CN103687607B - 用于治疗结缔组织疾患的来自菠萝蛋白酶的蛋白水解提取物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及从菠萝蛋白酶获得的用于治疗结缔组织疾病的蛋白水解提取物。特别地，本发明涉及包含从菠萝蛋白酶获得的用于治疗疾病例如掌腱膜挛缩症和阴茎硬结症的蛋白水解提取物的药物组合物。

Description

用于治疗结缔组织疾患的来自菠萝蛋白酶的蛋白水解提取物

发明领域

本发明涉及一种用于治疗结缔组织疾病的从菠萝蛋白酶获取的蛋白水解提取物。特别地，本发明涉及包含用于治疗疾病例如掌腱膜挛缩症和阴茎硬结症的从菠萝蛋白酶获取的蛋白水解提取物的药物组合物。

发明背景

胶原是结缔组织的主要组分，且它主要见于纤维组织如肌腱、韧带和皮肤。无数的疾病和疾患与过度胶原沉积相关联，最常见的是掌腱膜挛缩症和阴茎硬结症。

掌腱膜挛缩症(DD)是手中异常胶原产生和沉积的结缔组织疾患，其通常以无名指和小指的掌指关节(MCPJ)和近端指间关节(PIPJ)的挛缩为特征。在手掌筋膜水平处成纤维细胞增殖和分化为具有过度胶原沉积的成肌纤维细胞引起手掌和/或手指的结节和纤维索带的形成。纤维索带或结节可以有不同的厚度，从纤维索带的直径1毫米到纤维结节的直径近10毫米。当疾病进展时，索带开始收缩，引起干扰和降低手功能的手指屈曲-畸形(屈曲挛缩)。

DD的发病率随年龄增加，且男性更经常患病。遗传易感性、吸烟、酒精、糖尿病、癫痫和重复的手工作业被认为是DD的常见危险因素。DD的严重性和进展可通过手指屈曲挛缩的受影响程度来分类。

手术筋膜切除术是目前最广泛可用的DD治疗，其为大部分患者提供了虽然短暂但积极的结局。然而，手术筋膜切除术通常涉及常见的手术并发症(例如，感染、血肿、组织损失)以及特定的并发症例如手指神经损伤、手指损失、皮瓣损失、创伤愈合问题和术后僵硬。另外，筋膜切除术涉及长的恢复期并且不提供最后的痊愈，因为DD具有极高的复发率。已经尝试了使用针或薄刀片的微创程序；这样的程序虽然引起更少的并发症，却增加复发率。还开发了非手术干预，且包括放射、超声、注射维生素A、维生素E、类固醇和γ-干扰素。

体外研究已表明胶原酶降低拉伸模量和破裂掌腱膜挛缩症的索带组织所需要的力的能力，表明胶原酶在酶促筋膜切开术中可能是有效的。临床研究最近表明使用溶组织梭菌(Clostridium histolyticum)胶原酶的治疗释放了DD挛缩并改进了受影响关节的活动范围。在DD患者中的胶原酶注射的8年随访显示，当与应用胶原酶治疗前的初始挛缩相比，在疾病复发后的MCPJ挛缩更不严重。也表明通常从正常成人手掌筋膜中缺失的III型胶原在DD患者的组织中是丰富的。

阴茎硬结症是一种涉及在阴茎的软组织中的富含胶原的纤维斑块的生长的结缔组织疾患，影响多达10％的男性。特别地，纤维斑块形成于白膜，围绕阴茎海绵体的组织厚鞘，引起经常与疼痛相关联的异常弯曲。

手术是似乎具有可预测的可重复疗效的治疗阴茎硬结症的唯一方法。手术通常仅适用于疾病稳定并且畸形阻止性交和/或引起极度疼痛的长期病例。然而，可因手术发生并发症，包括永久性的阴茎缩短。

用于阴茎硬结症治疗的非手术方法也可用，虽然它们基本都是无效的。已经尝试了通过直接病变内注射来溶解斑块。在注射方法学中，涉及梭菌属胶原酶的方法似乎展示了最一致的疗效，虽然在效果和持续时间上仍然非常有限。另外，已经尝试了放射治疗和激光技术。

美国专利号5,589,171,6,086,872和再公告的美国专利号RE39,941公开了治疗罹患掌腱膜挛缩症的个体的方法，该方法包括将胶原酶应用于纤维的受影响的受掌筋膜。

美国专利号6,022,539公开了治疗罹患阴茎硬结症的个体的方法，该方法包括将胶原酶注射入该个体的阴茎中的纤维阴茎硬结斑块。

美国专利号6,353,028公开了用于治疗以下结缔组织疾患的包含钙通道阻滞剂和有利于钙通道阻滞剂的穿皮递送的载体剂的局部药物：阴茎硬结症、掌腱膜挛缩症和Ledderhose纤维化。

美国专利申请公布号2008/0206228公开了用于治疗各种创伤、烧伤、褥疮、血管溃疡和糖尿病足部溃疡以及用于治疗肥厚性瘢痕和瘢痕疙瘩的含有与胶原酶相关联的透明质酸或其衍生物的药物。明确地公开了掌腱膜挛缩症的治疗。

国际专利申请公布号WO 2004/037183公开了用于治疗涉及纤维化的病患的方法和组合物，其中公开了阴茎硬结症和掌腱膜挛缩症。所述组合物包含例如磷酸二酯酶(PDE)-4抑制剂、PDE-5抑制剂或升高cGMP的化合物。

国际专利申请公布号WO 2005/074913公开了细胞周期抑制剂用于治疗挛缩如掌腱膜挛缩症或阴茎硬结挛缩的用途，细胞周期抑制剂包括抗微管剂、抗代谢物、烷化剂、长春花属生物碱、PDE抑制剂、包括胶原酶的基质金属蛋白酶。

背景技术中没有公开或表明来自植物来源的蛋白水解酶对于治疗涉及过度胶原沉积的结缔组织疾患是有用的。

已经发现从菠萝植物(菠萝(Ananas comosus))的茎获得的提取物选择性地去除失活组织。这样的提取物，也称为菠萝蛋白酶，包含各种蛋白水解酶和水解酶。

本发明的申请者的国际专利申请公布号WO2006/054309公开了从菠萝蛋白酶获得的包含菠萝蛋白酶中存在的大部分蛋白水解酶的清除组合物，蛋白水解酶具有23kDa的平均分子量。WO2006/054309还公开了所述清除组合物用于清除非活性组织的用途。

