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CN103874763A - 从胎儿组织制备亲代细胞库 - Google Patents

从胎儿组织制备亲代细胞库 Download PDF

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CN103874763A
CN103874763A CN201280034452.0A CN201280034452A CN103874763A CN 103874763 A CN103874763 A CN 103874763A CN 201280034452 A CN201280034452 A CN 201280034452A CN 103874763 A CN103874763 A CN 103874763A
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L·A·劳伦-阿普尔盖特
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Original Assignee
CT HOSPITALIER UNIVERSITAIRE VAUDOIS (CHUV)
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Abstract

本发明涉及在体外从由胎儿骺组织、胎儿跟腱组织和胎儿皮肤组织组成的胎儿组织制备亲代细胞库（PCB）的方法，所述方法使用快速机械原代细胞培养选择要用于伤口和组织修复方法的细胞类型。

Description

从胎儿组织制备亲代细胞库
技术领域
本发明涉及在体外从由胎儿骺组织、胎儿跟腱组织和胎儿皮肤组织组成的胎儿组织制备亲代细胞库（PCB）的方法，所述方法使用快速机械原代细胞培养选择要用于伤口和组织修复方法的细胞类型。
背景技术
细胞疗法正成为令人感兴趣的用于修复、恢复或改善组织功能的医学疗法的附加方法，尤其是与传统的外科技术结合。一些细胞选择在患者中更适合细胞疗法。可用每种最终细胞类型的优点和缺点评估来自所有发育年龄的动物和人的组织选择。目前基于人细胞的疗法的限制因素与如下方面的技术局限有关：细胞增殖能力（简单培养条件下）、维持原代人细胞培养物的分化表型、传染病的传播以及取决于其分离步骤的所选择的细胞群的一致性和稳定性。培养的来自一次器官捐献的原代胎儿细胞满足了开发治疗产品的迫切且严格的技术方面。来自一个胎儿器官捐献的原始细胞库和工作细胞库可在短时间内形成并且可在建立细胞库的所有阶段进行安全性测试。
细胞疗法已经被提议作为外科操作和特定组织的组织工程的侵入性较小的替代方案或联合疗法。已经研究发现若干种细胞类型可用于细胞疗法：胚胎干细胞（ES）、脐带细胞、胎儿细胞和成体干细胞（来自骨髓-造血干细胞或HSC和骨髓干细胞或MSC）以及脂肪组织细胞、血小板细胞、胎盘细胞和羊水细胞。对于在组织工程中的任何应用而言，细胞源和细胞类型是基本方面。对于有各种优缺点的具体疗法，每种细胞类型需要不同的方法来操纵其分化和自我更新能力。
对胎儿细胞的重要性（尤其是在开发必需疫苗中）没有许多公共知识的情况下，胎儿细胞已经广泛地在生物学和药学中使用了很多年。胎儿细胞是具有高的扩增（expansion）、再生和低免疫原性性质的分化的细胞。它们可以从发育9周后的胚胎期后的胎儿组织分离。胎儿皮肤细胞为有效且安全的细胞疗法和组织工程提供了理想的解决办法，几个理由包括：a)来自一次器官捐献的细胞扩增能力；b）最小的细胞生长需求；c）对用于递送的生物材料的适应；和d）对氧化性应激的抗性。胎儿皮肤细胞具有大量扩增的可能性，因为其仅需要一次器官捐献（1-4cm2组织）即可生成足够的冷冻细胞用以产生能够进行数十万次治疗的库（即，对于皮肤来说，可从一个专用的细胞库产生超过350亿个9×12cm胎儿皮肤结构体）。同样，与干细胞或间充质细胞类型相比，细胞培养要求最低。因为胎儿皮肤细胞是已经分化的并且不需要进行定向或改变，所以细胞培养和扩增不需要通常所必需的大量的额外生长因子。对于建立细胞库，为了避免可传播的病毒性、真菌性或细菌性疾病而对供体进行精心筛选并对供体及培养的细胞进行广泛的筛选，使得可安全且可靠地利用胎儿细胞以用于治疗用途。另外，不像新生儿的、幼小的或成体的细胞，胎儿细胞尤其良好地适应于能够有效且简单地递送至患者的生物材料。已经表明，来自供体（新生儿至成体）的细胞不能够有效地整合至多种生物材料中，并且一些生物材料事实上对所述细胞是毒性的。的确，支架对于组织工程来说是非常重要的，但是细胞类型是最可能的限制性因素。对于处理用于临床递送的终产物来说，所述终产物的同源分布和快速形成是主要的显著优点。对于自体移植或目前的可市购产品来说，当需要长的培养期时，存在不可忽视的污染风险增加。同样重要的是拥有一致且容易重复的方法。通过用胎儿细胞形成一致的细胞库，可消除多种风险因素以为患者带来安全且有效的基于人细胞的疗法。
对于基于细胞的产品，建议的关键要素包括同一性、纯度、无菌性、安全性和有效性。总之，新的条例对要用于临床试验和治疗的基于细胞的产品的产生和用于产生其的环境提出了严格的标准。目前基于人细胞的疗法的限制因素与如下方面的技术局限有关：细胞增殖能力（在简单培养条件下）、维持原代人细胞培养的分化表型、传染病的传播以及取决于其分离步骤的所选择的细胞群的一致性和稳定性。培养的来自一次器官捐献的原代胎儿细胞符合开发治疗产品的迫切且严格的技术方面。来自一个胎儿器官捐献的原始和工作细胞库可在短时间内形成并且可在建立细胞库的所有阶段进行安全性测试。对于治疗用途来说，在体外扩增（out-scaling）的过程中可以使用胎儿细胞直到其寿命的三分之二，并且可确保若干生物学特性的一致性，包括蛋白质浓度、基因表达和生物活性。
涉及胎儿细胞收集、培养扩增和保存的对胎儿细胞的相对简单的操作已经使胎儿细胞成为细胞疗法的一种有吸引力的选择。与ES细胞不同，胎儿细胞不形成肿瘤并且似乎在移植时没有免疫原性。与目前的间充质干细胞相比，胎儿细胞不需要用于生长的饲养层或用于分化的特定的生长因子。一次器官捐献能够产生可用于数十万次患者治疗的一致的原始细胞库（MCB）。与其中完成血清学和病理学分析的原始器官捐献平行，可以容易地对完全明确的一致细胞库评估涉及任何可能的病毒和病原体的安全性。
