CN102813918A - 一种猪圆环病毒2型重组亚单位疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及了一种猪圆环病毒的2型重组亚单位疫苗及其制备方法，将猪圆环病毒2型ORF1和ORF2基因优势抗原表位区进行合理组合，利用生物信息学和SOEing PCR技术优化密码子，获取人工基因序列YSORF，构建到原核表达载体，利用大肠杆菌表达重组融合蛋白，经适度纯化后与佐剂混合制备出含有ORF1和ORF2蛋白片段的亚单位疫苗。本发明创造性地以柔性肽将猪圆环病毒2型ORF1和ORF2基因优势表位区串联组合，既增加了表位数量，又有利于融合蛋白正确空间构象的形成；同时还对ORF1和ORF2的密码子进行了优化，增加融合蛋白的表达量，降低了生产成本。本发明生产的疫苗具有产量高、成本低、保护力强等优点，适宜于大规模生产。

Description

一种猪圆环病毒2型重组亚单位疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于生物制药领域，涉及一种猪圆环病毒2型重组亚单位疫苗，同时还涉及一种该疫苗的制备方法，同时还涉及一种构建人工基因YSORF及融合蛋白rYSORF。

技术背景

猪圆环病毒病（PCV）是由猪圆环病毒2型（PCV2）引起的猪传染性疾病，是继猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）之后新发现的又一重要疫病。自1997年Clark等首次分离到猪圆环病毒2型（PCV2）以来，该病已给全世界养猪业造成了巨大的经济损失。目前，如何有效防控PCV已成为全球养猪业关注的焦点。

迄今，全球有4种商品化PCV2疫苗相继问世，其中梅里亚动物保健公司研发的PCV2疫苗

为全病毒灭活苗，适用于母猪免疫。由于PCV2难培养、生长慢，考虑到病毒培养成本高、周期长，人们又摸索出了一些新的方法来制备PCV2仔猪用疫苗，主要包括两种类型：一类是亚单位疫苗，如勃林格殷格翰动物保健公司的PCV2疫苗和英特威/先灵葆雅动物保健公司的PCV2疫苗

大量田间试验表明该类疫苗可为仔猪提供良好的免疫保护；另一类是嵌合病毒灭活苗，用PCV2的ORF2片段置换不致病的PCV1中的ORF2片段，即获得了PCV1-PCV2嵌合病毒，具有与PCV2类似的免疫原性。近年来，以上PCV2疫苗已在部分国家和地区进行了注册，并在该病的防治过程中发挥了重要的作用。然而，目前我国尚无注册及国产的PCV2商品化疫苗，临床上急需针对PCV2的安全、保护力高的疫苗。

基因工程疫苗如DNA疫苗、亚单位疫苗及病毒活载体疫苗等将是研制PCV2疫苗的主要方向。猪2型圆环病毒含有两个主要的开放阅读框:ORF1和ORF2，其中ORF1与病毒复制有关，免疫原性和保护力弱；ORF2为PCV2的主要结构蛋白基因，编码病毒的衣壳蛋白,可自我装配成病毒样粒子，是病毒的主要免疫原性蛋白，并且McNeilly等(McNeilly F etal.,Archires of Virology,2001)研究证实ORF2中含有可中和病毒的中和抗原表位，是亚单位疫苗研制的主要候选基因。

发明内容

本发明的目的在于提供一种猪圆环病毒2型重组亚单位疫苗。

本发明的目的还在于提供一种猪圆环病毒2型重组亚单位疫苗的制备方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种猪圆环病毒的2型重组亚单位疫苗，所述的亚单位疫苗主要由猪圆环病毒2型融合蛋白rYSORF和佛氏不完全佐剂组成。

