CN102002479A - 一种脐带血间充质干细胞及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种脐带血间充质干细胞及其制备方法和用途。所述的CD105阳性(CD105⁺)的脐带血间充质干细胞通过下述方法分离得到：(1)将来自脐血的间充质干细胞的单细胞悬液和荧光标记的CD105单克隆抗体混合；和(2)通过流式细胞仪分选得到CD105阳性(CD105⁺)的脐带血间充质干细胞。所述的CD105阳性(CD105⁺)的脐带血间充质干细胞可以用作组织工程种子细胞，和/或用于制备组织工程化骨移植物。

Description

一种脐带血间充质干细胞及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及组织工程领域，尤其涉及一种脐带血间充质干细胞及其制备方法和用途。

背景技术

各种外伤和脑外科术后造成的颅骨缺损是临床常见疾病，当缺损面积大于颅骨面积的十分之一后，即不能通过自体周围骨组织再生修复缺损。目前常用的治疗手段均有其自身无法弥补的缺点，不能达到外形和功能的良好修复，采用组织工程技术有望达到理想的修复效果。

脐带血间充质干细胞(umbilical cord blood derived mesenchymal stemcells，UCB-MSCs)是存在于脐带血中的一种间充质干细胞，具有潜在的多向分化能力，在体外特定诱导环境下，除了可以向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞分化之外，还可以分化为神经胶质细胞、肝细胞、心肌细胞等。尽管UCB-MSCs的成骨分化潜能已被证实，但其在骨组织构建及骨缺损修复领域的研究却很少。国外的研究多集中在神经系统、血管内皮细胞、心肌细胞、造血细胞等方面；而以UCB-MSCs为种子细胞构建组织工程骨的研究，目前尚未见报道。其最重要的原因在于：尚无获得比较纯化的具有成骨分化潜能的UCB-MSCs细胞亚群的方法。事实上，采用目前常用的分离方法获得的UCB-MSCs，是一个混合细胞群体，不可避免地含有大量混杂的、不具备成骨分化潜能的细胞，例如脂肪前体细胞、内皮细胞、血管周皮细胞、造血细胞等。必须对这些混杂的细胞群体进行分选纯化，才能提高UCB-MSCs作为种子细胞构建组织工程骨的成功率和均质性。

因此，本领域迫切需要提供一种分离得到纯化的具有成骨潜能的UCB-MSCs。

发明内容

本发明旨在提供一种脐带血间充质干细胞的分离方法。

本发明的第二个目的是提供一种纯化的具有成骨潜能的脐带血间充质干细胞。

本发明的第三个目的是提供一种上述纯化的脐带血间充质干细胞的用途。

本发明的第四个目的是提供一种组织工程化骨移植物。

本发明的第五个目的是提供一种上述的组织工程化骨移植物的制备方法。

在本发明的第一方面，提供了一种脐带血间充质干细胞的分离方法，所述的方法包括步骤：

(1)将来自脐血的间充质干细胞的单细胞悬液和荧光标记的CD105单克隆抗体混合；和

(2)通过流式细胞仪分选得到CD105阳性(CD105⁺)的脐带血间充质干细胞。

在另一优选例中，步骤(1)中避光混合20-40分钟。

在另一优选例中，步骤(1)中4℃避光孵育20-40分钟，其中每隔10分钟进行颠倒震荡操作，以避免发生细胞沉淀，有利于与抗体充分反应。

在另一优选例中，每5.0×10⁶细胞经避光孵育20-40分钟，分选后可获得1.0-1.3×10⁶数量的CD105阳性的细胞。

在另一优选例中，所述来自脐血的间充质干细胞选自第1、4、7、和/或10代细胞。

在另一优选例中，所述的来自脐血的间充质干细胞通过下述步骤得到：

(a)将脐血和淋巴细胞分离液混合、离心，得到白膜层细胞；和

(b)培养白膜层细胞，得到来自脐血的间充质干细胞。

在另一优选例中，步骤(b)中白膜层细胞培养在含有DMEM、胎牛血清、青霉素、链霉素、和L-谷氨酰胺的培养液中进行。

在另一优选例中，DMEM培养液(1000-4500mg葡萄糖/升)的胎牛血清含量为15-30％(v/v)，并且培养皿在接种细胞24小时前预先使用胎牛血清涂层处理(Coating)。

