CN108884453A - 用于治疗伤口的清创组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及含水凝胶形式的清创组合物。特别地，本发明涉及一种清创组合物，所述清创组合物包含从菠萝蛋白酶获得的以干燥形式存在的蛋白水解酶混合物和含水凝胶载体，其中，在使用前，蛋白水解酶混合物与含水凝胶载体混合以形成用于伤口的清创和治疗的清创组合物。

Description

用于治疗伤口的清创组合物

发明领域

本发明涉及清创组合物。特别地，本发明涉及清创组合物，所述清创组合物包含从菠萝蛋白酶获得的呈干燥形式的蛋白水解酶混合物和含水凝胶载体，其中，在使用前，蛋白水解酶混合物与含水凝胶载体混合以形成可用于慢性伤口的清创和治疗的清创组合物。

发明背景

慢性伤口或难以愈合的伤口是使每年数百万人痛苦的常见疾病。大多数慢性伤口是由局部或全身(generalized)血管功能不全引起的，所述局部或全身(generalized)血管功能不全减少通向皮肤和皮下组织的血液。最常见类型的慢性伤口或难以愈合的伤口包括：压迫性溃疡(褥疮(decubiti)或“褥疮(bed sores)”)、糖尿病性溃疡、动脉性溃疡、静脉性溃疡和术后溃疡/创伤后溃疡。

慢性伤口导致对皮肤的严重损伤。这种损伤可能累及皮肤的整个厚度，并且通常可能包括更深的组织。受损伤的皮肤失去健康皮肤的解剖学组织，角质层至少被部分损坏，并且因此皮肤的内层不再免受外部环境的损害。此外，受损伤的皮肤通常含有必须被去除以便促进愈合的焦痂、患病细胞和/或异常细胞。焦痂留在原位使损伤延伸并加深进入邻近的未受损伤的组织。这种焦痂还用作细菌生长的介质，并且用作可能危及生命的感染、污染和脓毒症的源头。

焦痂、患病细胞和/或异常细胞的去除，也被称为“清创”，通过外科手术、通过机械手段(敷料更换，沐浴)、通过自溶程序(促进浸渍的敷料)或通过酶促手段来进行。手术是最常见的清创程序之一，其中小的坏死区域被从整片受损伤的皮肤中切除。该方法局限于小的非切向表面。手术还涉及去除大部分的健康组织，这部分健康组织如果被保存，可以作为自然的、自发愈合过程的源头。外科手术也更昂贵并且需要医疗资源。

酶促清创相比于机械清创和手术清创是有优势的，主要是由于它不那么痛苦、更具选择性并且不需要良好训练的医学人员的帮助。用于清创的蛋白水解酶的应用是本领域熟知的。这些酶包括从细菌中分离的那些酶和通常在植物来源中发现的那些酶，例如木瓜(木瓜蛋白酶)、无花果(无花果蛋白酶)和菠萝(菠萝蛋白酶)。可用于消化无活力的组织，尤其是焦痂组织，将其从哺乳动物宿主中的有活力的组织中解剖和分离出来的源自菠萝植物的水解酶尤其描述于美国专利第4,197,291号、第4,226,854号、第4,307,081号、第4,329,430号和第5,830,739号中。

从局部敷用蛋白水解酶获得的治疗活性程度尤其受酶的固有催化特性控制。与局部使用包含蛋白水解酶的组合物相关的主要问题是，由于病变区域典型的低pH、酶分子吸附到伤口床(wound bed)的表面和/或敷料的表面、以及伤口渗出物内的部分对酶促活性的抑制，酶的催化活性被快速减弱。因此，获得稳定的酶促制剂是复杂的。

几种软膏目前正被销售用于清除焦痂。这些软膏通常被每天敷用，持续几个月以实现期望的伤口清创。

属于Bolton等人的美国专利第4,668,228号公开了清创带，其在封闭的或半封闭的手术胶带的粘合剂(adhesive mass)表面上含有干燥的粉末形式的可用于清除焦痂和坏死组织的蛋白水解酶，例如枯草杆菌蛋白酶、菠萝蛋白酶。根据美国专利第4,668,228号，当清创带被敷用于烧伤表面时，不能穿透封闭带背衬的来自伤口的水激活清创酶。

属于Bolton等人的美国专利第4,784,653号公开了用于在治疗溃疡和烧伤类型的伤口中使用的吸附性粘合剂敷料，其包含三层夹层型构造，该三层夹层型构造具有封闭膜作为外层、吸附性纤维层作为中间层和湿粘的(wet-stick)粘合剂作为面向内部伤口的粘合剂层，该粘合剂层由具有亲水性特性和疏水性特性两者的丙烯酸聚合物制成。根据美国专利第4,784,653号，如果需要，可将清创酶添加到粘合剂(adhesive mass)中。

属于Stern等人的美国专利第5,514,370号公开了用于局部敷用的药物组合物，其包含在非水性赋形剂中的高浓度的胶原酶。美国专利第5,514,370号还公开了治疗伤口的方法，该方法包括对伤口敷用主要由非水性赋形剂和胶原酶组成的组合物。

属于Rolf的美国专利第5,804,213号公开了预包装的敷料，其包含用于形成可倾倒的天然的或合成的水基水胶体聚合物凝胶以敷涂伤口的干燥的颗粒状固体。根据美国专利第5,804,213号，一种干燥的成分是被包含在与水分隔开的密封容器的隔室中的水胶体。在与水混合后，混合物是流动的足以使其被倾倒或扩散到伤口中。在敷用于伤口后，水化的水胶体分散体开始凝固以形成固态的、自持式柔性敷料，该柔性敷料由水、水胶体和生物活性成分组成。

属于Hobson等人的美国专利第6,548,556号公开了酶促性无水亲水性清创剂，其组合使用蛋白水解酶和无水亲水性泊洛沙姆载体。

属于Caldwell等人的美国专利第8,062,661号公开了清创皮肤伤口的方法，该方法包括使皮肤伤口与水凝胶贴片清创组合物接触，和从所述皮肤伤口去除水凝胶贴片清创组合物以从皮肤伤口去除异物。

属于本发明的申请人的国际申请公开号WO 2006/054309公开了可用于清除焦痂组织和用于伤口愈合的从菠萝蛋白酶获得的清创组合物。

属于本发明的申请人的国际申请公开号WO 2013/011514公开了用于治疗与过量的胶原沉积相关的包括Dupuytren病和Peyronie病在内的结缔组织疾病的从菠萝蛋白酶获得的蛋白水解提取物。

