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CN110669142B - 融合rgd的猪圆环病毒2型病毒样颗粒、突变型感染性克隆及其制备方法和应用 - Google Patents

融合rgd的猪圆环病毒2型病毒样颗粒、突变型感染性克隆及其制备方法和应用 Download PDF

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CN110669142B CN201910942130.XA CN201910942130A CN110669142B CN 110669142 B CN110669142 B CN 110669142B CN 201910942130 A CN201910942130 A CN 201910942130A CN 110669142 B CN110669142 B CN 110669142B
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Abstract

本发明公开了一种融合RGD的猪圆环病毒2型病毒样颗粒、感染性克隆及其制备方法和应用。融合RGD的猪圆环病毒2型病毒样颗粒，RGD短肽融合于PCV2 Cap蛋白上。本发明的融合RGD的猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒，是通过对PCV2 Cap蛋白进行了RGD多肽序列短肽修饰，RGD短肽融合于PCV2 Cap蛋白上，并在体外组装成表面融合RGD的PCV2病毒样颗粒。与野生型PCV2病毒样颗粒相比，融合RGD的PCV2病毒样颗粒免疫小鼠产生的PCV2特异性IgM和IgG抗体水平显著升高，能诱导产生高滴度的PCV2抗体，融合RGD的PCV2病毒样颗粒增强体液免疫应答。融合RGD的PCV2病毒样颗粒可应用于增强型VLPs和鉴别诊断的分子标签VLPs疫苗研制，为PCV2疫苗的研发提供了新思路。

Description

融合RGD的猪圆环病毒2型病毒样颗粒、突变型感染性克隆及 其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及分子生物学与病毒学领域，特别地，涉及一种融合RGD的猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒和突变型感染性克隆。此外，本发明还涉及一种包括上述融合RGD的猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒和突变型感染性克隆的制备方法和应用。
背景技术
猪圆环病毒(Porcine circovirus，简称PCV)属于圆环病毒科(Circoviridae)，是一类无囊膜、正二十面体的单链环状DNA病毒，基因组大小约为1.7Kb。目前PCV有3个基因型，分别为猪圆环病毒1型(Porcine circovirus 1，简称PCV1)、猪圆环病毒2型(Porcinecircovirus 2，简称PCV2)及最新发现的猪圆环病毒3型(Porcine circovirus 3，简称PCV3)。据相关报道证实，PCV1不具有致病性，而PCV2则可产生许多相关疾病，而PCV3是否具有致病性仍在进一步探究中。
PCV2是猪圆环病毒相关性系统疾病(PCV2-systemic disease，PCV2-SD)的主要病原，在世界普遍流行，常与其他病原混合感染，造成巨大的经济损失。目前，基于PCV2 Cap蛋白(Capsid protein)组装的病毒样颗粒(Virus-like particles，VLPs)亚单位疫苗因具有高效和安全的特点，已经被广泛应用于猪场PCV2的预防。PCV2 Cap蛋白是PCV2唯一的核衣壳蛋白，也是主要免疫原性蛋白，有7个不规则的Loops结构。
精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)能特异性识别细胞表面的整合素，研究表明，RGD有效地促进芜菁黄花叶病毒属等病毒对细胞的粘附，也有效地促进细胞对生物材料的粘附。
发明内容
本发明提供了一种融合RGD的猪圆环病毒2型病毒样颗粒、感染性克隆及其制备方法和应用，解决现有PCV2疫苗产生的抗体效价低，免疫空白期长，猪群病毒载量降低比例较差的技术问题。
本发明采用的技术方案如下：
一种融合RGD的猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒，RGD短肽融合于PCV2 Cap蛋白上。
进一步地，RGD短肽插入到PCV2 Cap蛋白Loop CD区域。
进一步地，融合RGD的猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒是通过构建重组质粒pET100-PCV2 Cap-iRGD表达获得，重组质粒pET100-PCV2 Cap-iRGD氨基酸序列如SEQ IDNO：14所示。
根据本发明的另一方面，还提供了一种融合RGD的猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：针对Loop CD区域的突变体，利用Oligo7.0设计引物；以pET100-PCV2-DNLS Cap为模板，利用over-lap PCR技术和胶回收扩增突变体的目的片段；将目的片段插入到载体中得到重组表达质粒pET100-PCV2 Cap-iRGD；将重组表达质粒转化进入感受态细胞中得到重组基因工程菌；将重组基因工程菌进行分离、纯化获得重组蛋白；将重组蛋白体外组装获得融合RGD的猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒。
进一步地，引物包括：引物F1-Nde I-001核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，引物R1-003核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；引物F2-004核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，引物R2-BamH I-007核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
根据本发明的另一方面，还提供了一种药物组合物或疫苗，包括上述融合RGD的猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒，还包含药学可接受的载体和/或赋形剂。
根据本发明的另一方面，还提供了一种如上述融合RGD的猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒在制备药物组合物或疫苗，用于预防或治疗由PCV2感染导致的疾病。
根据本发明的另一方面，还提供了一种突变型感染性克隆，由以1.1拷贝且含有两个Stem-loop的PCV2全基因组的质粒为模板，在其全长Cap基因的N端的Loop CD区域插入RGD序列构建所得。