在另一优选例中，DMEM为低糖的培养液(1000mg葡萄糖/升)，胎牛血清的含量为20％(v/v)。

在另一优选例中，所述的脐带血是人脐带血。

在本发明的第二方面，提供了一种脐带血间充质干细胞，所述的干细胞通过如上所述的本发明提供的分离方法得到，所述的脐带血间充质干细胞为CD105阳性(CD105⁺)。

在本发明的第三方面，提供了一种如上所述的本发明提供的脐带血间充质干细胞的用途，(i)用作组织工程种子细胞；和/或(ii)用于制备组织工程化骨移植物。

在本发明的第四方面，提供了一种组织工程化骨移植物，所述的移植物包括如上所述的本发明提供的脐带血间充质干细胞和医学上可接受的生物可降解材料。

在本发明的第五方面，提供了一种如上所述的本发明提供的组织工程化骨移植物的制备方法，所述的方法包括步骤：

(1)将来自脐血的间充质干细胞的单细胞悬液和荧光标记的CD105单克隆抗体混合；

(2)通过流式细胞仪分选得到CD105阳性(CD105⁺)的脐带血间充质干细胞；和

(3)将步骤(2)得到的CD105阳性(CD105⁺)的脐带血间充质干细胞接种于医学上可接受的生物可降解材料，形成骨移植物。

据此，本发明提供了一种分离得到纯化的具有成骨潜能的UCB-MSCs，及其相关用途。

附图说明

图1显示了脐带血间充质干细胞的CD105阳性表达情况；其中A是第1代脐带血间充质干细胞的CD105阳性表达率为40.9％；B是经分选纯化后，CD105阳性表达率提高到98.9％。

图2显示了培养原代细胞得到脐带血间充质干细胞克隆的情况；其中，

A是原代细胞在含15％胎牛血清的DMEM培养液(1000mg葡萄糖/升)中贴壁生长，形成细胞克隆的情况；B是原代细胞在含30％胎牛血清的DMEM培养液(4500mg葡萄糖/升)中贴壁生长，形成细胞克隆的情况。

图3显示了CD105阳性(CD105⁺)与CD105阴性(CD105^-)的脐带血间充质干细胞成骨、成脂肪和成软骨的多向诱导分化能力情况；从上至下依次为茜素红染色(Alizarin Red)、油红染色(Oil Red O)和番红(Safranin O)染色情况。

图4显示了CD105阳性(CD105⁺)与CD105阴性(CD105^-)的脐带血间充质干细胞体外增殖能力情况。

图5显示了裸大鼠颅骨缺损修复的大体观察；其中A为6周时照片；B为12周时照片；A、B中的左边均为对照组(CD105^-细胞组)，右边均为实验组(CD105⁺细胞组)。

图6显示了裸大鼠颅骨缺损修复的显微CT检测；其中A是术后6周；B是术后12周；A、B中左边均为对照组(CD105^-细胞组)，右边均为实验组(CD105⁺细胞组)。

图7显示了裸大鼠颅骨缺损修复12周时的组织学检测情况；其中右边显示实验组(CD105⁺细胞组)，左边显示对照组(CD105^-细胞组)(HE染色，×40倍)。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，发现可以将干细胞标志物CD105作为分选条件，建立脐带血间充质干细胞的分离方法；进一步地，发明人发现CD105阳性(CD105⁺)的脐带血间充质干细胞具有明确的成骨分化潜能，可以用作组织工程化骨移植物的种子细胞。在此基础上，完成了本发明。