来自可形成特定细胞源（包括软骨细胞（软骨-祖细胞）、皮肤成纤维细胞祖细胞和腱祖细胞）的特定组织例如软骨、腱和皮肤的胎儿分化细胞的原代培养物决定了所形成的临床细胞库的质量。公认的是，对所述组织的最初处理对于此后产生的细胞的生理特性非常重要。原代培养的常规现有技术是酶消化小块组织以释放所有活细胞用于细胞培养。这尤其用于“硬的”组织，但是也用于软组织，其中常规使用多个消化步骤。这样做，释放了完全不同的细胞群，并将其培养在原代细胞培养物和次代细胞培养物中（Carrascosa A,Audi L,Ballabriga A PediatricResearch19:720-727,1985；Roche S et al,Biomaterials22:9-18,2001；Bae H.et al.,The Spine Journal Vol.8,No.5,92S-93S页,2008；Reginato A.M.et al.,Arthritis and Rheumatism,Vol.37,No.9,1994）。
然而，还已知的是，酶处理会引起不一致性，形成具有不同形态、生理特性、稳定性和功能的细胞群（Diaz-Romero J,Gaillard J-P,Grogan P,Nesic,Trub T,Varlet P-M J Cellular Physiol202:731-742,2005）。
关节软骨无血管、无神经和无淋巴的性质已经使得修复这样的组织成为了对外科医生和组织工程师的挑战。骨软骨治疗策略（尤其是细胞源的选择仍为核心且有争议的问题）的黄金标准还没有确定。目前，成体间充质间质细胞（MSC）是最常用的细胞源，尽管存在对表型同质性、可靠性和稳定性的担忧。
需要改进骨软骨缺陷的治疗，因为目前没有令人满意的治疗方案。尤其关键的是开发新方案来避免软骨的过早退化以避免全关节置换。新细胞辅助外科技术的开发是基于可以满足严格的治疗剂制备要求的确定细胞库产品。
因此，仍然需要开发用于产生新组织，例如腱、软骨、其他肌肉骨骼组织和皮肤的方法，以用于治疗策略。更具体地，需要开发可提供更稳定和一致的细胞群的细胞库，并需要找到不具有触发免疫反应的风险且不携带任何传染原的合适细胞源。
发明内容
为了解决上述问题，申请人已经建立了一种机械且快速地释放早期贴壁细胞群的非酶方法，所述早期贴壁细胞群限定亲代细胞库（PCB）建立的特征。在一些实施方案中，所述原代的分化细胞来自特定的软骨组织、特定的腱组织和特定的皮肤组织。对于本领域技术人员来说，其他实施方案可以包括来自皮肤和肌肉骨骼组织例如腱、骨、肌肉和椎间盘的原代分化细胞。所述PCB的形成使得能够实现一致且稳定的进一步的细胞库建立。
具体的，在一个实施方案中，本发明提供了一种用于分离、扩增和形成胎儿细胞的体外非酶方法，所述胎儿细胞选自胎儿骺软骨细胞、胎儿跟腱细胞或胎儿皮肤成纤维细胞（fibroblst），所述方法包括以下步骤：
a)使用胎儿样品，所述胎儿样品选自包含胎儿骺软骨细胞的尺骨胎儿软骨；包含胎儿跟腱细胞的胎儿跟腱；或包含胎儿皮肤成纤维细胞的胎儿腹部皮肤；
b)通过机械附着到解剖刀刻痕面（scored surface）来微切割和分散所述尺骨胎儿软骨、胎儿跟腱或胎儿腹部皮肤样品；
c)在其中所述胎儿骺软骨细胞、胎儿跟腱细胞或胎儿腹部皮肤成纤维细胞增殖的条件下，体外培养所述尺骨胎儿软骨、胎儿跟腱或胎儿腹部皮肤样品，
d)从中选择和分离最初的贴壁胎儿骺软骨细胞细胞群、最初的贴壁胎儿跟腱细胞细胞群和最初的贴壁胎儿皮肤成纤维细胞群。
在另一个实施方案中，本发明提供了通过本发明的非酶方法获得的胎儿细胞，例如命名为FE002-Cart并以登录号ECACC12070303-FE002-Cart保藏的胎儿骺软骨细胞细胞系、命名为FE002-Ten并以登录号ECACC12070302-FE002-Ten保藏的胎儿跟腱细胞细胞系和命名为FE002-SK2并以登录号ECACC12070301-SK2保藏的胎儿皮肤成纤维细胞细胞系。
在另一个实施方案中，本发明提供了通过本发明的方法获得的胎儿细胞用于通过使用整合至各种基质中的分化的软骨细胞、腱细胞或皮肤细胞，产生新软骨组织和/或三维结构体、新腱组织和/或三维结构体、新皮肤组织和/或三维结构体。
在另一个实施方案中，本发明提供了通过本发明的方法获得的胎儿细胞用作治疗剂。
在另一个实施方案中，本发明提供了通过本发明的方法获得的胎儿细胞用于修复和再生骨软骨组织和肌肉骨骼组织的方法中、用于修复和再生腱组织和肌肉骨骼组织的方法中，以及用于修复和再生皮肤组织以及治疗烧伤、创伤和纤维化病症的方法中。
在另一个实施方案中，本发明提供了通过本发明的方法获得的胎儿细胞用于治疗骨软骨疾病或缺陷、关节炎和肌肉骨骼疾病的方法中；用于治疗肌肉骨骼疾病和腱疾病的方法中；用于治疗皮肤疾病的方法中。
在本发明的又一个实施方案中提供了一种用于开发用于治疗关节缺陷、治疗骨软骨缺陷、软骨修复、腱修复、肌肉骨骼组织修复和皮肤修复的治疗剂和/或医疗装置的筛选方法，所述方法包括使用通过本发明的非酶方法获得的胎儿骺软骨细胞（FEC）、胎儿跟腱细胞或胎儿皮肤成纤维细胞。
附图说明
图1示出了用于开始胎儿皮肤祖细胞的亲代细胞库产生的组织活组织检查以及在第4天的显示出一致性的细胞选择。
图2示出了胎儿皮肤祖细胞在低密度接种（约2000个细胞/cm2）后的细胞生长，以及在第6天和第12天的冷冻细胞贮液的复苏，其显示出高的稳定性、一致性和保持的功能。
图3示出了在酶消化组织以制备亲代细胞库时细胞群筛选的形态和生长差异，以及细胞群的非一致性。
图4示出了用于开始胎儿腱祖细胞（胎儿跟腱细胞）的亲代细胞库产生的组织活组织检查以及在第4天的显示出一致性的细胞选择。
图5示出了胎儿腱祖细胞在低密度接种（约2000个细胞/cm2）后的细胞生长，以及在第0、3、7和10天的冷冻细胞贮液的复苏，其显示出高的稳定性、一致性和保持的功能。
图6示出了胎儿腱祖细胞的FACS分析和3D基质沉积特性。
图7示出了为了开始胎儿软骨-祖细胞（胎儿骺软骨细胞）的亲代细胞库产生而对近端尺骨骺组织进行的处理，以及在第6天进行细胞选择，其显示出一致性。
图8示出了胎儿软骨-祖细胞（胎儿骺软骨细胞）在低密度接种（约2000个细胞/cm2）后的细胞生长，以及在第6天和第12天进行的冷冻细胞贮液的复苏，其显示出高的稳定性、一致性和保持的功能。
图9示出胎儿软骨-祖细胞（胎儿骺软骨细胞）的FACS分析和3D基质沉积特性。
图10示出了胎儿细胞祖细胞在组织培养塑料板上沿着板上（plated）的机械刻痕扩增。
图11示出了使用非酶的组织制备方法快速形成临床亲代细胞库。