对治疗涉及过度胶原沉积的结缔组织疾病的改进的无创方法存在未满足的需求。

发明概述

本发明提供了用于治疗结缔组织疾病的从菠萝蛋白酶获得的蛋白水解提取物。特别地，本发明提供用于治疗与过度胶原沉积相关联的结缔组织疾病的从菠萝蛋白酶获得的蛋白水解提取物，所述结缔组织疾病包括掌腱膜挛缩症和阴茎硬结症。

现在首次公开了，从菠萝蛋白酶获得的包含存在于菠萝蛋白酶中的一种或多种半胱氨酸蛋白酶例如茎菠萝蛋白酶或凤梨蛋白酶(ananain)的蛋白水解提取物能够降解天然的、非变性的抗原。出乎意料地，将蛋白水解提取物注射入掌腱膜挛缩症的索带导致索带的断裂同时维持正常健康的结缔组织完整。

本发明还公开了，蛋白水解提取物断裂或溶解掌腱膜挛缩症的索带的功效类似于或甚至高于胶原酶的功效。然而，由于胶原酶对多种类型胶原的亲和力，它可能对非患病韧带或肌腱造成损伤，而本发明的蛋白水解提取物对患病的索带显示特异性。因此，本发明的蛋白水解提取物对于涉及过度胶原沉积的结缔组织疾病，特别对于掌腱膜挛缩症和阴茎硬结症的治疗，提供了改进和安全的药物。

由于可以以小体积制备高浓度蛋白水解提取物的事实，这样的小体积可被注射入患病的纤维索带或斑块，因而避免对周围组织的外渗和损伤，简化临床程序并因此增加患者的顺应性。

根据一个方面，本发明提供一种治疗结缔组织疾病的方法，该方法包括对需要这种治疗的受试者施用包含治疗有效量的从菠萝蛋白酶获得的蛋白水解提取物和药学上可接受的载体的药物组合物，其中蛋白水解提取物包含选自由茎菠萝蛋白酶和凤梨蛋白酶组成的组的至少一种半胱氨酸蛋白酶，并且其中结缔组织疾病与过度胶原沉积相关联。

根据另外的实施方案，结缔组织疾病选自由掌腱膜挛缩症、阴茎硬结症、肩周炎和Ledderhose疾病组成的组。根据某个实施方案，结缔组织疾病是掌腱膜挛缩症。根据另一实施方案，结缔组织疾病是阴茎硬结症。

根据一个实施方案，蛋白水解提取物包含茎菠萝蛋白酶和凤梨蛋白酶。根据另一个实施方案，蛋白水解提取物还包含半胱氨酸蛋白酶前体。根据另外的实施方案，蛋白水解提取物还包含半胱氨酸蛋白酶片段。根据一个示例性实施方案，蛋白水解提取物包含茎菠萝蛋白酶、凤梨蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶前体。

根据另外的实施方案，药物组合物还包含选自由麻醉剂、抗菌剂和抗炎剂组成的组的剂。

根据还另外的实施方案，麻醉剂选自由以下组成的组：阿美索卡因(丁卡因)、利诺卡因(利多卡因)、赛罗卡因、布比卡因、丙胺卡因、罗哌卡因、苯佐卡因、甲哌卡因、可卡因和其组合。每种可能性是本发明的一个单独的实施方案。

根据另外的实施方案，抗菌剂选自由以下组成的组：盐酸金刚烷胺、硫酸金刚烷胺、阿米卡星、硫酸阿米卡星、氨基糖苷类、阿莫西林、氨苄西林、安沙霉素类(amsamycins)、杆菌肽、β-内酰胺类、杀念菌素、卷曲霉素、羧苄青霉素、头孢氨苄、头孢噻啶、头孢噻吩、头孢唑啉、头孢匹林、头孢拉定、头孢来星、chilomphenicols、氯己定、葡糖酸氯己定、盐酸氯己定、氯喔星、氯喹那多、金霉素、盐酸金霉素、环丙沙星、环杆菌素、克林霉素、盐酸克林霉素、克霉唑、氯唑西林、地美环素、双氯西林、二碘羟基喹啉、强力霉素、乙胺丁醇、盐酸乙胺丁醇、红霉素、依托红霉素、硬脂酸红霉素(erhmycin stearate)、法呢醇、氟氯西林、庆大霉素、硫酸庆大霉素、短杆菌肽、灰黄霉素、卤普罗近、卤代醌醇(haloquinol)、六氯酚、iminocylcline、碘氯羟喹、卡那霉素、硫酸卡那霉素、林可霉素、lineomycin、盐酸lineomycin、大环内酯类、甲氯环素、美他环素、盐酸美他环素、methenine、马尿酸乌洛托品、扁桃酸乌洛托品、甲氧西林、甲硝唑、咪康唑、盐酸咪康唑、米诺环素、盐酸米诺环素、莫匹罗星、萘夫西林、新霉素、硫酸新霉素、奈替米星、硫酸奈替米星、呋喃西林、诺氟沙星、制霉菌素、羟甲辛吡酮、竹桃霉素、orcephalosporins、苯唑西林、oxyteacline、盐酸土霉素、对氯间二甲苯酚、巴龙霉素、硫酸巴龙霉素、青霉素类、青霉素G、青霉素V、喷他脒、盐酸喷他脒、苯氧乙基青霉素、多粘菌素类、喹诺酮类、硫酸链霉素、四环素、妥布霉素、托萘酯、三氯生、利福平、利福霉素、罗利环素、银盐、大观霉素、螺旋霉素、链霉素、磺胺、四环素类、四环素、妥布霉素、硫酸妥布霉素、三氯卡班(triclocarbon)、三氯生、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑、泰乐菌素、万古霉素和yrothricin。每种可能性是本发明的一个单独的实施方案。