对于提供改善的伤口清创，并且特别是慢性伤口清创的酶促清创组合物存在长期且未被满足的需求。

发明概述

本发明提供了清创组合物，所述清创组合物包含：从菠萝蛋白酶获得的呈干燥形式的蛋白水解酶的混合物、pH调节剂和含水凝胶载体，其中，在使用前，蛋白水解酶的混合物与pH调节剂和含水凝胶载体混合以形成凝胶形式的具有一定粘度和一定pH的清创组合物。本发明还提供了用于清创伤口特别是慢性伤口的方法，所述方法包括将本发明的清创组合物敷用在伤口部位上，从而实现伤口清创的步骤。

伤口清创是伤口床准备(WBP)的关键过程，并且被认为是慢性伤口管理中的必要干预手段，该干预手段可促进伤口愈合和完全的伤口闭合。

已知的是，目前用于治疗慢性伤口的可用的酶促清创剂，例如软膏，被持续长时间段，例如持续三个月、六个月或甚至十二个月每天敷用，以实现焦痂去除。

本发明的申请人先前已经证明，在烧伤伤口清创中，包含10％(w/w)的量的从菠萝蛋白酶获得的蛋白水解酶混合物、2.2％(w/w)的量的980NF、磷酸氢二钠和水的凝胶制剂在单次4小时敷用后是有效的。由于980NF的含量，该凝胶制剂具有范围从55,000厘泊(cP)至多达120,000Cp的高粘度。

现在首次公开了具有范围从约10,000厘泊(cP)至约45,000cP的粘度的含水凝胶制剂，其包含：(i)载体的总重量的1％(w/w)至5％(w/w)的量的在本文被命名为API的从菠萝蛋白酶获得的蛋白水解酶混合物；(ii)pH调节剂；和(iii)包含丙烯酸的交联聚合物、极性共溶剂和水的载体；这样的凝胶制剂使API能够向慢性伤口的焦痂组织渗透，以便有效地清除无活力的组织。本发明的凝胶制剂使慢性伤口的焦痂清除能够在几天内实现，并且由此作为快速且有效的酶促清创剂是极为有用的，特别是对于慢性伤口或难以愈合的伤口是极为有用的。

还公开了，本发明的含水凝胶制剂对人类受试者中的慢性伤口清创的效力在各种病因学的慢性伤口，例如静脉性腿部溃疡、糖尿病性下肢溃疡和创伤伤口/术后伤口中被展示。但是，更高的效力出乎意料地展示在静脉性腿部溃疡和糖尿病性下肢溃疡的清创中。

现在公开了将本发明的含水凝胶制剂敷用于人类受试者的慢性伤口上持续4小时/天，持续多达连续10天，导致焦痂/腐肉的完全去除，具有轻度或中度的不良作用，该不良作用基本上类似于用不含API的含水凝胶制剂，即凝胶媒介物观察到的那些不良作用。不良作用是短暂的，并且患者在几天内恢复。因此，本发明的含水凝胶制剂是安全且被良好耐受的。

现在还公开了，如果每次敷用均在慢性伤口上敷用较长的持续时间，则本发明的含水凝胶制剂中较低量的API就可以实现有效的焦痂清除。因此，本发明公开了含水凝胶制剂中5％(w/w)的API或甚至更低量的API，例如2％(w/w)或甚至1％(w/w)可被敷用于慢性伤口，在1-4周的治疗期期间，每次敷用持续24小时、48小时或甚至持续更长的时间段，以便实现完全的伤口清创。

还公开了加入到本发明的含水凝胶制剂中的极性共溶剂甘油减轻了皮肤刺激。因此，本发明的含水凝胶制剂包含极性共溶剂，优选甘油。

在一些实施方案中，本发明的含水凝胶制剂具有范围从约6.5至约8.0的pH，例如约7.0的pH。在此pH范围内，蛋白水解酶的活性基本上是最大的。为了达到这些pH，本发明的含水凝胶制剂包含pH调节剂，因此能够获得极为有效的酶促清创剂。

因此，在整个说明书和权利要求书中也被称为“清创组合物”的本发明的含水凝胶制剂作为用于伤口，并且特别是慢性伤口或难以愈合的伤口的清创和治疗的快速、有效、安全且良好耐受的酶促剂是极具优势的。

根据第一方面，本发明提供了清创组合物，所述清创组合物包含：

(a)从菠萝蛋白酶获得的包含茎菠萝蛋白酶(EC 3.4.22.32)和ananain(EC3.4.22.31)的蛋白水解酶混合物，所述蛋白水解酶混合物呈干燥或冻干形式；

(b)pH调节剂；和

(c)载体，所述载体包含：

(i)丙烯酸的交联聚合物；

(ii)极性共溶剂；和

(iii)水；

其中，在使用前，蛋白水解酶混合物与pH调节剂和载体混合以形成凝胶形式的清创组合物，所述凝胶形式的清创组合物的特征在于具有约10,000厘泊(cP)至约45,000cP范围内的粘度，和范围从约6.0至约8.0的pH，并且其中所述蛋白水解酶混合物以范围从载体的总重量的约1％(w/w)至约7％(w/w)的量存在于清创组合物中。

根据一些实施方案，蛋白水解酶混合物以范围从载体的总重量的约2％(w/w)至约7％(w/w)的量，例如以载体的总重量的约2％、2.5％、3％、3.5％、4％、5％、6％或约7％(w/w)的量存在于清创组合物中。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。根据另外的实施方案，蛋白水解酶混合物以范围从约1％(w/w)至约5％(w/w)的量存在于清创组合物中。根据一个示例性实施方案，蛋白水解酶混合物以载体的总重量的约2.5％(w/w)的量存在。根据另一个示例性实施方案，蛋白水解酶混合物以载体的总重量的5％(w/w)的量存在于清创组合物中。

根据另外的实施方案，pH调节剂选自由磷酸钠、碳酸钠、磷酸钾和碳酸钾组成的组。根据一个实施方案，pH调节剂与蛋白水解酶混合物一起以干燥的形式存在。根据另一个实施方案，pH调节剂与载体一起存在。根据示例性实施方案，pH调节剂是磷酸钠。根据一个实施方案，磷酸钠是无水磷酸氢二钠。根据另外的实施方案，无水磷酸氢二钠以范围从载体的总重量的约0.1％(w/w)至约2％(w/w)的量存在。根据某个实施方案，无水磷酸氢二钠以载体的总重量的约0.25％(w/w)的量存在。

根据进一步的实施方案，丙烯酸的交联聚合物是卡波姆。根据又进一步的实施方案，卡波姆选自由以下组成的组：丙烯酸与烯丙基蔗糖或烯丙基季戊四醇交联的聚合物、丙烯酸和丙烯酸C₁₀-C₃₀烷基酯与烯丙基季戊四醇交联的聚合物、卡波姆均聚物或含有聚乙二醇和长链烷基酸酯的嵌段共聚物的卡波姆共聚物、及其组合。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

