CN103805672A - 一种酶法制备氨苄西林的工艺 - Google Patents
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Abstract
一种酶法制备氨苄西林的工艺，其包括以下步骤：（a）将6-氨基青霉烷酸、苯甘氨酸衍生物与青霉素G酰化酶混合于水中，得混合液；（b）用酸或碱调节控制混合液的pH值为5.5～6.1后，在温度为0～40℃下进行反应；（c）待反应完全后，分离，将含有氨苄西林粗品的反应液用酸溶清，再用碱结晶，养晶，洗涤，干燥，得氨苄西林产品。本发明提供的制备工艺不仅工艺简单、操作方便、能耗较小、安全性高、稳定性好，而且反应体系要求的pH值易于控制、反应时间短、转化率高达99%以上、产品纯度高、无需溶媒回收。因此，本发明在工业生产的推广应用中是一种低成本、高效率的生产工艺。
Description
技术领域
本发明涉及一种药物的制备方法，具体地说是一种酶法制备氨苄西林的工艺。
背景技术
氨苄西林是一种β-内酰胺抗生素，除其本身具有广谱抗菌活性、杀菌活性强、毒性低、适应症广及临床应用广泛外，还是合成许多半合成青霉素的原料，如：氨苄西林钠、哌拉西林、美洛西林、阿洛西林等。因此，该药的生产需求量相对较大。
目前，该药物的合成方法主要是化学法和酶法。其化学合成法的过程繁琐，条件苛刻，对环境的污染较大；而酶法合成可以显著减少反应步骤，条件温和，降低能耗，对环境污染较小。现有酶法合成氨苄西林主要采用的工艺路线为：苯甘氨酸甲酯盐酸盐和6-氨基青霉素烷酸（6-APA）在合成酶的催化作用下生成氨苄西林，进一步分离、结晶、干燥得到纯品。但是，采用上述酶法合成氨苄西林在工业生产中还存在诸多问题。如专利EP 0339751 B1中公开了以6-APA和D-PGMe为原料在酰化酶的作用下，控制恒定的pH=6.3反应，在温度为5-15℃下，获得产物，转化率为88%，反应时间为6 h。另有US 7029885 B2中也公开了以6-APA和D-苯基甘氨酸酰胺·1/2 H2SO4在水中通过控制恒定的pH来制备氨苄西林，其中原料D-苯基甘氨酸酰胺·1/2 H2SO4在反应过程中以恒定的速度加入到反应器中，反应9 h，获得产物，6-APA的转化率为97.5%。为避免“在高浓度的6-APA下进行酰化反应时，合成氨苄西林的转化率低”，该方法采用将D-苯基甘氨酸酰胺原料以分批法加入或部分量入的方式完成反应。但是，在反应过程中，随着该原料的不断滴加，反应液的PH值不断降低，PH值低到一定值时，酰化酶活性降低甚至失活，导致反应速度降低，而不得不通过延长反应时间来获得较高的转化率，但反应时间的延长导致发生水解反应（副反应）的几率增加，从而影响产品的纯度及最终转化率。因此，该制备方法必须采取在整个反应过程中，保持反应液pH值恒定的方式进行，以避免酰化酶活性降低同时也有效抑制水解反应的发生，从而得到较高的转化率和较好的纯度。而这种加料方式对控制性的要求高，并且需要连续不断地调节反应液的酸碱度以保持恒定的pH值，其生产工艺较为繁琐，工业控制性差。这些问题的存在致使该酶法制备工艺在工业上推广应用的难度较大。
发明内容
本发明的目的就是提供一种酶法制备氨苄西林的工艺，以解决现有酶法制备氨苄西林存在工艺步骤繁琐，工业控制性要求高、转化率低以及反应时间长等问题。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种酶法制备氨苄西林的工艺它包括以下步骤：
（a）将6-氨基青霉烷酸、苯甘氨酸衍生物与青霉素G酰化酶混合于水中，得混合液；其中6-氨基青霉烷酸与苯甘氨酸衍生物的摩尔比为1:1.0～2.0，青霉素G酰化酶在反应体系中的浓度为5-100IU/ml；
（b）用酸或碱调节混合液的pH值为5.5～6.1后，在温度为0～40℃下进行反应；
（c）待反应完全后，分离，将含有氨苄西林粗品的反应液用酸溶清，再用碱结晶，养晶，洗涤，干燥，得氨苄西林产品。
本发明所述步骤（a）中苯甘氨酸衍生物是指苯甘氨酸甲酯、苯甘氨酸乙酯、苯甘氨酸甲酯硫酸盐、苯甘氨酸甲酯盐酸盐、苯甘氨酸甲酯硝酸盐、苯甘氨酸乙酯硫酸盐、苯甘氨酸乙酯盐酸盐、苯甘氨酸乙酯硝酸盐、苯甘氨酰胺、苯甘氨酰胺硫酸盐、苯甘氨酰胺盐酸盐、苯甘氨酰胺硝酸盐中的一种或两种或多种任意比的组合。