所述的融合蛋白rYSORF中加入的佛氏佐剂是佛氏不完全佐剂，先将纯化后的融合蛋白调至1mg/ml，按佛氏不完全佐剂与融合蛋白的体积比为1:1在搅拌状态下加入。

同时，本发明的技术方案还采用了一种猪圆环病毒2型重组亚单位疫苗的制备方法，所采用的技术方案包括下述步骤：

1）构建人工基因YSORF:

选取猪圆环病毒2型ORF1和ORF2蛋白免疫优势区，利用生物信息学优化密码子，形成人工基因序列，命名为YSORF；设计引物，利用重叠PCR(SOE)技术拼接YSORF，该序列包含柔性肽(G₃S)₅，连接ORF1和ORF2蛋白免疫优势区；然后利用生物信息学软件Vector NTI对该序列进行密码子优化，获得人工基因YSORF序列；

2）构建重组表达载体rYSORF；

3）融合蛋白rYSORF的诱导表达；

在TB液体培养基中诱导表达，优化表达条件促进融合蛋白在上清中表达；

4）分离纯化大肠杆菌表达的猪圆环病毒2型重组蛋白；

5）利用纯化的猪圆环病毒2型融合蛋白，辅以适量的佛氏不完全佐剂，制备成猪圆环病毒2型重组亚单位疫苗。

所述步骤3）中融合蛋白rYSORF表达条件的优化是将含有人工基因YSORF的工程菌按1/500接种液体TB培养基，37℃剧烈振荡培养至OD600≈1.0时，加入诱导剂IPTG至0.05mM和表面活性剂SDS至0.05%，40℃诱导培养6小时，获得可溶性融合蛋白rYSORF。

所述的构建人工基因YSORF序列包含序列表中SEQ IDNO.1、SEQIDNO.2和SEQ IDNO.3，且分别位于人工基因YSORF序列的上游、中部和下游。

所述的融合蛋白rYSORF序列包含序列表中的SEQ IDNO.4、SEQ IDNO.5和SEQ IDNO.6，且位于融合蛋白rYSORF序列氨基端、中部和羧基端。

本发明将ORF1和ORF2蛋白免疫优势区融合在一起，显著提高了重组PCV2亚单位疫苗的免疫效果；为了提高融合蛋白的表达效率和可溶性，采用SOE PCR技术对全基因序列进行了密码子优化，同时在诱导表达时加入适量的表面活性剂SDS，改变大肠杆菌膜结构，促进表达融合蛋白的分泌；为了最大限度的降低融合蛋白表达后抗原表位被掩盖的频率，在2个免疫优势区之间增加“氨基酸连接臂”[-GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS-,(G₃S)₅]，促进融合蛋白的可溶性表达，使获得的融合蛋白形成正确折叠，完全展示各自的抗原表位。本发明是利用SOEing-PCR的方法和生物信息学软件获得人工基因，同时在两个不同ORF1基因和ORF2基因之间连接柔性肽进行基因的融合表达。利用人工优化改造的基因提高了重组质粒在大肠杆菌中分泌表达量，减少了包涵体的形成，因而也省去了蛋白的变性和复性步骤，降低了生产成本。

对仔猪的免疫保护效力试验

1试验仔猪

30头试验用仔猪为10－14日龄，来至新郑某猪场，试验前进行猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒和猪细小病毒等主要病原进行检测，确认为病原阴性。

2仔猪免疫及攻毒试验

将30头试验用仔猪分为3组，每组10头。其中，第1组给予1ml亚单位疫苗进行免疫，2周后加强免疫1次；第2组为攻毒对照，不进行免疫；第3组为阴性对照，单独饲养。再次免疫3周后对第1和第2组进行攻毒试验，观察记录攻毒过程，3周后剖杀所有试验仔猪，观察各组织器官的病理变化，同时结合临床症状和病原PCR检测判断各仔猪发病情况。在1免前、攻毒前和剖杀前收集所有仔猪血样并进行ELISA检测，分析抗体产生情况。