根据还进一步的实施方案，卡波姆选自由以下组成的组：均聚物、共聚物、互聚物等。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

根据进一步的实施方案，卡波姆包括但不限于980NF、71G NF、971P NF、974P NF、981NF、PEMULEN^TM TR-1NF、PEMULEN^TM TR-2NF、 ETD2020NF、 Ultrez 10NF、卡波姆934(934NF)、卡波姆934P(934P NF)、卡波姆940(940NF)、卡波姆941(941NF)和卡波姆1342(1342P NF)。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。根据一些实施方案，卡波姆是以范围从载体的总重量的约0.5％(w/w)至约1.5％(w/w)的量存在的980NF。根据某个实施方案，980NF以载体的总重量的约1％(w/w)的量存在。

根据又进一步的实施方案，极性共溶剂选自由甘油、聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚甘油、丙二醇、乙醇、异丙醇及其组合组成的组。根据进一步的实施方案，极性共溶剂是以范围从载体的总重量的约2％(w/w)至约15％(w/w)的量存在的甘油。根据一个示例性实施方案，甘油以载体的总重量的10％(w/w)的量存在。

根据还进一步的实施方案，清创组合物的粘度范围为从约10,000cP至约30,000cP，可选地从约15,000cP至约25,000cP。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。根据某些实施方案，粘度范围为从约16,000cP至约22,000cP。

根据又进一步的实施方案，清创组合物的pH范围为从约6.0至约7.0，可选地pH是约7.0。

根据一些实施方案，清创组合物包含：

(a)范围从载体的总重量的约1％(w/w)至约7％(w/w)的量的从菠萝蛋白酶获得的包含茎菠萝蛋白酶(EC 3.4.22.32)和ananain(EC 3.4.22.31)的蛋白水解酶混合物；

(b)pH调节剂；

(c)载体，所述载体包含：

(i)丙烯酸与烯丙基蔗糖或烯丙基季戊四醇交联的聚合物；

(ii)甘油；和

(iii)水。

根据另外的实施方案，清创组合物包含：

(a)范围从载体的总重量的约1％(w/w)至约7％(w/w)的量的从菠萝蛋白酶获得的包含茎菠萝蛋白酶(EC 3.4.22.32)和ananain(EC 3.4.22.31)的蛋白水解酶混合物；

(b)pH调节剂；

(c)载体，所述载体包含：

(i)范围从载体的总重量的约0.5％(w/w)至约1.5％(w/w)的量的

980NF；

(ii)甘油；和

(iii)水。

根据进一步的实施方案，清创组合物包含：

(a)从菠萝蛋白酶获得的包含茎菠萝蛋白酶(EC 3.4.22.32)和ananain(EC3.4.22.31)的蛋白水解酶混合物，其以范围从载体的总重量的约1％至约7％(w/w)的量，优选地以范围从载体的总重量的约1％(w/w)至约5％(w/w)的量存在于第一容器中；

(b)存在于第二容器中的载体，所述载体包含：

(i)载体的总重量的约0.9％(w/w)的量的980NF；

(ii)载体的总重量的约10％(w/w)的量的甘油；

(iii)以载体的总重量的约0.25％(w/w)的量存在的无水磷酸氢二钠；

和

(iv)水，

其中，清创组合物的粘度范围为从约15,000cP至约25,000cP，并且pH范围为从约6.0至约7.0。

根据另一个方面，本发明提供了用于清创伤口的方法，所述方法包括对需要这样的治疗的受试者的伤口部位敷用治疗有效量的根据本发明的原理的清创组合物的步骤。

根据一些实施方案，方法包括对伤口部位敷用本发明的清创组合物的步骤，所述清创组合物包含：

(a)从菠萝蛋白酶获得的包含茎菠萝蛋白酶(EC 3.4.22.32)和ananain(EC3.4.22.31)的以干燥或冻干形式存在的蛋白水解酶混合物；

(b)pH调节剂；

(c)载体，所述载体包含：

(i)丙烯酸的交联聚合物；

(ii)极性共溶剂；和

(iii)水。

其中，在使用前，蛋白水解酶混合物与pH调节剂和载体混合以形成凝胶形式的清创组合物，所述清创组合物的特征在于具有约10,000厘泊(cP)至约45,000cP范围内的粘度，和范围从约6.0至约8.0的pH，并且其中所述蛋白水解酶混合物以范围从载体的约1％(w/w)至约7％(w/w)的量存在于清创组合物中。

根据一些实施方案，方法包括敷用包含以下的清创组合物的步骤：

(a)从菠萝蛋白酶获得的包含茎菠萝蛋白酶(EC 3.4.22.32)和ananain(EC3.4.22.31)的蛋白水解酶混合物，其以范围从载体的约1％(w/w)至约7％(w/w)的量，优选地以范围从载体的约1％(w/w)至约5％(w/w)的量以干燥或冻干的形式存在于第一容器中；

(b)存在于第二容器中的载体，所述载体包含：

(i)载体的总重量的约0.9％(w/w)的量的980NF；

(ii)载体的总重量的约10％(w/w)的量的甘油；

(Iii)约0.25％(w/w)的量的无水磷酸氢二钠；和

(iv)水。

其中，组合物的粘度范围为从约15,000cP至约25,000cP，并且pH范围为从约6.0至约7.0。

根据另外的实施方案，通过本发明的清创组合物清创的伤口是难以愈合的伤口或慢性伤口。根据进一步的实施方案，难以愈合的伤口或慢性伤口选自由糖尿病性溃疡、静脉瘀滞性溃疡、动脉功能不全性溃疡、压迫性溃疡、术后伤口和创伤后伤口组成的组。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。根据进一步的实施方案，难以愈合的伤口或慢性伤口选自由糖尿病性下肢溃疡、静脉性腿部溃疡、术后伤口和创伤后伤口组成的组。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。根据某些实施方案，难以愈合的伤口或慢性伤口是糖尿病性下肢溃疡或静脉性腿部溃疡。

根据进一步的实施方案，用于治疗难以愈合的伤口或慢性伤口的清创组合物以至少一次敷用的方案被敷用于伤口部位，其中每次敷用，清创组合物与伤口部位保持接触持续约4-24小时。根据又进一步的实施方案，清创组合物以至少2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或至少10次敷用的方案被敷用于伤口部位，或直至焦痂被清除，其中每次敷用，清创组合物与伤口部位保持接触持续约4-24小时。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。根据一个示例性实施方案，清创组合物以10次敷用的方案被敷用，其中每次敷用，清创组合物与伤口部位保持接触持续约4小时。