具体地，本发明提供的脐带血间充质干细胞的分离方法包括步骤：

(1)将来自脐血的间充质干细胞的单细胞悬液和荧光标记的CD105单克隆抗体混合；和

(2)通过流式细胞仪分选得到CD105阳性(CD105⁺)的脐带血间充质干细胞。

可以使用本领域熟知的方法分离、培养得到来自脐血的间充质干细胞，例如但不限于，将来自哺乳动物的脐血和淋巴细胞分离液混合，离心得到白膜层细胞，并将其在培养液(如含有20％胎牛血清，L-谷氨酰胺2mmol/ml，青霉素和链霉素100U/ml，低糖DMEM基础培养液)中制成细胞悬液，以约1×10⁵/cm²的密度接种于经血清涂层预处理的培养皿，于37℃、5％CO₂、100％饱和湿度的条件下培养。第5天首次换液，加入基础培养液继续培养，每周两次换液。待细胞生长近融合后，以0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化，以1×10⁴/cm²的密度接种进行细胞传代。

优选第1、4、7、10代细胞，消化后制成单细胞悬液。

可以使用本领域常规的荧光试剂标记CD105单克隆抗体，例如但不限于，PE(Phycoerythrin，藻红蛋白)、FITC(fluorescein isothiocyanate，异硫氰酸荧光素)等。

使用本领域常规的方法进行CD105流式分选，例如但不限于，直接荧光标记单标法、免疫磁珠抗体标记法等，得到CD105阳性(CD105⁺)和CD105阴性(CD105^-)两类细胞群。这两类细胞群的接种、培养可以使用本领域常规的方法进行。

本发明将得到的CD105阳性(CD105⁺)脐带血间充质干细胞(i)用作组织工程种子细胞；和/或(ii)用于制备组织工程化骨移植物。

所述的移植物包括本发明分选得到的CD105阳性(CD105⁺)脐带血间充质干细胞和医学上可接受的生物可降解材料。

可用于本发明的医学上可接受的生物可降解材料，包括(但并不限于)：

(a)人工合成可降解性高分子材料，例如聚α-羟基酸(如聚乳酸PLA、聚羟基乙酸PGA、聚羟基丁酸PHB等)、聚酸酐(polyanhydrides)、聚偶磷氮(polyphosphazenes)、聚氨基酸(polyamino acid)、假聚氨基酸(pesudo-polyamino acid)、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚酯尿烷(polyesterurethane)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚对二氧六环酮(polydioxanone)等；

(b)天然可降解材料，例如胶原(collagen)、明胶(gelatin)、糖氨聚糖(glycosaminoglycan，GAGs)、壳聚糖(chitosan)、甲壳素(chitin)、海藻酸盐、藻酸钙凝胶等；各种脱细胞基质，例如脱细胞脱钙骨基质、脱细胞真皮基质等；

(c)上述材料的混合物或复合材料，尤其是高分子材料与天然材料的复合材料。

优选使用天然可降解材料；更佳地，使用脱钙骨。

本发明提供的组织工程化骨移植物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将来自脐血的间充质干细胞的单细胞悬液和荧光标记的CD105单克隆抗体混合；

(2)通过流式细胞仪分选得到CD105阳性(CD105⁺)的脐带血间充质干细胞；和

(3)将步骤(2)得到的CD105阳性(CD105⁺)的脐带血间充质干细胞接种于医学上可接受的生物可降解材料，形成骨移植物。

本发明组织工程化骨移植物中的种子细胞浓度通常约为1×10⁵/ml至5×10⁸/ml或更高，较佳地为1×10⁶/ml至1×10⁸/ml，更佳地为5×10⁶/ml至5×10⁷/ml。通常，以培养液调整种子细胞浓度，然后与可降解材料混合。混合时，培养液与可降解材料的比例没有特别限制，但是以该材料能够吸附的培养液最大量为宜。

此外，在本发明的组织工程化骨移植物中，还可添加或复合其他各种细胞、生长因子、各种转基因成分，从而保持骨细胞表型、促进骨细胞生长，以及促进组织工程化骨移植物在体内的血管神经化。

用本发明方法形成的组织工程化骨移植物或骨，可直接植入体内皮下、骨缺损处。

所述的骨移植物优选颅骨移植物，更佳地为人颅骨移植物。

如本文所用，“纯化的或分离的”指纯化的或分离的物质基本上不含有其他细胞、蛋白质或多肽。

术语“异种移植”指将所需生物材料(如脐带血)从某一物种中取出，分选得到的CD105阳性(CD105⁺)的脐带血间充质干细胞形成的组织工程骨移植物再施用于另一物种对象的方法。