具体实施方式
尽管与本文所述的方法和材料类似或等价的方法和材料可用于实施或测试本发明，下文仍然描述了合适的材料和方法。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都以引用的方式全文纳入本文。提供本文论述的出版物和申请仅由于其公开在本申请提交日之前。本文任何内容都不应理解为承认本发明不能凭借先前的发明而早于这些出版物。另外，所述材料、方法和实例仅仅是示例的而并非意欲进行限制。
在有冲突的情况下，以本说明书（包括定义）为准。除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语的含义都与本文主题所属领域的技术人员通常理解的含义相同。给出本文使用的以下定义以帮助理解本发明。
本文使用的“一个”意指“至少一个”或“一个或多个”。
术语“包含”通常以包括的意思使用，也就是说，允许一个或多个特征或组分的存在。
术语“生物材料”意指天然的或合成的材料，包括与细胞或生物组织接触时没有有害作用的金属、陶瓷和聚合物。通常，生物材料支持物选自聚合支持物——包括烯烃聚合物、氟聚合物、聚苯乙烯、聚丙烯酸聚合物、聚酯聚合物、聚氨酯聚合物、硅聚合物、纤维素聚合物、环氧聚合物、基于硅酮的聚合物、合成水凝胶、聚碳酸酯；生物相容的金属支持物——包括钛和钛合金、镍、氧化锆、不锈钢和钴铬、氧化铝-氧化锆复合材料；和/或生物相容的陶瓷——包括瓷、羟基磷灰石以及其混合物。
术语“胎儿软骨细胞或软骨-祖细胞”、“胎儿跟腱细胞或胎儿腱祖细胞”或“胎儿成纤维细胞或胎儿皮肤祖细胞”意指与未分化的胎儿细胞相比的分化细胞。与本发明相反，术语“未分化的”用于描述未成熟细胞或原始细胞。例如，未分化的胎儿皮肤细胞包括可分化为真皮成纤维细胞和表皮角化细胞或甚至其他无关组织的特定细胞类型的那些胎儿皮肤细胞。分化细胞是当置于另一种细胞类型特异性的分化培养基中或置于不同的微环境中时不会去分化成为不同细胞谱系的那些细胞。例如，如果将胎儿皮肤成纤维细胞置于成骨分化培养基中，那么它们不会变成整个成骨细胞群，或者如果将它们置于脂肪形成培养基中，它们不会变成整个脂肪细胞群，如果将同样的细胞置于与骨连接的3D基质中，其不会因为环境的改变而去分化成为整个的成骨细胞群。于是这些确定的分化细胞因为其可能用作用于人和兽医的药物的治疗剂而具有显著的优点。
术语“适当的培养条件”或“其中胎儿骺软骨细胞或软骨-祖细胞、胎儿腱祖细胞或胎儿皮肤祖细胞增殖的条件”是含可促进增殖的营养物的用于培养细胞的培养基。所述营养培养基可以以适当的组合和适当的浓度含有如下的任一种：等渗盐水、缓冲液、氨基酸、血清或血清替代物以及其他外源添加的因子。本领域技术人员会认识到，可使用任何常规使用的培养条件。选择最适当的培养基的方法、培养基制备和细胞培养技术是本领域熟知的并描述于多种来源，包括Doyle et al.,(eds.),1995,Cell&Tissue Culture:Laboratory Procedures,John Wiley&Sons,Chichester；和Ho and Wang(eds.),1991,Animal Cell Bioreactors,Butterworth-Heinemann,Boston，它们以引用的方式纳入本文。例如，可使用任何适当类型的培养基来分离本发明的胎儿骺软骨细胞，例如，但不限于，DMEM、McCoys5A培养基（Gibco）、Eagle's基础培养基、CMRL培养基、Glasgow基本培养基、Ham's F-12培养基、Iscove's改良Dulbecco's培养基、Liebovitz'L-15培养基和RPMI1640、无血清培养基等。所述培养基可补充有一种或多种组分，包括例如胎牛血清（FBS）、确定的生长因子的血清替代物、马血清（ES）、人血清（HS）、确定的细胞培养生长因子和一种或多种抗生素和/或抗真菌药以控制微生物污染，例如单独或组合使用的青霉素G、硫酸链菌素、两性霉素B和艮他霉素和制霉菌素，等等。
术语“细胞系”是指永久建立的细胞培养物，当给予合适的新鲜培养基和充足的空间时其会无限地增殖。术语原代细胞系是指传代数有限的建立的细胞培养物。
术语“细胞库”是指从供体胎儿组织例如尺骨胎儿软骨、胎儿跟腱或胎儿皮肤收获活组织检查物；在适当的培养条件下培养所述胎儿组织并使胎儿细胞增殖至高浓度；对所述组织和所得培养物的细胞使用酶或非酶处理（即，胰蛋白酶）以使其悬浮；合并所悬浮的细胞以制备大体均匀的来自所述培养物的细胞悬浮液；轻柔地与冷冻保护剂混合；将所述细胞悬浮液的小份密封在安瓿中；并冷冻所述小份。可凭经验确定冷冻的最佳速率。例如，通过以1℃/分钟降低所述安瓿的温度直至-80℃，然后约24小时后转移至-160℃，或者在自动的校准的Nano冰箱的编程的循环中全循环冷却至-165℃。该超低温库保存所述细胞使得它们停止老化，从而容许它们保留它们被收集那天所具有的功能和活性。
本发明的冷冻保存的细胞构成了细胞库（1-107/ml），所述细胞库的一些部分可通过解冻来“提取（withdrawn）”，然后根据需要用于产生新软骨细胞和组织。通常，解冻应该快速进行，例如通过将安瓿从液氮转移至37℃水浴。应将所述安瓿中已解冻的内含物在无菌条件下立即转移到含有适当培养基例如含有10%FBS的DMEM的培养瓶中。将所述培养基中的细胞调至初始密度为约1-6×103-4个细胞/ml是可取的。一旦进行培养，就可以每日检查所述细胞，例如，用倒置显微镜检测细胞增殖，并在它们达到适当的密度时尽可能快地进行继代培养或者用扫描显微镜实时监控以进行质量控制。
可以按照需要从所述库中提取本发明的细胞，并在体外使用用于产生新软骨、腱或皮肤组织或者细胞，例如作为三维的软骨、腱或皮肤培养物，如本文所述，或在体内使用，例如通过直接向受试者中需要新软骨、新腱或新皮肤组织或细胞的部位给予细胞。
术语“受试者”（如在治疗“受试者”中）或“患者”意欲是指受病症、缺陷、障碍或疾病（如本文所指定的）折磨、对其易感或患有其的哺乳动物个体。该术语不表示特定的年龄或性别。因此，意欲涵盖成体和新生的受试者，无论雄性还是雌性。该术语还包括人和动物。例如，所述受试者可以是，例如，人、非人灵长类、野生动物、狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊、兔、大鼠或小鼠。优选地，受试者是人和马。本文使用的术语野生动物包括任何未驯化的哺乳动物、鸟类、两栖类或鱼。这种野生动物的实例包括但不限于獾、狸、狮、虎、熊、鹰和鹿。
