动剂-聚肌苷酸-聚胞苷酸和/或Toll样受体7/8剂动剂-R848为免疫增强剂；201油佐剂。利用该方法制备的BI与TI混合表位疫苗免疫猪，能够产生同等或优于全病毒灭活疫苗的保护性免疫效果，而且对三个谱系的病毒都具有交叉保护作用，是一种新型的免疫增强型O型口蹄疫基因工程混合表位疫苗。

Description

一种口蹄疫基因工程混合表位疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于兽药技术领域，涉及一种口蹄疫基因工程混合表位疫苗及其制备方法，一种免疫增强型O型口蹄疫基因工程混合表位疫苗及其制备方法。

背景技术

口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease，FMD)是一种严重危害偶蹄动物的病毒性疫病，被世界动物卫生组织(OIE)列为必须通报的烈性传染病，中国将其列为一类动物传染病。该病主要侵染猪、牛、羊等偶蹄动物，传播途径多、传播速度快，曾多次在世界范围发生大流行。

FMD的致病因子是口蹄疫病毒(FMDV)，归属于小RNA病毒科(Picornaviridae)的口蹄疫病毒属(Aphthovirus)。FMDV有七个血清型，分别为O、A、C、Asia 1、SAT1、SAT2、SAT3，每个血清型又可产生很多基因亚型，也因流行区域而分为很多的拓扑型；不同血清型之间无交叉保护反应，同一血清型的不同谱系病毒之间的交叉免疫保护性也有差异，因而经常需要根据流行毒与疫苗毒株的抗原关系分析，来确定用于预防流行毒株的适宜的疫苗毒株。

FMDV核酸分子为单股正链的RNA分子，基因组全长约8500个碱基，只含有一个大的开放阅读框，表达产生的聚蛋白逐级裂解产生病毒的结构蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4)和非结构蛋白(Lab，2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D)，结构蛋白组装产生病毒的衣壳结构，非结构蛋白则参与病毒与宿主的相互作用、抑制宿主细胞的转录翻译机制、参与病毒的复制过程。病毒衣壳蛋白是诱导产生中和抗体的主要免疫原，在结构蛋白上存在多个构象性的与线性的中和表位。

早期通过单克隆抗体与免疫逃逸突变株的序列分析研究表明，在O型FMDV至少存在5个功能独立的中和性抗原表位，组成抗原位点的区段主要包括VP1的G-H环以及其C端氨基酸，VP2的31，70～73，75和77位氨基酸，VP1B-C环的43和44位点氨基酸；VP3的58位氨基酸，VP1149位氨基酸等参与构成五个中和表位。这5个中和表位除了由VP1G-H环构成的位点1为线性表位外，其余均为构象表位。利用合成肽免疫实验动物和牛的试验似乎证明位点1是最优势的抗原表位，但是有的试验结果显示疫苗免疫后针对位点2的抗体应答水平高于位点1；其中针对G-H环位点的免疫显然是最重要的，因为不同血清型病毒，在G-H环附近的变异幅度最大，而且G-H环是病毒结合细胞受体的部位。VP1G-H环也是研制口蹄疫表位肽疫苗的主要基因对象，但是单独合成G-H环研制表位肽疫苗并不能诱导免疫动物产生有效的保护性免疫应答，还需要有T细胞表位的参与才能诱导产生较好的保护性免疫应答。

T细胞表位对于诱导产生更高水平的中和抗体、尽早的清除病毒具有重要的作用，有学者综合分析了不同血清型病毒抗原位点区域的差异，结果显示B-细胞与T-细胞抗原位点区域显示出很明显的血清型特征，已经发现在FMDV的结构蛋白以及非结构蛋白3A与3D上均存在T-细胞表位，有些T-细胞表位在血清型间比较保守，有些在毒株之间差异较大；其中VP4，VP1，3A，3D蛋白中均含有保守的T细胞表位，这些表位可能更易被宿主细胞表达的MHC分子识别，因而在分子疫苗设计中受到更多的关注。