术语“自体移植”指将所需生物材料(如脐带血)从某人中取出，分选得到的CD105阳性(CD105⁺)的脐带血间充质干细胞形成的组织工程骨移植物再施用于同一人的方法。

术语“同种异体移植”指将所需生物材料(如脐带血)从同一物种的某个体中取出，分选得到的CD105阳性(CD105⁺)的脐带血间充质干细胞形成的组织工程骨移植物再施用于另一不同个体的方法。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

本发明的主要优点在于：

1、首次使用CD105分选得到纯化的脐带血间充质干细胞。

2、首次将纯化的脐带血间充质干细胞作为种子细胞得到组织工程化骨移植物。

下面将结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。

本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

本发明实施例中使用的主要材料和试剂：

1.实验动物：Sprague-Dawley裸大鼠8只，3月龄，雄性，体重约250-300克，购于中国科学院上海实验动物中心。

2.低糖DMEM培养基，购于Gibco公司，美国。

3.Ficoll淋巴细胞分离液，购于Sigma公司，美国。

4.胎牛血清，购于Hyclone公司，美国。

5.CD105鼠抗人单克隆抗体(PE标记)，购于AbD Serotec公司，美国。

6.脱钙骨生物支架材料，自备(脱钙骨制备过程：①猪来源的松质骨骨片切取；②骨片冲洗；③脱细胞；④脱脂；⑤超声清洗；⑥脱钙；⑦二次脱脂；⑧干燥；⑨灭菌)。

实施例1

人UCB-MSCs分离和培养

脐血标本均来源于上海第六人民医院产科，获得产妇同意。每例脐血标本体积应不少于30mL，以等量的PBS缓冲液混匀，每10mL缓慢滴入到等量的Ficoll淋巴细胞分离液(密度1.077g/mL)，600g离心20min。抽取白膜层细胞，以等量的PBS缓冲液洗涤离心，基础培养液(含低糖DMEM，20％胎牛血清、100U/ml青霉素和链霉素、2mmol/L L-谷氨酰胺)重悬，接种至100mm、经胎牛血清涂层预处理的培养皿(Falcon，美国)，置于37℃、饱和湿度、5％CO₂的培养箱内培养。第5天首次全量换液，之后每周2次换液，2周后达60％-80％融合时，0.25％胰蛋白酶(含0.02％EDTA)消化传代。

实施例2

CD105细胞表面抗原分析与分选

分别取第1、4、7、10代细胞，胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液。含2％牛血清白蛋白的PBS缓冲液冲洗细胞，4℃下与CD105-PE单克隆抗体避光孵育30min。PBS缓冲液冲洗细胞，离心，弃上清。加入含1％多聚甲醛的PBS缓冲液0.2ml，使用同型对照单克隆抗体确定背景标记，流式细胞仪(BeckmanCoulter)分析标记细胞。

相同条件下，进行第1代细胞的CD105流式分选。具体步骤如下：

①胰蛋白酶消化细胞，300g离心5分钟。

②弃去上清液，加入PBS，300g离心5分钟。

③加入含1.0％牛血清白蛋白(BSA)的PBS，轻轻振摇试管，使细胞完全分散，制备成单细胞悬液，每管细胞数量应不少于5.0×10⁶。

④于每管加20μl稀释度为1∶50的CD105抗体溶液，混匀，置4℃下反应30min(直接荧光标记单标法)。

⑤300g离心5min，弃上清液。PBS反复洗涤2-3次。

⑥每管加入1000-2000μl PBS，悬浮细胞，40μm无菌滤网过滤。

⑦按照正常操作步骤，进行流式细胞分选，将细胞分为CD105⁺和CD105^-两类细胞群体。两类细胞常规接种培养，进行以下实验。

UCB-MSCs的CD105流式分析与分选结果：

不同代次UCB-MSCs的表面抗原检测结果显示，第1代至第10代细胞的CD105阳性表达率在30％-50％左右(图1A)。经分选纯化后，阳性率提高到95％以上(图1B)。