3试验结果及结论

试验结果见表2和表3。第1组试验仔猪在1免前血清中无抗体产生，在给予亚单位疫苗后10头供试仔猪均产生了PCV2特异性抗体，攻毒后，其中9仔猪健康状况良好，无典型临床症状和病理变化，有1头仔猪发病，病原PCR检测阳性；而第2组试验仔猪在攻毒前血清抗体阳性率为0，即所有仔猪血清中均没有PCV2特异性抗体，攻毒后发现所有仔猪均出现不同程度的临床症状，剖检及病原PCR检测结果证实仔猪发病；而第3组为阴性对照组，单独饲养，在整个试验过程，10头仔猪均未出现特异性抗体，也没有明显的临床症状。

表1供试仔猪PCV2特异性抗体分析结果

表2供试仔猪PCV2特异性抗体分析结果

由此可以得出结论，本发明制备的PCV2重组亚单位疫苗对仔猪有90％的保护率，若进一步优化接种剂量、佐剂类型等条件，其免疫保护效力会更高，可以用于猪场对抗PCV2，以保护猪群。

发明效果

1.融合蛋白的表达效率：采用SOEing PCR技术对全基因序列进行密码子优化，利用大肠杆菌进行表达，表达产物经SDS-PAGE证实，rYSORF获得了大量表达，与预期的大小一致，表达量占菌体蛋白的50％以上；

2.融合蛋白的可溶性：在诱导时添加适量的表面活性剂SDS，改变了大肠杆菌的膜结构，促进融合蛋白向胞外分泌，降低了形成包含体的可能；

3.氨基酸连接臂的作用：在两个免疫优势区之间增加氨基酸连接臂可以有效的提高融合蛋白的可溶性，促进融合蛋白形成正确的空间构象；

4.重组亚单位疫苗的免疫保护效果：试验证实施用本发明所述融合蛋白刺激产生的免疫应答明显强于单独施用ORF2蛋白时激发的免疫应答，显然ORF1和ORF2免疫优势区之间产生了免疫协同作用，融合蛋白的保护作用明显增强；

5.重组亚单位疫苗的安全性：通过对供试动物的临床试验，可以确定本发明所述亚单位疫苗对试验动物是安全的、可靠的，不会造成试验动物的不良反应。

本发明所需要解决的技术问题是提供一种通过将ORF1和ORF2蛋白免疫优势区合理连接，以弥补只有ORF2蛋白免疫强度弱，提高PCV2重组亚单位疫苗的免疫效果；通过增加氨基酸连接臂，使获得的ORF1和ORF2蛋白的免疫优势区能够独立形成空间结构，充分展示各自独立的抗原表位；通过密码子优化，提高融合蛋白表达量的猪PCV2重组亚单位疫苗的制备方法。

