CN103860565B - 一种治疗肝纤维化的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明属于中药或药物化学领域，涉及一种抗肝纤维化和/或肝硬化的药物组合物。具体地，本发明的药物组合物包含熊果酸和五味子乙素；或者由熊果酸和五味子乙素组成。本发明还涉及所述药物组合物在制备治疗和/或预防和/辅助治疗肝纤维化和肝硬化的药物、或者抑制肝星形细胞增殖或抑制肝星形细胞DNA合成的药物中的用途，以及一种抑制肝星形细胞增殖或抑制肝星形细胞DNA合成的方法。本发明的药物组合物可以明显改善肝纤维化的程度，其成分少，药效强，制备简单，并且无明显的肝细胞毒性，具有良好的市场前景，并且对于推动中药现代化有一定现实意义。

Description

一种治疗肝纤维化的药物组合物

技术领域

本发明属于中药或药物化学领域，涉及一种防治肝纤维化和/或肝硬化的药物组合物。本发明还涉及所述药物组合物在制备治疗和/或预防和/辅助治疗肝纤维化和/或肝硬化的药物或者抑制肝星形细胞增殖或者抑制肝星形细胞DNA合成的药物中的用途，以及一种抑制肝星形细胞增殖或抑制肝星形细胞DNA合成的方法。

背景技术

肝纤维化是以细胞外间质在肝脏过量沉积，导致肝脏结构或(和)功能异常的病理变化，是很多慢性肝病晚期共有的病理改变，是肝硬化的前驱阶段。肝纤维化的病因主要是各种损伤因素引起肝细胞损伤，受损的肝细胞、库普弗细胞（kupffer cell）、窦内皮细胞等在刺激下产生免疫介质和细胞因子，激活了肝星状细胞（Hepatic stellate cell，HSC），使得HSC合成大量细胞外基质（extracellular matrixc,ECM），ECM大量沉积在肝组织中，从而形成肝纤维化，肝星形细胞的激活是肝纤维化发生的中心环节。

肝纤维化的主要治疗方法可以分为几类：针对病因治疗、针对肝星形细胞、针对细胞外基质、保护肝细胞等，抑制肝星形细胞的活化、增殖、纤维生成等是抗肝纤维化的重要治疗手段。目前临床肝纤维化的治疗仍是针对病因治疗为主，以肝星形细胞为靶点的治疗药物除γ-干扰素外其他都未被批准进入临床应用。

目前已经有文献报道中药复方可以改善肝纤维化的发生，但是复方药味较多，一般3味以上，成分复杂且效果不理想。目前也已有关于熊果酸用于肝纤维化动物模型治疗的文献报道，但其治疗效果并不十分理想，且熊果酸浓度高时对肝细胞的毒性较强，这影响了其在临床上应用。

发明内容

本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，发现白花蛇舌草和五味子配伍有治疗肝纤维化和肝硬化的作用，经过进一步的研究发现这两味药中主要起作用的是熊果酸和五味子乙素两个单体，并且本发明人还发现熊果酸和五味子乙素组合后比二者单独应用具有更好的抑制肝星形细胞DNA合成的作用，且无肝细胞毒性。由此提供了下述发明：