根据另外的实施方案，抗炎剂选自由非甾体抗炎剂和甾体抗炎剂组成的组。

根据还另外的实施方案，药物组合物还包含选自由稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、缓冲剂、螯合剂和张度剂组成的组的组分。

根据还另外的实施方案，药物组合物以选自由固体制剂、半固体制剂、液体制剂和泡沫制剂组成的组的形式配制。根据某个实施方案，固体制剂是粉末。根据另一个实施方案，液体制剂是pH为约6到约7的可注射溶液。

根据一个示例性实施方案，药物组合物通过注射入患病的纤维组织而施用。药物组合物可作为单剂量或者以等分部分在患病的纤维组织中的两个或更多个位置处被注射。

根据另一个方面，本发明提供用于治疗结缔组织疾病的包含蛋白水解提取物的药物组合物，其中蛋白水解提取物包含选自由茎菠萝蛋白酶和凤梨蛋白酶组成的组的至少一种半胱氨酸蛋白酶，并且其中结缔组织疾病与过度胶原沉积相关联。

本发明的这些和其它实施方案将关于以下的图、描述、实施例和权利要求来更好理解。

附图简述

图1是显示两批蛋白水解提取物的溶胶原活性的图。增加浓度的蛋白水解提取物(被指定为MD2H-05-27和MD5H-10-46)在荧光标记的IV型胶原的存在下温育20分钟。在温育结束时测量荧光。结果以相对荧光单位(RFU)呈现。

图2是显示蛋白水解提取物对I型和IV型胶原的溶胶原活性的图。在荧光标记的I型胶原或IV型胶原的存在下，蛋白水解提取物被温育不同的时间段。在温育结束时测量荧光。结果以相对荧光单位(RFU)呈现。

图3是显示与胶原酶的溶胶原活性相比的蛋白水解提取物的溶胶原活性的图。溶组织梭菌(Clostridium histolyticum)胶原酶与荧光标记的IV型胶原或荧光标记的明胶一起温育并在20分钟的温育结束时测量荧光。蛋白水解提取物与荧光标记的IV型胶原一起温育20分钟并在此后测量荧光。

图4是显示蛋白水解提取物的明胶酶活性的图。增加浓度的两批蛋白水解提取物(被指定为J-01-19和J-14-45)在荧光标记的明胶的存在下温育20分钟并在此后测量荧光。

图5A-C是显示从患者手术切除掌腱膜挛缩症的索带的照片。图5A是显示掌腱膜挛缩症患者中的无名指的异常挛缩的照片。图5B是显示病理性索带的手术去除的照片。图5C是显示从掌床去除后的索带的照片。

图6是显示将掌腱膜挛缩症的索带切开为二的照片。

图7是显示索带的锚定的照片。

图8是显示溶液注射入掌腱膜挛缩症的索带的步骤的照片。

图9是显示抗张拉伸矫直机的照片。

图10A-B是显示拉伸力应用前和拉伸力应用后的索带的照片。图10A显示拉伸力应用前的索带。图10B显示拉伸力应用后且索带断裂前的索带。

图11显示随抗拉强度应用而变化的盐水对掌腱膜挛缩症的索带伸长的影响。掌腱膜挛缩症的索带注射有盐水并在盐水中温育24小时。此后，索带经历拉伸应力，并评估索带伸长和断裂。

图12显示随抗拉强度应用而变化的蛋白水解提取物对掌腱膜挛缩症的索带伸长的影响。掌腱膜挛缩症的索带注射有蛋白水解提取物并在蛋白水解提取物存在下温育24小时。此后，索带经历拉伸应力，并评估索带伸长和断裂。

图13显示随抗拉强度应用而变化的蛋白水解提取物单次注射对掌腱膜挛缩症的索带伸长的影响。掌腱膜挛缩症的索带注射有蛋白水解提取物并在盐水中温育24小时。此后，索带经历拉伸应力，并评估索带伸长和断裂。

发明详述

本发明提供治疗涉及过度胶原沉积的结缔组织疾病的方法，其包括对需要这种治疗的受试者施用从菠萝蛋白酶获得的蛋白水解提取物。

本发明的申请人的WO 2006/054309首次公开了从菠萝蛋白酶获得的清除组合物(也称为)，WO 2006/054309的内容通过引用并入，如同完全在本文陈述一样。WO2006/054309中公开的清除组合物包含半胱氨酸蛋白酶例如茎菠萝蛋白酶和凤梨蛋白酶。WO 2006/054309还公开该清除组合物比菠萝蛋白酶能更有效地清除烧伤的皮肤，即失活组织。然而，发现该清除组合物在清除健康或活的皮肤或真皮中是没有活性的(参见，例如，Singer等人，2010，J.Burn Care Res.31:304-309)。因此表明该清除组合物对失活组织是有活性的，对活的组织是没有活性的。

出乎意料地，本发明公开了从菠萝蛋白酶获得的蛋白水解提取物在体外展示溶胶原活性，并能够溶解从罹患掌腱膜挛缩症的受试者获得的掌纤维化索带。因为本发明的蛋白水解提取物不会使健康结缔组织降解，因此本发明提供了用于溶解富含胶原的纤维组织，特别是在罹患掌腱膜挛缩症或阴茎硬结症的受试者中的富含胶原的纤维组织的安全和有效的酶促药物。

术语“从菠萝蛋白酶获得的蛋白水解提取物”和“蛋白水解提取物”在整个说明书和权利要求中可交换使用，且指的是部分从菠萝蛋白酶纯化的酶促制剂。

术语“菠萝蛋白酶”指的是众多现在市售的菠萝蛋白酶粉末制剂中的任何一种。菠萝蛋白酶的生产商的实例包括但不限于Sigma and Challenge Bioproducts Co.Ltd.，Taiwan。菠萝蛋白酶从菠萝植物的茎中制备。获得菠萝蛋白酶的典型程序如下：来自菠萝植物的茎的汁液先用磷酸调整至pH为约3或4，并加入氢化钠或硫氢化钠以防止巯基氧化。惰性材料在约30％的丙酮中沉淀，且过滤后，用70％的丙酮使澄清的流体沉淀。此沉淀物通过离心收集，且再溶解在已用磷酸酸化的含有氢化钠或硫氢化钠的水中并再沉淀，或在真空烘箱中直接干燥。如果使材料再沉淀，则应用70％丙酮。来自任一过程的干燥材料适合作为起始原料，以得到本发明的清除组合物。