根据本发明的另一方面，还提供了一种如上述突变型感染性克隆在制备具有遗传标记的病毒毒株的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明的融合RGD的猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒，通过对PCV2 Cap蛋白进行了RGD多肽序列短肽修饰，并在体外组装成表面融合RGD的PCV2病毒样颗粒。与野生型PCV2病毒样颗粒相比，融合RGD的PCV2病毒样颗粒免疫小鼠产生的PCV2特异性IgM和IgG抗体水平显著升高，能诱导产生高滴度的PCV2抗体，融合RGD的PCV2病毒样颗粒增强体液免疫应答。融合RGD的PCV2病毒样颗粒可应用于增强型VLPs和鉴别诊断的分子标签VLPs疫苗研制，为PCV2疫苗的研发提供了新思路。
本发明的突变型感染性克隆，由以1.1拷贝且含有两个Stem-loop的PCV2全基因组的质粒为模板，在其全长Cap基因的N端的Loop CD区域插入RGD序列构建所得。突变型感染性克隆在PK-15细胞中能够进行复制，而且与1.1拷贝的野生型PCV2感染性克隆病毒比，突变型感染性克隆毒株基因组拷贝数增加。
除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照附图，对本发明作进一步详细的说明。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明的PCV2 Cap突变体设计示意图；
图2是本发明优选实施例的野生型及突变型PCV2核衣壳蛋白3D结构示意图；
图3是本发明优选实施例的重组质粒酶切鉴定示意图；
图4是本发明优选对比例1的重组质粒测序图谱；
图5是本发明优选实施例1的重组质粒测序图谱；
图6是本发明纯化蛋白的SDS-PAGE鉴定图；
图7是本发明纯化蛋白的Western blot鉴定图；
图8是本发明野生型WT-VLPs凝胶渗透色谱法鉴定结果图；
图9是本发明优选实施例1组装的VLPs凝胶渗透色谱法鉴定结果图；
图10是本发明对比例1组装的VLPs凝胶渗透色谱法鉴定结果图；
图11是本发明的VLPs的电镜图；
图12是本发明的VLPs入侵细胞的IFA图；
图13是本发明的小鼠血清中PCV2 Cap特异性lgM抗体水平的检测示意图；
图14是本发明的小鼠血清中PCV2 Cap特异性lgG抗体水平的检测示意图；
图15是本发明的的突变型感染性克隆设计示意图；
图16是本发明优选实施例的重组质粒pSP72-PCV2-iRGD酶切鉴定图；以及
图17是本发明优选实施例的突变型感染性克隆病毒拷贝数测定结果图。
其中，WT-Cap代表为PCV2 Cap蛋白；
iRGD-Cap代表为85G和86S之间插入含有一个拷贝的RGD序列(即SRGDG序列)的融合RGD的突变体蛋白；
rRGD-Cap代表为GS连接两个拷贝的“RGDGSRGD”完全替换“LPPGGGSN”序列的融合RGD的突变体蛋白；
WT-VLPs代表为野生型WT-VLPs，野生型WT-VLPs代表为野生型PCV2病毒样颗粒；
iRGD-PCV2 VLPs代表为85G和86S之间插入含有一个拷贝的RGD序列的融合RGD的PCV2病毒样颗粒；
rRGD-PCV2 VLPs代表为GS连接两个拷贝的“RGDGSRGD”完全替换“LPPGGGSN”序列的PCV2病毒样颗粒；
iDDD-PCV2 VLPs代表为85G和86S之间插入含有一个拷贝的DDD序列的PCV2病毒样颗粒。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
本实施例的融合RGD的猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒，RGD短肽融合于PCV2Cap蛋白上。本发明的融合RGD的猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒，通过对PCV2 Cap蛋白进行了RGD多肽序列短肽修饰，并在体外组装成表面融合RGD的PCV2病毒样颗粒。与野生型PCV2病毒样颗粒(简称：野生型WT-VLPs)相比，融合RGD的PCV2病毒样颗粒免疫小鼠产生的PCV2特异性IgM和IgG抗体水平显著升高，能诱导产生高滴度的PCV2抗体，融合RGD的PCV2病毒样颗粒增强体液免疫应答。融合RGD的PCV2病毒样颗粒可应用于增强型VLPs和鉴别诊断的分子标签VLPs疫苗研制，为PCV2疫苗的研发提供了新思路。
如图1所示，通过前期的试验研究，利用Oligo 7.0软件找到PCV2 Cap的Loop CD区N端75-92氨基酸NINDFLPPGGGSNPRSVP，已知当PCV2 Cap在体外组装成VLPs时80LPPGGGSN87基序位于VLPs的外表面，因此针对这8个氨基酸进行突变。
本实施例中，RGD短肽插入到PCV2 Cap蛋白Loop CD区域。在85G和86S之间插入含有一个拷贝的RGD序列，构建重组质粒命名为pET100-PCV2 Cap-iRGD，其氨基酸序列如SEQ IDNO：14所示。
本实施例中，融合RGD的猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒是通过构建重组质粒pET100-PCV2 Cap-iRGD表达获得，重组质粒pET100-PCV2 Cap-iRGD氨基酸序列如SEQ IDNO：14所示。通过上述重组质粒pET100-PCV2 Cap-iRGD的构建，设计在Loop CD区域N端的85G和86S之间插入RGD序列，再增设柔性氨基酸：丝氨酸(S)和甘氨酸(G)连接RGD序列，即SRGDG序列，设计相关引物，扩增目的基因，再获得重组质粒pET100-PCV2 Cap-iRGD。
一方面，本发明使用大肠杆菌表达系统来表达PCV2 Cap衣壳蛋白，确保了高表达量和低成本。另一方面，本发明提供无需变性的、可控的体外颗粒组装方法，并证实组装得到的iRGD-PCV2 VLPs具有良好的免疫反应性和免疫原性，与天然病毒颗粒形态相似，更适合于对天然病毒颗粒感染机制及其结构生物学等方面的研究。
根据本发明的另一方面，还提供了一种融合RGD的猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：针对Loop CD区域的突变体，利用Oligo7.0设计引物；以pET100-PCV2-DNLS Cap为模板，利用over-lap PCR技术和胶回收扩增突变体的目的片段；将目的片段插入到载体中得到重组表达质粒pET100-PCV2 Cap-iRGD；将重组表达质粒转化进入感受态细胞中得到重组基因工程菌；将重组基因工程菌进行分离、纯化获得重组蛋白；将重组蛋白体外组装获得融合RGD的猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒。本发明发现，当将RGD短肽插入Loop CD区域N端时，所获得的突变体能够在大肠杆菌感受态细胞中表达，并且能够在体外组装成病毒样颗粒。与现有技术相比，本发明的方法采用了高效、周期短的原核表达系统，并且通过体外组装获得了iRGD-PCV2 VLPs，其不仅避免了成本高、周期长、且效率较低的真核细胞表达系统的使用，消除了在细胞内进行组装时在iRGD-PCV2 VLPs中引入宿主蛋白或核酸等杂质的风险。所获得的iRGD-PCV2 VLPs可用于以Cap蛋白为基础的亚单位疫苗的研制，PCV2的结构测定、PCV2病毒的制备、蛋白颗粒组装机制和病毒感染机制等的研究。与野生型WT-VLPs相比，即，iRGD-PCV2 VLPs免疫小鼠产生的PCV2特异性IgM和IgG抗体水平显著升高，能诱导产生高滴度的PCV2抗体，iRGD-PCV2 VLPs增强体液免疫应答。