现在使用的口蹄疫疫苗主要为全病毒抗原灭活疫苗，在疫苗的制造过程中需要动用活病毒，因而，需要达到生物安全三级标准的GMP生产车间来防止病毒的扩散。同时、高效疫苗的生产过程中，要对病毒抗原进行浓缩，因而疫苗的生产与制备成本较高。基因工程疫苗的研制与应用，将为解决这些问题提供方法。目前，已经有合成肽疫苗被批准用于猪口蹄疫的免疫预防，美国也核准了口蹄疫病毒基因重组腺病毒活载体疫苗新兽药注册申请，说明未来口蹄疫基因工程疫苗替代传统灭活疫苗将是一种趋势。基因工程疫苗的应用也有助口蹄疫感染动物与疫苗免疫动物的鉴别诊断。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种口蹄疫基因工程混合表位疫苗及其制备方法，利用该方法制备的BI与TI混合表位疫苗免疫猪，能够产生同等或优于全病毒灭活疫苗的保护性免疫效果，而且对三个谱系的病毒都具有交叉保护作用，是一种新型的免疫增强型O型口蹄疫基因工程混合表位疫苗。

其技术方案为：

一种口蹄疫基因工程混合表位疫苗，由四部分组成，由中国型(Cathay)、泛亚、缅甸98三个谱系O型口蹄疫病毒主要中和性抗原表位组成的串联B细胞表位重组蛋白BI，其基因序列为SEQ ID NO：1，氨基酸序列为SEQ ID NO：2；由通用T细胞表位与多个口蹄疫病毒特异性T细胞表位串联组成的T细胞表位重组蛋白TI，其基因序列为SEQ ID NO：3，氨基酸序列为SEQ ID NO：4；添加Toll样受体3激动剂-聚肌苷酸-聚胞苷酸〔Polyinosinic：polycytidylic acid，Poly(I:C)〕和/或Toll样受体7/8剂动剂-R848为免疫增强剂；201油佐剂。

进一步，对于免疫猪，所述疫苗的用量为仔猪1mL，成年猪2mL每头份，耳后部深部肌肉注射。

本发明口蹄疫基因工程混合表位疫苗的制备方法，重组B与T细胞表位免疫原均可通过末端融合的6-组氨酸标签进行亲合层析纯化，纯化的BI、TI免疫原与Poly(I:C)分别按终浓度400，300与300μg/mL配制于磷酸盐缓冲液，然后按体积比1∶1加入201油佐剂进行乳化制备成疫苗。

本发明的有益效果：

猪体免疫试验结果显示，与口蹄疫O型传统灭活疫苗相比单独BI油佐剂疫苗在免疫后产生较高水平的中和抗体，BI免疫原添加Poly(I:C)后中和抗体的水平显著高于未免疫组与灭活疫苗免疫组(P＜0.01)；同时，BI免疫原加入TI与Poly(I:C)后，中和抗体的应答水平更加均匀，个体差异缩小，而且对不同谱系病毒的交叉中和作用也有明显提高((P＜0.05))；再用1000个猪半数感染量(PID50)的O/Mya/98系猪体适应毒攻击后，BI+Poly(I:C)与BI+TI+Poly(I:C)组猪均可完全抵抗强毒攻击，攻毒后10天内无一头猪表现出临床症状；而BI单独免疫组与灭活苗免疫组分别有2头与3头猪表现临床症状；对照组五头猪于攻毒后5天内全部发病。说明BI抗原是一种很好的B细胞免疫原，添加TI和Poly(I:C)能够诱导免疫猪产生保护性的免疫应答，其对猪的免疫保护作用优于灭活疫苗，因而，是一种新型的免疫增强型口蹄疫混合表位疫苗。