本发明的蛋白水解提取物可以包含存在于菠萝蛋白酶中的半胱氨酸蛋白酶中的一种或多种。根据一个示例性实施方案，蛋白水解提取物(也称为或)包含半胱氨酸蛋白酶茎菠萝蛋白酶(EC3.4.22.32)和凤梨蛋白酶(EC3.4.22.31)。蛋白水解提取物还可包含菠萝蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶前体中的一种或多种，例如，凤梨蛋白酶(EC3.4.22.31)前体、果实菠萝蛋白酶(EC 3.4.22.33)前体、和茎菠萝蛋白酶(EC3.4.22.31)前体。蛋白水解提取物还可包含半胱氨酸蛋白酶片段(参见，例如，WO2006/054309)、木菠萝凝集素样外源凝集素(参见，例如，Raval等人，Glycobiology，2004，14(12)：1247-1263)和/或菠萝蛋白酶抑制剂。

蛋白水解提取物可以通过包含以下步骤的方法制备：

(a)用可选地包含抗氧化剂的酸性溶液悬浮菠萝蛋白酶，酸性溶液的pH范围为约2.4至约4；

(b)将(a)的悬浮液调节至pH范围为从约2.4至约4；

(c)将助滤剂加入至(b)的悬浮液；

(d)过滤(c)的悬浮液以除去不溶性组分；

(e)将硫酸铵盐添加至(d)的过滤溶液，以得到范围从约40％至约50％的硫酸铵的饱和度；

(f)将(e)的悬浮液调节至pH为约2.5至约4；

(g)在3℃-10℃下温育(f)的悬浮液；

(h)离心(g)的悬浮液以产生硫酸铵沉淀物；

(i)将硫酸铵沉淀物溶解在具有在约2.4至约4的范围内的pH的可选地包含抗氧化剂的酸性溶液中；

(j)通过10kDa超滤器过滤(i)的溶液；以及

(k)冻干(j)的保留溶液。

根据一些实施方案，悬浮菠萝蛋白酶可在具有约2.4到4之间的pH的任何酸性溶液中进行。可根据本发明使用的酸性溶液或缓冲液的实例包括但不限于，水中的乙酸、乙酸盐缓冲液和含有1％巯基乙酸、pH2.4-4的乙酸盐缓冲液。根据某些示例性实施方案，酸性溶液选自美国专利第5,830,739号和第4,197,291号中公开的缓冲液和溶液，所述美国专利的内容通过引用并入，如同在本文完全阐明一样。

酸性溶液可以可选地包含抗氧化剂。抗氧化剂的实例包括但不限于，抗坏血酸、双对苯二酚、丁基化羟基甲苯和二硫苏糖醇。抗氧化剂可以以约0.5％到约2％，优选1％的浓度加入。

酸性溶液还可以包含湿润剂。湿润剂的实例包括但不限于，正辛醇。

可选地包含抗氧化剂的酸性溶液的pH可在从约2.4至约4的范围内。根据某一优选实施方案，可选地包含抗氧化剂的酸性溶液的pH可在从约2.4至约2.6的范围内。

根据另外的实施方案，将助滤剂加入到(a)的悬浮液中。根据一个实施方案，助滤剂包括二氧化硅。优选地，该助滤剂是天然硅藻土，该天然硅藻土经煅烧以便实现更快的流动速率。

沉淀所需的蛋白是通过将硫酸铵盐添加至(d)的过滤溶液来进行的。可以加入硫酸铵盐以得到在约40％至约50％之间的范围内的硫酸铵的饱和度。优选地，可以加入硫酸铵盐以得到40％的硫酸铵饱和度。

然后，将步骤(f)的悬浮液在3℃至10℃之间的温度下温育。优选地，将步骤(f)的悬浮液在3℃至10℃之间的温度下温育至少10小时。更优选地，将步骤(f)的悬浮液在4℃下温育12-24小时。

在温育结束时，对步骤(g)的悬浮液进行离心以沉淀所需蛋白，即蛋白水解酶。然后将沉淀物溶解在可选地包含抗氧化剂的酸性溶液中。根据一个示例性实施方案，将悬浮液在4℃下温育至少10小时。

使步骤(i)的溶液经历过滤步骤以留下具有超过约10kDa的分子量的蛋白水解酶。根据一个优选的实施方案，将步骤(i)的溶液通过具有约10kDa的截留分子量的膜过滤器过滤。

蛋白水解提取物可在过滤后被冻干，可以用蒸馏水洗涤且然后冻干，或可以被过滤且然后冻干。根据一个目前优选的实施方案，蛋白水解提取物通过具有至少约0.5μm的孔径的滤膜来过滤，以获得无菌溶液，然后将其冻干并储存。优选地，蛋白水解提取物作为冻干粉末被储存，因为其稳定性在没有水分时延长。在使用之前，将蛋白水解提取物溶解在溶液中，以便得到pH为约6至约7的溶液。

根据一个示例性实施方案，蛋白水解提取物可以通过包括以下步骤的方法制备：

(a)用pH为从约2.4至约2.6的包含1％抗坏血酸和正辛醇的0.3M乙酸悬浮菠萝蛋白酶；

(b)将(a)的悬浮液调节至pH范围为从约2.5至约3.5；

(c)将包含二氧化硅的助滤剂加入至(b)的悬浮液；

(d)通过压滤机过滤(c)的悬浮液以除去不溶性组分；

(e)将硫酸铵盐(285克/升)添加到(d)的过滤溶液以得到40％的硫酸铵饱和度；

(f)将(e)的悬浮液调节至pH为从约2.5至约3.5；

(g)在4℃下温育(f)的悬浮液约12-24小时；

(h)离心(g)的悬浮液以产生硫酸铵沉淀物；

(i)将硫酸铵沉淀物溶解在具有从约2.4至约2.6的pH的包含1％抗坏血酸的0.3M乙酸中；

(j)通过10kDa超滤器过滤(i)的溶液；

(k)过滤(j)的保留溶液以得到无菌溶液；以及

(l)冻干(k)的过滤溶液。

术语“掌腱膜挛缩症”和“DD”在本文可互换使用，且指的是手指不能充分伸展并且通常朝向手心弯曲的疾病。具体来说，掌腱膜挛缩症始于在手掌筋膜处，通常在尺侧处纤维瘤结节的形成。结节进展并形成从手掌到手指的纤维束带或索带。最终，这导致永久性的手指屈曲挛缩。无名指最常受到影响，其次是小指。