本实施例中，引物包括：引物F1-Nde I-001核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，引物R1-003核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；引物F2-004核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，引物R2-BamH I-007核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
根据本发明的另一方面，还提供了一种药物组合物或疫苗，包括上述融合RGD的猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒，还包含药学可接受的载体和/或赋形剂。
根据本发明的另一方面，还提供了一种如上述融合RGD的猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒在制备药物组合物或疫苗，用于预防或治疗由PCV2感染导致的疾病。
如图15所示，根据本发明的另一方面，还提供了一种突变型感染性克隆，由以1.1拷贝且含有两个Stem-loop的PCV2全基因组的质粒为模板，在其全长Cap基因的N端的LoopCD区域插入RGD序列构建所得。利用基因工程技术对PCV2全长基因组cap基因的Loop CD区N端插入一个拷贝RGD多肽序列的序列编辑，设计1.1拷贝带有RGD多肽序列的PCV2感染性克隆基因组序列，构建突变型感染性克隆。
根据本发明的另一方面，还提供了一种如上述突变型感染性克隆在制备具有遗传标记的病毒毒株的应用。将上述突变型感染性克隆应用于病毒毒株的制备，使得构建的毒株具有感染活性，且构建的具有遗传标记的病毒毒株的病毒拷贝数明显高于野生型病毒毒株，并具有更好的复制能力，可应用于致病机制研究以及分子鉴别诊断技术、活载体表位疫苗等研制。另外，具有遗传标记的病毒毒株，可与亲本野生型病毒相鉴别，在建立动物感染模型，探讨猪圆环病毒的致病机理、分子诊断及疫苗免疫效力的评价等方面均有重要的应用价值。
实施例
DH 5α(大肠杆菌)、BL21(DH3)感受态细胞、2×EasyTaq聚合酶，购自北京全式金生物公司。
限制性内切酶及T4 DNA连接酶、蛋白Marker(26619)，购自Thermo Fisher公司。
5kb DNA marker、溴化乙锭核酸染料(EB)，购自Vazyme公司。
Gel Extraction Kit(DNA胶纯化试剂盒)、质粒提取试剂盒，购自OMEGA公司。
质粒：含有PCV2 ORF2蛋白序列(GenBank：JF504708)的pET100-PCV2-DNLS Cap的重组质粒及含有PCV2全基因序列的pSP72-PCV2质粒(GenBank：KP112486)由本实验室保存。
抗原：WT-VLPs由本实验室保存。
抗体：兔源性抗PCV2 Cap的多克隆抗体由本实验室制备并保存、HRP标记的羊抗兔IgG抗体，HRP标记的羊抗鼠IgG、IgM抗体，购自KPL公司、FITC标记的驴抗兔IgG荧光抗体，购自Life Technologies公司。
其他为市销。
本发明中下述实施例中所使用的方法如无特殊说明均为常规方法，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译。第3版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行。同时，本发明中的氨基酸无特别说明外均用其缩写或代号标明(氨基酸中英文名称及其缩写和代号见表1)。
表1氨基酸中英文名称及其缩写和代号
Figure BDA0002223207450000061
实施例1
1.1RGD插入PCV2 Cap蛋白重组质粒的构建以及突变体3D蛋白结构模拟
以实验室保存的含有PCV2 ORF2蛋白序列(GenBank：JF504708)的pET100-PCV2-DNLS Cap质粒为模板，pET100-PCV2-DNLS Cap氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示，进行实验设计。利用DNAMAN软件找到PCV2 Cap的Loop CD区75-92氨基酸(NINDFLPPGGGSNPRSVP)，已知当PCV2 Cap在体外组装成VLPs时LPPGGGSN基序位于VLPs的外表面，在此8个氨基酸上进行突变，在85G和86S之间插入含有一个拷贝的RGD序列，命名为pET100-PCV2 Cap-iRGD。
利用已知的PCV2cs蛋白结构(Protein Data Bank number：3R0R)，通过Swiss-Model蛋白结构模拟软件(http://swissmodel.expasy.org/)和Modeller在线同源建模软件(https://salilab.org/modeller/)对突变型蛋白进行同源建模及结构预测，经过系统评分筛选最优模拟结果，并用PyMoL软件(https://pymol.org/)对模拟的结果进行展示。
1.2overlap-PCR引物设计
通过PCV2 Cap的LoopCD区插入RGD短肽形成突变体进行overlap-PCR引物设计，利用Oligo7.0软件设计相关的PCR引物，并送到擎科生物公司进行合成。
引物F1-Nde I-001核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，引物R1-003核苷酸序列如SEQID NO：2所示；
引物F2-004核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，引物R2-BamH I-007核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
1.3扩增目的片段
利用引物扩增目的片段，以pET100-PCV2-DNLS Cap为模板，pET100-PCV2-DNLSCap的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示，采用F1-Nde I-001、R1-003引物扩增目的片段的A片段，同时用F2-004、R2-BamH I-007引物扩增目的片段的B片段；再以等量的A、B片段为模板，用对应的前向引物F1-Nde I-001和后向引物R2-BamH I-007为扩增目的片段全长序列。具体反应体系见表2。
表2 PCR反应体系
Figure BDA0002223207450000071
反应条件：预变性94℃(5min)；变性95℃(30s)；退火56℃(30s)，延伸72℃(30s)，共35个循环；72℃延伸5min。将PCR产物点样于1％的琼脂糖凝胶中，在恒压90V的条件下进行电泳30分钟，跑胶结果用凝胶成像系统进行分析。
1.4重组表达质粒
PCR扩增后，反应产物经琼脂糖凝胶电泳分析，并用试剂盒对目的条带进行胶回收。再利用限制性内切酶NdeⅠ和Bam HⅠ双酶切目的片段全长序列和原核表达载体pET100，37℃水浴锅中酶切1h，酶切体系见表3。酶切后的产物经琼脂糖凝胶电泳分析后，将目的片段用琼脂糖凝胶试剂盒进行胶回收，再将胶回收纯化后的载体和目的片段，依照表4体系进行连接。
将上述连接产物取10μL转化到DH 5α的大肠杆菌细胞中，复苏1h后取200μL混合液均匀涂在含有氨苄抗生素的LB平板上，37℃恒温箱中倒置培养12-14h，挑取单克隆菌落利用质粒提取试剂盒提取质粒，并进行NdeⅠ和Bam HⅠ双酶切验证，验证正确的质粒送至公司进行测序，测序正确，获得重组表达质粒pET100-PCV2 Cap-iRGD，其氨基酸序列如SEQ IDNO：14所示。