根据还进一步的实施方案，清创组合物以至少一次敷用的方案被敷用于伤口部位，其中每次敷用，清创组合物与伤口部位保持接触持续约24小时。根据又进一步的实施方案，清创组合物以至少2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或至少10次敷用的方案被敷用于伤口部位，或直至焦痂被清除，其中每次敷用，清创组合物与伤口部位保持接触持续约24小时。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。根据一个示例性实施方案，清创组合物以10次敷用的方案被敷用，其中每次敷用，清创组合物与伤口部位保持接触持续约24小时。

根据另外的实施方案，清创组合物以至少一次敷用的方案被敷用于伤口部位，其中每次敷用，清创组合物与伤口部位保持接触持续约48小时或持续约72小时或持续其间的任何整数小时数。根据进一步的实施方案，清创组合物以至少2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或至少10次敷用的方案被敷用于伤口部位，或直至焦痂被清除，其中每次敷用，清创组合物与伤口部位保持接触持续约48小时或持续约72小时或持续其间的任何整数小时数。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。根据一个示例性实施方案，清创组合物以10次敷用的方案被敷用，其中每次敷用，清创组合物与伤口部位保持接触持续约48小时。

根据又进一步的实施方案，清创组合物以每周三次、持续至少一周的方案被敷用于慢性伤口，其中所述清创组合物与伤口部位保持接触持续选自由每次敷用48小时和每次敷用72小时组成的组的持续时间。根据还进一步的实施方案，清创组合物以每周3次、持续至少4次、5次、6次、7次、8次、9次或至少10次敷用的方案被敷用于慢性伤口，或直至焦痂被清除，其中所述清创组合物与伤口部位保持接触持续选自由每次敷用48小时和每次敷用72小时组成的组的持续时间。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。根据一个示例性实施方案，清创组合物以10次敷用的方案每周三次被敷用。

根据还进一步的实施方案，方案被重复一次、两次、三次或更多次或直至焦痂被完全清除，和/或获得伤口闭合。应注意，如果治疗方案被重复，则治疗可以是连续的或者可以是彼此隔开一天或更多天、一周或更多周或一个月或更多个月。另外地或可选地，如果焦痂复发并且尚未获得伤口闭合，则方案被重复一次、两次或更多次，直至焦痂被完全清除和/或获得伤口闭合。

根据又进一步的实施方案，所述方法还包括向受试者施用活性剂的步骤，所述活性剂选自由麻醉剂、抗细菌剂、抗真菌剂和抗炎剂组成的组。活性剂，诸如例如麻醉剂，可以被局部敷用于伤口部位或可以在敷用清创制剂之前、与敷用清创制剂同时或在敷用清创制剂之后被口服施用或肠胃外施用。

根据另一个方面，本发明提供了治疗伤口的方法，所述方法包括如本文以上定义的对需要这样的治疗的受试者的伤口部位敷用治疗有效量的根据本发明的原理的清创组合物的步骤。根据某个实施方案，伤口是难以愈合的伤口或慢性伤口。

根据进一步的方面，本发明提供了用于伤口愈合或伤口闭合的方法，所述方法包括如本文以上定义的对需要这样的治疗的受试者的伤口部位敷用治疗有效量的根据本发明的原理的清创组合物。根据某个实施方案，伤口是难以愈合的伤口或慢性伤口。

根据另一个方面，本发明提供了根据本发明的原理的清创组合物，用于如本文以上定义的在清创伤口的方法中和/或在治疗伤口和/或在伤口愈合和/或在伤口闭合中使用。根据某个实施方案，伤口是难以愈合的伤口或慢性伤口。

联系接下来的附图、描述、实施例和权利要求书，将更好地理解本发明的这些和其他实施方案。

附图简述

图1A-D是在猪中诱导的慢性伤口的显微照片。图1A显示了治疗前的慢性伤口，并且图1B显示了在用3％EscharEx凝胶治疗11次之后的慢性伤口。作为对照，在猪中诱导的慢性伤口(图1C)用凝胶媒介物来治疗，持续11次治疗(图1D)。

图2A-C显示了在用EsxharEx凝胶进行第10次治疗之后的焦痂百分比作为持续1小时(图2A)、4小时(图2B)和24小时(图2C)敷用于伤口的活性药物成分(API)的量的函数。

图3A-C显示了在用EsxharEx凝胶进行第10次治疗之后的焦痂的曲线下面积(AUC)作为持续1小时(图3A)、4小时(图3B)和24小时(图3C)敷用于伤口的API的量的函数。

图4A-B显示了在第10次治疗后的焦痂的曲线下面积(AUC)(上图)、焦痂百分比(中图)的二次模型以及满意度函数(对第10次治疗后的最低AUC和最低焦痂百分比的优化；下图)作为API的量的函数(图4A)并且作为治疗持续时间的函数(图4B)。宽虚线指示模型的置信区间(95％)。

图5显示了在意向治疗(ITT)群体中治疗组完成清创的时间。

图6显示了在ITT群体中患有静脉性腿部溃疡的受试者中治疗组完成清创的时间。

图7显示了在ITT群体中患有糖尿病性下肢溃疡的受试者中治疗组完成清创的时间。

发明详述

本发明提供了清创组合物，其包含：(i)从菠萝蛋白酶获得的以干燥或冻干形式存在的蛋白水解酶混合物；(ii)pH调节剂；和(iii)包含丙烯酸的交联聚合物、极性共溶剂和水的载体，其中在使用前，蛋白水解酶混合物与pH调节剂和载体混合以形成凝胶形式的清创组合物，其具有约10,000cP至约45,000cP范围的粘度并且具有约6.0至约8.0范围的pH。

如遍及说明书和权利要求书使用的术语“从菠萝蛋白酶获得的蛋白水解酶混合物”指的是从菠萝蛋白酶部分纯化的酶促制剂。

术语“菠萝蛋白酶”指的是源自菠萝植物的茎的蛋白质提取物，所述菠萝植物可以是商购的。

从菠萝蛋白酶获得的蛋白水解酶混合物(也被称为或)及其制剂在WO 2006/054309和WO 2013/011514中被公开，其内容通过引用并入，如同在本文完全阐述。从菠萝蛋白酶获得的蛋白水解酶混合物包含存在于菠萝蛋白酶中的半胱氨酸蛋白酶中的至少两种：茎菠萝蛋白酶(EC 3.4.22.32)和ananain(EC 3.4.22.31)。蛋白水解酶混合物还可以包含菠萝蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶前体中的一种或更多种，诸如例如，ananain(EC 3.4.22.31)前体、果实菠萝蛋白酶(EC 3.4.22.33)前体和茎菠萝蛋白酶(EC3.4.22.32)前体。蛋白水解酶混合物还可以包含半胱氨酸蛋白酶片段、木菠萝样凝集素和/或菠萝蛋白酶抑制剂(参见，例如WO 2006/054309)。根据某个实施方案，从菠萝蛋白酶获得的蛋白水解酶混合物包含茎菠萝蛋白酶(EC 3.4.22.32)、ananain(EC 3.4.22.31)、菠萝蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶前体和任选地木菠萝样凝集素。