术语“掌腱膜挛缩症的索带”和“患病索带”在本文中可互换使用，且指的是纵向地在手掌皮肤下延伸的筋膜纤维带。这些带导致覆盖的皮肤和与带连接的远端手指的挛缩，并最终进展为受影响手指的永久性的屈曲挛缩。通常，掌腱膜挛缩症的索带包含大量成纤维细胞、沉积增加的细胞外基质(ECM)蛋白特别是胶原、以及成肌纤维细胞。

应理解，本发明的蛋白水解提取物对于治疗具有与过度胶原沉积相关联的其它疾病的个体是有用的。涉及胶原沉积的其他纤维组织畸形和异常包括阴茎硬结症、Ledderhose纤维化、以及关节囊、肌腱和韧带鞘的纤维化。因而，蛋白水解提取物对于治疗肩周炎(粘连性囊炎)还可以是有用的。涉及过度胶原沉积或纤维组织畸形的这些结缔组织疾病与创伤或烧伤无关。

如本文所用，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指改善或消除与结缔组织疾病相关联的症状中的至少一种或多种。例如，与掌腱膜挛缩症相关联的症状包括例如关节挛缩、关节的运动范围减小。阴茎硬结症的症状包括，例如，疼痛、异常弯曲和勃起功能障碍。

术语蛋白水解提取物的“治疗有效量”是足以向施用该组合物的受试者提供有益效果的蛋白水解提取物的量。

术语“约”当指的是溶液或悬浮液的pH时，意思是指明高于或低于所指明的pH的0.5个pH单位都在本发明的范围之内。

本发明的药物组合物包含蛋白水解提取物和药学上可接受的载体。

术语“药学上可接受的”是指经联邦或州政府的管理机构批准，或在美国药典或其它公认的药典中列出用于动物并且更特别地用于人类的。

术语“载体”是指与蛋白水解提取物一起施用的稀释剂、赋形剂或媒介物。此类药物载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油以及类似物、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂。盐水溶液、NaCl/CaCl2水溶液、葡萄糖水溶液、甘油溶液和白蛋白溶液可以用作液体载体，特别是用于可注射溶液。当药物组合物静脉内施用时，水还可以用作载体。

药物组合物还可以包含稳定剂，例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、黄蓍胶、硅酸钙、聚乙烯吡咯烷酮和纤维素。该组合物可以另外含有润滑剂例如硬脂酸镁和矿物油；湿润剂；乳化剂和悬浮剂；防腐剂例如硫柳汞、苄醇、对羟基苯甲酸酯、羟基苯甲酸甲酯或羟基苯甲酸丙酯；抗氧化剂如抗坏血酸、双对苯二酚、丁基化羟基甲苯和二硫苏糖醇；以及缓冲剂如磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、苯甲酸钠、苯甲酸钾、柠檬酸钠、醋酸钠、和酒石酸钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；和用于调节张力的剂例如氯化钠或葡萄糖。

药物组合物还可包含麻醉剂。

麻醉剂包括但不限于阿美索卡因(丁卡因)、利诺卡因(利多卡因)、赛罗卡因、布比卡因、丙胺卡因、罗哌卡因、苯佐卡因、甲哌卡因、可卡因和它们的组合。

药物组合物还可包含抗菌剂。

抗菌剂包括但不限于盐酸金刚烷胺、硫酸金刚烷胺、阿米卡星、硫酸阿米卡星、氨基糖苷类、阿莫西林、氨苄西林、安沙霉素类、杆菌肽、β-内酰胺类、杀念菌素、卷曲霉素、羧苄青霉素、头孢氨苄、头孢噻啶、头孢噻吩、头孢唑啉、头孢匹林、头孢拉定、头孢来星、chilomphenicols、氯己定、葡糖酸氯己定、盐酸氯己定、氯喔星、氯喹那多、金霉素、盐酸金霉素、环丙沙星、环杆菌素、克林霉素、盐酸克林霉素、克霉唑、氯唑西林、地美环素、双氯西林、二碘羟基喹啉、强力霉素、乙胺丁醇、盐酸乙胺丁醇、红霉素、依托红霉素、硬脂酸红霉素、法呢醇、氟氯西林、庆大霉素、硫酸庆大霉素、短杆菌肽、灰黄霉素、卤普罗近、卤代醌醇、六氯酚、iminocylcline、碘氯羟喹、卡那霉素、硫酸卡那霉素、林可霉素、lineomycin、盐酸lineomycin、大环内酯类、甲氯环素、美他环素、盐酸美他环素、methenine、马尿酸乌洛托品、扁桃酸乌洛托品、甲氧西林、甲硝唑、咪康唑、盐酸咪康唑、米诺环素、盐酸米诺环素、莫匹罗星、萘夫西林、新霉素、硫酸新霉素、奈替米星、硫酸奈替米星、呋喃西林、诺氟沙星、制霉菌素、羟甲辛吡酮、竹桃霉素、orcephalosporins、苯唑西林、oxyteacline、盐酸土霉素、对氯间二甲苯酚、巴龙霉素、硫酸巴龙霉素、青霉素类、青霉素G、青霉素V、喷他脒、盐酸喷他脒、苯氧乙基青霉素、多粘菌素类、喹诺酮类、硫酸链霉素、四环素、妥布霉素、托萘酯、三氯生、利福平、利福霉素、罗利环素、银盐、大观霉素、螺旋霉素、链霉素、磺酰胺、四环素类、四环素、妥布霉素、硫酸妥布霉素、三氯卡班、三氯生、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑、泰乐菌素、万古霉素和yrothricin。