本发明步骤（a）中所述青霉素G酰化酶为固定化的青霉素G酰化酶。
本发明步骤（a）中所述青霉素G酰化酶在反应体系中的浓度为5～80IU/ml，优选浓度为5～60IU/ml。
本发明步骤（b）和步骤（c）中酸为硫酸、硝酸、盐酸、磷酸、醋酸、硼酸、柠檬酸中的一种或两种或多种的任意比组合；碱选自氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氨水、三乙胺中的一种或两种或多种的任意比组合。
本发明所述步骤（b）中用酸或碱调节混合液的pH值至5.5～6.1之间的任意一个值后，在温度为0～40℃下进行反应；优选pH值为5.5～5.9之间的任意值，反应温度为5-25℃；更优选pH值为5.5～5.7之间的任意值，反应温度为10-20℃。
本发明所述步骤（c）中反应完全是指反应后的6-氨基青霉烷酸残留量优选不高于15mM，更优选不高于10mM。
本发明所述步骤（c）将含有氨苄西林粗品的反应液在温度为35℃以下，用酸调节反应液的pH为0.6～1.6，碱结晶时反应液的pH为4.0～6.5。
本发明所述步骤（c）将含有氨苄西林粗品的反应液在温度为5～30℃下，更优选10～20℃，用酸调节反应液的pH值优选为0.8～1.4，用碱结晶时反应液的pH优选为4.5～5.5。
本发明所述步骤（c）养晶温度优选0-20℃，更优选0-10℃。
本发明在完全的水相介质中，按配比一次性加入6-APA、苯甘氨酸衍生物以及青霉素G酰化酶，操作人员仅需在发生反应之前将其混合液的pH值调整到某个适宜的值后，不需在反应过程中再进行pH值的调控，即可进行反应，这不仅解决了现有酶法制备该药品需要保持恒定pH值致使工作人员在整个反应过程都要不断地调控pH值带来工艺繁琐的问题，而且克服了现有酶法合成工艺在反应过程中原料和产物的浓度、体积不断变化，导致产物转化率低、纯度差的缺陷。本发明提供的制备工艺不仅工艺简单、操作方便、能耗较小、安全性高、稳定性好，而且反应体系要求的pH值易于控制、反应时间短、6-APA的转化率高达99%以上、产品纯度高、无需溶媒回收，因此，本发明在工业生产的推广应用中是一种低成本、高效率的生产工艺。
具体实施方式
下面实施例用于进一步详细说明本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1
将0.058mol的 6-APA、0.06mol的苯甘氨酸甲酯盐酸盐、2000IU固定化青霉素G酰化酶和200mL水混合，用硫酸和碳酸钠调节反应液的pH值为5.7，保持温度在15-20℃下进行反应；反应结束时，6-APA的残留量在5mM，然后将固定化青霉素G酰化酶与含有氨苄西林产物的反应液分离；所得含有氨苄西林产物的溶液在15℃下，用盐酸调至pH=0.8-1.0，过滤，用碳酸氢钠调结晶，调至终点pH=5.0；在5℃下养晶3h后洗涤、干燥，即得氨苄西林。
实施例2
将0.058mol的 6-APA、0.073mol的苯甘氨酸甲酯盐酸盐、2000IU固定化青霉素G酰化酶和200mL水混合，用硫酸和碳酸钠调节反应液的pH值为5.9，保持温度在15-20℃下进行反应；反应结束时，6-APA的残留量在5mM，然后将固定化青霉素G酰化酶与含有氨苄西林产物的反应液分离；所得含有氨苄西林产物的溶液在15℃下，用盐酸调至pH=0.8-1.0，过滤，用碳酸氢钠调结晶，调至终点pH=4.5；在8℃下养晶2h后洗涤、干燥，即得氨苄西林。
实施例3
将0.058mol的 6-APA、0.07mol的苯甘氨酸甲酯硝酸盐、1724IU固定化青霉素G酰化酶和200mL水混合，用硫酸和碳酸钠调节反应液的pH值为5.9，保持温度在0-10℃下进行反应； 当6-APA的残留量不高于10mM时，反应结束，然后将青霉素G酰化酶与含有氨苄西林产物的反应液分离；所得含有氨苄西林产物的溶液在35℃条件下，用硫酸调至pH=0.6，过滤，用碳酸钠调结晶，调至终点pH=4.0；在10℃下养晶3h后洗涤、干燥，即得氨苄西林。
实施例4