本发明的一个方面涉及一种药物组合物，其包含熊果酸和五味子乙素；或者由熊果酸和五味子乙素组成。

根据本发明任一项所述的药物组合物，其中，熊果酸和五味子乙素的配比是：

熊果酸1－50摩尔，五味子乙素1－150摩尔；

优选地，熊果酸1－40摩尔，五味子乙素1－100摩尔；或者熊果酸1－25摩尔，五味子乙素1－50摩尔；或者熊果酸1－10摩尔，五味子乙素1－20摩尔；

更优选地，熊果酸1摩尔，五味子乙素1－20摩尔；或者熊果酸1摩尔，五味子乙素1－10摩尔；或者熊果酸1摩尔，五味子乙素1－5摩尔；

进一步优选地，熊果酸1摩尔，五味子乙素1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、或5摩尔。

特别优选地，熊果酸1摩尔，五味子乙素3摩尔（本发明中有时也称为优选组方）。

本发明的另一方面涉及一种药物组合物，其包含白花蛇舌草和五味子；或者由白花蛇舌草和五味子组成。

根据本发明任一项所述的药物组合物，其中，白花蛇舌草和五味子的配比是：

白花蛇舌草1－100重量份，五味子1－100重量份；

优选地，白花蛇舌草1－50重量份，五味子1－50重量份；或者白花蛇舌草1－25重量份，五味子1－25重量份；或者白花蛇舌草1－10重量份，五味子1－10重量份；

更优选地，白花蛇舌草1重量份，五味子1－10重量份；或者白花蛇舌草1重量份，五味子1－5重量份；或者白花蛇舌草1重量份，五味子1－3重量份；或者白花蛇舌草1重量份，五味子1－2重量份；

进一步优选地，花蛇舌草1重量份，五味子1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、或2重量份；

特别优选地，白花蛇舌草1重量份，五味子1.2重量份。

本发明中所述药材例如白花蛇舌草或五味子是干的药材，洗净、晒干即可。所述重量份也是指药材干重。所述五味子包括南五味子、北五味子等，优选北五味子。

本发明的再一方面涉及一种药物组合物，其包含白花蛇舌草提取物和五味子提取物；或者由白花蛇舌草提取物和五味子提取物组成；具体地，（提取物所用原料）白花蛇舌草和五味子的配比如上面的药物组合物（其包含白花蛇舌草和五味子；或者由白花蛇舌草和五味子组成）中所述。

根据本发明任一项所述的药物组合物，所述白花蛇舌草提取物中含有熊果酸；所述五味子提取物中含有五味子乙素。具体地，这两种提取物中的熊果酸和五味子乙素的比例或配比如上面的药物组合物（其包含熊果酸和五味子乙素；或者由熊果酸和五味子乙素组成）中所述。

根据本发明任一项的药物组合物，其中，

所述白花蛇舌草提取物通过如下步骤制得：

白花蛇舌草（Hedvotis diffusa）干品粉碎后，用80％－95％甲醇或乙醇回流提取2－4次，每次1－3h，过滤，合并滤液减压蒸除乙醇，残留物（乙醇总提取物）冷冻干燥除尽溶剂，得到白花蛇舌草干燥提取物，粉碎，过60－100目筛（优选过80目筛），即得。

根据本发明任一项所述的药物组合物，其中，

所述五味子提取物通过如下步骤制得：

北五味子（Schisandra chinensis(Turcz)Baill）干品粉碎后，80％－95％甲醇或乙醇回流提取2－4次，每次1－3h，过滤，合并滤液减压蒸除乙醇，残留物（乙醇总提取物）冷冻干燥除尽溶剂，得到白花蛇舌草干燥提取物，粉碎，过60－100目筛（优选过80目筛），即得。

本发明人对本发明的药物组合物的活性进行了深入研究。发明人分离大鼠原代肝星形细胞和肝细胞，并采用血小板衍生生长因子-BB（platelet-derived growth factor-BB，PDGF-BB）诱导肝星形细胞增殖模型，进行以下观察：

1、分离原代大鼠肝星形细胞和肝细胞，建立PDGF-BB诱导肝星形细胞增殖模型；

2、中药单体组方对肝星形细胞增殖模型的DNA合成的作用，证明两个单体组方后对肝星形细胞的增殖有明显抑制作用，其抑制效果比单用两者好；

3、中药单体组方对肝星形细胞的毒性作用，证明两个单体组方后对肝星形细胞有一定的毒性作用；

4、中药单体组方对肝细胞的毒性作用，证明这两个单体组方后在有效浓度内并无明显肝细胞毒性。

根据本发明任一项所述的药物组合物，其还包含一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂；具体地，其为注射剂、口服液、胶囊、片剂、颗粒剂、丸剂或提取物再混合剂型。

可采用常规加工方法，制成上述中药单体组成的注射液、口服液、胶囊、片剂、颗粒剂、丸剂、提取物再混合等剂型。

术语“组合物”意指包括包含指定量的各指定成分的产品，以及直接或间接从指定量的各指定成分的组合产生的任何产品。

通常本发明药物组合物含有0.1－90重量％的有效成分（熊果酸和五味子乙素）。药物组合物可根据本领域已知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将有效成分与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人用的适当的施用形式或剂量形式。