蛋白水解酶混合物可以通过在WO 2013/011514中公开的程序获得。作为制备的最后步骤，蛋白水解酶混合物被冻干并且作为冻干的粉末储存直至使用。蛋白水解酶混合物作为冻干的粉末或干燥的粉末是高度稳定的，并且可以在2-8℃储存3年。在此时间段之后，蛋白水解酶混合物保持原始酶促活性的至少90％，如在生产过程结束时确定的。

如贯穿说明书和权利要求书可互换使用的术语“干燥的”、“冻干的”或“无水的”述及的是蛋白水解酶混合物或pH调节剂，其含有所述混合物或所述pH调节剂的总重量的至多3％(w/w)的量的水，可选地水以所述混合物或所述pH调节剂的总重量的上至2％、1％、0.5％，或还可选地以上至0.1％(w/w)的量存在。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。根据某些实施方案，蛋白水解酶混合物和pH调节剂不含水。

可用于实践本发明的丙烯酸的交联聚合物是卡波姆。合适的卡波姆包括但不限于由Lubrizol Advanced Materials,Cleveland,Ohio以商品名出售的各种聚合物，包括例如均聚物(丙烯酸与烯丙基蔗糖或烯丙基季戊四醇交联的聚合物)诸如71G NF、971P NF、974P NF、980NF和981NF；共聚物(丙烯酸和丙烯酸C₁₀-C₃₀烷基酯与烯丙基季戊四醇交联的聚合物)诸如PEMULEN^TM TR-1NF和PEMULEN^TM TR-2NF；互聚物(卡波姆均聚物或含有聚乙二醇和长链烷基酸酯的嵌段共聚物的卡波姆共聚物)诸如 ETD 2020NF和 Ultrez 10NF；“传统的”卡波姆诸如卡波姆934(934NF)、卡波姆934P(934PNF)、卡波姆940(940NF)、卡波姆941(941NF)和卡波姆1342(1342P NF)。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

极性共溶剂包括但不限于甘油、聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚甘油、丙二醇、乙醇、山梨糖醇、异丙醇及其组合。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。根据某些实施方案，极性共溶剂是甘油。

术语“药学上可接受的”意指被联邦或州政府的管理机构批准的或在美国药典或其他一般公认的药典中被列出为用于在人类中使用的。本发明的清创组合物的成分都是药学上可接受的剂。

术语“约”指的是高于或低于所指示值10％的值。

清创组合物还可以包含防腐剂，诸如例如苯甲醇、对羟基苯甲酸酯、羟苯甲酯或羟苯丙酯及其组合和/或抗氧化剂，诸如例如抗坏血酸、二氢醌、丁基化羟基甲苯、二硫苏糖醇及其组合和/或抗聚集剂，诸如例如寡糖，例如乳糖等。

清创组合物还可以包含活性剂，例如麻醉剂、抗细菌剂、抗真菌剂、抗炎剂、镇痛剂、生长因子、促愈合剂或其组合。麻醉剂包括但不限于地卡因(丁卡因)、利诺卡因(利多卡因)、赛鲁卡因、布比卡因、丙胺卡因、罗哌卡因、苯佐卡因、甲哌卡因、可卡因及其组合。

抗细菌剂包括但不限于金刚烷胺盐酸盐、金刚烷胺硫酸盐、阿米卡星、硫酸阿米卡星、氨基糖甙类、阿莫西林、氨苄青霉素、安莎霉素、杆菌肽、β-内酰胺类、杀念珠菌素、卷曲霉素、羧苄青霉素、头孢氨苄、头孢噻啶、头孢噻吩、头孢唑啉、头孢匹林、头孢拉定、头孢甘酸、氯霉素、氯己定、葡糖酸氯己定、盐酸氯己定、二氢氯喹、氯喹那多、金霉素、盐酸金霉素、环丙沙星、环杆菌素、克林霉素、盐酸克林霉素、克霉唑、邻氯青霉素、地美环素、双氯青霉素、二碘羟基喹啉、多西环素、乙胺丁醇、盐酸乙胺丁醇、红霉素、依托酸红霉素、硬脂酸红霉素、法尼醇、氟氯青霉素、庆大霉素、硫酸庆大霉素、短杆菌肽、灰黄霉素、卤普罗近、卤代醌醇、六氯酚、米诺环素、氯碘羟喹、卡那霉素、硫酸卡那霉素、林可霉素、林可霉素、盐酸林可霉素、大环内酯类、甲氯环素、美他环素、盐酸美他环素、乌洛托品、马尿酸乌洛托品、扁桃酸乌洛托品、甲氧西林、甲硝唑、咪康唑、盐酸咪康唑、米诺环素、盐酸米诺环素、莫匹罗星、萘夫西林、新霉素、硫酸新霉素、奈替米星、硫酸奈替米星、呋喃西林、诺氟沙星、制霉菌素、octopirox、竹桃霉素、头孢菌素、苯唑西林、土霉素、盐酸土霉素、对氯间二甲苯酚、巴龙霉素、硫酸巴龙霉素、青霉素、青霉素G、青霉素V、戊烷脒、盐酸戊烷脒、非奈西林、多粘菌素、喹诺酮例如氟喹诺酮、硫酸链霉素、四环素、妥布霉素、托萘酯、三氯生、利福平、利福霉素、吡甲四环素、银盐、壮观霉素、螺旋霉素、链霉素、磺胺类、四环素类、四环素、妥布霉素、硫酸妥布霉素、三氯卡班、三氯生、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑、泰洛星、万古霉素、yrothricin及其组合。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

抗真菌剂包括但不限于制霉菌素、克霉唑、咪康唑、酮康唑、氟康唑、噻苯达唑、益康唑、氯咪达唑(clomidazole)、异康唑、噻苯唑、噻康唑、硫康唑、联苯苄唑、奥昔康唑、芬替康唑、奥莫康唑、舍他康唑、氟三唑(flutrimazole)及其组合。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

