CN103740735A - 化学合成的HSV2病毒gC糖蛋白胞外区基因片段及其表达、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明化学合成的HSV2病毒gC糖蛋白胞外区基因片段及其表达、应用涉及基因工程技术、疫苗和诊断试剂领域。本发明是通过计算机分析，筛选出HSV2病毒gC糖蛋白内的强抗原表位，第28个氨基酸至第447个氨基酸，共420个氨基酸，选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成抗原表位的全新基因序列，利用基因工程技术，表达该基因片段、制备HSV2病毒gC糖蛋白的强抗原表位片段。表达的HSV2病毒gC糖蛋白的强抗原表位片段，可用于HSV2疫苗研制、HSV2病毒抗体的检测及用于免疫制备抗HSV2病毒单抗和多抗等。
Description
技术领域
本发明涉及的是化学合成的HSV2病毒gC糖蛋白胞外区的全新基因片段，利用基因工程技术，制备重组HSV2病毒gC糖蛋白。通过计算机分析，筛选出含强抗原表位的HSV2病毒的gC糖蛋白胞外区片段，选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术表达，表达的蛋白可用于疫苗及HSV2病毒抗体或抗原的检测等，本发明涉及基因工程技术、疫苗和诊断试剂领域。
背景技术
单纯疱疹病毒（Herpers simplex virus, HSV）属于疱疹病毒科α亚科，是人类感染的常见病毒之一，根据血清型可分为I和II型两种。其中，I型主要通过口面部感染，也存在性传播，II型主要通过性传播，并且和女性宫颈癌的发生密切相关。近期越来越多的研究表明，HSV I对阿兹海默症的发生有关联，HIV的感染和HSV II也有联系。HSV在全球普遍流行，HSV I型在成人血清中阳性率高达85%以上，HSV II型全球血清阳性率约为20%，并且发病人数以每年25%速度增加。
HSV可在感染组织或附近部位繁殖形成原发病灶，并在三叉神经核脊神经建立终身的潜伏感染，当机体受到外界刺激或免疫力下降是，HSV病毒下行至表皮大量增殖，形成复发感染。HSV反复发作与HSV免疫逃逸相关，HSV通过躲避人体免疫系统的攻击实现潜伏感染和复发感染，因此HSV一旦感染，很难被清除，患者受到长期疾病折磨。
病毒糖蛋白 (glycoproteins, gp) 是病毒毒粒表面的抗原决定簇，目前已发现并正式命名的包膜糖蛋白共有12个(gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gK、gL和gM等)。gB和gD糖蛋白参与病毒与宿主细胞的吸附和融合，已被选作候选疫苗，对其研究较多。近年研究发现，gC2是免疫逃逸相关的包膜糖蛋白。HSV病毒包膜蛋白gC与补体C3b结合，并阻断补体C5和P因子与C3b结合，从而阻断多个补体介导的免疫途径，使HSV病毒成功躲避机体的免疫系统攻击。因此他是造成病毒潜伏感染的蛋白分子之一。选取gC糖蛋白用于免疫机体，阻断病毒的潜伏感染，有希望成为理想的候选疫苗。
发明内容
本发明是化学合成的HSV2病毒gC糖蛋白胞外区的全新基因片段，利用基因工程技术，制备重组HSV2病毒gC糖蛋白胞外区片段。通过计算机分析，筛选出含强抗原表位的HSV2病毒gC糖蛋白胞外区片段,第28个氨基酸 — 第447个 氨基酸，共420个氨基酸，选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术表达该基因。表达的蛋白可用于疫苗、HSV2病毒抗体或抗原的检测及用于免疫制备抗HSV2病毒单抗和多抗等。
本发明通过计算机分析，筛选出含强抗原表位的HSV2病毒的gC糖蛋白胞外区片段，选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术表达，表达产物具有较好的抗原性和特异性，表达的蛋白可用于疫苗及HSV2病毒抗体或抗原的检测等。
化学合成的HSV2病毒gC糖蛋白胞外区基因片段及其表达、应用是采取以下步骤实现的：
1．HSV2病毒gC糖蛋白胞外区抗原表位的筛选及其基因片段的化学合成：
利用ANTHEWIN等软件，通过计算机分析HSV2病毒gC糖蛋白的氨基酸序列， 发现gC糖蛋白的N端（第28氨基酸 — 第447 氨基酸）含有较强的抗原决定簇。选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，并且在5'端增加了EcoRI酶切位点(下划线部分)、起始密码子（ATG）、信号肽（GGCTGGAGCTGTATTATCCTGTTCCTGGTCGCCACTGCCACTGGAGTTCATTCTAGT），在3'端增加了His标记（CAC CAC CAC CAC CAC CAC）、终止密码子（TGA）和Himd III酶切位点(下划线部分)，使该基因片段易于克隆至质粒pMCE5内的EcoRI和Himd III酶切位点内。
筛选的HSV2病毒gC糖蛋白内的抗原表位氨基酸序列（第28个aa － 第447个aa）：
Ser Pro Gly Arg Thr Ile Thr Val Gly Pro Arg Gly Asn Ala Ser Asn Ala Ala Pro Ser Ala Ser Pro Arg Asn Ala Ser Ala Pro Arg Thr Thr Pro Thr Pro Pro Gln Pro Arg Lys Ala Thr Lys Ser Lys Ala Ser Thr Ala Lys Pro Ala Pro Pro Pro Lys Thr Gly Pro Pro Lys Thr Ser Ser Glu Pro Val Arg Cys Asn Arg His Asp Pro Leu Ala Arg Tyr Gly Ser Arg Val Gln Ile Arg Cys Arg Phe Pro Asn Ser Thr Arg Thr Glu Phe Arg Leu Gln Ile Trp Arg Tyr Ala Thr Ala Thr Asp Ala Glu Ile Gly Thr Ala Pro Ser Leu Glu Glu Val Met Val Asn Val Ser Ala Pro Pro Gly Gly Gln Leu Val Tyr Asp Ser Ala Pro Asn Arg Thr Asp Pro His Val Ile Trp Ala Glu Gly Ala Gly Pro Gly Ala Ser Pro Arg Leu Tyr Ser Val Val Gly Pro Leu Gly Arg Gln Arg Leu Ile Ile Glu Glu Leu Thr Leu Glu Thr Gln Gly Met Tyr Tyr Trp Val Trp Gly Arg Thr Asp Arg Pro Ser Ala Tyr Gly Thr Trp Val Arg Val Arg Val Phe Arg Pro Pro Ser Leu Thr Ile His Pro His Ala Val Leu Glu Gly Gln Pro Phe Lys Ala Thr Cys Thr Ala Ala Thr Tyr Tyr Pro Gly Asn Arg Ala Glu Phe Val Trp Phe Glu Asp Gly Arg Arg Val Phe Asp Pro Ala Gln Ile His Thr Gln Thr Gln Glu Asn Pro Asp Gly Phe Ser Thr Val Ser Thr Val Thr Ser Ala Ala Val Gly Gly Gln Gly Pro Pro