本发明的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。给药剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将给药单元制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将给药单元制成胶囊，将有效成分与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明明胶囊或软胶囊中。也可将有效成分制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。为了将给药单元制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。

本发明的药物组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重及个体反应，给药途径及给药次数等。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药。剂量水平须根据具体的给药途径、所治疗病况的严重程度以及待治疗患者的病况和既往病史等来选定。但是，本领域的做法是，给药剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。

本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的药物组合物在制备治疗和/或预防和/辅助治疗肝纤维化和/或肝硬化的药物或者抑制肝星形细胞增殖或者抑制肝星形细胞DNA合成的药物中的用途。

本发明的再一方面涉及一种在体内或体外抑制肝星形细胞增殖或抑制肝星形细胞DNA合成的方法，包括使用有效量的本发明中任一项所述的药物组合物的步骤。

本发明的再一方面涉及一种治疗和/预防和/辅助治疗肝纤维化和肝硬化的方法，包括给予受试者有效量的本发明中任一项所述的药物组合物的步骤。

术语“预防和/或治疗有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。

术语“受试者”可以指患者或者其它接受本发明药物组合物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。

术语“疾病和/或病症”是指所述受试者的一种身体状态，该身体状态与本发明所述疾病和/或病症有关。

但应认识到，本发明的药物组合物的总日用量须由主诊医师在可靠的医学判断范围内作出决定。对于任何具体的患者，具体的治疗有效剂量水平须根据多种因素而定，所述因素包括所治疗的障碍和该障碍的严重程度；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；给药时间、给药途径和排泄率；治疗持续时间；与组合使用或同时使用的药物；及医疗领域公知的类似因素。例如，本领域的做法是，给药的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。一般说来，本发明的药物组合物以有效成分（熊果酸和五味子乙素）计算用于哺乳动物特别是人的剂量可以介于0.001－1000mg/kg体重/天，例如介于0.01－100mg/kg体重/天，例如介于0.01－10mg/kg体重/天。

根据本发明的药物组合物可以有效地预防和/或治疗本发明所述的各种疾病或病症。

发明的有益效果

本发明的药物组合物可以明显改善肝纤维化的程度，其成分少，药效强，制备简单，并且无明显的肝细胞毒性。

附图说明

图1：熊果酸和五味子乙素分别单用对原代肝细胞活力的影响。单因素方差分析，组间比较采用Dunnett-t检验，**P＜0.01，和Con比较。

图2：熊果酸和五味子乙素不同配比组方（又称为US组方）对HSC DNA合成的影响。

图3：白花蛇舌草和五味子组方对原代HSC活力的影响。单因素方差分析，组间比较采用Dunnett-t检验，***P<0.001，和Con比较。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：原代大鼠肝星形细胞增殖模型的建立

1.试剂和细胞

雄性Wistar大鼠，400g左右，军事医学科学院实验动物中心提供。

96孔板，Corning；Ⅳ型胶原酶，sigma公司；Pronase E，Roche公司；Dnase Ⅰ，Roche公司；DMEM培养液，天润善达生物科技有限责任公司；肝素钠，国药集团化学试剂有限公司；PDGF-BB，Peprotech公司。

蠕动泵，保定兰格恒流泵有限公司；多头细胞样品收集器，浙江绍兴ZT-2型；液体闪烁计数仪，PerkinElmer公司，型号：1450-024。

2.实验步骤

采用原位灌流法分离得到原代大鼠肝星形细胞（江涛，梁立武，郭顺根，等.肝星形细胞的分离与培养.武警医学院学报，2001,11(1):7.），按1×10⁵个/ml的密度接种于96孔板中，培养基为含20％FBS的DMEM高糖培养基，37℃、5％CO₂培养箱培养24h，换为含0.5％FBS的DMEM高糖培养基，37℃、5％CO₂培养箱培养48h，每孔加入用DMEM高糖培养基配制的PDGF-BB，使其加入反应体系后的浓度分别为1、5、25ng/ml，正常对照组加入DMEM高糖培养基，培养20h。每孔加入20μl³H-TdR，继续培养4h，采用多头细胞收集仪收集细胞于玻璃纤维滤纸上，待滤纸干后，在液体闪烁计数仪上检测其闪烁值。