三维基质意指任何选自以下的基质：胶原基质或PLA、PLGA、PEG、壳聚糖、弹性蛋白、包括例如HA（透明质酸）的水凝胶、硅酮、壳聚糖或其混合物。所述基质提供三维空间用以确保胎儿细胞（例如胎儿骺软骨细胞或软骨-祖细胞、胎儿腱祖细胞或胎儿皮肤祖细胞）或胎儿产品的恰当覆盖和递送，或者所述基质还与另外的植入材料连接。在一个实施方案中，本发明的方法使得能够使用整合至多种基质中的分化的软骨、腱或皮肤细胞来制备三维结构物。所述分化的软骨、腱或皮肤细胞与基质的整合可通过在基质内混合、结合、移液（pipetting）、接种、铺板或放置所述细胞来进行。
术语“胶原”是指多肽化合物，所述多肽化合物是亲水性的，可被胞外酶降解。因为，该物质已经被很好地研究，所以可以控制许多关键参数。胶原是弱抗原，因此有最小的排斥可能性。用于本发明的方法和用途的优选胶原是马胶原或猪胶原。
“植入物”可被认为是用于替换失去的生物结构、支持受损的生物结构或增强已存在的生物结构的医疗装置。植入物可由人造或天然材料制造。医用植入物是人造装置，接触身体的植入物表面可由生物医学材料例如钛、硅酮、聚合物、磷灰石、生物泡沫（biofoam）和生物凝胶制造。一些植入物可连接有具有生物活性的洗脱药物，例如可植入的胶囊或药物洗脱支架。植入材料可连接有特定组织类型的分化胎儿细胞，用于抗纤维化反应。
术语“递送系统”意指任何金属的或常规使用的矫形外科、外伤、上额骨-面部的天然或合成的植入材料、水凝胶、硅酮或移植物，其提供了单独转移或者与用于治疗组织或塑造（render）植入物的植入物结合来转移胎儿细胞或胎儿细胞产品的工具。
术语“软骨组织”按照本领域普遍公认的该术语在本文中使用，是指包含埋入到ECM中的细胞的专门类型的致密结缔组织（见，例如，Cormack,1987,Ham's Histology,9th Ed.,J.B.Lippincott Co.,pp.266-272）。软骨的生物化学组成根据类型而有所不同；然而，软骨的一般组成包含被由胶原、蛋白聚糖和水组成的致密ECM围绕的软骨细胞。若干类型的软骨是本领域认可的，包括，例如，透明软骨、关节软骨、肋软骨、纤维软骨、半月板软骨、弹性软骨、耳廓软骨和黄软骨。任何类型的软骨的产生意欲落在本发明的范围内。根据一个实施方案，本发明涉及用于产生优选用于人的新软骨组织的组合物和方法。然而，还可以实施本发明以产生新软骨组织，用于任何有需要的哺乳动物，包括马、狗、猫、绵羊、猪等。对这些动物的治疗意欲落在本发明的范围内。
术语“腱组织”按照本领域普遍公认的该术语在本文中使用，是指专门类型的纤维结缔组织，其主要包含胶原、蛋白聚糖和水。
术语“皮肤组织”按照本领域普遍公认的该术语在本文中使用，是指专门类型的纤维组织，还包含胶原、弹性蛋白和蛋白聚糖。
在本发明的一个实施方案中，公开了一种机械且快速地释放早期贴壁细胞群的非酶方法，所述早期贴壁细胞群限定亲代细胞库（PCB）建立的特征。在一些实施方案中，所述原代分化细胞来自特定的软骨组织、来自特定的腱组织和来自特定的皮肤组织。所述PCB的形成使得能够实现一致且稳定的进一步细胞库建立。
因此，根据本发明的实施方案，提供了一种用于分离、扩增和形成胎儿细胞的体外非酶方法，所述胎儿细胞选自胎儿骺软骨细胞、胎儿跟腱细胞或胎儿皮肤成纤维细胞，所述方法包括步骤：
a)使用胎儿样品，所述胎儿样品选自包含胎儿骺软骨细胞的尺骨胎儿软骨；包含胎儿跟腱细胞的胎儿跟腱；或包含胎儿皮肤成纤维细胞的胎儿腹部皮肤；
b)通过机械附着到解剖刀刻痕面来微切割和分散所述尺骨胎儿软骨、胎儿跟腱或胎儿腹部皮肤样品；
c)在其中所述胎儿骺软骨细胞、胎儿跟腱细胞或胎儿腹部皮肤成纤维细胞增殖的条件下，体外培养所述尺骨胎儿软骨、胎儿跟腱或胎儿腹部皮肤样品，
d)从中选择和分离最初的贴壁胎儿骺软骨细胞细胞群、最初的贴壁胎儿跟腱细胞细胞群和最初的贴壁胎儿皮肤成纤维细胞群。
优选地，尺骨胎儿软骨样品是来自胎儿近端尺骨骺的样品。
在具体实施方案中，本发明涉及一种用于从单次组织捐献（仅0.2-2cm组织）分离、扩增和形成胎儿骺软骨细胞或软骨-祖细胞（FEC）、胎儿跟腱祖细胞和胎儿皮肤祖细胞亲代细胞库的方法。软骨、腱和皮肤的源对于建立一致的细胞库是重要的。申请人已经发现，尺骨胎儿软骨是比胫骨、股骨或肋软骨更好的源，胎儿跟腱是优良的，来自腹部的胎儿皮肤是优良的。胎儿软骨、腱和皮肤具有显著的修复能力并且胎儿细胞展现出免疫调节活性和显著的伤口愈合能力。对于软骨来说，这些方面，与骺骨化后它们天然的骨软骨形成能力和FEC的细胞表征结合，使得在本发明的非酶方法中分离的该细胞群对于骨软骨和/或软骨组织修复和再生来说是非常令人感兴趣的细胞选择。
本发明的方法没有使用进行消化以释放选择的细胞群的传统原代培养方法。消化通常对不会自动分离的组织（即，血液细胞组分、一些胎盘组织切片、一些脐带切片）进行。组织的机械切割与沿着切口至组织培养板的定向的组织/细胞生长相结合，可仅在若干天生长中选择最初的贴壁细胞群，该细胞群是非常一致且同源的。这些细胞群生长更加迅速并且具有与已被酶消化的其他细胞群不同的形态谱和生理谱。申请人已经用表面上的细胞排列示出了被酶消化与机械处理的胎儿皮肤组织在2D上的生长差异。
重要的是，如果不经组织消化而形成原代培养物，那么所述胎儿关节软骨细胞、胎儿腱祖细胞和胎儿皮肤祖细胞不能容易地去分化为其他细胞谱系。在建立细胞库步骤中不经酶消化形成的软骨细胞或软骨-祖细胞、腱祖细胞和皮肤祖细胞不会分化为神经细胞、脂肪形成细胞和全骨原细胞，例如源自骨髓或源自已经被酶处理用于原代细胞培养或不具有固体组织组分以附着塑料培养皿的胎儿关节软骨细胞的间充质干细胞。另一个重要的方面是，从非酶的细胞原代细胞培养物形成的细胞库可产生在体外传代过程中更稳定的细胞。对于使用这些建立细胞库的细胞用于人的治疗剂而言，形态和染色体稳定性是重要的因素。
使用非酶的方法完全分离cGMP以及结合所观察到的培养的该FEC群、腱祖细胞群和皮肤祖细胞群的同质性和稳定性进行处理，使得能够在体外可靠地扩增FEC、腱祖细胞和皮肤祖细胞并使得能够从本描述方法的PCB群形成大量的原始细胞库。其还使得可以将每种组织的同一细胞库用于数十万患者的临床应用，为新型骨软骨、肌肉骨骼和皮肤再生疗法敞开了大门。