根据又一个实施方案，药物组合物还可包含抗炎剂。

抗炎剂可以是非甾体、甾体、或它们的组合。非甾体抗炎剂的非限制性实例包括昔康类，如吡罗昔康、伊索昔康、替诺昔康、舒多昔康；水杨酸酯类，如阿司匹林、双水杨酯(disalcid)、贝诺酯、曲利塞特(trilisate)、萨法比恩(safapryn)、索尔比林(solprin)、二氟尼柳、和芬度柳；乙酸衍生物，如双氯芬酸、芬氯酸、吲哚美辛、舒林酸、托美丁、伊索克酸、呋罗芬酸、硫平酸、齐多美辛、阿西美辛、芬替酸、佐美酸、克林达酸(clindanac)、奥昔平酸、联苯乙酸、和酮咯酸；芬那酸类，例如甲灭酸、甲氯芬、氟灭、尼氟灭、和托芬那酸；丙酸衍生物，如布洛芬、萘普生、苯噁洛芬、氟比洛芬、酮洛芬、非诺洛芬、芬布芬、吲哚洛芬(indopropfen)、吡洛芬、卡洛芬、奥沙普秦、普拉洛芬、咪洛芬、硫噁洛芬、舒洛芬、阿明洛芬、和噻洛芬酸；吡唑类，如保泰松、羟基保泰松、非普拉宗、阿扎丙、和曲保松。还可使用这些非甾体类抗炎剂的提取物。

甾体抗炎剂的非限制性实例包括糖皮质激素类如氢化可的松、羟基去炎松、α-甲基地塞米松、地塞米松-磷酸盐、二丙酸倍氯米松、戊酸氯倍他索、地奈德、去氧米松、醋酸去氧皮质酮、地塞米松、二氯松、双醋酸二氟拉松、戊酸二氟可龙、氟氯缩松(fluadrenolone)、氟氯缩松(fluclorolone acetonide)、氟氢可的松、新戊酸氟米松、氟西奈德(fluosinolone acetonide)、氟轻松醋酸酯、二氟美松丁基酯(flucortine butylester)、氟可龙、乙酸氟泼尼定(氟甲叉龙)、氟氢缩松、哈西奈德、醋酸氢化可的松、丁酸氢化可的松、甲基强的松龙、曲安奈德、可的松、可托多松、肤轻松(flucetonide)、氟氢可的松(fludrocorisone)、二乙酸二氟拉松(difluorosone diacetate)、氟拉诺龙(fluradrenolone)、氟氢可的松、双乙酸二氟乐松(diflurosone diacetate)、氟若卓龙安奈德、甲羟松、安西那非(amcinafel)、安西非特、倍他米松和其酯的平衡(balance of itsesters)、氯泼尼松、醋酸氯泼尼松、氯可托龙(clocortelone)、克辛诺龙(clescinolone)、二氯松、二氟泼尼酯(diflurprednate)、氟氯奈德、氟尼缩松、氟米龙、氟培龙、氟泼尼龙、戊酸氢化可的松、环戊丙酸氢化可的松、氢可他酯、甲泼尼松、帕拉米松、泼尼松龙、泼尼松、二丙酸倍氯米松、曲安西龙、以及其提取物。

药物组合物可以配制成干的或冻干的制剂、半固体制剂、液体制剂或泡沫制剂。因此，药物组合物可以以粉末、溶液、悬浮液、乳液、凝胶、喷雾或贴剂的形式配制。

该药物组合物可局部、皮下、皮内、或肌内施用到受影响的部位。

根据某个实施方案，药物组合物通过注射施用。根据一个示例性实施方案，药物组合物直接注射到患病纤维结节或索带或注射到纤维斑块中。可选地，药物组合物被植入到手术切口。无菌可注射制剂可以配制成水溶液或含油悬浮液，如本领域已知的。

对于在皮肤上局部使用，药物组合物可以以软膏、乳膏、洗剂、糊剂、喷雾或气溶胶的形式配制。合适的媒介物的实例包括但不限于，凡士林、阿夸弗尔(aquaphor)、新碱基(neobase)、丙二醇、甘油以及类似物。还可以使用这些媒介物中的两种或更多种的组合。

药物组合物可以配制成控释或缓释制剂，允许活性组分在预定的时间段中延长释放。在某个实施方案中，药物组合物与生物可降解的、生物相容的聚合物植入物联合施用，这使蛋白水解提取物在选定的位点在控制的时间段内释放。聚合物材料的实例包括聚酸酐、聚原酸酯、聚乙醇酸、聚乳酸、聚乙烯乙酸乙烯酯、其共聚物及共混物(参见，Medicalapplications of controlled release，Langer和Wise(编)，1974，CRC Pres.，BocaRaton，Fla.)。可选地，药物组合物作为凝胶局部施用。可以使用的聚合物材料的实例是多糖，特别是纤维素衍生物，如，例如，羟丙基纤维素、羧甲基纤维素和羟乙基纤维素、壳多糖、壳聚糖和藻酸盐。凝胶制剂将允许活性组分在预定的时间段内的延长释放。

药物组合物可以配制成泡沫。气体推进剂被使用以产生和施用作为泡沫的可发泡组合物。合适的气体推进剂的实例包括挥发性烃类，如丁烷、丙烷、异丁烷或其混合物以及碳氟化合物气体。该组合物可以是水性乳剂、水包油乳剂或油包水乳剂，其还包含稳定剂。稳定剂增加了组合物的粘度，可以有助于组合物的稳定性，和/或减慢泡沫破裂速率。稳定剂的实例包括但不限于，天然存在的聚合物材料(例如，藻酸盐、白蛋白、角叉菜胶、黄原胶、淀粉)，半合成聚合物材料，如纤维素醚(如羟乙基纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙甲基纤维素)，和合成聚合物材料(例如，聚乙烯醇、羧乙烯基聚合物和聚乙烯吡咯烷酮)。

药物的配制和施用的技术可见于"Remington's Pharmaceutical Sciences"MackPublishing Co.,Easton,PA，最新版本，其通过引用并入本文。