附图说明

图1为BI抗原的表达与纯化SDS-PAGE电泳分析图.其中，M为分子质量标准，1为诱导表达产物，2为诱导前对照，3～5显示在洗脱缓冲液D、E和F中的纯化蛋白.；

图2为TI抗原的表达与纯化SDS-PAGE电泳分析图，其中M为分子质量标准，1为为诱导前对照，2与3为诱导表达产物，4与5为在洗脱缓冲液E中的纯化蛋白。

具体实施方式

下面结合附图具体实施例来详细描述本发明的技术方案。

材料与方法

B细胞免疫原BI的设计与表达

根据国内外O型口蹄疫流行病学信息，设计并合成了B细胞免疫原基因BI，所含有的O型口蹄疫病毒中和抗原表位序列如下表1所示，将表1中的氨基酸序列按下列顺序进行排列组合：PADRE-GG-(O/HN/CHA/09)VP1 132-160-GG-VP1 193-211-GG-(O/Tibet/99)VP1132-160-GG-(O/IRN/2010)VP1 193-211-GG-VP1 132-160-GG-(O/Mya98)VP1132-160-GG-VP1 193-211-GG-Invasin-6×His，各表位之间以两个甘氨酸相连，最后加6组氨酸标签序列，有利于表达蛋白的纯化。设计好的序列交由南京GenScript公司进行编码序列的优化与合成，两端分别加入启始密码子与终止密码子，并加入Nco I与Hind III酶切位点，合成的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，其蛋白序列为SEQ ID NO.2：

表1.B细胞免疫原基因BI中的表位序列组成

表位	氨基酸序列	序列说明
			PADRE	AKFVAAWTL AAA	通用T细胞表位(Agadjanyan et al.，2005)
VP1132-160	GSSKYGDTSTNNVRGDLQVLAKKAERALP	O/HN/CHA/09毒株的G-H环(中国拓扑型)a
			VP1193-211	AIQPSTARHKQKIVAPAKQ	O/HN/CHA/09毒株的C-末端(中国拓扑型)
VP1132-160	GNCKYGESPVTNVRGDLQVLAQKAARTLP	O/Tibet/99的G-H环(泛亚拓扑型)
			VP1193-211	AIHPNEARHKQKIVAPVKQ	O/IRN/2010C-末端(泛亚2拓扑型)
VP1132-160	GDCKYGESRTTNVRGDLQVLAQKAATTLP	G-H loop of O/IRN/2010(泛亚2拓扑型)
			VP1132-160	GNCKYAGGSLTNVRGDLQVLDQKAARPLP	G-H loop of O/Mya/98(东南亚拓扑型)c
VP1193-211	AVHPSAARHKQKIVAPVKQ	C-terminal of O/Mya/98(东南亚拓扑型)c
			Invasin	TAKSKKFPSYTATYQF	通用T cell表位(Wang et al，2002)

^aO/HN/CHA/09为新分离的O型中国拓扑型FMDV；^bO/HN/CHA/93是中国拓扑型的疫苗毒株；^cO/Mya/98是东南亚(SEA)拓扑型的O型FMDV.

合成后的核苷酸序列插入pUC57载体进行保存。利用基因序列两端的Nco I与Hind III酶切位点切取目的基因片段亚克隆入PET28A载体中，将此重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，将鉴定阳性的重组菌在卡拉霉素抗性的LB液体培养基中培养过夜，然后按1％转接到含0.05mg/mL卡拉霉素的LB培养基中，37℃培养至对数生长期(OD600＝0.6)，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃振荡培养5h后，取表达产物1mL进行SDS-PAGE分析。结果，表达的BI蛋白大小介于20～29kD之间，与预期的23.7kD大小接近，如图1所示。

T细胞免疫原的设计与表达

TI抗原的设计与表达见赵清文章所述(赵清，孙普，刘在新，李平花，包慧芳，曹轶梅，白兴文，付元芳，卢曾军，李冬.一种新型T细胞免疫原的原核表达及对口蹄疫疫苗的免疫增强作用.中国生物工程学报，2011，27：1281-1291)，TI抗原基因的核苷酸序列为SEQ IDNO.3，其蛋白序列为SEQ ID NO.4：