源自10-16周龄胎儿组织的肌肉骨骼组织，例如腱、骨、肌肉、椎间盘（disc）和软骨以及皮肤组织是快速形成用于临床使用的亲代细胞库的理想源。当不使用酶消化所述组织以及当细胞排列方向为沿着锯齿状表面时，可快速制备所述衍生的细胞（在12-14天内，相对于当对所述组织进行酶消化时的数周至数月），并且所述衍生的细胞在群内是一致的且保持了具有相关生物标记物的特定组织-细胞类型的特征。
本发明的非酶方法提供了与通过已知的酶方法获得的细胞不同的细胞。因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种通过本发明的非酶方法获得的胎儿骺软骨细胞细胞系，其被命名为FE002-Cart并在2012年7月3号以登录号ECACC12070303-FE002-Cart保藏。在另一个实施方案中，本发明提供了通过本发明的非酶方法获得的胎儿跟腱细胞细胞系（本文中也称为胎儿跟腱祖细胞细胞系），其被命名为FE002-Ten并在2012年7月3号以登录号ECACC12070302-FE002-Ten保藏。在又一个实施方案中，本发明提供了一种通过本发明的非酶方法获得的胎儿皮肤成纤维细胞细胞系（本文中也称为胎儿皮肤祖细胞细胞系），其被命名为FE002-SK2并在2012年7月3号以登录号ECACC12070301-FE002-SK2保藏。
一旦建立，胎儿骺软骨细胞或软骨-祖细胞的培养物就可用于产生能够产生新软骨细胞和组织的软骨细胞。胎儿骺软骨细胞分化成软骨细胞，然后从软骨细胞产生软骨组织，这可通过向培养基加入或不加入特定的外源生长因子（例如BMP例如BMP-13或TGF-β），加入或不加入抗坏血酸盐来触发。可对建立的胎儿腱祖细胞和胎儿皮肤祖细胞应用相同的操作。
本发明还考虑了软骨细胞的培养物以及包含胎儿骺软骨细胞和软骨细胞的混合培养物的建立和维持。与胎儿骺软骨细胞一样，一旦建立了软骨细胞培养物或胎儿骺软骨细胞和软骨细胞的混合培养物，细胞群就可以在有益于细胞增殖而不形成软骨的条件下，例如在没有TGF-β或其他生长因子的培养基中，通过按照细胞密度指示传代至新鲜培养基来以有丝分裂的方式进行体外扩增。与前软骨细胞（pre-chondrocyte）的培养物一样，当达到足够的细胞密度时，应该将软骨细胞的培养物和胎儿骺软骨细胞和软骨细胞的混合培养物转移至新鲜培养基。因此，应该防止细胞单层的形成或使其最小化，例如，通过将所述细胞的一部分转移至新培养瓶并到新鲜培养基中。这种移动或转移应对任何细胞单层超过约25%融合的培养瓶进行。或者，可以摇动所述培养体系以防止细胞粘附。相同的方法可以等同地应用于胎儿腱祖细胞和胎儿皮肤祖细胞。
在本发明的又一个实施方案中，从尺骨胎儿软骨分离的胎儿骺软骨细胞或软骨-祖细胞的群以有丝分裂的形式扩增，并且体外培养以产生软骨细胞，所述软骨细胞可以产生用于治疗用途的软骨组织和细胞。相同的方法可以等同地应用于胎儿腱祖细胞和胎儿皮肤祖细胞。因此，在一个实施方案中，本发明涉及通过本发明的非酶方法获得的胎儿骺软骨细胞（FEC）、胎儿跟腱细胞和胎儿皮肤成纤维细胞用作治疗剂。
在本发明的另一个实施方案中，从尺骨胎儿软骨分离的胎儿骺软骨细胞或软骨-祖细胞被冷冻保存并冷冻保存在可按需将它们从中解冻并用于产生软骨组织和细胞的“库”中。从其中收获或产生的所述胎儿骺软骨细胞或软骨-祖细胞可冷冻保存在“库”里数年。可按需通过解冻从所述库中提取所述细胞，并且可随时使用解冻的细胞产生新组织和细胞，用于修复、替换或增大软骨以及其他间充质组织，例如骨、腱或韧带。相同的方法可以等同地应用于胎儿腱祖细胞和胎儿皮肤祖细胞。
因为从尺骨胎儿软骨样品分离的细胞的“胎儿”性质，可使植入的本发明的胎儿骺软骨细胞或从其产生的软骨组织的免疫排斥最小化。因此，在本发明的另一个实施方案中，这些细胞和“普遍存在的供体细胞”一样可用于任何有需要的受试者。对于胎儿腱祖细胞和胎儿皮肤祖细胞，可以等同地发现相同的特性。
在本发明的另一个实施方案中，将所述胎儿骺软骨细胞或软骨祖细胞、胎儿跟腱祖细胞或胎儿皮肤祖细胞悬浮在水凝胶溶液中，在此可将它们注射或植入至患者中。或者，可首先将所述细胞接种至水凝胶中，然后培养，之后植入。优选地，将所述细胞培养在水凝胶中以使得它们可以以有丝分裂的方式扩增，之后植入。
在本发明的又一个实施方案中，新软骨组织和细胞群制备自本发明的胎儿骺软骨细胞或软骨-祖细胞，并且可使用任何本领域已知或以后开发的修复、替换或增大的技术将其用于修复、替换或增大受试者中的软骨组织。例如，可将本发明的胎儿骺软骨细胞或软骨-祖细胞接种到由生物相容的无生命的材料组成的三维框架或支架上，所述材料具有所述软骨细胞可桥接的间隙空间、开口或孔。在适当的体外培养条件下，所接种的细胞基本包覆（envelope）所述三维框架并分泌细胞外基质以形成可植入体内的新的活软骨组织。或者，将本发明的胎儿骺软骨细胞或软骨-祖细胞接种到三维框架上并立即植入到受试者中的部位。所接种的细胞继续生长在体内形成新软骨组织或者刺激接受者软骨修复和重新组织。相同的方法可以等同地应用于胎儿腱祖细胞和胎儿皮肤祖细胞，用以形成或刺激所述接受者腱或皮肤的新腱组织或新皮肤组织以修复和重新组织。
在又一个实施方案中，其上接种本发明的细胞的三维框架还包含或者包被有一种或多种生物活性剂或其他选自抗炎剂、生长因子、免疫抑制剂等的化合物。
在本发明的另一个实施方案中，将本发明的胎儿骺软骨细胞或软骨-祖细胞在三维框架上接种并培养，并置于可被操纵以容许间歇性压强改变的容器中，或者置于为体外产生软骨组织结构体特别设计的生物反应器系统中，所述生物反应器容许在培养过程中对腔进行增压并通过对流为软骨细胞提供充足的营养物供应。相同的方法可以等同地应用于胎儿腱祖细胞和胎儿皮肤祖细胞。
基于支架的细胞疗法提供了明显的优势，因为递送的治疗性组织生成剂，在这种情况下是细胞，容易地被定位，从而可以通过关节内镜与所述支架一起植入（Iwasa et al.,2009）。这避开了对大的侵入性手术（全关节置换）的需要并且尽可能最佳地保留了原有组织，从而显著地减少炎症的发生，炎症会非常负面地影响所述治疗的结果（van Osch et al.,2009）。为了提供支持3D组织生长的模板，必须谨慎地设计支架的结构和组成。在有或没有进一步的化学修饰和添加侧基的情况下，已经使用了合成材料例如聚乙二醇（PEG）、聚乳酸（PLA）和聚乙醇酸（PGA）以及天然衍生的材料例如透明质酸、硫酸软骨素和壳聚糖，以产生骨和软骨（Ahmed et al.,2010；Chung et al.,2008;Khan et al.,2008）。