表3酶切体系
Figure BDA0002223207450000081
表4连接体系
Figure BDA0002223207450000082
反应条件：22℃水浴连接1h。
1.5重组质粒表达及重组基因工程菌的构建
将测序正确的重组质粒转化至BL 21感受态细胞中，转化后的菌液均匀涂在含氨苄抗生素的LB固体培养基上37℃过夜培养，挑取一个单克隆菌落到10mL含氨苄抗生素的LB培养基中，37℃、200rpm条件下过夜培养。将扩增的菌液按1:100比例加到含氨苄抗生素的新鲜1L TB培养基中培养3h，当菌液OD600值达到0.6-1.0时，加入1.2mL IPTG(终浓度为1mM)进行诱导表达，同时摇床降速至180rpm，温度降至30℃，继续培养6h后离心获得沉淀即为重组基因工程菌。
1.6重组蛋白的纯化及鉴定
向收集的沉淀菌中加入蛋白裂解液，利用超声破碎仪进行破碎，13800rpm，4℃条件下离心收集上清，将上清液与镍柱填料孵育通过亲和层析法进行蛋白纯化，室温结合1h后用高浓度的咪唑洗脱蛋白并用离心管进行收集，4℃进行保存。
SDS-PAGE可溶性分析
将纯化后的蛋白进行12％的SDS-PAGE凝胶电泳。
Western blot鉴定
将蛋白凝胶上的蛋白转至硝酸纤维膜上，3％BSA封闭1h，用1％BSA为溶剂稀释实验室保存的兔源性PCV2多抗(1:500)以及HRP标记的羊抗兔二抗(1:5000)，37℃分别孵育1h。PBST(含0.05％吐温)洗三次后，加入显色液，并于仪器下拍照观察。
1.7重组蛋白的体外VLPs组装及鉴定
取5mL纯化后的蛋白装入干净的透析袋中，将透析袋放入1L buffer A溶液中，4℃环境下进行体外自组装，48h后取出透析袋中的蛋白样品，并进行鉴定。
分子筛鉴定
先用蒸馏水和低渗PBS清洗分子筛的输入泵头，将蛋白样品缓慢加入到上样装置中(注意此步要保证上样装置内无空气进入)。打开紫外接收装置，根据紫外吸收光谱280nm处的峰值及洗脱液的体积，判定洗脱下来的颗粒大小，同时可预计出溶液中颗粒的浓度。
电镜观察
取10μL待观察的蛋白样品滴加置铜网上，室温孵育10min，待测样品被全完吸附后，用3％钨磷酸负染约9min，样品静置干燥后于透射电子显微镜下观察。
对比例1
1.1RGD替换PCV2 Cap蛋白重组质粒的构建以及突变体3D蛋白结构模拟
以实验室保存的含有PCV2 ORF2蛋白序列(GenBank：JF504708)的pET100-PCV2-DNLS Cap质粒为模板，进行实验设计。利用DNAMAN软件找到PCV2 Cap的Loop CD区75-92氨基酸(NINDFLPPGGGSNPRSVP)，已知当PCV2 Cap在体外组装成VLPs时LPPGGGSN基序位于VLPs的外表面，在此8个氨基酸上进行突变，将GS连接两个拷贝的“RGDGSRGD”完全替换80LPPGGGSN87，命名为pET100-PCV2 Cap-rRGD，其氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示。
利用已知的PCV2cs蛋白结构(Protein Data Bank number：3R0R)，通过Swiss-Model蛋白结构模拟软件(http://swissmodel.expasy.org/)和Modeller在线同源建模软件(https://salilab.org/modeller/)对突变型蛋白进行同源建模及结构预测，经过系统评分筛选最优模拟结果，并用PyMoL软件(https://pymol.org/)对模拟的结果进行展示。
1.2overlap-PCR引物设计
通过PCV2 Cap的LoopCD区“RGDGSRGD”完全替换LPPGGGSN形成突变体进行overlap-PCR引物设计，利用Oligo7.0软件设计相关的PCR引物，并送到擎科生物公司进行合成。
引物F1-Nde I-001核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，引物R1-001核苷酸序列如SEQID NO：5所示；
引物F2-002核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，引物R2-BamH I-007核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
其他步骤与实施例1相同。
对比例2
2.1DDD插入PCV2 Cap蛋白重组质粒的构建以及突变体3D蛋白结构模拟
以实验室保存的含有PCV2 ORF2蛋白序列(GenBank：JF504708)的pET100-PCV2-DNLS Cap质粒为模板，进行实验设计。利用DNAMAN软件找到PCV2 Cap的Loop CD区75-92氨基酸(NINDFLPPGGGSNPRSVP)，已知当PCV2 Cap在体外组装成VLPs时LPPGGGSN基序位于VLPs的外表面，在此8个氨基酸上进行突变，在85G和86S之间插入含有一个拷贝的DDD序列，即SDDDG序列，命名为pET100-PCV2 Cap-iDDD，其氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示。
利用已知的PCV2cs蛋白结构(Protein Data Bank number：3R0R)，通过Swiss-Model蛋白结构模拟软件(http://swissmodel.expasy.org/)和Modeller在线同源建模软件(https://salilab.org/modeller/)对突变型蛋白进行同源建模及结构预测，经过系统评分筛选最优模拟结果，并用PyMoL软件(https://pymol.org/)对模拟的结果进行展示。
2.2overlap-PCR引物设计
通过PCV2 Cap的LoopCD区插入DDD短肽形成突变体进行overlap-PCR引物设计，利用Oligo7.0软件设计相关的PCR引物，并送到擎科生物公司进行合成。
引物F1-Nde I-001核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，引物R1-005核苷酸序列如SEQID NO：7所示；
引物F2-006核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，引物R2-BamH I-007核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
其他步骤与实施例1相同。
实施例2
IFA分析融合RGD的PCV2病毒样颗粒入侵细胞特性
将PK15和IPEC-J2细胞分别接种于盛有细胞爬片的培养板中，分别加入1ug WT-VLPs和iRGD-PCV2 VLPs，未处理的细胞作为对照，孵育1h后更换新鲜培养基孵育过夜。用4％的多聚甲醛固室温中定细胞20min，0.1％Triton室温中透化细胞10min。3％BSA封闭1h，1％BSA稀释兔源性PCV2多抗(1∶500)以及FITC标记的驴抗兔二抗(1∶2000)，37℃分别孵育1h。PBST(含0.05％吐温)洗三次后，用DAPI对细胞核进行染色，指甲油封片后于倒置荧光显微镜下观察。
实施例3
融合RGD的PCV2病毒样颗粒的免疫动物研究