实施例3

人UCB-MSCs的培养

重复实施例1的步骤，将基础培养液中的含低糖DMEM和20％胎牛血清改为含15％胎牛血清的DMEM培养液(1000mg葡萄糖/升)或30％胎牛血清的DMEM培养液(4500mg葡萄糖/升)，原代脐血间充质干细胞的生长情况见图2。

结果表明，原代细胞在含15％胎牛血清的DMEM培养液(1000mg葡萄糖/升)中贴壁生长，形成细胞克隆；原代细胞在含30％胎牛血清的DMEM培养液(4500mg葡萄糖/升)中同样增殖旺盛，以克隆方式生长。

实施例4

细胞多向分化潜能与增殖能力的比较

流式分选后的细胞自接种次日起改用条件培养液，按照Zuk PA，Zhu M，Mizuno H，et al.Multilineage cells from human adipose tissue：implications for cell-basedtherapies.Tissue Eng.2001；7(2)：211-228.中公开的方法进行多向诱导。

成骨诱导液配方：基础培养液，10％胎牛血清，10^-8M地塞米松，10mM β-磷酸甘油酸钠，50μg/L磷酸抗坏血酸。诱导2w后行茜素红(Alizarin Red)染色，观察细胞外基质钙化和钙结节形成情况。

成脂肪诱导液配方：基础培养液，10％胎牛血清，0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、1μM地塞米松、10μM胰岛素、200μM吲哚美欣。诱导3w后行油红(Oil Red O)染色，观察细胞内脂肪颗粒形成情况。

成软骨诱导液配方：低糖DMEM，1％胎牛血清，10ng/ml TGF-β₁(转化生长因子β₁)，100ng/ml IGF(胰岛素样生长因子)，0.1μm地塞米松，6.25μg/ml转铁蛋白。诱导4w后行番红(Safranin O)染色，观察软骨特异性细胞外基质聚合蛋白多糖(GAG)的形成情况。

分别取对数生长期的CD105⁺与CD105^-细胞，胰蛋白酶消化，制备成浓度为1×10⁴/ml的细胞悬液，接种24孔板，每孔1ml。自细胞接种后每天行细胞计数(MTT法，每组3孔取均值)，连续2周，绘制细胞生长曲线。

统计学分析

细胞增殖的吸光度定量指标以均数±标准差的形式表示，应用SPSS11.0统计软件包进行统计学分析，p＜0.05为具有显著性差异。

细胞多向分化潜能与增殖能力的比较结果：

多向诱导分化：CD105⁺的UCB-MSCs成骨诱导2w后，茜素红(Alizarin Red)染色为阳性，形成面积大小不等的红色钙盐沉积区域。对照组则无明显钙沉积。成脂肪诱导3w后，CD105⁺的UCB-MSCs细胞浆内聚集较多脂滴样物，油红(OilRed O)染色证实诱导细胞胞浆内为脂性液体。对照组无脂滴形成。成软骨诱导4w后，CD105⁺的UCB-MSCs发生明显的成软骨分化，番红(Safranin O)染色为阳性，对照组则为阴性(图3)。

结果表明，CD105⁺的UCB-MSCs成骨、成脂肪和成软骨的多向诱导分化能力均显著高于CD105^-的细胞，表明经分选之后干细胞比例增高。

生长曲线：将CD105⁺与CD105^-的细胞计数结果绘制生长曲线，两者在前7天均增殖比较快速，8天之后进入平台期，数量变化不明显。在各时间点细胞数量无显著性差异(图4)。

结果表明，CD105⁺与CD105^-的UCB-MSCs体外增殖能力无明显差异。

实施例5

细胞材料复合物的制备

脱钙骨材料预先制备成5mm(直径)×1mm(高度)的圆片状。细胞培养、流式分选同实施例1和2，消化收集上述两类细胞群体，调整细胞浓度为20×10⁶/ml，每块材料接种50μl细胞悬液。细胞材料复合物体外成骨诱导培养2周后回植。

手术回植

裸大鼠8只，麻醉前禁饮食4小时，水合氯醛10mg/kg肌注麻醉，整个手术过程中动物保持俯卧位。麻醉平稳后，常规消毒铺巾，头部正中矢状切口，暴露双侧颅骨区，使用NSK手术环转，双侧各形成直径5mm的全层颅骨缺损，同时去除缺损区骨膜，彻底止血。一侧使用CD105+的人UCB-MSCs复合脱钙骨材料修复作为实验组，另一侧用CD105-的细胞复合材料修复作为对照组。全层缝合，关闭切口。术后未使用抗生素，于6周和12周各取材4只进行检测。