表达的TI融合蛋白的分子质量大小预期为21.0kD。

抗原纯化与定量

BI与TI抗原表达后均形成包涵体，将正确表达目的蛋白的阳性重组菌进行大量培养并诱导表达目的蛋白，先纯化并裂解包涵体，然后应用镍离子亲和层析柱进行纯化，纯化方法按照Resins操作说明书进行。纯化产物进行SDS-PAGE分析，BI纯化结果如图1所示，TI表达与纯化SDS-PAGE结果如图2所示。

抗原制备与猪体免疫试验

采用蛋白质定量试剂盒测定纯化蛋白的浓度，纯化蛋白的浓度均稀释或浓缩至800μg/mL进行疫苗配制。按下表2取一定量的纯化蛋白与免疫增强剂混合，加入等体积201油佐剂，用乳化机搅拌完全乳化而制成油佐剂疫苗。

表2疫苗配制与猪免疫分组

组别	疫苗	动物数	组份	佐剂
					G1	B6	5	400μg/mL	1mL 201
G2	B6+Poly(I:C)	5	400+300μg/mL	1mL 201
					G3	B6+T+Poly(I:C)	5	400+300+300μg/mL	1mL 201
G4	灭活疫苗	5	1ml病毒灭活抗原	1mL 206
					G5	PBS缓冲液	3	1ml PBS	1mL 201

猪体免疫试验：筛选无口蹄疫病毒抗体的健康非免疫大白猪猪25头，体重约30kg，按表2随机分为5组并进行免疫，免疫剂量为2mL/头，耳后部肌肉注射。免疫前与免疫后每周采血1次，分离血清检测口蹄疫中和抗体应答与细胞免疫状况。免疫28天后进行攻毒，攻毒毒种为O/Mya/98强毒，适应于猪体，并测定了猪体半数感染量(PID50)；攻毒剂量为1000PID50，攻毒剂量与方法均与传统灭活疫苗效力检验剂量相同。攻毒后每天观察猪发病情况，记录体温变化，以及蹄、鼻与口腔内是否出现口蹄疫临床症状。

结果

BI与TI蛋白的表达与纯化

结果分别见图1与图2所示，由图可见成功表达并纯化获得了BI与TI抗原，纯化蛋白的纯度均均可达90％以上，达到了制备疫苗的要求。

免疫猪攻毒保护结果

五组猪于免疫后28天进行攻毒，攻毒剂量为1000PID50。攻毒后逐日观察记录发病情况，结果显示，PBS对照组猪最早于攻毒后第2天表现临床症状，至第3天时5头猪已全部发病；灭活苗免疫组于第3天有2头猪发病，至第7天时有1头发病；BI表位单独免疫组于第5天有2头猪发病，但均只有蹄出现水泡症状，到10天时其余3头猪均未出现临床症状；BI+Poly(I:C)与BI+TI+Poly(I:C)免疫组均未出现临床症状，全部获得保护。

免疫猪口蹄疫病毒ELISA抗体测定结果

采用O型口蹄疫液相阻断ELISA(LPB-ELISA)方法检测免疫后7～28天和攻毒后10天采集的血清样本，从表3可以看出第1～4组，免疫后O型抗体水平逐渐上升，28天的抗体水平为最高；而攻毒后10天，发病猪的LPB-ELISA抗体均有显著升高，而未发病猪的抗体水平仅略有升高。PBS对照组猪的攻毒前均未检测抗体应答，攻毒后10天抗体水平达到最高检测限。

采用3ABC间接ELISA检测口蹄疫病毒的非结构蛋白抗体，结果显示攻毒前(免疫后28天)采集的血清样本，除第3组均为阳性之外，其余攻毒前血清样本均为阴性；这是由于第3组猪疫苗中添加了TI抗原，TI抗原中含有3A蛋白中的T表位，故免疫后产生针对该T表位的抗体，利用大肠杆菌表达的3ABC蛋白检测时，造成反应为阳性。攻毒后发病的10头猪中，除1头3ABC抗体为阴性之外，其余9头均为阳性，未发病猪于攻毒后10天非结构蛋白3ABC抗体应答均为阴性，进一步说明，病毒在体内有复制。