3.结果。如下面的表1所示。

表1：原代大鼠肝星形细胞增殖模型（均数±标准差）

单因素方差分析，组间比较采用Dunnett-t检验，均数±标准差，***P<0.001，和对照比较。

由表1可以看出，随着PDGF-BB浓度的增加，³H-TdR测定的原代HSC ³H-TdR掺入值均数逐渐升高，其中25ng/ml时其掺入值高于对照组，差异有显著性（P<0.001），说明该浓度的PDGF-BB可以明显促进HSC的DNA合成，即可以成为HSC增殖模型，所以选定25ng/ml为后续HSC增殖模型的造模浓度。

实施例2：熊果酸和五味子乙素单用对原代肝细胞的毒性作用

1.实验材料

噻唑兰（Thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT），Amreaco公司；Ensipire多功能酶标仪，PerkinElmer，型号：2300；其它试剂来源同实施例1。

熊果酸和五味子乙素可以商购（例如购于上海同田生物技术有限公司，货号分别为E-0076和E-0133，纯度均大于97%）或者参考下面的实施例8－9的方法制备。

2.实验步骤

采用MTT法观察熊果酸和五味子乙素单用对原代肝细胞的毒性作用。原位灌流法分离得到原代大鼠肝细胞（劳全林，江青艳，高淑静，等.用原位灌流法分离大鼠肝细胞.华南农业大学学报（自然科学版）2001，22（3）:90.），按5×10⁵个/ml的密度接种于96孔板中，培养基为含10％FBS的DMEM高糖培养基，37℃、5％CO₂培养箱培养4h，换新鲜的培养基，37℃、5％CO₂培养箱培养20h，换用新鲜培养基，加入熊果酸、五味子乙素，使其加入反应体系后的浓度为2.5、7.5和22.5μM，正常对照(Con组)加入DMEM高糖培养基。培养20h，每孔加入20μl 0.25％MTT，继续培养4h，加入10％SDS 150μl培养过夜，采用酶标仪在570nm检测其吸光度。

3.实验结果。

如图1所示。

结果显示，熊果酸22.5μM时对肝细胞有一定毒性作用，可降低肝细胞活力，五味子乙素在2.5-22.5μM范围内对肝细胞无明显毒性。

实施例3：熊果酸和五味子乙素单用以及组合使用对原代HSCDNA合成的影响

1.试剂和细胞

熊果酸和五味子乙素可以商购（例如购于上海同田生物技术有限公司，货号分别为E-0076和E-0133，纯度均大于97%）或者参考下面的实施例8－9的方法制备。

2.实验方法和步骤

采用³H-TdR掺入法观察熊果酸和五味子乙素对肝星形细胞DNA合成的影响。原位灌流法分离得到原代大鼠肝星形细胞，按1×10⁵个/ml的密度接种于96孔板中，培养基为含20％FBS的DMEM高糖培养基，37℃、5％CO₂培养箱培养24h，换为含0.5％FBS的DMEM高糖培养基，37℃、5％CO₂培养箱培养48h，分别加入药物（熊果酸、五味子乙素），使其加入反应体系后的浓度为2.5和7.5μM，同时模型和各给药组每孔加入PDGF-BB 25ng/ml，正常对照组加入DMEM高糖培养基，培养20h，每孔加入20μl ³H-TdR，继续培养4h，采用多头细胞收集仪收集细胞于玻璃纤维滤纸上，待滤纸干后，在液体闪烁计数仪上检测其闪烁值。

3.实验结果

如表2和表3所示。

表2：熊果酸、五味子乙素及其组方对原代HSC DNA合成的影响

单因素方差分析，组间比较采用Dunnett-t检验，均数±标准差，***P<0.001，和正常对照比较；###P<0.001，和PDGF-BB+DMSO比较。

计算两药相互作用指数(coeffcieent of durg intearction，CDI)，计算公式为:CDI=AB/（A×B），AB为熊果酸+五味子乙素组³H-TdR掺入值与PDGF-BB+DMSO组³H-TdR掺入值的比值；A或B是各药物单独使用组³H-TdR掺入值与PDGF-BB+DMSO组³H-TdR掺入值的比值。当CDI<1两药有协同作用;当CDI<0.07时，协同作用非常显著。熊果酸和五味子乙素的相互作用系数如表3所示。