抗炎剂可以是非甾体抗炎剂、甾体抗炎剂或其组合。非甾体抗炎剂的非限制性实例包括昔康类，例如吡罗昔康、伊索昔康、替诺昔康、舒多昔康；水杨酸酯/盐，例如阿司匹林、双水杨酯(disalcid)、贝诺酯、三水杨酸胆碱镁(trilisate)、safapryn、solprin、二氟尼柳和芬度柳；乙酸衍生物，例如双氯芬酸、芬氯酸、吲哚美辛、舒林酸、托美丁、伊索克酸、呋罗芬酸、硫平酸、齐多美辛、阿西美辛、芬替酸、佐美酸、环氯弗酸(clindanac)、奥昔平酸、联苯乙酸和酮咯酸；芬那酸类(fenamates)，例如甲芬那酸、甲氯芬那酸、氟芬那酸、尼氟灭酸和托芬那酸；丙酸衍生物，例如布洛芬、萘普生、苯恶洛芬、氟比洛芬、酮洛芬、非诺洛芬、芬布芬、吲哚洛芬、吡洛芬、卡洛芬、奥沙普秦、普拉洛芬、咪洛芬、硫恶洛芬、舒洛芬、阿米洛芬和噻洛芬酸(tiaprofenic)；吡唑类，例如苯基丁氮酮、羟基保泰松、非普拉宗、阿扎丙宗和三甲保泰松(trimethazone)。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

甾体抗炎药的非限制性实例包括皮质类固醇，例如氢化可的松、羟基-曲安西龙、α-甲基地塞米松、磷酸地塞米松、二丙酸倍氯米松、戊酸氯倍他索、地奈德、去氧米松、醋酸去氧皮质酮、地塞米松、双氯松、双醋酸二氟拉松、戊酸二氟可龙、氟氢缩松、氟氯奈德、氟氢可的松、氟美松新戊酸酯、氟轻松、氟轻松醋酸酯、福可定丁酯、氟可龙、醋酸氟泼尼定(fluprednylidene)、氟氢缩松、哈西奈德、醋酸氢化可的松、丁酸氢化可的松、甲基强的松龙、曲安奈德、可的松、可托多松、醋酸氟轻松、氟氢可的松、双醋酸二氟拉松、氟氢缩松、氟氢可的松、diflurosone diacetate、缩丙酮氟氢缩松、甲羟松、amcinafel、安西非特、倍他米松及其酯的平衡物、氯泼尼松、醋酸氯泼尼松、氯可托龙、地西龙、双氯松、二氟泼尼酯、氟二氯松、氟尼缩松、氟米龙、氟培龙、氟泼尼龙、戊酸氢化可的松、环丙戊酸氢化可的松、氢可他酯、甲泼尼松、帕拉米松、泼尼松龙、泼尼松、二丙酸倍氯米松和曲安奈德。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

止痛剂包括但不限于可待因、氢可酮、羟考酮、芬太尼和丙氧芬。每种可能性代表单独的实施方案。

生长因子包括但不限于表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子等。

促愈合剂包括但不限于透明质酸等。

根据优选的实施方案，清创组合物是无菌的。

本发明的凝胶制剂的粘度可以通过任何已知的手段来测量。粘度可以使用锥板几何仪通过绝对粘度测量来确定。可选地，Brookfield(转子和样品杯)粘度计可以被用于计算本文描述的凝胶制剂的粘度。本文提及的粘度范围都是在室温测量的。

蛋白水解酶混合物和载体可以分别储存在单个容器的第一隔室和第二隔室中，或者可以储存在两个单独的容器，即在第一容器和第二容器中。pH调节剂可以是无水的或干燥的，并且可以与蛋白水解酶混合物一起储存在第一隔室或第一容器中。可选地，pH调节剂可以与载体一起储存在第二隔室或第二容器中。可选地，pH调节剂可以储存在第三个不同的隔室或容器中。根据某个实施方案，pH调节剂与载体一起储存在第二隔室或第二容器中，并且在使用前，将蛋白水解酶混合物和载体混合以形成本发明的清创组合物。

根据另一个方面，本发明提供了包含三个容器的系统，其中第一容器包含蛋白水解酶混合物，第二容器包含载体，并且第三容器包含pH调节剂。可选地，系统包含两个容器，其中第一容器包含蛋白水解酶混合物，并且第二容器包含载体和pH调节剂。

根据一些实施方案，组合物不含粘合剂，并且照此它是非粘附性的。

清创组合物的用途

本发明提供了用于清创皮肤伤口的方法，包括对需要这样的治疗的受试者的皮肤伤口部位局部敷用治疗有效量的本发明的清创组合物，从而清除伤口的焦痂以促进伤口愈合和伤口闭合的步骤。根据某些实施方案，伤口是慢性伤口或难以愈合的伤口。

本发明还提供了治疗皮肤伤口的方法，包括对需要这样的治疗的受试者的皮肤伤口部位局部敷用治疗有效量的本发明的清创组合物，从而治疗伤口的步骤。根据某些实施方案，伤口是慢性伤口或难以愈合的伤口。

如遍及本说明书和权利要求书中可互换使用的术语“慢性伤口”、“慢性皮肤伤口”或“难以愈合的伤口”指的是，未能如伤口应表现的那样经历一系列有序且及时的事件而产生持久的结构的、功能的和/或美观的闭合的伤口。在一个月内未能愈合的伤口被认为是慢性伤口或难以愈合的伤口。

如本文使用的术语“伤口的清创”指的是从伤口去除无活力的组织：坏死的焦痂、腐肉或纤维蛋白和细菌/生物膜。坏死的焦痂是薄的或厚的、皮革样的、死亡的、黑色的、棕色的或棕褐色的组织，而腐肉和生物膜是伤口床上的渗出性的、白色或黄绿色斑状的脆弱组织。坏死组织、异物和细菌通过产生干扰局部伤口愈合过程的金属蛋白酶或刺激金属蛋白酶的产生而阻碍身体愈合的意图。这种恶劣的环境允许细菌增殖、在覆盖伤口床的渗出物、碎片和化脓性排出物(“腐肉”)内进一步定植于伤口。此外，细菌分泌与腐肉一起形成生物膜的结构性产物，因此保护它们的菌落免受潜在的破坏。细菌产生其各自的伤口抑制性酶，并且更重要地，消耗了大部分对于伤口愈合所需的稀缺的、可利用的局部资源。

在慢性伤口中，几种不同的因素可能起重要作用。暴露的表面例如骨、肌腱、筋膜或甚至脂肪不支持细胞增殖，并且它们变干的并且变成异物，例如人造的植入物。对局部血液供应(动脉、静脉、淋巴、压力等)的任何干扰可能导致伤口变得难以愈合并变成慢性的。肉芽组织可能变得顽固、萎缩、失去其丰富的血管基质，在颜色上变得更暗和不透明，并且将不会参与伤口愈合和闭合过程。