药物组合物可以在受影响的纤维组织中的两个或更多个位置作为单剂量，或以等分部分被施用。待施用的蛋白水解提取物的量是其使斑块软化和/或破裂的有效量。蛋白水解提取物的有效量的范围可以从约0.2毫克/天到约40毫克/天。在某个实施方案中，药物组合物以两个或更多个等分部分施用，每个等分部分含有约0.5-1.5毫克，可选地作为0.2-0.5毫升的溶液或悬浮液施用。

在某些实施方案中，向其施用包含蛋白水解提取物的药物组合物的器官被固定几个小时，例如，2至12小时。

在整个说明书中公开的每种可能性是本发明的一个单独的实施方案。

呈现下面的实施例以提供对本发明的更完整的理解。阐述以说明本发明的原理的具体的技术、条件、材料、比例和报告的数据是示例性的，且不应该被解释为限制本发明的范围。

实施例1

蛋白水解提取物的溶胶原活性

蛋白水解提取物从菠萝蛋白酶得到，如在WO2006/054309中描述的。

首先确定了两批Debrase降解IV型胶原的能力。该测定是基于明胶酶/胶原酶测定试剂盒(Invitrogen)，它含有用荧光素标记的DQ IV型胶原TM作为底物。已知该底物有效被胶原酶消化以产生高度荧光的肽。荧光的增加与蛋白水解活性成正比。

向每个孔中加入Debrase反应缓冲液(0.15M Tris-HCl和10mM EDTA，pH7.6)，以获得100μL的最终体积。然后将10μL0.5μg/μL的DQ IV型胶原TM溶液加入孔中。此后，将0.225-1ng/μL浓度的不同体积(10-80μL)的新鲜制备的Debrase加入到孔中的Debrase缓冲液中以实现1.5-20ng/孔的浓度。Debrase缓冲液用作阴性对照。反应板在室温下温育20分钟。为使反应停止，加入20μL停止反应溶液(Debrase缓冲液中0.324mM碘乙酸)。荧光强度通过配备有标准荧光滤器的荧光微板读数器(Analyst AD，LJL)测量。来自不存在酶下温育的孔的背景荧光被减去。

图1显示两批Debrase的溶胶原活性。如该图所示，两批Debrase发挥相似的溶胶原活性，表明获得本发明的蛋白水解提取物的实验程序得到一致的酶制剂。

其次，确定蛋白水解提取物降解I型和IV型胶原的能力。为达到这一目的，用荧光素标记的DQ IV型胶原^TM和DQ I型胶原^TM被用作底物。如上文所述进行测定，并持续如在图2所表示的时间段。通过加入20μL停止反应溶液(Debrase缓冲液中的0.324mM碘乙酸)来使反应停止并如上文所述测量荧光强度。

从溶组织梭菌纯化的胶原酶用作具有预定活性的阳性对照(一个单位被定义为在5个小时内在37℃，pH7.5从胶原释放1微摩尔的E-亮氨酸等效物所需的酶的量)。

对于使用溶组织梭菌胶原酶的测定，加入胶原酶反应缓冲液(0.05MTris-HCl，0.15M NaCl，5mM CaCl2，0.2mM叠氮化钠，pH7.6)以得到100μL/每孔的最终体积。然后，在梭菌胶原酶缓冲液中的0.4-1mU/μL的不同体积(10-80μL)的梭菌胶原酶，被加入至参考孔以达到从5到80mU/孔的范围的浓度。为了停止梭菌胶原酶反应–加入20μL在胶原酶缓冲液中的2mg/ml1,10-邻二氮杂菲。

来自梭菌胶原酶的数据被用作每mU单位的参考值。来自蛋白水解提取物(也称为Debrase)的数据样本除以参考值以确定mU/ng Debrase。

图2显示蛋白水解提取物分别以1.58和1.27mU/ng的比活性降解I型和IV型胶原。

接着，比较针对胶原的蛋白水解提取物的活性与溶组织梭菌胶原酶活性。胶原酶对明胶的蛋白水解活性也使用明胶酶/胶原酶测定试剂盒(Invitrogen)和DQ明胶^TM(Invitrogen)作为底物来测量。

图3显示蛋白水解提取物发挥对IV型胶原的溶胶原活性，该活性比通过市售胶原酶对胶原而获得的活性更高。

图4显示蛋白水解提取物发挥明胶酶活性。如该图所示，蛋白水解提取物的明胶酶活性在2-8ng/孔的浓度范围内是线性的。

实施例2

蛋白水解提取物促进掌腱膜挛缩症的索带的断裂

掌腱膜挛缩症的索带从经历筋膜切除术(图5A、图5B和图5C)的患者获得。知情同意书由所有受试者在手术前签署，并且研究获得了赫尔辛基委员会的批准。实验研究了蛋白水解提取物进行索带的筋膜切除术的能力。

组织制备

从患者处获得的索带被分为两或三片，这取决于它们的长度(图6)。索带通过Krackov技术经由聚丙烯1缝线(Ethicon，Somerville，NJ)连接到机械测试装置(图7)。两个索带之一注射有蛋白水解提取物(根据索带大小，0.3-0.5ml的蛋白水解提取物)，而第二对照索带注射有盐水(图8)。蛋白水解提取物组的索带浸渍在蛋白水解提取物溶液中，而对照组的索带浸渍在盐水中。两组均在37℃温育24小时。

机械测试

温育24小时后，所有的索带都连接到机械拉伸应力测试装置(Zwick1445测试系统，Zwick Co.，德国)。每根索带经历增加的载荷，直到索带或连接缝线断裂。该装置测量断裂前所施加的拉力。

组织学分析

获得每个样本的样品用于组织学分析和用于确定疾病的阶段。

统计分析

采用Fisher精确检验测试与研究组比较的对照组的效率。

结果

所有用蛋白水解提取物处理的索带(n＝10)均在拉伸之后断裂(图10A和图10B)。一些用蛋白水解提取物处理的索带几乎完全断裂，几乎在机械测试前溶解。所有的对照索带(n＝9)在拉力应用后没有断裂。如图11所示，所有的对照索带表现出了相似的应力伸长模式，表现为随着索带的越来越大的应力具有有限的伸长，直到施加非常高的载荷时断裂。与此相反，所有的用蛋白水解提取物处理的索带表现出索带的抗拉强度损失，在非常低的应力下导致索带的断裂(图12)。结果表明，低剂量，即，0.8mg/ml的蛋白水解提取物，能够使掌腱膜挛缩症的索带断裂，而且这种作用在较高剂量的蛋白水解提取物，即，高至150mg/ml下被进一步证明。