生物材料支架作为细胞外基质发挥功能，以提供物理结构用以保护细胞或用以引导组织生长。为了得到用于递送至需要的手术部位的三维系统，整合至所述基质中是必要的。与成体和间充质细胞不同，已经表明胎儿细胞可由于其固有的附着和迁移性质而渗透多种生物材料。这使得能够将所述细胞快速接种至相应的生物材料中，并且在植入前仅需要对所述植入物进行较少的操作。不同的材料和制造方法可形成可适于软骨组织工程的具有不同性质的生物材料支架。已经开发了用于其他外科目的许多生物可降解的生物材料和水凝胶，例如止血海绵和组织填料（Mast et al.,1993；Patino et al.2002；Drury and Moony,2003）。这些生物材料提供了要测试生物相容性并且确保所述生物材料递送系统和细胞产品的结合不产生激进（radical）衍生产物的临床级材料（归类为医疗装置）。
在又一个实施方案中，将本发明的胎儿骺软骨细胞或软骨-祖细胞直接给予体内部位，例如通过注射而不与三维框架连接，以在该部位产生新软骨组织和细胞群。相同的方法可以等同地应用于胎儿腱祖细胞和胎儿皮肤祖细胞。因此，在一个实施方案中，本发明涉及通过本发明的非酶方法获得的胎儿骺软骨细胞（FEC）用于产生新软骨组织和/或三维结构体；通过本发明非酶方法获得的胎儿跟腱细胞用于产生新腱组织和/或三维结构体；和通过本发明的非酶方法获得的胎儿皮肤成纤维细胞用于产生新皮肤组织和/或三维结构体。
在本发明的又一个实施方案中，使用外源提供的生长因子例如TGF-β或BMP（例如BMP-2、BMP-12和BMP-13）刺激本发明的胎儿骺软骨细胞或软骨-祖细胞以产生软骨。
在本发明的又一个实施方案中，可遗传改造本发明的胎儿骺软骨细胞或软骨-祖细胞以产生特定类型的生长因子、肽、蛋白质或可增加所产生的软骨量或提高植入的成功率（例如通过减少与所述植入物相关的排斥或炎症风险）的其他分子，或者增加它们的产生。相同的方法可以等同地应用于胎儿腱祖细胞和胎儿皮肤祖细胞。
本发明还涉及上述方法的产物，包括但不限于，以有丝分裂的方式或以其他方式扩增的本发明的胎儿骺软骨细胞或软骨-祖细胞；从其产生的新软骨组织；从其提取的细胞外基质；和三维软骨/框架结构体。本发明还涉及这些细胞、结构体和组织在体内用于修复、替换或增大软骨，或者在体外用于形成可用于产生新软骨组织或生物活性剂的三维软骨培养物，或者用于测试潜在治疗剂的细胞毒性。相同的方法可以等同地应用于胎儿腱祖细胞和胎儿皮肤祖细胞。
在本发明的实施方案中，从尺骨胎儿软骨分离的胎儿骺软骨细胞或软骨-祖细胞，以及从其分化的软骨细胞，可用于产生新软骨组织和细胞，以修复或替换软骨。相同的方法可以等同地应用于可用于产生新腱或皮肤组织以修复或替换腱或皮肤的胎儿腱祖细胞和胎儿皮肤祖细胞。
在本发明的又一个实施方案中，根据本发明的方法从尺骨胎儿软骨分离的胎儿骺软骨细胞或软骨-祖细胞以及从其分化的软骨细胞可用作治疗剂。优选地，根据本发明的方法从尺骨胎儿软骨分离的胎儿骺软骨细胞以及从其分化的软骨细胞，可用于骨软骨修复（包括软骨修复和腱修复）和再生的方法中，可用于治疗骨软骨疾病或缺陷（包括骨软骨病损、损伤、创伤、破碎和骨折、软骨下骨坏死和骨软骨炎）和/或关节炎的方法中。相同的方法可以等同地应用于胎儿腱祖细胞和胎儿皮肤祖细胞，用于腱和皮肤的特定疗法。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及通过本发明的非酶方法获得的胎儿骺软骨细胞（FEC）用于修复和再生骨软骨组织和肌肉骨骼组织的方法中；通过本发明的非酶方法获得的胎儿跟腱细胞用于修复和再生腱组织和肌肉骨骼组织的方法中；以及通过本发明的非酶方法获得的胎儿皮肤成纤维细胞用于修复和再生皮肤组织和用于治疗烧伤、创伤和纤维化病症的方法中。
在本发明的又一个实施方案中，提供了通过本发明的非酶方法获得的胎儿骺软骨细胞（FEC）用于治疗骨软骨疾病或缺陷、关节炎和肌肉骨骼疾病的方法中；通过本发明的非酶方法获得的胎儿跟腱细胞用于治疗肌肉骨骼疾病和腱疾病的方法中；以及通过本发明的非酶方法获得的胎儿皮肤成纤维细胞用于治疗皮肤疾病的方法中。
胎儿骺软骨细胞（FEC）或软骨-祖细胞用于骨软骨组织工程是非常有前景的。的确，在胎儿发育的整个过程中，骺成为次级骨化中心（SOC）的主要部位，所述次级骨化中心将FEC固化物（condensate）转变为关节软骨区域和在血管侵入后变成骺小梁骨和髓的物质（Blumeret al.,2008；Onyekwelu et al.,2009）。已知胎儿软骨，例如对胎儿皮肤所观察到的，具有显著的自我修复能力。在胎儿山羊模型中，已经显示用外部的疤痕或纤维组织形成进行修复是有缺陷的（Namba et al.,1998）。
本发明的细胞（胎儿骺软骨细胞或软骨-祖细胞和软骨细胞）和软骨组织可用于在体外对多种化合物筛选药剂、生长因子/调节因子、抗炎剂等的有效性和细胞毒性。为了这个目的，体外维持本发明的细胞或上述的组织培养物并将其暴露于要测试的化合物。细胞毒性化合物的活性可以通过其损伤或杀死培养物中的细胞的能力来测量。这可以通过活体染色技术容易地评估。生长因子/调节因子的作用可通过体外分析活细胞的数量，例如通过总细胞计数和分化细胞计数来评估。这可以使用标准的细胞学和/或组织学技术来实现，包括使用免疫细胞化学技术，所述免疫细胞化学技术应用限定类型特异性的细胞抗原的抗体。可以评估多种药物对上述的悬浮培养物或三维系统中的本发明的细胞的效应。因此，从尺骨胎儿软骨分离的胎儿骺软骨细胞或软骨-祖细胞还可用于开发用于治疗关节缺陷、治疗骨软骨缺陷、软骨修复、腱修复的先进治疗剂和/或医疗装置。相同的方法可以等同地应用于胎儿腱祖细胞和胎儿皮肤祖细胞，所述腱祖细胞和胎儿皮肤祖细胞同样可用于开发用于治疗肌肉骨骼组织的先进治疗剂和/或医疗装置。
因此，在本发明的实施方案中，提供了一种用于开发用于治疗关节缺陷、治疗骨软骨缺陷、软骨修复、腱修复、肌肉骨骼组织修复和皮肤修复的治疗剂和/或医疗装置的筛选方法，所述方法包括使用通过本发明的非酶方法获得的胎儿骺软骨细胞（FEC）、胎儿跟腱细胞或胎儿皮肤成纤维细胞。
本发明的细胞（胎儿骺软骨细胞或软骨-祖细胞和软骨细胞）和软骨组织可以用作模型系统，用于研究生理病症或病理病症。例如，被固定的关节在多个方面会相对迅速地受损害。软骨细胞的代谢活性似乎因为损失蛋白聚糖而受到影响，并且很快观察到水含量的增加。软骨正常白色的、发亮的外观变为暗的青色，并且软骨厚度减少。然而，相对于因应激依赖的代谢稳态紊乱引起的这种改变的量，因营养缺乏引起的这种改变量却不明显。本发明的细胞和软骨组织可用于通过将营养培养基泵入或泵出所述软骨结构体来确定在不同物理条件（例如，间歇性增压）下软骨的营养需求。这对研究关节软骨（例如膝中的）拉伸强度的年龄相关或损伤相关的减少的根本原因尤其有用，所述减少使弱化的软骨易于形成创伤性损伤。相同的方法可以等同地应用于胎儿腱祖细胞和胎儿皮肤祖细胞，所述胎儿腱祖细胞和胎儿皮肤祖细胞可用于研究腱和皮肤的拉伸强度的年龄相关或损伤相关的减少变成创伤性损伤或年龄相关损伤的根本原因。