Arg Thr Phe Thr Cys Gln Leu Thr Trp His Arg Asp Ser Val Ser Phe Ser Arg Arg Asn Ala Ser Gly Thr Ala Ser Val Leu Pro Arg Pro Thr Ile Thr Met Glu Phe Thr Gly Asp His Ala Val Cys Thr Ala Gly Cys Val Pro Glu Gly Val Thr Phe Ala Trp Phe Leu Gly Asp Asp Ser Ser Pro Ala Glu Lys Val Ala Val Ala Ser Gln Thr Ser Cys Gly Arg Pro Gly Thr Ala Thr Ile Arg Ser Thr Leu Pro Val Ser Tyr Glu Gln Thr Glu Tyr Ile Cys Arg Leu Ala Gly Tyr Pro Asp Gly Ile Pro Val Leu Glu His His Gly Ser His Gln Pro Pro Pro Arg Asp Pro Thr Glu Arg Gln Val Ile Arg Ala Val Glu Gly
化学合成的含HSV2病毒gC糖蛋白胞外区抗原表位基因的DNA 序列（1360 bp）：
GAATTC GCC GCC ACC ATG GGC TGG AGC TGT ATT ATC CTG TTC CTG GTC GCC ACT GCC ACT GGA GTT CAT TCT AGT CCT GGT CGC ACT ATC ACC GTG GGG CCA AGA GGC AAC GCA AGC AAT GCA GCT CCA TCA GCC TCC CCT AGG AAC GCA TCT GCT CCA CGA ACC ACA CCA ACC CCA CCT CAG CCA CGA AAG GCT ACA AAG TCA AAA GCC TCC ACT GCT AAA CCT GCA CCA CCC CCT AAG ACT GGT CCA CCC AAA ACC TCC AGC GAG CCT GTG CGA TGC AAC CGT CAC GAC CCA CTG GCC AGA TAC GGC AGT CGC GTG CAG ATC CGA TGT CGT TTC CCT AAT TCA ACT CGA ACC GAG TTT CGT CTG CAG ATC TGG AGA TAT GCA ACA GCC ACT GAT GCC GAA ATT GGC ACC GCT CCA AGC CTG GAG GAA GTG ATG GTC AAC GTG TCT GCA CCT CCA GGC GGA CAG CTG GTG TAC GAC AGC GCC CCA AAT CGA ACA GAT CCC CAT GTC ATC TGG GCA GAG GGA GCT GGA CCT GGA GCT TCT CCA CGG CTG TAT AGT GTG GTC GGT CCA CTG GGC AGG CAG CGG CTG ATC ATT GAG GAA CTG ACC CTG GAA ACA CAG GGC ATG TAC TAT TGG GTG TGG GGC AGG ACT GAC CGG CCT AGT GCC TAC GGA ACC TGG GTC AGA GTG CGC GTC TTC AGG CCC CCT AGC CTG ACT ATC CAC CCA CAT GCT GTG CTG GAG GGA CAG CCT TTT AAG GCA ACC TGC ACA GCA GCC ACC TAC TAT CCT GGA AAC CGG GCT GAG TTC GTG TGG TTT GAA GAC GGG AGG CGG GTC TTC GAT CCT GCC CAG ATT CAC ACT CAG ACC CAG GAA AAT CCA GAT GGT TTT AGC ACC GTG TCT ACA GTC ACT TCT GCT GCA GTG GGC GGT CAG GGA CCA CCA CGA ACC TTC ACA TGT CAG CTG ACC TGG CAC CGT GAC AGC GTG TCT TTT AGT AGA CGC AAT GCA TCC GGA ACA GCC AGC GTC CTG CCT AGA CCA ACT ATC ACC ATG GAG TTC ACC GGG GAT CAT GCC GTG TGC ACA GCA GGA TGC GTG CCA GAA GGG GTC ACA TTC GCC TGG TTT CTG GGC GAC GAT TCT AGT CCC GCT GAG AAA GTG GCT GTC GCA AGT CAG ACT TCA TGC GGA AGA CCA GGG ACA GCT ACT ATT CGC TCA ACA CTG CCC GTG TCC TAC GAG CAG ACT GAA TAT ATC TGT CGC CTG GCC GGT TAT CCC GAC GGC ATT CCT GTG CTG GAG CAC CAT GGA TCC CAT CAG CCT CCA CCC AGA GAT CCA ACT GAG AGG CAG GTC ATT AGA GCC GTC GAG GGA CAC CAC CAC CAC CAC CAC TGA TAAGCTT
2．表达HSV2病毒gC糖蛋白胞外区片段重组质粒的构建:
提取质粒pMCE5,用EcoR I和Hind III双酶切，电泳后回收酶切的质粒大片段, 溶于去离子水内。同样用EcoR I和Hind III双酶切化学合成的HSV2病毒gC糖蛋白基因片段，电泳回收后, 溶于去离子水内。
取等摩尔浓度的上述两种酶切后DNA片段，在同一离心管内用T4 DNA 连接酶连接，使HSV2病毒gC糖蛋白基因片段插入到载体pMCE5内的EcoR I和Hind III位点之间，与载体上的起始密码子翻译框架一致，表达一个融合蛋白。
3．重组质粒的筛选与鉴定:
将重组质粒转化大肠杆菌DH5α，涂布含100μg／ml氨苄青霉素的LB平板，置37℃ 过夜。次日随机挑取转化菌落、1个含质粒pMCE5转化菌作阴性对照，1个含pUC57-gC2转化菌作阳性对照，菌液PCR扩增HSV2病毒gC糖蛋白胞外区基因片段,含HSV2病毒gC糖蛋白胞外区基因片段的阳性重组质粒，应扩增出长约1360bp 的基因片段。在提取阳性单菌落质粒，进行双酶切鉴定并将含有外源基因的质粒进行DNA序列分析，序列分析证实重组质粒含有合成的HSV2病毒gC糖蛋白基因片段，序列完全正确：