术后新生骨的评价

术后6周、12周取材，行如下检测观察骨缺损愈合修复情况。

1.大体观察：暴露双侧颅骨区观察骨愈合情况。

2.显微C T(MicroCT)：取下颅骨，去除周围软组织，拍摄显微CT三维成像观察。

3.组织学：标本取材后固定、脱钙、石蜡包埋，切片，苏木素-伊红(HE)染色。

结果

大体观察：术后6周时双侧骨缺损基本仍为脱钙骨材料覆盖，新生骨生成不明显；12周时实验组(CD105⁺细胞)为新生骨组织充填缺损，对照组(CD105^-细胞)为软组织充填缺损区，双侧脱钙骨材料均基本降解完全(图5)。

MicroCT：术后6周时实验组有少量新生骨组织，对照组无明显新骨生成；12周时支架材料均基本降解完全，其中实验组有骨组织形成，覆盖骨缺损的大部分区域；对照组仍无新生骨形成(图6)。

结果表明，术后6周，实验组表面形成少量新骨(右)，对照组新生骨不明显(左)；术后12周，实验组形成的组织工程骨覆盖骨缺损大部分区域(右)，对照组的缺损区未形成新生骨组织，脱钙骨材料降解完全(左)。

组织学检测：12周时取材HE染色表明，实验组有骨组织形成，为编织骨结构。但对照侧为纤维结缔组织，形成骨不连(图7)。

结果表明，实验组缺损部位有新骨生成，基本形成骨性连接(右)，对照组的缺损区为纤维组织，没有骨样结构(左)。

对比例

方法：分别取实施例1中得到的第1、4、7、10代细胞，胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液。含2％牛血清白蛋白的PBS缓冲液冲洗细胞，4℃下分别与CD29-PE(BD Pharmingen公司，美国)、CD31-PE(AbD Serotec公司，美国)、CD34-PE(BD Pharmingen公司，美国)、CD45-PE(AbD Serotec公司，美国)、CD105-PE(AbD Serotec公司，美国)及CD166-FITC(AbD Serotec公司，美国)单克隆抗体避光孵育30min。PBS缓冲液冲洗细胞，离心，弃上清。加入含1％多聚甲醛的PBS缓冲液0.2ml，使用同型对照单克隆抗体确定背景标记，流式细胞仪(Beckman Coulter)分析标记细胞。

不同代次UCB-MSCs表面抗原检测结果见表1。

表1不同代次UCB-MSCs表面抗原的阳性表达率(％，n＝5)

代次

CD29

CD31

CD34

CD45

CD105

CD166

P1

24.73±4.55

3.52±2.02

14.92±0.21

7.47±1.12

39.68±9.69

13.61±5.91

P4

29.88±8.49

1.61±0.25

6.94±0.24

4.97±0.15

41.12±4.68

33.12±7.37

P7

30.21±5.31

1.14±0.81

3.89±0.55

3.95±0.45

43.99±5.44

25.18±6.35

P10

40.01±4.88

0.81±0.15

2.96±0.17

3.94±0.33

49.8±10.74

24.83±5.11

结果表明，第1代至第10代细胞的CD105表达比较稳定，阳性率在40％-50％左右。而CD29和CD166的阳性表达率不稳定。CD31、CD34和CD45阳性率1％-15％不等。该结果显示，脐血间充质干细胞成分不纯，为多种细胞混杂的细胞群体，例如有CD34阳性的造血系细胞，CD31阳性的内皮祖细胞等，因此未分选纯化的细胞群肯定会影响脐血间充质干细胞构建组织工程骨的效果。