本发明的细胞（胎儿骺软骨细胞或软骨-祖细胞和软骨细胞）和软骨组织还可用于研究细胞因子和因风湿性疾病而释放到滑液中的其他促炎介质（例如IL-1、TNF和前列腺素类）的作用机制。因此，可以体外测试患者自身的关节液，以研究这些化合物对本发明细胞的生长的效应。另外，可筛选对具体患者最有效的细胞毒性剂和/或药剂，例如减少或防止软骨吸收或另外增强关节软骨的平衡生长的那些。然后，可将在体外被证明有效的试剂用于有疗效地治疗所述患者。相同的方法可以等同地应用于胎儿腱祖细胞和胎儿皮肤祖细胞，所述胎儿腱祖细胞和胎儿皮肤祖细胞可用于研究生长因子、细胞因子和引起组织修复失衡的其他促炎介质的作用机制。
本领域的技术人员会理解，除了本文具体描述的那些以外，本文描述的发明易于进行变化和修改。应理解，在不背离本发明精神或必要特征的前提下，本发明包括所有这些变化和修改。本发明还单独或集体地包括本说明书中提到或注明的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任意两个或多个所述步骤或特征的任意和全部组合。因此，本公开被认为在所有方面均是说明性而非限制性的，本发明的范围由所附权利要求书给出，并且意图涵盖落在其等同含义和范围内的所有变化。
参照下面的实施例将更充分地理解前文的描述。然而，这些实施例是实施本发明的方法的示例，而非意欲限制本发明的范围。
实施例
遵守严格的移植法律和法规以及器官捐献和筛选的指导方针，处理近端尺骨骺、跟腱和腹部皮肤以生成FEC、腱和皮肤亲代细胞库，用于组织工程应用（CHUV伦理委员会方案#62/07）。通过机械附着到解剖刀刻痕面将组织活组织检查物（软骨，约2mm3，腱，约0.2mm3，皮肤，约2cm2）微切割并分散。（不使用酶处理以确保仅有贴壁的软骨、腱或皮肤生长晕（outgrowth）和细胞群的一致性：临床使用的必需标准）。在1-2天至一周，观察到FEC、腱和皮肤生长晕，在一周和两周时完成扩增。建立了亲代细胞库，有含有5-10×106个细胞的50-200个小瓶，并且保存在液氮的气相中。分离的细胞的体外表征展现出单层培养物中显著的同质性以及具有重叠倾向的明显的增殖潜力（3D培养）。FEC、腱祖细胞和皮肤祖细胞在最初的六次传代内似乎没有展现出明显的表型变化。FEC和腱祖细胞能够当置于片（pellet）培养物形式时自发地融合（coalesce），沉积基质并表达基本的软骨形成或腱细胞标记物。流式细胞分析显示了指示同源群的单峰分布。与成体骨髓衍生的MSC的比较得到了与软骨形成或腱细胞一致的FEC或腱表面标记物谱，而不是未分化的祖细胞表型。
胎儿软骨细胞、腱祖细胞和皮肤祖细胞的细胞库建立、与治疗剂制备有关的表征
建立细胞库
在知情同意和书面同意以及当地医学院伦理委员会批准的情况下细胞库自1993以来已在洛桑大学医院（University Hospital of Lausanne）从妊娠终止后获得的12-14孕周的胎儿活组织检查物建立，更特别是对于临床细胞库而言自2007年以来建立。至今，已经成功地从2个独立的供体形成了临床前关节软骨细胞库。使用这些（第0代FE002-Cart、第0代FE-002-Ten、第0代FE-002-SK2）之一，可以建立低传代数（第3代MCB、第5代WCB）的临床前和临床实验所需的所有细胞。
从约0.3cm3关节软骨（半径）（见图7），从约0.2mm3跟腱和从约1cm2腹部皮肤，制备了第0代和第1代的临床前细胞库。如果可能，将组织切割成<0.5mm3的碎块，并培养在补充有10%FCS和谷氨酰胺的DMEM中，在第3代和第6代或者第1代和第9代所述细胞被用于进行表征和实验。在分裂前将它们培养至汇合，用PBS冲洗两次并计数。
不经酶处理的详细步骤
如果可能，将组织分至两个10cm平板中，每个平板中约5完整组织碎块（<0.5mm3）。将组织培养皿事先在层流洁净工作台中用无菌的解剖刀以棋盘样式深深刻痕。将组织碎块置于刻痕的塑料区域，将组织碎块慢慢切碎并且使所述碎块附在塑料凹痕内。在最初24小时中在每个碎块的周围放置少量的营养培养基以避免组织漂浮。在最初24小时之后，向每个10cm平板加入8ml培养基，并在传代前每周更换2次所述培养基。这些碎块培养在仅补充有10%胎牛血清（Hyclone）的DMEM中，以帮助确保一致的细胞培养。细胞培养物在37℃下在95%空气/10%CO2的增湿气氛中培养。要提及的很重要的一点是，用于临床试验的细胞培养物所必需的任何营养物组分应该具有完全的安全要求和追踪。应该使用已经针对外来剂进行测试的所有的动物衍生制品，例如胎牛血清和胰蛋白酶、具体临床批次的胰蛋白酶和γ照射的血清。甚至在一天后初次观察到细胞生长，但是在细胞生长继续的5-7天中，将组织和细胞的培养皿通过胰蛋白酶（0.25%胰蛋白酶-0.1%乙二胺四乙酸[EDTA])或者仅用EDTA处理而从板中除下，以传代至多个组织培养瓶或进行冷冻用于建立细胞库。此时，将一些胎儿软骨、胎儿腱或胎儿皮肤细胞在液氮中冷冻至单个单元中，其他的以1000-2000个细胞/cm2或10000-50000个细胞/cm2传代，用于产生所述PCB。将细胞以2000g离心15分钟，重悬于DMEM（5ml）+FCS（4ml）+DMSO（1ml，Fluka）的冷冻液，并以1ml小份（约500-1000万个细胞）冷冻在–80℃下的Nalgene Cryo1℃Freezing Container’s（Nalgene）中，达到–1℃/分钟的冷却和冻结曲线。24小时后，将细胞转移至液氮中以保存更长时间。
将1-2小瓶的临床前胎儿关节软骨、胎儿腱或胎儿皮肤用于制备用于表征的一致的工作细胞库（WCB）。步骤设计与用于cGMP制备的步骤设计相同。简言之，开始将细胞以1500个细胞/cm2，或1000-100000个细胞/cm2接种至100个含有15ml培养基（DMEM+10%临床级血清，胎牛，Invitrogen）的细胞培养瓶（T75,Nunc）中。每2天给细胞更换培养基，细胞的产生/扩增在37℃、10%湿度下持续10-14天完成，或者在更高的接种密度下持续3-6天完成。在第12-14天，使数批10个T75培养瓶经受TrypLE处理，以从培养瓶分离细胞并将其置于离心管中。离心前向每个管加入等体积的营养培养基以缓冲TrypLE作用。将从所有的培养瓶获得的细胞片状沉淀物重悬于200ml冰冷的培养基溶液（DMEM，血清，DMSO，比例为5:4:1）并以10×106个细胞/ml的稀释度等分至100个Nunc冻存管（freezing viles）（1.5ml）。