GCC GCC ACC ATG GGC TGG AGC TGT ATT ATC CTG TTC CTG GTC GCC ACT GCC ACT GGA GTT CAT TCT AGT CCT GGT CGC ACT ATC ACC GTG GGG CCA AGA GGC AAC GCA AGC AAT GCA GCT CCA TCA GCC TCC CCT AGG AAC GCA TCT GCT CCA CGA ACC ACA CCA ACC CCA CCT CAG CCA CGA AAG GCT ACA AAG TCA AAA GCC TCC ACT GCT AAA CCT GCA CCA CCC CCT AAG ACT GGT CCA CCC AAA ACC TCC AGC GAG CCT GTG CGA TGC AAC CGT CAC GAC CCA CTG GCC AGA TAC GGC AGT CGC GTG CAG ATC CGA TGT CGT TTC CCT AAT TCA ACT CGA ACC GAG TTT CGT CTG CAG ATC TGG AGA TAT GCA ACA GCC ACT GAT GCC GAA ATT GGC ACC GCT CCA AGC CTG GAG GAA GTG ATG GTC AAC GTG TCT GCA CCT CCA GGC GGA CAG CTG GTG TAC GAC AGC GCC CCA AAT CGA ACA GAT CCC CAT GTC ATC TGG GCA GAG GGA GCT GGA CCT GGA GCT TCT CCA CGG CTG TAT AGT GTG GTC GGT CCA CTG GGC AGG CAG CGG CTG ATC ATT GAG GAA CTG ACC CTG GAA ACA CAG GGC ATG TAC TAT TGG GTG TGG GGC AGG ACT GAC CGG CCT AGT GCC TAC GGA ACC TGG GTC AGA GTG CGC GTC TTC AGG CCC CCT AGC CTG ACT ATC CAC CCA CAT GCT GTG CTG GAG GGA CAG CCT TTT AAG GCA ACC TGC ACA GCA GCC ACC TAC TAT CCT GGA AAC CGG GCT GAG TTC GTG TGG TTT GAA GAC GGG AGG CGG GTC TTC GAT CCT GCC CAG ATT CAC ACT CAG ACC CAG GAA AAT CCA GAT GGT TTT AGC ACC GTG TCT ACA GTC ACT TCT GCT GCA GTG GGC GGT CAG GGA CCA CCA CGA ACC TTC ACA TGT CAG CTG ACC TGG CAC CGT GAC AGC GTG TCT TTT AGT AGA CGC AAT GCA TCC GGA ACA GCC AGC GTC CTG CCT AGA CCA ACT ATC ACC ATG GAG TTC ACC GGG GAT CAT GCC GTG TGC ACA GCA GGA TGC GTG CCA GAA GGG GTC ACA TTC GCC TGG TTT CTG GGC GAC GAT TCT AGT CCC GCT GAG AAA GTG GCT GTC GCA AGT CAG ACT TCA TGC GGA AGA CCA GGG ACA GCT ACT ATT CGC TCA ACA CTG CCC GTG TCC TAC GAG CAG ACT GAA TAT ATC TGT CGC CTG GCC GGT TAT CCC GAC GGC ATT CCT GTG CTG GAG CAC CAT GGA TCC CAT CAG CCT CCA CCC AGA GAT CCA ACT GAG AGG CAG GTC ATT AGA GCC GTC GAG GGA CAC CAC CAC CAC CAC CAC TGA T
构建的重组质粒表达HSV2的病毒gC糖蛋白胞外区片段（420个氨基酸），在其N端融合了载体上的19个氨基酸，在其C端融合了载体上的6个氨基酸,全长445个氨基酸,其氨基酸序列如下：
N端：Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser
C端：His His His His His His
4．重组质粒在CHO细胞中的表达鉴定：
CHO细胞在不含血清的细胞表达培养基在锥形瓶中震荡培养，37℃，5% CO2。转染前一天，以适当的浓度将CHO细胞接种于不含血清的细胞表达培养基中，震荡悬浮培养，37℃，5% CO2。用DNA和PEI混合物转染重组质粒。转染后第五天收集细胞上清，检测蛋白表达水平，第六天收集所有上清用于纯化重组蛋白。
5．重组蛋白的纯化、鉴定和浓度检测：
收集细胞上清100ml，离心后将上清以1ml/min的速度加入His TrapTM FF crude column中。10倍体积平衡液（1×PBS，0.5mol/L NaCl，20mmol/L imidazole，pH7.4）洗脱杂蛋白，再加入1ml洗脱液（1×PBS，0.5mol/L NaCl，500mmol/L imidazole，pH7.4）洗脱目的蛋白，静置20分钟后洗脱，收集洗脱液，用透析液（1×PBS，0.5mol/L NaCl，pH7.4）透析过夜，即为纯化的目的蛋白，SDS-PAGE、Western Blot检测，并测定蛋白浓度。
6．免疫小鼠及gC2抗血清的制备：
10只雄性昆明小鼠随机分为2组，每组5只。实验组以纯化的重组gC2糖蛋白与弗氏佐剂等体积混合，充分乳化，分别于第0，2，4周，腹腔注射免疫小鼠，2 ug/只/次，0.1ml/只，对照组以PBS等体积混合弗氏佐剂，充分乳化，0.1ml/只。每次免疫后2周眼眶采血。血液37℃放置1小时后4℃过夜，4000rpm离心10分钟，取上清即得重组蛋白gC2抗血清。
7. 重组蛋白gC2的免疫原性检测：
用1×CBS将纯化的重组gC2糖蛋白稀释为1 ug/ml，包被酶联板，每孔100ul，4℃过夜。次日5%FBS封闭酶联板，每孔130ul, 室温2小时。将制备的抗血清用样本稀释液按1:500，1:2500，1:12500逐级稀释后，分别加至封闭后的酶联板孔内，每孔100ul，37℃反应1小时，用PBST洗5遍后，加1:5000稀释的羊抗小鼠IgG-HRP，每孔100ul，37℃反应30 分钟，PBST洗5遍，加底物TMB溶液每孔100 ul，37℃避光显色10 分钟，加50ul 1N盐酸终止反应，用酶联仪测定A450值。
8．酶联免疫斑点试验（ELISPOT）：
选取IFN-γ和IL-4两个分别代表Th1和Th2细胞因子作为检测对象。每组检测5只小鼠，每只小鼠设置三个复孔。第三次免疫两周后处死小鼠，取小鼠脾脏，制备悬浮的小鼠脾淋巴细胞，经细胞计数，将细胞密度调整至5×106个cell/ml。按试剂盒操作说明：在96孔滤膜板中加入15μl 35%乙醇30s,PBS洗涤3次；加入100μl/孔已稀释的捕获抗体，4℃包被过夜；弃液，包被稀释液洗涤2次，加入200μl/孔RPMI1640完全培养基，37℃封闭1h；弃液，加入100μl/孔已提取的淋巴细胞，并加入相应抗原蛋白作刺激物，使抗原蛋白终浓度达4μg/ml，静置于CO2培养箱48h；弃液，PBST洗涤3次，加入100μl/孔生物素标记的检测抗体，4℃过夜；弃液，PBST洗涤4次，加入100μl/孔亲和素标记的辣根过氧化物酶，室温45min；弃液，PBST洗涤3次，PBS洗涤2次，加入100μl/孔新配置的AEC（3-amino-9-ethylcarbazole）底物液，室温显色10-60min；弃液，去离子水洗涤3次，终止显色，避光晾干；斑点计数，并进行统计分析。
所述的化学合成的HSV2病毒gC糖蛋白胞外区的基因片段序列，利用细菌、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞及转基因动植物进行重组表达、制备。
以上述所述的方法制备的HSV2病毒gC糖蛋白胞外区片段，用于HSV2病毒亚单位疫苗的研制及抗体检测。
本发明与现有技术相比具有的优点
本发明表达的HSV2病毒的gC糖蛋白片段，有较多优点:
1．目前应用的HSV2病毒抗体的酶联免疫检测试剂盒，其使用的抗原是全病毒抗原，生产较危险、成本高、与其它病毒有交叉反应等缺点。表达的HSV2病毒的gC糖蛋白胞外区片段用作抗原可克服上述缺点。