附图说明

图1人工合成基因YSORF设计流程图；

图2PCR扩增基因YSORF产物；

泳道M：DNA相对分子质量标准；

泳道1：阴性对照；

泳道2：YSORF基因PCR扩增产物；

图3pET28a-YSORF表达产物的SDS-PAGE分析；

泳道M：相对分子质量蛋白质marker；

泳道1：未经诱导的菌液；

泳道2：经IPTG诱导的菌液；

图4pET28a-YSORF表达产物破碎上清经His亲和层析纯化SDS-PAGE分析；

泳道1：超声破碎上清；

泳道2：上样流穿液；

泳道3：PB Buffer B1（5mM Imidazole）洗杂纯化产物；

泳道4：PB Buffer B2（10mM Imidazole）洗杂纯化产物；

泳道5：PB Buffer B3（20mM Imidazole）洗杂纯化产物；

泳道6：PB Buffer B4（40mM Imidazole）洗杂纯化产物；

泳道7：PB Buffer B5（60mM Imidazole）洗杂纯化产物；

泳道8：PB Buffer B6（80mM Imidazole）洗杂纯化产物；

泳道9：PB Buffer B7（100mM Imidazole）洗脱纯化产物；

泳道10：PB Buffer B8（200mM Imidazole）洗脱纯化产物；

泳道11：PB Buffer B9（500mM Imidazole）洗脱纯化产物；

泳道12：相对分子质量蛋白质marker。

具体实施方式

实施例1

一种猪圆环病毒2型重组亚单位疫苗，主要由猪圆环病毒2型融合蛋白rYSORF和佛氏不完全佐剂组成，所述的融合蛋白rYSORF中加入的佛氏佐剂是佛氏不完全佐剂，先将纯化后的融合蛋白调至1mg/ml，按佛氏不完全佐剂与融合蛋白的体积比为1:1在搅拌状态下加入。

实施例2

一种猪圆环病毒2型重组亚单位疫苗的制备方法，所述方法的具体步骤如下：

SOEing PCR合成人工基因YSORF

据文献报道，PCV2病毒基因组的主要有两个开放阅读框：ORF1和ORF2。其中，ORF1编码与复制相关的蛋白，具较弱的免疫保护性，其免疫优势区在180～220aa附近；而ORF2编码病毒的主要结构蛋白，是PCV2主要免疫保护性蛋白，其免疫优势区在60～210aa。将ORF1和ORF2蛋白免疫优势区截取出来，并以柔性肽(G₄S)₅连接2个免疫优势区形成融合蛋白rYSORF的氨基酸序列，然后利用生物信息学软件Vector NTI对该序列进行密码子优化，获得人工基因YSORF序列，同时在序列5’端加入BamH I，3’端加入终止密码子TAA和Xho I。

以上述序列为模板设计引物，每条引物长约59bp，且相邻两条引物之间有16bp的重叠（引物序列见表1），按设计流程（图1）采用SOEing PCR方法合成人工基因YSORF，PCR循环条件为：94℃预变性5min；94℃ 30sec，50℃ 30sec，72℃ 30sec 10个循环，94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 30sec 25个循环；72℃延伸7min，PCR产物经1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统拍照记录，结果见图2。

将按上述PCR产物进行切胶回收，回收纯化的DNA片段进行T/A克隆，将人工合成的基因YSORF片段连接到T/A克隆载体pMD-18获得pMD-18-YSORF，转化大肠杆菌DH5a，筛选阳性克隆子并进行测序验证，由上海生工完成，测序正确的克隆子用于载体的构建。

表1人工合成基因YSORF所需的引物

2.表达载体pET28a-YSORF的构建

用限制性内切酶BamH I和Xho I酶切质粒pMD-18-YSORF，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，切胶回收小片段，然后亚克隆到线性化的载体pET28a上，载体线性化过程使用相同的限制性内切酶，连接液转化大肠杆菌DH5a，筛选阳性克隆子并进行测序验证，在确保阅读框正确后，将重组载体命名为pET28a-YSORF，转化到BL21(DE3)感受态细胞中，进行蛋白表达。

3.重组蛋白rYSORF的诱导表达

培养过程中需要卡拉霉素维持工程菌的稳定性，卡拉霉素的浓度为30ug/ml。从固体LB培养基上挑取单克隆，接种5ml液体LB，37℃，150rpm振荡菌过夜，然后按1/500体积比接种液体TB培养基，37℃剧烈振荡培养至OD600≈1.0时，加入诱导剂IPTG至0.05mM和表面活性剂SDS至0.05%，40℃诱导培养6小时，取少量菌液进行SDS-PAGE检测(图3)。

4.重组蛋白rYSORF的纯化

诱导后的工程菌经离心收集菌体，菌体沉淀用pH7.4、浓度为20mM的PBS洗涤两次后用于下游的纯化。按10ml缓冲液/1g菌体比例用pH7.4、浓度为20mM的PBS重悬菌体，采用超声波破碎法破碎细胞，破碎条件是：功率800W，工作时间/间隙时间＝10sec/10sec，超声次数根据菌体的多少决定。破碎后的菌体经4℃、13000rpm离心30min，收集上清液，取20ul上清液进行SDS-PAGE电泳检测，电泳结果如图4所示。电泳后凝胶染色、脱色后，以薄层扫描测定重组蛋白rYSORF占菌体总蛋白的含量，同时以SmartSpec^TM3000（BIO-RAD）测定上清内菌体蛋白总量。