将鉴定正确的WT-VLPs和iRGD-PCV2 VLPs稀释至200μg/mL，将弗氏佐剂(完全或不完全)分别与WT-VLPs或iRGD-PCV2 VLPs按1:1充分混合均匀后，按20μg VLPs/只剂量免疫小鼠。
5周龄雌性清洁型昆明小鼠随机分为3组，第一、二组分别为WT-VLPs疫苗接种组、iRGD-PCV2 VLPs疫苗接种组，第三组为PBS对照组。小鼠适应一周后进行首免，免疫剂量为200μL(使用完全弗氏佐剂)，免疫方法为腹腔注射。首免后第14、28天分别进行加强免疫，免疫剂量和方法同上(均使用不完全弗氏佐剂)。且在首免后第14、28天，每组随机选取5只小鼠进行眼球采血，分离血清用于PCV2特异性抗体水平的检测。
实施例4
间接ELISA检测免疫小鼠体内PCV2特异性抗体水平
包被的抗原为本实验室制备并保存的WT-VLPs，采用pH为9.6的50mM NaHCO3缓冲液作为包被稀释液，将用于包被的抗原浓度稀释至1μg/mL，每孔加入200μL，4℃包被过夜。PBST为稀释液配制3％BSA封闭液，每孔加入100μL，于振荡器37℃封闭3h。血清样品作为一抗，与PBST按1∶150的比例稀释，每孔加入100μL，于振荡器37℃孵育30min。HRP标记羊抗鼠IgG或IgM抗体为二抗，与PBST按1∶4000稀释后每孔加入100μL，于振荡器37℃孵育15min。每孔加入50μL TMB显色液，室温反应5min后，每孔加入50μL 2M硫酸进行终止。除终止反应这一步骤外，其他步骤之间都以PBST为洗涤液，每孔加入200μL，于振荡器37℃洗3次，每次5min，最后一次洗完后拍干。
检测结果如下所示：
图2是本发明优选实施例的野生型及突变型PCV2核衣壳蛋白3D结构示意图，A、B、C、D分别代WT-VLPs、rRGD-PCV2 VLPs、iRGD-PCV2 VLPs、iDDD-PCV2 VLPs。1代表Loop CD，2代表LPPGGGSN序列，3代表RGD序列，4代表DDD序列。
图3是本发明优选实施例的重组质粒酶切鉴定示意图，M：Marker；泳道1-3：pET100-PCV2Cap-iRGD酶切产物；泳道4-7：pET100-PCV2Cap-rRGD酶切产物。
图4是本发明优选对比例1的重组质粒测序图谱。
图5是本发明优选实施例1的重组质粒测序图谱。
图6是本发明纯化蛋白的SDS-PAGE鉴定图，M：Marker；泳道1：纯化的WT-Cap蛋白；泳道2：纯化的iRGD-Cap蛋白；泳道3：纯化的rRGD-Cap蛋白。
图7是本发明纯化蛋白的Western blot鉴定图，M：Marker；泳道1：纯化的WT-Cap蛋白；泳道2：纯化的iRGD-Cap蛋白；泳道3：纯化的rRGD-Cap蛋白。
图8是本发明野生型WT-VLPs凝胶渗透色谱法鉴定结果图。
图9是本发明iRGD-PCV2 VLPs凝胶渗透色谱法鉴定结果图。
图10是本发明rRGD-PCV2 VLPs凝胶渗透色谱法鉴定结果图。
图11是本发明的VLPs的电镜图；WT：WT-VLPs；iRGD：iRGD-PCV2 VLPs；rRGD：rRGD-PCV2 VLP。
图12是本发明的VLPs入侵细胞的IFA图，NC：对照组；WT-VLPs：野生型WT-VLPs细胞内荧光染色；iRGD-VLPs：iRGD-VLPs细胞内荧光染色。
图13是本发明的小鼠血清中PCV2 Cap特异性lgM抗体水平的检测示意图。
图14是本发明的小鼠血清中PCV2 Cap特异性lgG抗体水平的检测示意图。
如图2所示，对野生型及突变型PCV2 Cap核衣壳蛋白进行了3D结构模拟，从图2-B中可以看到，将Loop CD上80LPPGGGSN87 8个氨基酸完全替换成RGDGSRGD后，Loop CD结构发生了明显变化，但RGD序列仍能够展示在VLPs表面。而对于插入RGD修饰的VLPs，可以看到整个Loop区结构未发生明显变化，可清楚辨识80LPPGGGSN87基序所在的结构位置，同时RGD序列(标号3)紧密结合并展示在VLPs表面(图2-C)。对于插入DDD修饰的VLPs，仍能看到整个Loop区，但LPPGGGSN基序所在的结构位置与野生型相比产生变化，且DDD序列(标号4)未能紧密结合，呈散状展示在VLPs表面(图2-D)。插入DDD修饰的VLPs，其结构发生明显变化，说明将Loop CD区N端插入的DDD短肽可能会影响PV2 Cap蛋白的表达和纯化，也说明并非任一短肽都可以对Loop CD区进行修饰。
如图3所示，结果显示两个重组质粒均切出两条大小不同的DNA带(5764bp和702bp左右)。如图4和图5所示，同时基因测序结果与原始设计序列完全一致，说明RGD成功修饰PCV2 Cap且目的片段已成功插入到原核表达载体pET100中，命名为pET100-PCV2Cap-iRGD和pET100-PCV2Cap-rRGD。
如图6所示，通过镍柱亲和层析法对表达的蛋白进行纯化，利用SDS-PAGE方法对表达的蛋白进行鉴定，SDS-PAGE结果显示，两种纯化后地突变体蛋白在26KD左右出现了明显的特异性条带，说明在大肠杆菌中能成功表达出可溶性突变体蛋白，且突变体蛋白能够被纯化。
如图7所示，Western blot鉴定结果显示，两种突变体蛋白在26KD左右均出现了明显的特异性蛋白条带，说明纯化后的可溶性突变体蛋白iRGD-Cap和rRGD-Cap能够特异性识别抗PCV2 Cap蛋白抗体。
如图8、图9和图10所示，将体外组装的突变体VLPs全部通过Sephacryl S-300分子筛，结果通过紫外吸收光谱展示。如图8所示，WT-VLPs在43mL左右体积处被洗脱下来，如图9所示，iRGD-PCV2 VLPs与WT-VLPs在同一体积处被洗脱下来，且紫外吸收峰280nm处出现了一个较高的吸收峰，与预期结果一致。如图10所示，而PCV2 Cap的Loop CD区“RGDGSRGD”完全替换LPPGGGSN形成突变体蛋白体外组装未在同体积值处出现吸收峰，说明未组装病毒样颗粒，此处与3D蛋白结构模拟结果相一致。
如图11所示，电子显微镜下观察到，iRGD-Cap重组蛋白体外自组装后形成大小约17nm的iRGD-PCV2 VLPs，其大小形状均与野生型WT-VLPs一致。而rRGD-Cap突变体未观察到病毒样颗粒。
如图12所示，在IPEC-J2和PK15正常细胞中均未出现特异性荧光信号，而野生型WTVLPs和iRGD-PCV2 VLPs入侵的细胞中均出现了大量的特异性荧光信号，经过与DAPI染色细胞核组合成像后发现，野生型WT-VLPs和iRGD-PCV2 VLPs在细胞内的分布有差异。
如图13和图14所示，首免后第14天和第28天，利用间接ELISA的方法检测各组小鼠免疫不同VLPs后诱导产生的针对PCV2 Cap的特异性抗体水平。如图13所示，首免后第14天和第28天，免疫了iRGD-PCV2 VLPs的小鼠体内IgM抗体水平均高于野生型WT-VLPs组，且在首免后第28天，显著高于野生型WT-VLPs组(P<0.01，**标示)。同时，如图14所示，特异性IgG抗体水平检测结果显示，随着免疫次数增加，免疫了野生型WT-VLPs和iRGD-PCV2 VLPs组的小鼠其IgG抗体水平均出现上升，重要的是，免疫了iRGD-PCV2 VLPs组的小鼠其诱导产生的特异性IgG抗体水平均高于野生型WT-VLPs组，且在首免后第28天IgG抗体水平显著高于野生型WT-VLPs组(P<0.01，**标示)。
实施例5
5.1突变型感染性克隆的构建