①
2．目前缺乏HSV2病毒疫苗。灭活疫苗的研究取得了较大进展，但是生产成本高、危险大。HSV2病毒的gC糖蛋白在感染的细胞中含量最多,是疱疹病毒家族中高度保守的蛋白,各毒株间差异较小,同时gC蛋白具有较强的免疫原性,可诱导机体产生中和抗体和细胞免疫反应,并且和病毒逃逸机制相关,因此HSV2gC糖蛋白是构建HSV疫苗理想的目的基因。我们选择了其强抗原表位，利用基因工程技术表达制备，为研制基因工程疫苗奠定基础。基因工程疫苗安全、成本低。
3．根据筛选出的HSV2病毒的gC糖蛋白胞外区片段氨基酸序列，选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，该基因适宜在真核和原核细胞内高表达。
4．本发明构建的表达HSV2病毒的gC糖蛋白的CHO细胞株，可大量纯化制备该蛋白，易于纯化，且具有相当强的免疫原性。目前未见表达该段蛋白的报道。
附图说明
以下将结合附图对本发明作进一步说明：
图1是菌液PCR检测8个重组子的PCR扩增产物。M：2000 DL DNA（TaKaRa）；1-8：挑取单菌落菌液PCR产物； 9： 空pMCE5/DH5α菌液PCR产物； 10： gC2基因PCR产物。
图2是双酶切鉴定结果。 M：5000 DL DNA（TaKaRa）； 1： 重组质粒经EcoRI 和HindIII双酶切产物； 2： 重组质粒经EcoRI 单酶切产物。
图3是表达HSV2病毒的gC糖蛋白重组菌的SDS-PAGE分析结果。 M： Protein Marker； 1： 还原条件下电泳； 2： 非还原条件电泳
图4是表达HSV2病毒的gC糖蛋白纯化前后的Western-Blots分析结果。M： Protein Marker； 1： 还原条件下电泳； 2： 非还原条件电泳；P： Multiple-tag作为阳参。
图5是ELISA检测重组蛋白gC2免疫原性
图6是小鼠淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-4频率
具体实施方式
本发明实施方式的详细说明：
HSV2病毒的gC糖蛋白抗原表位的分析、基因合成及表达
通过计算机分析HSV2病毒的gC糖蛋白的全部氨基酸序列，筛选出HSV2病毒的gC糖蛋白内的强抗原表位,选用真核偏爱的密码子，化学合成HSV2病毒的gC糖蛋白强抗原表位的全新基因片段。将基因片段克隆至质粒pMCE5内的EcoRI/HindIII位点，与载体上的起始密码子的翻译框架一致，可表达一个融合蛋白。将构建的真核表达质粒pMCE5-gC2并转染至CHO细胞进行真核表达，获得了高表达gC糖蛋白的细胞株。
材料与方法
1. 菌种与质粒: 宿主菌DH5α及表达载体pMCE5为本实验室保存。
2. 分子生物学试剂:限制性内切酶EcoRI、HindIII、及T4 DNA连接酶为TaKaRa公司产品。质粒纯化试剂盒及从琼脂糖凝胶内回收DNA片段的试剂盒为TaKaRa公司产品.其它试剂为进口或国产分析纯试剂。
3. 基因片段的合成: 由大连TaKaRa公司帮助合成。
4. 基因克隆方法: DNA的酶切、连接、电泳；质粒的提取、转化。其它试剂盒按说明书进行操作。
5. DNA序列分析：用TAKARA公司质粒纯化试剂盒纯化质粒，用DNA全自动测序仪测序。
结果
1. HSV2病毒的gC糖蛋白抗原表位筛选及基因片段的合成：
利用ANTHEWIN等软件，通过计算机分析HSV2病毒的gC糖蛋白的全部氨基酸序列（UniProtKB:Q89730），筛选出HSV2病毒的gC糖蛋白内的强抗原表位,即从第28个氨基酸到第447个氨基酸，其氨基酸序列如下：
Ser Pro Gly Arg Thr Ile Thr Val Gly Pro Arg Gly Asn Ala Ser Asn Ala Ala Pro Ser Ala Ser Pro Arg Asn Ala Ser Ala Pro Arg Thr Thr Pro Thr Pro Pro Gln Pro Arg Lys Ala Thr Lys Ser Lys Ala Ser Thr Ala Lys Pro Ala Pro Pro Pro Lys Thr Gly Pro Pro Lys Thr Ser Ser Glu Pro Val Arg Cys Asn Arg His Asp Pro Leu Ala Arg Tyr Gly Ser Arg Val Gln Ile Arg Cys Arg Phe Pro Asn Ser Thr Arg Thr Glu Phe Arg Leu Gln Ile Trp Arg Tyr Ala Thr Ala Thr Asp Ala Glu Ile Gly Thr Ala Pro Ser Leu Glu Glu Val Met Val Asn Val Ser Ala Pro Pro Gly Gly Gln Leu Val Tyr Asp Ser Ala Pro Asn Arg Thr Asp Pro His Val Ile Trp Ala Glu Gly Ala Gly Pro Gly Ala Ser Pro Arg Leu Tyr Ser Val Val Gly Pro Leu Gly Arg Gln Arg Leu Ile Ile Glu Glu Leu Thr Leu Glu Thr Gln Gly Met Tyr Tyr Trp Val Trp Gly Arg Thr Asp Arg Pro Ser Ala Tyr Gly Thr Trp Val Arg Val Arg Val Phe Arg Pro Pro Ser Leu Thr Ile His Pro His Ala Val Leu Glu Gly Gln Pro Phe Lys Ala Thr Cys Thr Ala Ala Thr Tyr Tyr Pro Gly Asn Arg Ala Glu Phe Val Trp Phe Glu Asp Gly Arg Arg Val Phe Asp Pro Ala Gln Ile His Thr Gln Thr Gln Glu Asn Pro Asp Gly Phe Ser Thr Val Ser Thr Val Thr Ser Ala Ala Val Gly Gly Gln Gly Pro Pro Arg Thr Phe Thr Cys Gln Leu Thr Trp His Arg Asp Ser Val Ser Phe Ser Arg Arg Asn Ala Ser Gly Thr Ala Ser Val Leu Pro Arg Pro Thr Ile Thr Met Glu Phe Thr Gly Asp His Ala Val Cys Thr Ala Gly Cys Val Pro Glu Gly Val Thr Phe Ala Trp Phe Leu Gly Asp Asp Ser Ser Pro Ala Glu Lys Val Ala Val Ala Ser Gln Thr Ser Cys Gly Arg Pro Gly Thr Ala Thr Ile Arg Ser Thr Leu Pro Val Ser Tyr Glu Gln Thr Glu Tyr Ile Cys Arg Leu Ala Gly Tyr Pro Asp Gly Ile Pro Val Leu Glu His His Gly Ser His Gln Pro Pro Pro Arg Asp Pro Thr Glu Arg Gln Val Ile Arg Ala Val Glu Gly