表3：熊果酸和五味子乙素组方对原代HSC DNA合成的相互作用系数（CDI）

熊果酸+五味子乙素（μM）	2.5+2.5	2.5+2.5	2.5+2.5	2.5+2.5
					CDI	0.939	0.782	0.317	0.762

由表2结果可见，熊果酸和五味子乙素合用组都能明显抑制原代HSC的DNA合成，和两药单用比有统计学差异；由表3结果可见，熊果酸和五味子乙素合用组均具有协同抑制原代肝星形细胞DNA合成的作用。

采用SAS统计软件对表2中“熊果酸和五味子乙素”组中的4种组合方式进行析因设计的方差分析，结果如下面的表4所示。

表4：熊果酸和五味子乙素组方各个效应项的检验结果

来源	自由度	F值	P值
				熊果酸	1	760.36	<0.0001
五味子乙素	1	79.79	0.0001
				熊果酸*五味子乙素	1	79.03	0.0001

由表4可见，熊果酸、五味子乙素和熊果酸*五味子乙素的P值都<0.001，说明熊果酸、五味子乙素及两者之间的相互作用对肝星形细胞的DNA合成均有影响。

根据表2的实验结果，因熊果酸在高浓度条件下对肝细胞有毒性作用，故在满足实验需求的情况下应尽量减少熊果酸的浓度，通过实验数据分析，本发明人选择组方2即熊果酸2.5μM+五味子乙素7.5μM为优选组方，并对其进行进一步的药效评价。

实施例4：熊果酸和五味子乙素不同配伍比例对原代大鼠肝星形细胞DNA合成的影 响

1.试剂

熊果酸和五味子乙素可以商购（例如购于上海同田生物技术有限公司，货号分别为E-0076和E-0133，纯度均大于97%）或者参考下面的实施例8－9的方法制备。。

2.实验步骤

采用原位灌流法分离得到原代大鼠肝星形细胞，按1×10⁵个/ml的密度接种于96孔板中，培养基为含20％FBS的DMEM高糖培养基，37℃、5％CO₂培养箱培养24h，换为含0.5％FBS的DMEM高糖培养基，37℃、5％CO₂培养箱培养48h，模型及各给药组每孔加入PDGF-BB25ng/ml，熊果酸和五味子乙素组方按表5中配伍比例加入，使熊果酸和五味子乙素加入反应体系后的总摩尔浓度为5μM，培养20h，每孔加入20μl³H-TdR，继续培养4h，采用多头细胞收集仪收集细胞于玻璃纤维滤纸上，待滤纸干后，在液体闪烁计数仪上检测其闪烁值。

表5：US组方配伍设计

3.实验结果

如图2所示。

由图2可见，在药物总的摩尔浓度一致的情况下，熊果酸和五味子不同配伍比例组方（US组方）都有抑制肝星形细胞DNA合成的作用，以组方3的抑制作用最强。根据表5，组方3的配伍比例为0.23:0.77，和本研究的优选组方即熊果酸：五味子乙素=1：3的比例非常接近，这也说明本研究所选用的优选组方是合理的。

实施例5：US优选组方对原代HSC的毒性作用

1.实验材料

MTT，Amreaco公司；Ensipire多功能酶标仪，PerkinElmer，型号：2300；其它试剂来源同实施例1。

2.实验方法和步骤

采用MTT法观察优先组方对肝星形细胞的毒性作用。原位灌流法分离得到原代大鼠肝星形细胞，按1×10⁵个/ml的密度接种于96孔板中，培养基为含20％FBS的DMEM高糖培养基，37℃、5％CO₂培养箱培养24h，换为含0.5％FBS的DMEM高糖培养基，37℃、5％CO₂培养箱培养48h，加入熊果酸、五味子乙素，使其加入反应体系后的浓度为2.5和7.5μM，其加入体系后总药物浓度为10μM，正常对照组加入DMEM高糖培养基。培养20h，每孔加入20μl 0.25％MTT，继续培养4h，加入10％SDS 150μl培养过夜，采用酶标仪在570nm检测其吸光度。