如本文使用的术语“伤口床准备(WBP)”指的是由适当的清创产生伤口床以加速内源性愈合或促进其他治疗措施的有效性。它是一种清创、去除伤口和患者内阻碍愈合的各种“负担”的过程。伤口内的负担包括渗出物、细菌、生物膜和坏死的碎片/细胞碎片。患者的整体健康状态对于愈合过程是重要的。在慢性伤口中，去除令人厌恶的焦痂、腐肉或生物膜可能产生清洁的伤口床，但是如果这样的伤口床不能得到患者的全身状况或肢体状况支持，则这样的伤口床可能仍然不足以用于将来的愈合。

为愈合准备的伤口床是没有焦痂、腐肉、纤维蛋白或生物膜的伤口床，该伤口床还具有健康组织和/或健康的肉芽组织(按粒度计刻度，级别(level)>7)的有活力的床，健康组织和/或健康的肉芽组织将允许伤口在有活力的、干净的床上通过瘢痕形成和挛缩-外皮形成(任选地使用例如生物敷料、伤口愈合增强敷料、合成的伤口敷料、真空或臭氧伤口愈合系统的方式)而自发闭合或将支持自体STSG(中厚皮片移植(Split Thickness SkinGraft))或皮肤同种异体移植。

根据一些实施方案，伤口的清创指的是去除治疗前存在的至少50％，可选地至少75％的无活力组织。每种可能性是本发明的单独的实施方案。根据某些实施方案，伤口的清创指的是去除治疗前存在的至少90％、或至少95％、和优选地100％的无活力组织；这样的清创，即对治疗前存在的90％或更多的无活力组织的清除，在整个说明书和权利要求书中被称为“完全的伤口清创”。

术语“伤口闭合”指的是使组织的细胞覆盖层再生的过程。因此，促进伤口闭合意味着在细胞覆盖层的再生中产生积极的效果。积极的效果可以是加速再生过程的或减少伤口的损伤面积。

术语“治疗有效量”是足以为被施用组合物的受试者提供有益效果的蛋白水解酶混合物的量。

根据一些实施方案，本发明的清创组合物可以被每天敷用于慢性伤口部位，持续约4-24小时、或持续其间的任何整数小时数、持续至少一天的治疗周期。可选地，本发明的清创组合物可以被每天敷用于慢性伤口部位持续约4-24小时、或持续其间的任何整数小时数、持续至少连续2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天的治疗周期或直至焦痂被清除。每种可能性是本发明的单独的实施方案。

根据另外的实施方案，本发明的清创组合物可以以至少一次敷用的方案被敷用于慢性伤口部位，其中每次敷用，清创组合物与伤口部位保持接触持续约4-24小时，例如持续约24小时。可选地，本发明的清创组合物可以以至少2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或至少10次敷用的方案被敷用于慢性伤口部位，或直至焦痂被清除，其中每次敷用，清创组合物与伤口部位保持接触持续约4-24小时，例如持续约24小时。每种可能性是本发明的单独的实施方案。根据一个实施方案，方案的持续时间是至少一天。可选地，方案的持续时间是多达四周，优选每次敷用约24小时的多达10次敷用。

根据进一步的实施方案，本发明的清创组合物可以以至少一次敷用的方案，每次敷用与慢性伤口部位保持接触持续约48小时。可选地，本发明的清创组合物可以以至少2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或至少10次敷用的方案或直至焦痂被清除，每次敷用与慢性伤口部位保持接触持续约48小时。每种可能性是本发明的单独的实施方案。根据一个实施方案，方案的持续时间是至少两天。可选地，方案的持续时间是多达四周，优选每次敷用约48小时的多达10次敷用。

根据又进一步的实施方案，本发明的清创组合物可以以至少一次敷用，例如至少2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或至少10次敷用的方案或直至焦痂被清除，每次敷用与慢性伤口部位保持接触持续约72小时。每种可能性是本发明的单独的实施方案。根据一个实施方案，方案的持续时间是至少三天。可选地，方案的持续时间是多达四周，优选地每次敷用约72小时的多达10次敷用。

根据又进一步的实施方案，治疗方案可以被重复一次、两次、三次或更多次直至伤口被完全清创和/或获得伤口闭合。如果重复，则方案可以是彼此连续/顺序性的，或者可以彼此隔开数天、数周或数月。

根据一些实施方案，本发明的方法还可以包括用封闭层或封闭敷料覆盖清创组合物以将组合物保持或保留在伤口部位的步骤。

根据一些实施方案，本发明的方法还可以包括在敷用/接触时间结束时，诸如例如，在敷用/接触时间4小时后或24小时后或48小时后或72小时后洗涤伤口部位的另外的步骤。

应理解，在整个说明书和权利要求书中被指示的数值的范围包括其间的任何整数。

根据一些实施方案，如果洗涤伤口部位并且清创组合物的随后敷用在数小时或数天后进行，则湿润的或潮湿的敷料层，优选地潮湿的盐水纱布可以被敷用于伤口部位。

根据另外的实施方案，本发明的方法还可以包括在清创期间保护伤口边缘和伤口周围皮肤的步骤。

本发明涵盖组合疗法，其中本发明的方法可以与已知的清创方法，例如手术清创或快速清创(sharp debridement)组合。根据一些实施方案，本发明的方法可以在手术清创或快速清创之前进行。可选地，本发明的方法可以在手术清创或快速清创之后进行。

根据一些实施方案，被敷用于伤口部位的治疗有效量的API的范围在每100cm²的伤口表面约0.1gr至约2gr之间。根据另外的实施方案，被敷用于伤口部位的清创组合物的量是每100cm²的伤口表面约20gr。

实施例1

凝胶制剂的毒性研究

该研究旨在评价两种凝胶制剂的皮肤毒性。两种凝胶制剂都是含有0.9％Carbopol 980NF的含水制剂。然而，仅一种制剂含有10％甘油。凝胶制剂还含有凝胶制剂的总重量的2.5％或5％w/w的量的从菠萝蛋白酶获得的蛋白水解酶的混合物。

如先前描述的(参见，例如，WO 2013/011514)来制备从菠萝蛋白酶获得的蛋白水解酶混合物(在此之后被命名为API以表示活性药物成分，也称为或)。在治疗之前，将量为1gr粉末或0.5gr粉末的API与含有以下成分的20gr凝胶媒介物混合：0.9％w/w具有或不具有10％w/w甘油的980NF、0.25％w/w无水磷酸氢二钠和水。在敷用于皮肤部位之前，将凝胶媒介物和粉末混合多达15分钟以形成凝胶制剂。

将杂种家猪用肌肉内(i.m.)施用的赛拉嗪和盐酸氯胺酮、静脉内施用的地西泮并且吸入5％异氟烷和氧气来麻醉。猪背部的毛发被剪掉并且用抗生素肥皂和无菌碘清洗。皮肤用无菌纱布干燥。向每个皮肤部位(3cm×3cm)敷用2gr每种凝胶制剂。