根据筛选的HSV2病毒gC糖蛋白内的抗原表位氨基酸序列，选择真核的密码子，化学合成全新的基因序列，并且在5'端增加了EcoRI酶切位点(下划线部分)、起始密码子（ATG）、信号肽（GGCTGGAGCTGTATTATCCTGTTCCTGGTCGCCACTGCCACTGGAG TCATTCTAGT），在3'端增加了His标记（CAC CAC CAC CAC CAC CAC）、终止密码子（TGA）和Himd III酶切位点(下划线部分)，使该基因片段易于克隆至质粒pMCE5内的EcoRI和Hind III酶切位点内。化学合成的含HSV2病毒gC糖蛋白抗原表位基因的DNA 序列（1360 bp）如下：
GAATTC GCC GCC ACC ATG GGC TGG AGC TGT ATT ATC CTG TTC CTG GTC GCC ACT GCC ACT GGA GTT CAT TCT AGT CCT GGT CGC ACT ATC ACC GTG GGG CCA AGA GGC AAC GCA AGC AAT GCA GCT CCA TCA GCC TCC CCT AGG AAC GCA TCT GCT CCA CGA ACC ACA CCA ACC CCA CCT CAG CCA CGA AAG GCT ACA AAG TCA AAA GCC TCC ACT GCT AAA CCT GCA CCA CCC CCT AAG ACT GGT CCA CCC AAA ACC TCC AGC GAG CCT GTG CGA TGC AAC CGT CAC GAC CCA CTG GCC AGA TAC GGC AGT CGC GTG CAG ATC CGA TGT CGT TTC CCT AAT TCA ACT CGA ACC GAG TTT CGT CTG CAG ATC TGG AGA TAT GCA ACA GCC ACT GAT GCC GAA ATT GGC ACC GCT CCA AGC CTG GAG GAA GTG ATG GTC AAC GTG TCT GCA CCT CCA GGC GGA CAG CTG GTG TAC GAC AGC GCC CCA AAT CGA ACA GAT CCC CAT GTC ATC TGG GCA GAG GGA GCT GGA CCT GGA GCT TCT CCA CGG CTG TAT AGT GTG GTC GGT CCA CTG GGC AGG CAG CGG CTG ATC ATT GAG GAA CTG ACC CTG GAA ACA CAG GGC ATG TAC TAT TGG GTG TGG GGC AGG ACT GAC CGG CCT AGT GCC TAC GGA ACC TGG GTC AGA GTG CGC GTC TTC AGG CCC CCT AGC CTG ACT ATC CAC CCA CAT GCT GTG CTG GAG GGA CAG CCT TTT AAG GCA ACC TGC ACA GCA GCC ACC TAC TAT CCT GGA AAC CGG GCT GAG TTC GTG TGG TTT GAA GAC GGG AGG CGG GTC TTC GAT CCT GCC CAG ATT CAC ACT CAG ACC CAG GAA AAT CCA GAT GGT TTT AGC ACC GTG TCT ACA GTC ACT TCT GCT GCA GTG GGC GGT CAG GGA CCA CCA CGA ACC TTC ACA TGT CAG CTG ACC TGG CAC CGT GAC AGC GTG TCT TTT AGT AGA CGC AAT GCA TCC GGA ACA GCC AGC GTC CTG CCT AGA CCA ACT ATC ACC ATG GAG TTC ACC GGG GAT CAT GCC GTG TGC ACA GCA GGA TGC GTG CCA GAA GGG GTC ACA TTC GCC TGG TTT CTG GGC GAC GAT TCT AGT CCC GCT GAG AAA GTG GCT GTC GCA AGT CAG ACT TCA TGC GGA AGA CCA GGG ACA GCT ACT ATT CGC TCA ACA CTG CCC GTG TCC TAC GAG CAG ACT GAA TAT ATC TGT CGC CTG GCC GGT TAT CCC GAC GGC ATT CCT GTG CTG GAG CAC CAT GGA TCC CAT CAG CCT CCA CCC AGA GAT CCA ACT GAG AGG CAG GTC ATT AGA GCC GTC GAG GGA CAC CAC CAC CAC CAC CAC TGA TAAGCTT
2．表达HSV2病毒gC糖蛋白胞外区片段重组质粒的构建:
提取质粒pMCE5,用EcoRI和Hind III双酶切，电泳后回收酶切的质粒大片段, 溶于去离子水内。同样用EcoRI和Hind III双酶切化学合成的HSV2病毒gC糖蛋白胞外区基因片段，电泳回收后, 溶于去离子水内。
取等摩尔浓度的上述两种酶切后DNA片段，在同一离心管内用T4 DNA 连接酶连接，使HSV2病毒gB糖蛋白胞外区基因片段插入到载体pMCE5内的EcoRI和Hind III位点之间，与载体上的起始密码子翻译框架一致，表达一个融合蛋白。
3．重组质粒的筛选与鉴定:
将上步连接的重组质粒转化到大肠杆菌DH5α,将转化产物涂布含氨苄青霉素（100μg／ml）的固体LB培养基上，置37℃培养过夜。次日随机挑选1-8号转化子菌落、一个含质粒pMCE5转化菌作阴性对照和一个含质粒pUC57-gC2转化菌作阳性对照，分别接种到3 ml含氨苄青霉素100μg／ml液体LB培养基，37℃振荡培养5h,取菌液1ml，离心收菌。分别用50μl去离子水悬浮菌体，沸水煮5min,离心（4℃，12000rpm ）5min, 取上清2μl用作PCR模板,PCR扩增插入载体内的HSV2病毒gC糖蛋白胞外区基因片段，PCR 反应浓度为：质粒模板2μl、HSV2病毒gC糖蛋白胞外区基因片段的正链P1（CCGGAATTCGCCGCCACCATGGG）和负链引物P2（AAATGCGGCCGCTGACCATGATTACGCCA AGCT）各1μl、10×pyrobest buffer 5.0μl、 2.5 mmol/L dNTP 4.0μl、Pyrobest DNA Taq 酶0.5μl (2.5 U)、去离子水36.5μl,总体积50μl。扩增条件为：94℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃4分钟，35个循环；最后72℃延伸7分钟。 取PCR扩增产物5μl,用1.0％的Agarose凝胶检测, 结果，1号转化子扩增出1360bp的目的基因片段（见图1），而含质粒pMCE5的对照菌没有扩增出该基因片段。初步证实，这1号转化子含有HSV2病毒gC糖蛋白基因片段。
提取1号重组子的质粒， 双酶切鉴定（见图2）并测定质粒内的HSV2病毒gC糖蛋白基因序列，DNA序列分析证实，重组质粒含有合成的HSV2病毒gC糖蛋白基因片段，序列完全正确：