将0.058mol的 6-APA、0.032mol的苯甘氨酸甲酯盐酸盐和0.032mol苯甘氨酸甲酯硫酸盐、1400IU固定化青霉素G酰化酶和200mL水混合，用硝酸和氨水调节反应液的pH值为5.6，保持温度在10-20℃下进行反应； 当6-APA的残留量在15mM时，反应结束，然后将青霉素G酰化酶与含有氨苄西林产物的反应液分离；所得含有氨苄西林产物的溶液在25℃条件下，用硫酸调至pH=1.0，过滤，用碳酸钠调结晶，调至终点pH=5.5；在15℃下养晶2h后洗涤、干燥，即得氨苄西林。
实施例5
将0.058mol的 6-APA、0.03mol的苯甘氨酸乙酯硫酸盐和0.04mol苯甘氨酸乙酯硝酸盐、2000IU固定化青霉素G酰化酶和200mL水混合，用硝酸和氨水调节反应液的pH值为5.9，保持温度在20-25℃下进行反应； 当6-APA的残留量在12mM时，反应结束，然后将青霉素G酰化酶与含有氨苄西林产物的反应液分离；所得含有氨苄西林产物的溶液在20℃条件下，用硫酸调至pH=1.5，过滤，用碳酸钠调结晶，调至终点pH=5；在0℃下养晶3h后洗涤、干燥，即得氨苄西林。
实施例6
将0.058mol的 6-APA、0.03mol的苯甘氨酸乙酯盐酸盐和0.04mol的苯甘氨酸乙酯硝酸盐、1724IU固定化青霉素G酰化酶和200mL水混合，用硝酸和氨水调节反应液的pH值，控制pH为5.6，保持温度在20-25℃下进行反应； 当6-APA的残留量在10mM时，反应结束，然后将青霉素G酰化酶与含有氨苄西林产物的反应液分离；所得含有氨苄西林产物的溶液在15℃条件下，用硫酸调至pH=1.6，过滤，用碳酸钠调结晶，调至终点pH=6.0；在0℃下养晶2.5h后洗涤、干燥，即得氨苄西林。
实施例7
将0.058mol的 6-APA、0.04mol的苯甘氨酰胺盐酸盐和0.05mol苯甘氨酰胺硫酸盐、1400IU固定化青霉素G酰化酶和200mL水混合，用硝酸和氨水调节反应液的pH值为5.9，保持温度在15-25℃下进行反应； 当6-APA的残留量在10mM时，反应结束，然后将青霉素G酰化酶与含有氨苄西林产物的反应液分离；所得含有氨苄西林产物的溶液在25℃条件下，用硫酸调至pH=1.0，过滤，用碳酸钠调结晶，调至终点pH=4.8；在20℃下养晶3h后洗涤、干燥，即得氨苄西林。
实施例8
将0.058mol的 6-APA、0.116mol的苯甘氨酰胺盐酸盐、1000IU固定化青霉素G酰化酶和200mL水混合，用硝酸和氨水调节反应液的pH值为5.5，保持温度在0-5℃下进行反应； 当6-APA的残留量在15mM时，反应结束，然后将青霉素G酰化酶与含有氨苄西林产物的反应液分离；所得含有氨苄西林产物的溶液在25℃条件下，用硫酸调至pH=0.6，过滤，用碳酸钠调结晶，调至终点pH=4.0；在20℃下养晶3h后洗涤、干燥，即得氨苄西林。
实施例9
将0.058mol的 6-APA、0.09mol的苯甘氨酰胺硝酸盐和0.026mol的苯甘氨酰胺盐酸盐、20000IU固定化青霉素G酰化酶和200mL水混合，用硝酸和氨水调节反应液的pH值为6.1，保持温度在35-40℃下进行反应； 当6-APA的残留量在5mM时，反应结束，然后将青霉素G酰化酶与含有氨苄西林产物的反应液分离；所得含有氨苄西林产物的溶液在25℃条件下，用硫酸调至pH=1.6，过滤，用碳酸钠调结晶，调至终点pH=6.5；在0℃下养晶3h后洗涤、干燥，即得氨苄西林。
实施例10
将0.058mol的 6-APA、0.116mol的苯甘氨酰胺硝酸盐、12000IU固定化青霉素G酰化酶和200mL水混合，用硝酸和氨水调节反应液的pH值为5.83，保持温度在35-40℃下进行反应； 当6-APA的残留量在5mM时，反应结束，然后将青霉素G酰化酶与含有氨苄西林产物的反应液分离；所得含有氨苄西林产物的溶液在25℃条件下，用硫酸调至pH=1.6，过滤，用碳酸钠调结晶，调至终点pH=6.5；在0℃下养晶3h后洗涤、干燥，即得氨苄西林。
对比例1