讨论

颅颌面骨缺损的修复目前主要有自体、异体骨移植、人工材料充填修复骨缺损这三种方法，但均有其各自的缺点。组织工程技术的兴起为骨缺损修复提供了新的方法。骨髓基质干细胞(BMSCs)具有在特定条件下快速增殖、定向分化等干细胞特性，已逐渐成为组织工程骨最常用的种子细胞。但其面临的主要问题有：细胞来源有限，骨髓的获取对供者是一种创伤，而且细胞体外扩增周期较长。因此，种子细胞是影响组织工程骨技术临床应用推广的关键因素之一。

近年来研究发现，在脐带血(UCB)中也存在类似的具有多向分化潜能的间充质干细胞(MSCs)。这类细胞不表达造血系标志(CD34，CD45，vWF等)，而与BMSCs具有类似的生物学行为(贴壁生长、成纤维细胞形态)和细胞表面标志(CD105，CD166，SH2，SH3等)。UCB-MSCs在体外特定诱导环境下，除了可以向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞分化之外，还可以分化为神经胶质细胞、肝细胞、心肌细胞等。与BMSCs相比，UCB-MSCs来源更丰富，取材更方便且无创伤，可以解决种子细胞来源不足，体外扩增周期长等缺点，因此潜在着巨大的临床应用价值。

但截至目前，尚未证实人UCB-MSCs能否作为组织工程骨的种子细胞来应用于骨组织构建并修复骨缺损。发明人认为UCB-MSCs是相对混杂的细胞群体，必须进行分选纯化，提高干细胞纯度，才有可能作为种子细胞构建组织工程骨。

发明人在本实验研究中采用CD105作为人UCB-MSCs分选纯化的干细胞表面标志，建立UCB-MSCs的分选纯化技术。检测结果表明，分选后的CD105+细胞体外增殖能力不受明显影响，而多向分化能力显著提高，证实干细胞成分和比例增高。以此作为种子细胞，脱钙骨为支架材料，建立裸大鼠颅骨标准缺损模型，运用组织工程技术进行修复。大体观察、影像学及组织学表明CD105+的UCB-MSCs/脱钙骨复合物能够修复颅骨缺损，而CD105-组却未能修复标准骨缺损，从而证实经分选纯化后的UCB-MSCs有望成为组织工程骨新的种子细胞来源。本发明表明UCB-MSCs在修复骨缺损中能够发挥作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。

Claims (10)

1.一种脐带血间充质干细胞的分离方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

(1)将来自脐血的间充质干细胞的单细胞悬液和荧光标记的CD105单克隆抗体混合；和

(2)通过流式细胞仪分选得到CD105阳性(CD105⁺)的脐带血间充质干细胞。

2.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤(1)中避光混合20-40分钟。

3.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述来自脐血的间充质干细胞选自第1、4、7、和/或10代细胞。

4.如权利要求3所述的分离方法，其特征在于，所述的来自脐血的间充质干细胞通过下述步骤得到：

(a)将脐血和淋巴细胞分离液混合、离心，得到白膜层细胞；和

(b)培养白膜层细胞，得到来自脐血的间充质干细胞。

5.如权利要求4所述的分离方法，其特征在于，步骤(b)中白膜层细胞培养在含有DMEM、胎牛血清、青霉素、链霉素、和L-谷氨酰胺的培养液中进行。

6.如权利要求1-5任一所述的分离方法，其特征在于，所述的脐带血是人脐带血。

7.一种脐带血间充质干细胞，其特征在于，所述的干细胞通过如权利要求1的分离方法得到，所述的脐带血间充质干细胞为CD105阳性(CD105⁺)。

8.一种如权利要求7所述的脐带血间充质干细胞的用途，其特征在于，(i)用作组织工程种子细胞；和/或(ii)用于制备组织工程化骨移植物。

9.一种组织工程化骨移植物，其特征在于，所述的移植物包括如权利要求7所述的脐带血间充质干细胞和医学上可接受的生物可降解材料。

10.一种如权利要求9所述的组织工程化骨移植物的制备方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

(1)将来自脐血的间充质干细胞的单细胞悬液和荧光标记的CD105单克隆抗体混合；

(2)通过流式细胞仪分选得到CD105阳性(CD105⁺)的脐带血间充质干细胞；和

(3)将步骤(2)得到的CD105阳性(CD105⁺)的脐带血间充质干细胞接种于医学上可接受的生物可降解材料，形成骨移植物。

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