GCC GCC ACC ATG GGC TGG AGC TGT ATT ATC CTG TTC CTG GTC GCC ACT GCC ACT GGA GTT CAT TCT AGT CCT GGT CGC ACT ATC ACC GTG GGG CCA AGA GGC AAC GCA AGC AAT GCA GCT CCA TCA GCC TCC CCT AGG AAC GCA TCT GCT CCA CGA ACC ACA CCA ACC CCA CCT CAG CCA CGA AAG GCT ACA AAG TCA AAA GCC TCC ACT GCT AAA CCT GCA CCA CCC CCT AAG ACT GGT CCA CCC AAA ACC TCC AGC GAG CCT GTG CGA TGC AAC CGT CAC GAC CCA CTG GCC AGA TAC GGC AGT CGC GTG CAG ATC CGA TGT CGT TTC CCT AAT TCA ACT CGA ACC GAG TTT CGT CTG CAG ATC TGG AGA TAT GCA ACA GCC ACT GAT GCC GAA ATT GGC ACC GCT CCA AGC CTG GAG GAA GTG ATG GTC AAC GTG TCT GCA CCT CCA GGC GGA CAG CTG GTG TAC GAC AGC GCC CCA AAT CGA ACA GAT CCC CAT GTC ATC TGG GCA GAG GGA GCT GGA CCT GGA GCT TCT CCA CGG CTG TAT AGT GTG GTC GGT CCA CTG GGC AGG CAG CGG CTG ATC ATT GAG GAA CTG ACC CTG GAA ACA CAG GGC ATG TAC TAT TGG GTG TGG GGC AGG ACT GAC CGG CCT AGT GCC TAC GGA ACC TGG GTC AGA GTG CGC GTC TTC AGG CCC CCT AGC CTG ACT ATC CAC CCA CAT GCT GTG CTG GAG GGA CAG CCT TTT AAG GCA ACC TGC ACA GCA GCC ACC TAC TAT CCT GGA AAC CGG GCT GAG TTC GTG TGG TTT GAA GAC GGG AGG CGG GTC TTC GAT CCT GCC CAG ATT CAC ACT CAG ACC CAG GAA AAT CCA GAT GGT TTT AGC ACC GTG TCT ACA GTC ACT TCT GCT GCA GTG GGC GGT CAG GGA CCA CCA CGA ACC TTC ACA TGT CAG CTG ACC TGG CAC CGT GAC AGC GTG TCT TTT AGT AGA CGC AAT GCA TCC GGA ACA GCC AGC GTC CTG CCT AGA CCA ACT ATC ACC ATG GAG TTC ACC GGG GAT CAT GCC GTG TGC ACA GCA GGA TGC GTG CCA GAA GGG GTC ACA TTC GCC TGG TTT CTG GGC GAC GAT TCT AGT CCC GCT GAG AAA GTG GCT GTC GCA AGT CAG ACT TCA TGC GGA AGA CCA GGG ACA GCT ACT ATT CGC TCA ACA CTG CCC GTG TCC TAC GAG CAG ACT GAA TAT ATC TGT CGC CTG GCC GGT TAT CCC GAC GGC ATT CCT GTG CTG GAG CAC CAT GGA TCC CAT CAG CCT CCA CCC AGA GAT CCA ACT GAG AGG CAG GTC ATT AGA GCC GTC GAG GGA CAC CAC CAC CAC CAC CAC TGA T
构建的重组质粒表达HSV2的病毒gC糖蛋白片段（420个氨基酸），在其N端融合了载体上的19个氨基酸，在C端融合了载体上的6个氨基酸,全长445个氨基酸,其氨基酸序列如下：
N端：Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser
C端：His His His His His His
4．重组质粒在CHO细胞中的表达鉴定：
CHO细胞在不含血清的细胞表达培养基在锥形瓶中震荡培养，37℃，5% CO2。转染前一天，以适当的浓度将CHO细胞接种于不含血清的细胞表达培养基中，震荡悬浮培养，37℃，5% CO2。用DNA和PEI混合物转染重组质粒。转染后第五天收集细胞上清，检测蛋白表达水平，第六天收集所有上清用于纯化重组蛋白。
表达HSV2病毒gC糖蛋白的纯化
根据表达HSV2病毒gC糖蛋白的氨基酸序列，分析其理化特性，确定适当的纯化方法。CHO细胞表达的HSV2 gC糖蛋白融合有载体上的His蛋白,因此我们决定采用亲和层析法，用His TrapTM FF crude column进行纯化。纯化获得了表达的gC糖蛋白，具体步骤如下：
材料和方法
1. 主要试剂: His TrapTM FF crude column为GE Heathcare公司产品，其它试剂为国产或进口分析纯试剂。
2. 重组蛋白的纯化：收集细胞上清100ml，离心后将上清以1ml/min的速度加入His TrapTM FF crude column中。10倍体积平衡液（1×PBS，0.5mol/L NaCl，20mmol/L imidazole，pH7.4）洗脱杂蛋白，再加入1ml洗脱液（1×PBS，0.5mol/L NaCl，500mmol/L imidazole，pH7.4）洗脱目的蛋白，静置20分钟后洗脱，收集洗脱液，用透析液（1×PBS，0.5mol/L NaCl，pH7.4）透析过夜，即为纯化的目的蛋白，SDS-PAGE、Western Blot检测，并测定蛋白浓度。
结果
将从His TrapTM FF crude column上洗脱的蛋白进行SDS-PAGE、Western Blot分析，结果显示(分别见图3、4)，表达产物约90kDa，蛋白浓度为40μg/ml。
重组gC糖蛋白的免疫原性分析
以纯化获得的gC2重组蛋白为抗原，混合弗氏佐剂免疫小鼠，制备抗血清，间接ELISA法检测效价，评测获得的gC2重组蛋白的免疫原性。
材料和方法
1. 雄性昆明小鼠，6-8周龄，购自中国军事医学科学院实验动物中心。
2. 完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂为Sigma公司产品。小鼠抗His单抗、羊抗小鼠IgG-HRP为金斯特公司产品，其它试剂为国产或进口分析纯试剂。
3. 动物免疫及抗血清制备：10只雄性昆明小鼠随机分为2组，每组5只。实验组以纯化的重组gC2糖蛋白与弗氏佐剂等体积混合，充分乳化，分别于第0，2，4周，腹腔注射免疫小鼠，2 ug/只/次，0.1ml/只，对照组以PBS等体积混合弗氏佐剂，充分乳化，0.1ml/只。每次免疫后2周眼眶采血。血液37℃放置1小时后4℃过夜，4000rpm离心10分钟，取上清即得重组蛋白gC2抗血清。间接ELISA检测抗血清滴度。
4. ELISA试验: 用1×CBS将纯化的重组gC2糖蛋白稀释为1 ug/ml，包被酶联板，每孔100ul，4℃过夜。次日5%FBS封闭酶联板，每孔130ul, 室温2小时。将制备的抗血清用样本稀释液按1:500，1:2500，1:12500逐级稀释后，分别加至封闭后的酶联板孔内，每孔100ul，37℃反应1小时，用PBST洗5遍后，加1:5000稀释的羊抗小鼠IgG-HRP，每孔100ul，37℃反应30 分钟，PBST洗5遍，加底物TMB溶液每孔100 ul，37℃避光显色10 分钟，加50ul 1N盐酸终止反应，用酶联仪测定A450值。
结果