采用检测3B抗体的间接ELISA方法检测显示所有猪于免疫后第28内非结构蛋白抗体均为阴性，而且所有未发病猪的3B抗体也为阴性，进一步说明第3组猪于免疫后28天与攻毒后10检测3ABC抗体阳性为TI抗原中所带的3A表位所致，而不是由于攻毒后病毒感染所致。

表3.LPB-ELISA与3ABC-ELISA抗体与临床症状检测记录结果

^aO型LPB-ELISA抗体水平用log10对数值表示；

^b3ABC抗体测定采用3ABC间接ELISA方法；

^c3B抗体测定采用3B间接ELISA方法；

^c根据出现病损的蹄数进行打分，评价病损严重程度，最高病损打分为4分。针对不同谱系病毒的交叉中和试验结果

采用微量细胞中和试验测定免疫猪与对照猪免疫28天与攻毒后10天对O型口蹄疫病毒三个不同谱系毒株的交叉中和抗体水平，结果显示，一次免疫后28天1～3组均产生了中和抗体，对O型缅甸98系(O/Mya/98)的中和抗体水平较泛亚系(O/CHA/99)与中国型高(O/HN/09)，而且产生的中和抗体水平较灭活疫苗免疫组高，而PBS对照组未产生中和抗体(均＜0.6)；攻毒后10天，所有发病猪的中和抗体水平均达到较高水平；而未发病猪的中和抗体水平升高有限，有个别未发病猪甚至一直未检测到中和抗体(表4)，说明猪体中和抗体水平与免疫保护并不一定有对应关系，说明针对口蹄疫的特异性细胞免疫对于免疫猪的保护性免疫具有重要的作用。

表4.针对不同谱系病毒的交叉中和抗体检测结果(log10)

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (1)

1.一种口蹄疫基因工程混合表位疫苗，其特征在于，由四部分组成，由中国型(Cathay)、泛亚、缅甸98三个谱系O型口蹄疫病毒主要中和性抗原表位组成的串联B细胞表位重组蛋白BI，其基因序列为SEQ ID NO：1，氨基酸序列为SEQ ID NO：2；由通用T细胞表位与多个口蹄疫病毒特异性T细胞表位串联组成的T细胞表位重组蛋白TI，其基因序列为SEQ ID NO：3，氨基酸序列为SEQ ID NO：4；添加Toll样受体3激动剂-聚肌苷酸-聚胞苷酸和/或Toll样受体7/8剂动剂-R848为免疫增强剂；201油佐剂；

对于免疫猪，所述疫苗的用量为仔猪1mL，成年猪2mL每头份，耳后部深部肌肉注射；

所述口蹄疫基因工程混合表位疫苗的制备方法，重组B与T细胞表位免疫原均可通过末端融合的6-组氨酸标签进行亲合层析纯化，纯化的BI、TI免疫原与Poly(I∶C)分别按终浓度400，300与300μg/mL配制于磷酸盐缓冲液，然后按体积比1∶1加入201油佐剂进行乳化制备成疫苗；

B细胞免疫原BI的设计与表达

根据国内外O型口蹄疫流行病学信息，设计并合成了B细胞免疫原基因BI，所含有的O型口蹄疫病毒中和抗原表位序列如下表1所示，将表1中的氨基酸序列按下列顺序进行排列组合：PADRE-GG-(O/HN/CHA/09)VP1132-160-GG-VP1193-211-GG-(O/Tibet/99)VP1132-160-GG-(O/IRN/2010)VP1193-211-GG-VP1132-160-GG-(O/Mya98)VP1132-160-GG-VP1193-211-GG-Invasin-6×His，各表位之间以两个甘氨酸相连，最后加6组氨酸标签序列，有利于表达蛋白的纯化，设计好的序列交由南京GenScript公司进行编码序列的优化与合成，两端分别加入启始密码子与终止密码子，并加入Nco I与Hind III酶切位点，合成的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，其蛋白序列为SEQ ID NO.2。