以实验室保存的1.1拷贝且含两个Stem-loop的PCV2全基因组的质粒为模板(GenBank：KP112486)，在其全长Cap基因的N端的Loop CD区，85G和86S间插入一个拷贝的RGD序列，构建带有RGD多肽序列的1.1拷贝的突变型感染性克隆基因组序列，命名为pSP72-PCV2-iRGD(PCV2-iRGD)，如图15所示。
5.2overlap-PCR扩增目的片段计
通过Loop CD区插入RGD短肽进行overlap-PCR引物设计，利用Oligo7.0软件设计相关的PCR引物，并送到擎科生物公司进行合成。
引物F1-Kpn I-005核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，引物R1-009核苷酸序列如SEQID NO：10所示；
引物F2-010核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示，引物R2-Hind III-008核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示。
利用引物扩增目的片段，以1.1拷贝的PCV2全基因组质粒为模板，用F1-Kpn I-005和R1-009及F2-010和R2-Hind III-008两对引物分别扩增出突变型感染性克隆质粒的A和B片段，再将A和B片段以1:1混合后为模板，利用F1-Kpn I-005和R2-Hind III-008扩增出pSP72-PCV2-iRGD全长片段，长度为1897bp。反应体系如表5所示。
表5 PCR反应体系
Figure BDA0002223207450000131
Figure BDA0002223207450000141
反应条件：预变性94℃(5min)；变性95℃(30s)；退火56℃(30s)，延伸72℃(2min)，共35个循环；72℃延伸5min。将PCR产物点样于1％的琼脂糖凝胶中，在恒压90V的条件下进行电泳30min，跑胶结果用凝胶成像系统进行分析。
5.3突变型感染性克隆基因鉴定
扩增后的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析，并用试剂盒对目的条带进行胶回收。再利用限制性内切酶Kpn I和Hind III分别双酶切目的片段和克隆载体pSP72，37℃水浴锅中酶切1h，酶切体系见表3。酶切后的产物经琼脂糖凝胶电泳分析并用试剂盒进行胶回收，再将回收纯化后的载体和目的片段，依照表4体系进行连接。
将上述连接产物取10μL转化到DH 5α的大肠杆菌细胞中，复苏1h后取200μL混合液均匀涂在含有氨苄抗生素的LB平板上，37℃恒温箱中倒置培养12-14h，挑取单克隆菌落利用质粒提取试剂盒提取质粒，并进行Kpn I和Hind III双酶切验证，验证正确的质粒送至公司进行测序，测序正确，获得突变型感染性克隆质粒。
5.4突变型感染性克隆病毒拯救及拷贝数检测
5.4.1质粒转染
利用NanoDrop超微量分光光度计测定构建的突变型感染性克隆质粒pSP72-PCV2-iRGD和野生型感染性克隆质粒pSP72-PCV2的DNA浓度。
(1)将PK15按0.5×106接种于6孔细胞板中，当细胞完全贴壁后进行转染；(2)取5μL Lip2000转染试剂与100μL Opti-MEM混合均匀，标记为A液，取2.5μg质粒与100μL Opti-MEM混合均匀，标记为B液，室温下静置反应5min；(3)将A和B液混合均匀，室温静置反应20min；(4)取出6孔细胞板，弃去培养基，PBS洗3次，加入1.8mL新鲜DMEM培养基，再将AB混合液轻轻滴加至对应孔中，混匀后置于于37℃，CO2培养箱中培养72h；(5)以转染的细胞为P0代，对其进行盲传，同时收取每一代细胞上清液用于后续病毒载量的分析。
5.4.2Q-PCR检测感染性克隆病毒拷贝数
将不同代数的细胞上清煮沸5min后作为模板，利用实验室保存的PCV2荧光定量PCR检测引物ZY097和ZY098对突变型感染性克隆病毒拯救后的拷贝数进行检测，设立阴性对照组、标准样品组及检测样品组，每组3个复孔，且标准样品组设置5个浓度梯度。检测体系见表6。
表6荧光定量PCR反应体系
Figure BDA0002223207450000142
Figure BDA0002223207450000151
检测结果如下所示：
图16是本发明优选实施例的重组质粒pSP72-PCV2-iRGD酶切鉴定图，M：Marker；泳道1-6：pSP72-PCV2-iRGD。
图17是本发明优选实施例的突变型感染性克隆病毒拷贝数测定结果图。
如图16所示，获得的突变型感染性克隆质粒双酶切后经过1％琼脂糖凝胶电泳分析，pSP72-PCV2-iRGD观察到大小约2400bp和1800bp的特异性条带，分别与pSP72载体和目的片段大小相似，将质粒送至公司进一步验证，测序结果与设计序列完全一致。
如图17所示，野生型PCV2感染性克隆和突变型感染性克隆质粒转染至PK15细胞，进行病毒拯救，Q-PCR检测第3代细胞上清中PCV2核酸载量，结果显示，在细胞上清中均可检测到PCV2核酸，结果指示突变型感染性克隆病毒在PK15细胞中能够进行复制。而且与1.1拷贝的野生型PCV2感染性克隆病毒(WT)比，突变型感染性克隆毒株(iRGD)基因组拷贝数增加。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖南农业大学
<120> 融合RGD的猪圆环病毒2型病毒样颗粒、感染性克隆及其制备方法和应用
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttccatatgc ggggttctca tcatc 25
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
accgtcaccg cgggaaccgc cacccggtgg cag 33
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcccgcggtg acggttccaa cccacgcagc gtg 33
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcgggatcct tatcacgggt tcagc 25
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtcaccgcgg gaaccgtcac cgcggaagtc gttgatattg 40
<210> 6
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgcggtgacg gttcccgcgg tgacccacgc agcgtgcctt tc 42
<210> 7
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
accgtcgtcg tcggaaccgc cacccggtgg caggaag 37
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tccgacgacg acggttccaa cccacgcagc gtg 33
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cggggtacct ccttggatac gtcatcgctg 30
<210> 10