将0.058mol的 6-APA、2000IU固定化青霉素G酰化酶和200mL水混合，在时间t=0时开始部分量入0.064mol的苯甘氨酸甲酯硫酸盐，保持温度在15-25℃，在反应过程中用硫酸滴定将pH控制为6.3进行反应。在反应结束时，加入硫酸使pH降至5.6，停止反应，过滤，用碳酸钠调结晶，调至终点pH=5.0；在10℃下养晶3h后洗涤、干燥，即得氨苄西林。
实施例11：实验例结果检测
检测方法：
转化率计算方法：6-APA转化率=1-（6-APA物料摩尔数）/6-APA总投料摩尔数
杂质的检测方法：依据《欧洲药典》EP6.0版，用高效液相色谱检测氨苄西林成品中杂质情况。高效液相色谱检测仪的型号：品牌：日本岛津；型号：LC-20AD XR。
其检测结果：
| 组别 | 转化率/% | 反应时间/min | 单个杂质/% | 总杂质/% |
| 实施例1 | 99.25 | 160 | 0.09 | 0.14 |
| 实施例2 | 99.36 | 145 | 0.06 | 0.06 |
| 实施例3 | 99.06 | 150 | 0.07 | 0.07 |
| 实施例4 | 99.56 | 195 | 0.11 | 0.34 |
| 实施例5 | 99.03 | 160 | 0.09 | 0.09 |
| 实施例6 | 99.49 | 185 | 0.14 | 0.24 |
| 实施例7 | 99.21 | 145 | 0.22 | 0.33 |
| 实施例8 | 99.23 | 210 | 0.11 | 0.17 |
| 实施例9 | 99.51 | 75 | 0.22 | 0.44 |
| 实施例10 | 99.11 | 120 | 0.09 | 0.15 |
| 对比例1 | 97.25 | 320 | 0.56 | 1.55 |
从以上实验结果可知，本发明不仅工艺简单、工业操作方便、pH值易于控制，而且制备的氨苄西林转化率高，反应时间短，杂质少，纯度高。可见，本发明是一种低成本、高效率的生产工艺。
Claims (9)
1.一种酶法制备氨苄西林的工艺，其特征在于它包括以下步骤：
（a）将6-氨基青霉烷酸、苯甘氨酸衍生物与青霉素G酰化酶混合于水中，得混合液；其中6-氨基青霉烷酸与苯甘氨酸衍生物的摩尔比为1:1.0～2.0，青霉素G酰化酶在反应体系中的浓度为5-100IU/ml；
（b）用酸或碱调节混合液的pH值至5.5～6.1后，在温度为0～40℃下进行反应；
（c）待反应完全后，分离，将含有氨苄西林粗品的反应液用酸溶清，再用碱结晶，养晶，洗涤，干燥，得氨苄西林产品。
2.根据权利要求1所述的酶法制备氨苄西林的工艺，其特征在于，所述步骤（a）中苯甘氨酸衍生物是指苯甘氨酸甲酯、苯甘氨酸乙酯、苯甘氨酸甲酯硫酸盐、苯甘氨酸甲酯盐酸盐、苯甘氨酸甲酯硝酸盐、苯甘氨酸乙酯硫酸盐、苯甘氨酸乙酯盐酸盐、苯甘氨酸乙酯硝酸盐、苯甘氨酰胺、苯甘氨酰胺硫酸盐、苯甘氨酰胺盐酸盐、苯甘氨酰胺硝酸盐中的一种或两种或多种任意比的组合。
3.根据权利要求1所述的酶法制备氨苄西林的工艺，其特征在于，步骤（a）中所述青霉素G酰化酶为固定化的青霉素G酰化酶。
4.根据权利要求1所述的酶法制备氨苄西林的工艺，其特征在于，步骤（a）中所述青霉素G酰化酶在反应体系中的浓度为5～80IU/ml。
5.根据权利要求1或4所述的酶法制备氨苄西林的工艺，其特征在于，步骤（a）中所述青霉素G酰化酶在反应体系中的浓度为5～60IU/ml。
6.根据权利要求1所述的酶法制备氨苄西林的工艺，其特征在于，步骤（b）中所述混合液的pH值为5.5～5.9，温度为5-25℃。
7.根据权利要求1或6所述的酶法制备氨苄西林的工艺，其特征在于，步骤（b）中所述混合液的pH值为5.5～5.7，温度为10-20℃。
8.根据权利要求1所述的酶法制备氨苄西林的工艺，其特征在于，步骤（c）中所述反应完全是指反应后的6-氨基青霉烷酸残留量不高于15mM。
9.根据权利要求1所述的酶法制备氨苄西林的工艺，其特征在于，所述步骤（c）将含有氨苄西林的溶液在温度为35℃以下，用酸调溶液的pH为0.6～1.6，碱结晶时溶液的pH值为4.0～6.5，养晶温度为0-20℃。
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