3.结果。如下面的表6所示。

表6：US优选组方对原代HSC的毒性作用

单因素方差分析，组间比较采用Dunnett-t检验，***P<0.001，和DMSO比较。

由表6可见，US优选组方能降低HSC的活力，对HSC有一定细胞毒的作用。

实施例6：US优选组方对原代肝细胞的毒性作用

1.实验材料

MTT，Amreaco公司，Ensipire多功能酶标仪，PerkinElmer，型号：2300；其它试剂来源同实施例1。

2.实验步骤

采用MTT法观察US优选组方对原代肝细胞的毒性作用。原位灌流法分离得到原代大鼠肝细胞，按5×10⁵个/ml的密度接种于96孔板中，培养基为含10％FBS的DMEM高糖培养基，37℃、5％CO₂培养箱培养4h，换新鲜的培养基，37℃、5％CO₂培养箱培养20h，换用新鲜培养基，同时加入熊果酸、五味子乙素，使其加入反应体系后的浓度为2.5和7.5μM，正常对照加入DMEM高糖培养基。培养20h，每孔加入20μl0.25％MTT，继续培养4h，加入10％SDS 150μl培养过夜，采用酶标仪在570nm检测其吸光度。

3.结果。如下面的表7所示。

表7：US优选组方对原代肝细胞的毒性作用

单因素方差分析，组间比较采用Dunnett-t检验。

结果显示，该优选组方对肝细胞无毒副作用。

上面的实验结果显示，熊果酸和五味子乙素的组方可以有效抑制HSC的DNA合成，对HSC发挥细胞毒作用，且对原代肝细胞无明显影响，从而可能在治疗肝纤维化方面可能具有一定作用。

实施例7：白花蛇舌草和五味子乙素乙醇提取物对原代HSC的毒性作用

1.实验材料

MTT，Amreaco公司；Ensipire多功能酶标仪，PerkinElmer，型号：2300；其它试剂来源同实施例1。

2.白花蛇舌草提取物和五味子提取物的制备

白花蛇舌草干品粗粉1kg，用90％乙醇回流提取3次，每次2h，过滤，合并滤液减压蒸除乙醇，残留物（乙醇总提取物）冷冻干燥除尽溶剂，得到白花蛇舌草干燥提取物，粉碎，过80目筛，即得。

五味子干品粗粉1kg，用90％乙醇回流提取3次，每次2h，过滤，合并滤液减压蒸除乙醇，残留物（乙醇总提取物）冷冻干燥除尽溶剂，得到五味子干燥提取物，粉碎，过80目筛，即得。

3.实验步骤

采用MTT法观察白花蛇舌草和五味子乙素乙醇提取物对原代HSC的毒性作用。原位灌流法分离得到原代大鼠肝星形细胞，按1×10⁵个/ml的密度接种于96孔板中，培养基为含20％FBS的DMEM高糖培养基，37℃、5％CO₂培养箱培养24h，换为含0.5％FBS的DMEM高糖培养基，37℃、5％CO₂培养箱培养48h，加入白花蛇舌草、五味子的乙醇提取物复方(重量比为1:2)，使其加入反应体系后的复方总药物浓度（是指白花蛇舌草提取物和五味子提取物的总重量占体系的总体积）为0.2、2、20μg/ml，其加入体系后的浓度为2μg/ml，同时每孔加入PDGF-BB，使其加入反应体系后的浓度为25ng/ml，正常对照（Con）组加入DMEM高糖培养基。培养20h，每孔加入20μl 0.25％MTT，继续培养4h，加入10％SDS 150μl培养过夜，采用酶标仪在570nm检测其吸光度。

4.结果。

如图3所示。由图3可见，白花蛇舌草和五味子乙醇提取物组方（复方）有一定抑制肝星形细胞活力的作用。

实施例8：从白花蛇舌草中提取熊果酸的提取工艺

白花蛇舌草干燥全草（10kg）经粉碎机粉碎后，分别用乙酸乙酯和乙醇浸泡3次，并合并所得浸膏。将浸膏过正相柱色谱进行分离，其中得到的第12段（2g）继续过RP-C18反相柱进行分离，将其中的186-206管进行合并，得到795mg样品，为了进一步纯化样品，采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（5：4：5：4）的逆流色谱分离体系去除杂质，检测波长210nm，流速2ml/min，转速800，合并47－50管，得到纯度为98％的白色结晶性粉末。其结构经NMR和MS测定即为目的化合物熊果酸。