每次免疫后2周小鼠眼底静脉丛取血，制备抗血清，间接ELISA法检测血清血清中抗体滴度。结果显示，小鼠抗gC2血清平均滴度在免疫前、第一次免疫后、第二次免疫后、第三次免疫后的抗血清滴度分别为0.00±0.00、5.77±0.38、7.03±0.77、8.57±0.38（如图5），且PBS对照组抗gC2血清滴度始终为0.00。小鼠在第一次免疫后即产生较高水平的抗体，通过第二次、第三次免疫后，小鼠体内抗体水平仍缓慢升高，产生高滴度水平。使用SPSS 13.0软件进行单因素方差分析及Q检验，P＜0.05，免疫前及三次免疫后小鼠抗血清滴度的提高均具有显著统计学意义。表达的重组蛋白gC2能刺激免疫系统产生较好的体液免疫效果。
重组gC2蛋白的细胞免疫效果分析
获取以gC2重组蛋白为抗原进行三次免疫后的小鼠脾脏，制备小鼠脾淋巴细胞，利用酶联免疫斑点试验（ELISPOT），检测淋巴细胞分泌IL-4和IFN-γ的细胞频率，评测纯化获得的gC2重组糖蛋白的细胞免疫效果。
材料和方法
1. Mouse IL-4 ELISPOT Ready-SET-Go和Mouse IFN-γ ELISPOT Ready-SET-Go为eBioscience公司产品。
2. 小鼠淋巴细胞分离液为达科为公司产品，其它试剂为国产或进口分析纯试剂。
3. Elispot实验方法：选取IFN-γ和IL-4两个分别代表Th1和Th2细胞因子作为检测对象。每组5只小鼠，每只小鼠设置三个复孔。第三次免疫两周后处死小鼠，取小鼠脾脏，制备悬浮的小鼠脾淋巴细胞，经细胞计数，将细胞密度调整至5×106个cell/ml。按试剂盒操作说明：在96孔滤膜板中加入15μl 35%乙醇30s,PBS洗涤3次；加入100μl/孔已稀释的捕获抗体，4℃包被过夜；弃液，包被稀释液洗涤2次，加入200μl/孔RPMI1640完全培养基，37℃封闭1h；弃液，加入100μl/孔已提取的淋巴细胞，并加入相应抗原蛋白作刺激物，使抗原蛋白终浓度达4μg/ml，静置于CO2培养箱48h；弃液，PBST洗涤3次，加入100μl/孔生物素标记的检测抗体，4℃过夜；弃液，PBST洗涤4次，加入100μl/孔亲和素标记的辣根过氧化物酶，室温45min；弃液，PBST洗涤3次，PBS洗涤2次，加入100μl/孔新配置的AEC（3-amino-9-ethylcarbazole）底物液，室温显色10-60min；弃液，去离子水洗涤3次，终止显色，避光晾干；斑点计数，并进行统计分析。
结果
各组免疫小鼠脾细胞在体外特异性抗原刺激后，其激活的分泌IL-4和IFN-γ的淋巴细胞数各不相同，结果见表1和图6。免疫gC2蛋白组分泌IL-4和IFN-γ平均值分别为19.2±2.48/106 个细胞和13.46±2.832/106 个细胞，PBS对照组分泌值均接近于0/106 个细胞，统计学处理显示gC2组与PBS对照组有显著统计学差异（p＜0.05）。说明gC2蛋白刺激小鼠产生了特异的细胞免疫。
以上说明了gC2蛋白刺激小鼠产生了特异的细胞免疫。
化学合成的HSV病毒gB蛋白胞外区基因片段序列表见附件文档：核苷酸或氨基酸序列表计算机可读载体。
Claims (4)
1.一种化学合成的HSV2病毒gC糖蛋白的胞外区基因片段，该基因片段编码含强抗原表位的HSV2病毒的gC糖蛋白胞外区基因片段，即第28个氨基酸至第447个 氨基酸，共420个氨基酸，在5'端增加了EcoRI酶切位点(下划线部分)、起始密码子（ATG）、信号肽（GGCTGGAGCTGTATTATCCTGTTCCTGGTCGCCACTGCCACTGG AGTTCATTCTAGT），在3'端增加了His标记（CAC CAC CAC CAC CAC CAC）、终止密码子（TGA）和Himd III酶切位点(下划线部分)，化学合成的基因序列全长1360 bp，序列如下：
GAATTC GCC GCC ACC ATG GGC TGG AGC TGT ATT ATC CTG TTC CTG GTC GCC ACT GCC ACT GGA GTT CAT TCT AGT CCT GGT CGC ACT ATC ACC GTG GGG CCA AGA GGC AAC GCA AGC AAT GCA GCT CCA TCA GCC TCC CCT AGG AAC GCA TCT GCT CCA CGA ACC ACA CCA ACC CCA CCT CAG CCA CGA AAG GCT ACA AAG TCA AAA GCC TCC ACT GCT AAA CCT GCA CCA CCC CCT AAG ACT GGT CCA CCC AAA ACC TCC AGC GAG CCT GTG CGA TGC AAC CGT CAC GAC CCA CTG GCC AGA TAC GGC AGT CGC GTG CAG ATC CGA TGT CGT TTC CCT AAT TCA ACT CGA ACC GAG TTT CGT CTG CAG ATC TGG AGA TAT GCA ACA GCC ACT GAT GCC GAA ATT GGC ACC GCT CCA AGC CTG GAG GAA GTG ATG GTC AAC GTG TCT GCA CCT CCA GGC GGA CAG CTG GTG TAC GAC AGC GCC CCA AAT CGA ACA GAT CCC CAT GTC ATC TGG GCA GAG GGA GCT GGA CCT GGA GCT TCT CCA CGG CTG TAT AGT GTG GTC GGT CCA CTG GGC AGG CAG CGG CTG ATC ATT GAG GAA CTG ACC CTG GAA ACA CAG GGC ATG TAC TAT TGG GTG TGG GGC AGG ACT GAC CGG CCT AGT GCC TAC GGA ACC TGG GTC AGA GTG CGC GTC TTC AGG CCC CCT AGC CTG ACT ATC CAC CCA CAT GCT GTG CTG GAG GGA CAG CCT TTT AAG GCA ACC TGC ACA GCA GCC ACC TAC TAT CCT GGA AAC CGG GCT GAG TTC GTG TGG TTT GAA GAC GGG AGG CGG GTC TTC GAT CCT GCC CAG ATT CAC ACT CAG ACC CAG GAA AAT CCA GAT GGT TTT AGC ACC GTG TCT ACA GTC ACT TCT GCT GCA GTG GGC GGT CAG GGA CCA CCA CGA ACC TTC ACA TGT CAG CTG ACC TGG CAC CGT GAC AGC GTG TCT TTT AGT AGA CGC AAT GCA TCC GGA ACA GCC AGC GTC CTG CCT AGA CCA ACT ATC ACC ATG GAG TTC ACC GGG GAT CAT GCC GTG TGC ACA GCA GGA TGC GTG CCA GAA GGG GTC ACA TTC GCC TGG TTT CTG GGC GAC GAT TCT AGT CCC GCT GAG AAA GTG GCT GTC GCA AGT CAG ACT TCA TGC GGA AGA CCA GGG ACA GCT ACT ATT CGC TCA ACA CTG CCC GTG TCC TAC GAG CAG ACT GAA TAT ATC TGT CGC CTG GCC GGT TAT CCC GAC GGC ATT CCT GTG CTG GAG CAC CAT GGA TCC CAT CAG CCT CCA CCC AGA GAT CCA ACT GAG AGG CAG GTC ATT AGA GCC GTC GAG GGA CAC CAC CAC CAC CAC CAC TGA TAAGCTT 。