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggctcccgcg gtgacggttc aaaccccctc actgtg 36
<210> 11
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
accgtcaccg cgggagcccc ctcctggggg aag 33
<210> 12
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cccaagcttt cttcttgctg ggcatgttgc tgc 33
<210> 13
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr
1 5 10 15
Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp
20 25 30
His Pro Phe Thr Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg Leu Ser Arg Thr Phe
35 40 45
Gly Tyr Thr Ile Lys Arg Thr Thr Val Lys Thr Pro Ser Trp Ala Val
50 55 60
Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu Pro Pro Gly Gly Gly
65 70 75 80
Ser Asn Pro Arg Ser Val Pro Phe Glu Tyr Tyr Arg Ile Arg Lys Val
85 90 95
Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr Gln Gly Asp Arg Gly
100 105 110
Val Gly Ser Ser Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn Phe Val Thr Lys Ala
115 120 125
Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr Ser Ser Arg His Thr
130 135 140
Ile Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr Phe Thr Pro Lys Pro
145 150 155 160
Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro Asn Asn Lys Arg Asn
165 170 175
Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Ala Gly Asn Val Asp His Val Gly
180 185 190
Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp Gln Glu Tyr Asn Ile
195 200 205
Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe Asn Leu Lys Asp Pro
210 215 220
Pro Leu Asn Pro
225
<210> 14
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr
1 5 10 15
Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp
20 25 30
His Pro Phe Thr Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg Leu Ser Arg Thr Phe
35 40 45
Gly Tyr Thr Ile Lys Arg Thr Thr Val Lys Thr Pro Ser Trp Ala Val
50 55 60
Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu Pro Pro Gly Gly Gly
65 70 75 80
Ser Arg Gly Asp Gly Ser Asn Pro Arg Ser Val Pro Phe Glu Tyr Tyr
85 90 95
Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr
100 105 110
Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn
115 120 125
Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr
130 135 140
Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr
145 150 155 160
Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro
165 170 175
Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Ala Gly Asn
180 185 190
Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp
195 200 205
Gln Glu Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe
210 215 220
Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro
225 230
<210> 15
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr
1 5 10 15
Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp
20 25 30
His Pro Phe Thr Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg Leu Ser Arg Thr Phe
35 40 45
Gly Tyr Thr Ile Lys Arg Thr Thr Val Lys Thr Pro Ser Trp Ala Val
50 55 60
Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Arg Gly Asp Gly Ser Arg
65 70 75 80
Gly Asp Pro Arg Ser Val Pro Phe Glu Tyr Tyr Arg Ile Arg Lys Val
85 90 95
Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr Gln Gly Asp Arg Gly
100 105 110
Val Gly Ser Ser Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn Phe Val Thr Lys Ala