破碎上清经His亲和层析纯化重组蛋白rYSORF，再经G25凝胶过滤层析除掉样品中的咪唑，收集纯化蛋白并用Smart Spec^TM3000测定纯化蛋白的浓度，同时采用常规的SDS-PAGE（图4）方法测定蛋白纯度，蛋白纯度在99％以上。

5.重组PCV2亚单位疫苗的制备

将纯化后的融合蛋白调至1mg/ml，按照1：1的体积比将融合蛋白rYSORF在搅拌状态下滴入佛氏不完全佐剂中，滴完后再继续搅拌10min，得到亚单位疫苗。制备好的疫苗经粘度、剂型、稳定性等各项指标检验合格后置4℃保存。

序列表

SEQ IDNO.1

〈110〉郑州后羿制药有限公司

〈120〉一种猪圆环病毒2型重组亚单位疫苗及其制备方法

〈160〉6

〈210〉1

〈211〉123bp

〈212〉DNA

〈213〉人工合成

〈400〉1

1aaaagcaaat gggcggcgaa ctttgcggac ccggaaacca cctattggaa accgccgcgc    60

aacaaatggt gggatggcta tcatggcgaa gaagtggtgg tgattgatga tttttatggctgg 123

SEQ IDNO.2

〈210〉2

〈211〉60bp

〈212〉DNA

〈213〉人工合成

〈400〉1

1ggcggcggca gcggcggcgg cagcggcggc ggcagcggcg gcggcagcgg cggcggcagc   60

SEQ IDNO.3

〈210〉3

〈211〉456bp

〈212〉DNA

〈213〉人工合成

〈400〉1

1accaccgtga aaaccccgag ctgggcggtg gatatgatgc gctttaacat taacgatttt 60

ctgccgccgg gcggcggcag caacccgcgc agcgtgccgt ttgaatatta tcgcattcgc 120

aaagtgaaag tggaattttg gccgtgcagc ccgattaccc agggcgatcg cggcgtgggc 180

agcagcgcgg tgattctgga tgataacttt gtgaccaaag cgaccgcgct gacctatgat 240

ccgtatgtga actatagcag ccgccatacc attacccagc cgtttagcta tcatagccgc 300

tattttaccc cgaaaccggt gctggatagc accattgatt attttcagcc gaacaacaaa 360

cgcaaccagc tgtggctgcg cctgcagacc gcgggcaacg tggatcatgt gggcctgggc 440

accgcgtttg aaaacagcat ttatgatcag gaataa                           456

SEQ IDNO.4

〈210〉4

〈211〉41aa

〈212〉PRT

〈213〉圆环病毒

〈400〉1

Lys Ser Lys Trp Ala    Ala Asn Phe Ala Asp    Pro Glu Thr Thr Tyr

1                  5                        10                     15

Trp Lys Pro Pro Arg    Asn Lys Trp Trp Asp    Gly Tyr His Gly Glu

                   20                    25               30

Glu Val Val Val Ile    Asp Asp Phe Tyr Gly    Trp

                   35                    40     41

SEQ IDNO.5

〈210〉5

〈211〉20aa

〈212〉PRT

〈213〉柔性多肽

〈400〉1

Gly Gly Gly Ser Gly    Gly Gly Ser Gly Gly    Gly Ser Gly Gly Gly

1                  5                         10                   15

Ser Gly Gly Gly Ser

                   20

SEQ IDNO.6

〈210〉6

〈211〉151aa

〈212〉PRT

〈213〉圆环病毒

〈400〉1

Thr Thr Val Lys Thr    Pro Ser Trp Ala Val    Asp Met Met Arg Phe

1               5                       10                         15

Asn Ile Asn Asp Phe    Leu Pro Pro Gly Gly    Gly Ser Asn Pro Arg