2.权利要求1所述的化学合成的HSV2病毒gC糖蛋白的胞外区基因片段，采用基因工程技术表达该基因序列编码的HSV2病毒的gC糖蛋白胞外区基因片段，纯化表达的蛋白片段，具体方法如下：
表达HSV2病毒的gC糖蛋白胞外区基因片段重组质粒的构建:
用EcoR I和Himd III双酶切质粒pMCE5和化学合成的HSV2病毒的gC糖蛋白胞外区基因片段，电泳回收后，用T4 DNA 连接酶连接，使HSV2病毒的gC糖蛋白胞外区基因片段插入到载体pMCE5内的EcoR I和Himd III位点之间，与载体上的起始密码子翻译框架一致，表达一个融合蛋白，全长445个氨基酸,该融合蛋白N端融合了载体上的19个氨基酸，C端包含HSV2病毒的gC糖蛋白内的第28个氨基酸至第447个氨基酸及His标签（6个氨基酸），全长445氨基酸序列如下：
Ser Pro Gly Arg Thr Ile Thr Val Gly Pro Arg Gly Asn Ala Ser Asn Ala Ala Pro Ser Ala Ser Pro Arg Asn Ala Ser Ala Pro Arg Thr Thr Pro Thr Pro Pro Gln Pro Arg Lys Ala Thr Lys Ser Lys Ala Ser Thr Ala Lys Pro Ala Pro Pro Pro Lys Thr Gly Pro Pro Lys Thr Ser Ser Glu Pro Val Arg Cys Asn Arg His Asp Pro Leu Ala Arg Tyr Gly Ser Arg Val Gln Ile Arg Cys Arg Phe Pro Asn Ser Thr Arg Thr Glu Phe Arg Leu Gln Ile Trp Arg Tyr Ala Thr Ala Thr Asp Ala Glu Ile Gly Thr Ala Pro Ser Leu Glu Glu Val Met Val Asn Val Ser Ala Pro Pro Gly Gly Gln Leu Val Tyr Asp Ser Ala Pro Asn Arg Thr Asp Pro His Val Ile Trp Ala Glu Gly Ala Gly Pro Gly Ala Ser Pro Arg Leu Tyr Ser Val Val Gly Pro Leu Gly Arg Gln Arg Leu Ile Ile Glu Glu Leu Thr Leu Glu Thr Gln Gly Met Tyr Tyr Trp Val Trp Gly Arg Thr Asp Arg Pro Ser Ala Tyr Gly Thr Trp Val Arg Val Arg Val Phe Arg Pro Pro Ser Leu Thr Ile His Pro His Ala Val Leu Glu Gly Gln Pro Phe Lys Ala Thr Cys Thr Ala Ala Thr Tyr Tyr Pro Gly Asn Arg Ala Glu Phe Val Trp Phe Glu Asp Gly Arg Arg Val Phe Asp Pro Ala Gln Ile His Thr Gln Thr Gln Glu Asn Pro Asp Gly Phe Ser Thr Val Ser Thr Val Thr Ser Ala Ala Val Gly Gly Gln Gly Pro Pro Arg Thr Phe Thr Cys Gln Leu Thr Trp His Arg Asp Ser Val Ser Phe Ser Arg Arg Asn Ala Ser Gly Thr Ala Ser Val Leu Pro Arg Pro Thr Ile Thr Met Glu Phe Thr Gly Asp His Ala Val Cys Thr Ala Gly Cys Val Pro Glu Gly Val Thr Phe Ala Trp Phe Leu Gly Asp Asp Ser Ser Pro Ala Glu Lys Val Ala Val Ala Ser Gln Thr Ser Cys Gly Arg Pro Gly Thr Ala Thr Ile Arg Ser Thr Leu Pro Val Ser Tyr Glu Gln Thr Glu Tyr Ile Cys Arg Leu Ala Gly Tyr Pro Asp Gly Ile Pro Val Leu Glu His His Gly Ser His Gln Pro Pro Pro Arg Asp Pro Thr Glu Arg Gln Val Ile Arg Ala Val Glu Gly
重组质粒的筛选与鉴定：
将重组质粒转化大肠杆菌DH5α，涂布含氨苄青霉素(100μg／ml)LB平板，置37℃ 过夜；次日随机挑取转化菌落、1个对照菌(质粒pMCE5转化菌)1个阳性对照菌（pUC57-gC2），菌液PCR扩增HSV2病毒gC糖蛋白胞外区基因片段,含HSV2病毒gC糖蛋白胞外区基因片段的阳性重组质粒，应扩增出长约1360bp 的基因片段；在提取阳性单菌落质粒，进行双酶切鉴定及测序；
重组质粒在CHO细胞中的表达鉴定：
CHO细胞在不含血清的细胞表达培养基在锥形瓶中震荡培养，37℃，5% CO2；转染前一天，以适当的浓度将CHO细胞接种于不含血清的细胞表达培养基中，震荡悬浮培养，37℃，5% CO2；用DNA和PEI混合物转染重组质粒；转染后第五天收集细胞上清，检测蛋白表达水平，第六天收集所有上清用于纯化重组蛋白；
重组蛋白的纯化、鉴定和浓度检测：
收集细胞上清100ml，离心后将上清以1ml/min的速度加入His TrapTM FF crude column中；10倍体积平衡液（1×PBS，0.5mol/L NaCl，20mmol/L imidazole，pH7.4）洗脱杂蛋白，再加入1ml洗脱液（1×PBS，0.5mol/L NaCl，500mmol/L imidazole，pH7.4）洗脱目的蛋白，静置20分钟后洗脱，收集洗脱液，用透析液（1×PBS，0.5mol/L NaCl，pH7.4）透析过夜，即为纯化的目的蛋白，SDS-PAGE、Western Blot检测，并测定蛋白浓度；纯化获得的gC2蛋白分子量约为90kD。
3.权利要求1所述的化学合成的HSV2病毒gC糖蛋白胞外区的基因片段序列，利用细菌、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞及转基因动植物进行重组表达、制备。
4.权利要求2或权利要求3所述的方法制备的HSV2病毒gC糖蛋白胞外区片段，用于HSV2病毒亚单位疫苗的研制及抗体检测。
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| CN102112150A (zh) * | 2008-05-30 | 2011-06-29 | 格利科菲公司 | 用于生产具有末端α-1,3-连接的半乳糖的蛋白质的酵母菌株 |
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- 2013-12-31 CN CN201310751323.XA patent/CN103740735B/zh active Active
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