为了评估蛋白水解提取物的单次注射对掌腱膜挛缩症的索带的拉伸的影响，索带在沿着索带的三个不同的位点处注射有蛋白水解提取物，且然后在没有蛋白水解提取物下在37℃在盐水中温育24小时。

图13示出了在掌腱膜挛缩症的索带的三个位点给予的蛋白水解提取物的注射能够将索带的抗拉强度降低4-5的系数(参见图13，测试1a和2显示索带分别在18N和15N的应力下断裂)。一个索带(图13，测试1b)在0.4N的应力下经历断裂。这些结果表明蛋白水解提取物溶解掌腱膜挛缩症的索带的效率并明显地暗示了本发明的蛋白水解提取物是用于掌腱膜挛缩症以及用于涉及过度胶原沉积的其他结缔组织疾病的高度有效的酶促药物。

本领域技术人员将理解，本发明不受本文以上已具体显示和描述的内容限制。更确切地，本发明的范围由下面的权利要求界定。

Claims (17)

1.一种药物组合物，其包括用于治疗结缔组织疾病的从菠萝蛋白酶获得的蛋白水解提取物，其中所述蛋白水解提取物包含茎菠萝蛋白酶、凤梨蛋白酶、至少一种半胱氨酸蛋白酶前体以及木菠萝凝集素样外源凝集素，并且其中所述结缔组织疾病与过度胶原沉积相关联。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述结缔组织疾病选自由掌腱膜挛缩症、阴茎硬结症、肩周炎和Ledderhose疾病组成的组。

3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述结缔组织疾病是掌腱膜挛缩症。

4.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述结缔组织疾病是阴茎硬结症。

5.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包含选自由麻醉剂、抗菌剂和抗炎剂组成的组的剂。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，其中所述麻醉剂选自由丁卡因、利多卡因、赛罗卡因、布比卡因、丙胺卡因、罗哌卡因、苯佐卡因、甲哌卡因、可卡因和其组合组成的组。

7.根据权利要求5所述的药物组合物，其中所述抗菌剂选自由以下组成的组：氨基糖苷类、安沙霉素类、β-内酰胺类、头孢霉菌素类、氯霉素类、大环内酯类、青霉素类、多粘菌素类、喹诺酮类和四环素类。

8.根据权利要求5所述的药物组合物，其中所述抗菌剂选自由以下组成的组：盐酸金刚烷胺、硫酸金刚烷胺、阿米卡星、硫酸阿米卡星、阿莫西林、氨苄西林、杆菌肽、杀念菌素、卷曲霉素、羧苄青霉素、头孢氨苄、头孢噻啶、头孢噻吩、头孢唑啉、头孢匹林、头孢拉定、头孢来星、氯己定、葡糖酸氯己定、盐酸氯己定、氯喔星、氯喹那多、金霉素、盐酸金霉素、环丙沙星、环杆菌素、克林霉素、盐酸克林霉素、克霉唑、氯唑西林、地美环素、双氯西林、二碘羟基喹啉、强力霉素、乙胺丁醇、盐酸乙胺丁醇、红霉素、依托红霉素、硬脂酸红霉素、法呢醇、氟氯西林、庆大霉素、硫酸庆大霉素、短杆菌肽、灰黄霉素、卤普罗近、卤代醌醇、六氯酚、米诺环素、碘氯羟喹、卡那霉素、硫酸卡那霉素、林可霉素、盐酸林可霉素、甲氯环素、美他环素、盐酸美他环素、乌洛托品、马尿酸乌洛托品、扁桃酸乌洛托品、甲氧西林、甲硝唑、咪康唑、盐酸咪康唑、米诺环素、盐酸米诺环素、莫匹罗星、萘夫西林、新霉素、硫酸新霉素、奈替米星、硫酸奈替米星、呋喃西林、诺氟沙星、制霉菌素、羟甲辛吡酮、竹桃霉素、苯唑西林、土霉素、盐酸土霉素、对氯间二甲苯酚、巴龙霉素、硫酸巴龙霉素、青霉素G、青霉素V、喷他脒、盐酸喷他脒、苯氧乙基青霉素、硫酸链霉素、四环素、妥布霉素、托萘酯、三氯生、利福平、利福霉素、罗利环素、银盐、大观霉素、螺旋霉素、链霉素、磺胺、妥布霉素、硫酸妥布霉素、三氯卡班、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑、泰乐菌素、万古霉素和短杆菌素。

9.根据权利要求5所述的药物组合物，其中所述抗炎剂选自由非甾体抗炎剂和甾体抗炎剂组成的组。

10.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包含选自由稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、缓冲剂、螯合剂和张度剂组成的组的组分。

11.根据权利要求1所述的药物组合物，所述药物组合物以选自由固体制剂、半固体制剂、液体制剂和泡沫制剂组成的组的形式配制。

12.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述固体制剂是粉末。

13.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述液体制剂是pH为6至7的可注射溶液。

14.根据权利要求1所述的药物组合物，所述药物组合物适合于通过注射入患病的纤维组织而施用。

15.根据权利要求14所述的药物组合物，所述药物组合物适合于作为单剂量注射。

16.根据权利要求14所述的药物组合物，所述药物组合物适合于以等分部分在患病的纤维组织中的两个或更多个位置处注射。

17.一种药物组合物在制备用于治疗结缔组织疾病的药剂中的用途，所述药物组合物包括从菠萝蛋白酶获得的蛋白水解提取物，其中所述蛋白水解提取物包含茎菠萝蛋白酶、凤梨蛋白酶、至少一种半胱氨酸蛋白酶前体以及木菠萝凝集素样外源凝集素，并且其中所述结缔组织疾病与过度胶原沉积相关联。