                  20                    25                         30

Ser Val Pro Phe Glu    Tyr Tyr Arg Ile Arg    Lys Val Lys Val Glu

                 35                       40                       45

Phe Trp Pro Cys Ser    Pro Ile Thr Gln Gly    Asp Arg Gly Val Gly

                 50                        55                      60

Ser Ser Ala Val Ile    Leu Asp Asp Asn Phe    Val Thr Lys Ala Thr

                  65                      70                       75

Ala Leu Thr Tyr Asp    Pro Tyr Val Asn Tyr    Ser Ser Arg His Thr

                 80                      85                        90

Ile Thr Gln Pro Phe    Ser Tyr His Ser Arg    Tyr Phe Thr Pro Lys

                 95                       100                     105

Pro Val Leu Asp Ser    Thr Ile Asp Tyr Phe    Gln Pro Asn Asn Lys

             110                         115                      120

Arg Asn Gln Leu Trp    Leu Arg Leu Gln Thr    Ala Gly Asn Val Asp

             125                       130                     135

His Val Gly Leu Gly    Thr Ala Phe Glu Asn    Ser Ile Tyr Asp Gln

             140                       145                     150

Glu

151

Claims (6)

1.一种猪圆环病毒的2型重组亚单位疫苗，其特征在于：所述的亚单位疫苗主要由猪圆环病毒2型融合蛋白rYSORF和佛氏佐剂组成。

2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒的2型重组亚单位疫苗，其特征在于：所述的融合蛋白rYSORF中加入的佛氏佐剂是佛氏不完全佐剂，先将纯化后的融合蛋白调至1mg/ml，按佛氏不完全佐剂与融合蛋白的体积比为1:1在搅拌状态下加入。

3.一种猪圆环病毒2型重组亚单位疫苗的制备方法，其特征在于：包括下述步骤：

1）构建人工基因YSORF:

选取猪圆环病毒2型ORF1和ORF2蛋白免疫优势区，利用生物信息学优化密码子，形成人工基因序列，命名为YSORF；设计引物，利用重叠PCR(SOE)技术拼接YSORF，该序列包含柔性肽(G₃S)₅，连接ORF1和ORF2蛋白免疫优势区；然后利用生物信息学软件Vector NTI对该序列进行密码子优化，获得人工基因YSORF序列；

2）构建重组表达载体rYSORF；

3）融合蛋白rYSORF的诱导表达；

在TB液体培养基中诱导表达，优化表达条件促进融合蛋白在上清中表达；

4）分离纯化大肠杆菌表达的猪圆环病毒2型重组蛋白；

5）利用纯化的猪圆环病毒2型融合蛋白，辅以佛氏不完全佐剂，制备成猪圆环病毒2型重组亚单位疫苗。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤3）中融合蛋白rYSORF表达条件的优化是将含有人工基因YSORF的工程菌按1/500接种液体TB培养基，37℃剧烈振荡培养至OD600≈1.0时，加入诱导剂IPTG至0.05mM和表面活性剂SDS至0.05%，40℃诱导培养6小时，获得可溶性融合蛋白rYSORF。

5.一种构建人工基因YSORF，其特征在于：所述基因YSORF序列包含序列表中SEQ IDNO.1、SEQ IDNO.2和SEQ IDNO.3，且分别位于人工基因YSORF序列的上游、中部和下游。

6.一种融合蛋白rYSORF，其特征在于：所述融合蛋白rYSORF序列包含序列表中的SEQ IDNO.4、SEQ IDNO.5和SEQ IDNO.6，且位于融合蛋白rYSORF序列氨基端、中部和羧基端。

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