将细胞冷冻在–80℃下的Nalgene Cryo1℃Freezing Container’s（Nalgene）中，达到–1℃/分钟的冷却和冻结曲线。24小时后，将细胞转移至气相的液氮中。该WCB是第二代，被用于细胞表征，可以使用不同代的细胞，但是主要是2-8代。
胎儿软骨细胞表征：同一性、稳定性、一致性、遗传稳定性
已经将建库的胎儿软骨细胞和在申请人实验室中相同技术条件下建库的BM-MSC细胞的比较贯穿在申请人的研究中。MSC是同种细胞，并且是已经被提议且已在用于软骨等组织再生的临床前和临床实验中使用的主要其他细胞类型之一（然而，间充质细胞不是组织特异性的并且必须对其编程以制备其他组织类型）。此外，MSC更加不稳定并且必须在4代以下使用。相同的方法可以等同地应用于胎儿腱祖细胞和胎儿皮肤祖细胞。
与BM-MSC相比的胎儿软骨表征
胎儿关节软骨细胞库已经通过与BM-MSC细胞相比的表面标记物（用FACS分析完成）和基质沉积的功能测定来表征。已经分离了源自关节骺组织的胎儿软骨细胞并且已经冷冻了亲代细胞库。
在初步的实验中已经比较的一些标记物包括:
CD105：内皮因子。TGFβ受体复合物的一部分。MSC阳性选择的主要标准。
CD90：Thy-1。MSC阳性选择的主要标准。
CD44：PTPRC。白细胞标记物。bmMSC阴性选择的标准。
CD73：NT5E。MSC阳性选择的主要标准。
CD166：ALCAM。
（见图8和9）
相同的方法可以等同地应用于胎儿腱祖细胞和胎儿皮肤祖细胞。
生物相容性：胎儿软骨与水凝胶和基质的生物相容性
最初测试了可用于医疗用途的不同基质的生物相容性。不同组成的水凝胶、胶原和一些生物可降解聚合物被用于最初的实验中。对于水凝胶，细胞被培养在插入到事先准备的琼脂模型中的凝胶中。这对于避免细胞附着到管并容许三维生长来说是必需的。所述模型的制备如下进行：通过将1ml融化的琼脂糖（20%琼脂，低熔点琼脂）用移液管移到1.5ml无菌圆锥形eppendorf离心管中，0.5ml无菌圆锥形eppendorf离心管被插入到所述液体琼脂中并使其凝固，然后取出0.5ml管留下圆锥形的内凹（inset）。加入凝胶和细胞之后，将100μl培养基用移液管移至每个管的表面上，并每周两次更换培养基。将细胞在37℃培养箱中在95%相对湿度和10%CO2下培养一、二和四周。
对于基质制备，研究了细胞接种密度（103至104个细胞cm2）和生长期（1至28天）的初步实验以确定胎儿细胞递送的最佳条件。将第3或4代的胎儿细胞和BM-MSC（对于MSC来说最多是第4代，因为此后不稳定）置于10ml培养基（含10%FBS的DMEM）中并接种到基质上。将含所述细胞的基质置于95%相对湿度和10%CO2下的37℃培养箱中。然后，一小时后加入另外的30ml培养基。每周两次给基质更换培养基。还通过接触测定测量了生物相容性，其中将细胞培养在最初接种有水凝胶或基质的组织培养板中。参考水凝胶和基质界面对细胞生长和迁移进行目视分析。一、二和四周后，将样品用吉姆萨（giemsa）染色并拍照（Sony CyberShot DSC-S70，Zeiss宏镜头，变焦6×，3.3兆像素）。

Claims (18)

1.一种用于分离、扩增和形成选自胎儿骺软骨细胞、胎儿跟腱细胞或胎儿皮肤成纤维细胞的胎儿细胞的体外非酶方法，包括以下步骤：
a)使用胎儿样品，所述胎儿样品选自包含胎儿骺软骨细胞的尺骨胎儿软骨；包含胎儿跟腱细胞的胎儿跟腱；或包含胎儿皮肤成纤维细胞的胎儿腹部皮肤；
b)通过机械附着到解剖刀刻痕面来微切割和分散所述尺骨胎儿软骨、胎儿跟腱或胎儿腹部皮肤样品；
c)在其中所述胎儿骺软骨细胞、胎儿跟腱细胞或胎儿腹部皮肤成纤维细胞增殖的条件下，体外培养所述尺骨胎儿软骨、胎儿跟腱或胎儿腹部皮肤样品，
d)从中选择和分离最初的贴壁胎儿骺软骨细胞细胞群、最初的贴壁胎儿跟腱细胞细胞群和最初的贴壁胎儿皮肤成纤维细胞群。
2.权利要求1的方法，其中尺骨胎儿软骨样品是胎儿近端尺骨骺的样品。
3.通过权利要求1的方法获得的胎儿骺软骨细胞（FEC）细胞系，其被命名为FE002-Cart并且以登录号ECACC12070303-FE002-Cart保藏。
4.通过权利要求1的方法获得的胎儿跟腱细胞细胞系，其被命名为FE002-Ten并且以登录号ECACC12070302-FE002-Ten保藏。
5.通过权利要求1的方法获得的胎儿皮肤成纤维细胞细胞系，其被命名为FE002-SK2并且以登录号ECACC12070301-SK2保藏。
6.权利要求3的胎儿骺软骨细胞（FEC）用于产生新软骨组织和/或三维结构体的用途。
7.权利要求4的胎儿跟腱细胞用于产生新腱组织和/或三维结构体的用途。
8.权利要求5的胎儿皮肤成纤维细胞用于产生新皮肤组织和/或三维结构体的用途。
9.权利要求3的胎儿骺软骨细胞（FEC），用作治疗剂。
10.权利要求4的胎儿跟腱细胞，用作治疗剂。
11.权利要求5的胎儿皮肤成纤维细胞，用作治疗剂。
12.权利要求3的胎儿骺软骨细胞（FEC），用于修复和再生骨软骨组织和肌肉骨骼组织的方法中。
13.权利要求4的胎儿跟腱细胞，用于修复和再生腱组织和肌肉骨骼组织的方法中。
14.权利要求5的胎儿皮肤成纤维细胞，用于修复和再生皮肤组织以及用于治疗烧伤、创伤和纤维化病症的方法中。
15.权利要求3的胎儿骺软骨细胞（FEC），用于治疗骨软骨疾病或缺陷、关节炎和肌肉骨骼疾病的方法中。
16.权利要求4的胎儿跟腱细胞，用于治疗肌肉骨骼疾病和腱疾病的方法中。
17.权利要求5的胎儿皮肤成纤维细胞，用于治疗皮肤疾病的方法中。
18.一种用于开发用于治疗关节缺陷、治疗骨软骨缺陷、软骨修复、腱修复、肌肉骨骼组织修复和皮肤修复的治疗剂和/或医疗装置的筛选方法，所述方法包括使用权利要求3的胎儿骺软骨细胞（FEC）、权利要求4的胎儿跟腱细胞或权利要求5的胎儿皮肤成纤维细胞。
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