实施例9：从五味子中提取五味子乙素的提取工艺

取五味子的干燥果实，粉碎机进行粉碎后，过40目筛，取过筛之后的五味子粉末10g，加入90％的乙醇50mL，回流提取2.5h，提取次数为3次，合并滤液，减压蒸除乙醇，将残留物溶于200ml甲醇中，以1.0mL/min的流速上柱，大孔树脂AB-8吸附150min，吸附之后利用蒸馏水60ml以0.5mL/min的流速进行洗脱，收集过柱流出液，干燥得纯度为97％的白色粉末。其结构经NMR和MS测定即为目的化合物熊果酸。

实施例10：熊果酸和五味子复方注射剂的制备

（1）将吐温-800.1ml、司盘-80、胆固醇及脑磷脂溶于适量的磷酸盐缓冲液中，制成未包封药物的多相脂质体。

（2）将熊果酸1g、五味子乙素3g、吐温-8000.1ml、聚乙烯毗咯烷酮（PVP）溶于60m l磷酸盐缓冲液中。

（3）将上述制备的脂质体、熊果酸、五味子乙素磷酸盐缓冲液经流通蒸汽灭菌处理后，再将灭菌液经超声法处理两次，每次10min。

（4）在无菌条件下，往65℃熔融状态的脂质体中加入熊果酸和五味子乙素磷酸盐缓冲溶液和海藻糖、冻结保护剂。

（5）加入磷酸盐缓冲液至100ml后，过滤灌注安瓿中，每支1ml。快速冷冻，再升温至一定温度，最后在真空条件下冻干即得。

实施例11：熊果酸和五味子乙素复方胶囊的制备

将熊果酸（粉末）和五味子乙素（粉末），混合均匀，装入胶囊即得。

实施例12：熊果酸和五味子复方片剂的制备

取熊果酸1g、五味子乙素3g，与PEG4000.1ml、PVP和β-CD，混合均匀，制成固定分散物，粉碎过80目筛，采用干法粉末直接压片。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (14)

1.一种药物组合物，其由熊果酸和五味子乙素组成，其中，熊果酸和五味子乙素的配比是：熊果酸1－50摩尔，五味子乙素1－150摩尔。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，熊果酸和五味子乙素的配比是：熊果酸1－40摩尔，五味子乙素1－100摩尔。

3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，熊果酸和五味子乙素的配比是：熊果酸1－25摩尔，五味子乙素1－50摩尔。

4.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，熊果酸和五味子乙素的配比是：熊果酸1－10摩尔，五味子乙素1－20摩尔。

5.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，熊果酸和五味子乙素的配比是：熊果酸1摩尔，五味子乙素1－20摩尔。

6.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，熊果酸和五味子乙素的配比是：熊果酸1摩尔，五味子乙素1－10摩尔。

7.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其中，熊果酸和五味子乙素的配比是：熊果酸1摩尔，五味子乙素1－5摩尔。

8.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，熊果酸和五味子乙素的配比是：熊果酸1摩尔，五味子乙素1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、或5摩尔。

9.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，熊果酸和五味子乙素的配比是：熊果酸1摩尔，五味子乙素3摩尔。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的药物组合物，其还包含一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。

11.根据权利要求10所述的药物组合物，其为注射剂、口服液、胶囊、片剂、颗粒剂或丸剂。

12.权利要求1至11中任一项所述的药物组合物在制备治疗和/或预防肝纤维化和/或肝硬化的药物，或者抑制肝星形细胞增殖或者抑制肝星形细胞DNA合成的药物中的用途。

13.根据权利要求12所述的用途，其中，所述治疗为辅助治疗。

14.一种在体外抑制肝星形细胞增殖或抑制肝星形细胞DNA合成的方法，包括使用有效量的权利要求1至11中任一项所述的药物组合物的步骤。