115 120 125
Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr Ser Ser Arg His Thr
130 135 140
Ile Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr Phe Thr Pro Lys Pro
145 150 155 160
Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro Asn Asn Lys Arg Asn
165 170 175
Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Ala Gly Asn Val Asp His Val Gly
180 185 190
Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp Gln Glu Tyr Asn Ile
195 200 205
Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe Asn Leu Lys Asp Pro
210 215 220
Pro Leu Asn Pro
225
<210> 16
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr
1 5 10 15
Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp
20 25 30
His Pro Phe Thr Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg Leu Ser Arg Thr Phe
35 40 45
Gly Tyr Thr Ile Lys Arg Thr Thr Val Lys Thr Pro Ser Trp Ala Val
50 55 60
Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu Pro Pro Gly Gly Gly
65 70 75 80
Ser Asp Asp Asp Gly Ser Asn Pro Arg Ser Val Pro Phe Glu Tyr Tyr
85 90 95
Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr
100 105 110
Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn
115 120 125
Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr
130 135 140
Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr
145 150 155 160
Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro
165 170 175
Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Ala Gly Asn
180 185 190
Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp
195 200 205
Gln Glu Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe
210 215 220
Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro
225 230

Claims (7)

1.一种融合RGD的猪圆环病毒2型病毒样颗粒，其特征在于，
所述RGD短肽融合于PCV2 Cap蛋白上，在GenBank：JF504708编码的PCV2 ORF2蛋白序列Loop CD区域N端的85G和86S之间插入含有一个拷贝的RGD序列，再增设柔性氨基酸：丝氨酸(S)和甘氨酸(G)连接RGD序列，即SRGDG序列。
2.根据权利要求1所述的融合RGD的猪圆环病毒2型病毒样颗粒，其特征在于，
所述融合RGD的猪圆环病毒2型病毒样颗粒是通过构建重组质粒pET100-PCV2 Cap-iRGD表达获得，所述重组质粒pET100-PCV2 Cap-iRGD氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示。
3.一种根据权利要求1或2所述的融合RGD的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
针对权利要求1或2的Loop CD区域的突变体，利用Oligo 7.0设计引物；以pET100-PCV2-DNLS Cap为模板，利用over-lap PCR技术和胶回收扩增突变体的目的片段；
将目的片段插入到载体中得到重组表达质粒pET100-PCV2 Cap-iRGD；
将所述重组表达质粒转化进入感受态细胞中得到重组基因工程菌；
将所述重组基因工程菌进行分离、纯化获得重组蛋白；
将所述重组蛋白体外组装获得所述融合RGD的猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒。
4.根据权利要求3所述的融合RGD的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，所述引物包括：
引物F1-Nde I-001核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，
引物R1-003核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
引物F2-004核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，
引物R2-BamH I-007核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
5.一种药物组合物或疫苗，其特征在于，包括权利要求1或2所述的融合RGD的猪圆环病毒2型病毒样颗粒，还包含药学可接受的载体和/或赋形剂。
6.一种突变型感染性克隆，其特征在于，由以1.1拷贝且含有两个Stem-loop的GenBank：KP112486的PCV2全基因组的质粒为模板，在其全长Cap基因的N端的Loop CD区域，85G和86S间插入一个拷贝的RGD序列构建所得。
7.如权利要求6所述的突变型感染性克隆在制备具有遗传标记的病毒毒株的应用。
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Recombinant virus-like particles as a carrier of B- and T-cell epitopes of hepatitis C virus (HCV);MarijaMihailova等;《Vaccine》;20060531;第24卷(第20期);第4370页右栏第3段,第4375页右栏第2段,第4376页左栏第1段 *

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