将每种凝胶制剂每天一次地局部敷用于猪的背部持续4小时，并且在治疗结束时去除制剂。在敷用凝胶制剂之前和之后对皮肤部位拍照，并且使用Draize量表评价红斑和水肿：

红斑:

0-无红斑

1-非常轻微的红斑(几乎观察不到)

2-界限清楚的红斑

3-中度红斑

4-重度红斑(甜菜红色)至轻微的焦痂形成(深度损伤)

水肿:

0-无水肿

1-非常轻微的水肿

2-轻微的水肿(区域的边缘因明显凸起而界限清楚)

3-中度水肿(凸起约1毫米)

4-重度水肿(凸起超过1毫米，并且延伸到暴露区域之外)

还对皮肤部位进行了组织病理学评价。然后将皮肤部位敷上弹性绷带直至下一次治疗。该程序被重复连续14天。具有或不具有甘油的凝胶媒介物被用作对照。

结果

结果指示，对于2.5％w/w和5％w/w的API，在第4次治疗后，对于两种凝胶制剂，即具有或不具有甘油的凝胶制剂，首先观察到红斑，平均评分值是0.5和1.0。红斑的平均等级随着治疗次数的增加而增加，并且存在到第14天。在用单独的凝胶媒介物治疗的皮肤部位中未观察到红斑。结果还指示，红斑按照凝胶制剂中API量的函数而增加。由含有凝胶制剂的总重量的5％w/w的量的API的具有甘油的凝胶制剂引起的红斑的最大平均评分为2.33，并且由含有凝胶制剂的总重量的2.5％w/w的量的API的具有甘油的凝胶制剂引起的红斑的最大平均评分为1.33。由含有凝胶制剂的总重量的5％w/w的量的API的不具有甘油的凝胶制剂引起的红斑的最大平均评分为2.66，并且由含有凝胶制剂的总重量的2.5％w/w的量的API的不具有甘油的凝胶制剂引起的红斑的最大平均评分为2.0。

对于两种凝胶制剂，仅观察到轻微水肿(最大评分平均值为0.66)。

因此，这些结果证明，凝胶制剂中较高量的API带来较高水平的皮肤刺激，而甘油减轻了皮肤刺激。因此，后续实验使用与含有10％甘油、0.9％w/w 980NF、0.25％w/w无水磷酸氢二钠和水的凝胶媒介物混合的API来进行；含有API和凝胶媒介物的该凝胶制剂被命名为EX01或EscharEx凝胶。

实施例2

敷用持续时间和API量对慢性伤口治疗的影响

该研究旨在确定实现慢性伤口中焦痂去除的最大效力所必需的敷用持续时间和凝胶制剂中API的量。

慢性伤口模型在杂种家猪中被建立。将四个量的API(0、0.75％、1.25％和5％w/w)与如本文以上在实施例1中描述的含有甘油的凝胶媒介物混合，并持续三种敷用持续时间(1小时、4小时和24小时)敷用于慢性伤口，持续连续10天。在十天时间(也被表示为“治疗周期”)结束时，持续另外的14天(称为“恢复周期”)观察猪的慢性伤口，以评价清创对慢性伤口的愈合速度的影响。

在治疗周期开始和治疗周期期间以及恢复周期期间对慢性伤口拍照。焦痂区域和伤口区域通过目视评价，通过ImageJ软件(NIH,MD,USA)测量并且通过统计学软件(SAS Inc.,NC,USA)分析。在每张照片中，测量伤口尺寸和焦痂尺寸。红斑和水肿如本文以上在实施例1中描述的来评价。在第一次治疗之前、最后一次治疗之后和恢复周期结束时，从每个伤口的中心和从每个伤口的边缘获取活检组织。将组织包埋在石蜡中、切片并且用苏木精和曙红(H&E)染色。

使用来自照片的测量结果计算以下参数(“/”意味着“占…的比(out of)”)：

1)周期结束时的焦痂面积/伤口面积的百分比。

2)曲线下面积(AUC)，其中x轴是治疗次数，而y轴是焦痂百分比。该参数显示治疗的效力：治疗越有效，曲线下面积越小。

3)周期结束时的伤口尺寸/初始尺寸的百分比。

4)曲线下面积(AUC)，其中x轴是治疗次数，而y轴是伤口尺寸占初始尺寸的百分比。该参数显示伤口闭合：伤口闭合越快，面积越小。

结果

在治疗周期开始时，慢性伤口已经形成焦痂。图1A和图1C是显示治疗前的慢性伤口的代表性照片。焦痂包含两个不同的区域：其中皮肤被完全切除的伤口的中心和伤口边缘。在中心，薄的焦痂层形成，而在边缘，焦痂包含坏死的皮肤。

在用含有API的凝胶制剂(称为EscharEx凝胶或EX01)治疗的慢性伤口中，焦痂软化并逐渐随治疗(from treatment to treatment)溶解，直至周边处的溶解导致焦痂与有活力的组织完全脱离(图1B)。与之相比，用凝胶媒介物治疗的慢性伤口在治疗周期期间几乎不改变其外观和连贯性(consitency)(图1D)。在少数情况下，在第10次治疗后，大块焦痂与伤口床脱离。在凝胶媒介物和凝胶制剂EX01两者中，如果焦痂保留到最后一次治疗后，则其在恢复周期期间被干燥并且从伤口脱落。

尽管用凡士林保护，用凝胶制剂EX01治疗的伤口周围的区域在治疗周期期间仍出现水肿和红斑。这种皮肤刺激现象在用5％(w/w)API的24小时治疗组中更明显。用1.25％(w/w)API的24小时治疗引起与如通过用凝胶制剂EX01中的5％(w/w)API治疗4小时获得相似的皮肤刺激。红斑和水肿都于1-2天后在恢复周期期间完全消失。

发现在第10次治疗之后的焦痂百分比显著地依赖于凝胶制剂中的API的量和治疗持续时间。虽然在1小时治疗中，在第10次治疗时焦痂的量和API的浓度之间不存在相关性(图2A)，但在4小时治疗中，API的浓度越高，在第10次治疗后观察到的焦痂的量越少(图2B)。24小时治疗显示凝胶制剂中低浓度的API以浓度依赖性方式降低焦痂百分比；然而，较高浓度的API未进一步降低焦痂百分比(图2C)。

发现清创效力(AUC)显著地依赖于API浓度和治疗持续时间。在测量的所有API浓度下，1小时治疗不如4小时和24小时治疗有效(分别为图3A、图3B和图3C)。在4小时治疗中，AUC与API浓度相关(图3B)，而在24小时治疗中，AUC仅与较低浓度的API相关(图3C)。

针对第10次治疗之后的焦痂的曲线下面积(AUC；图4A和图4B，上图)和焦痂百分比(图4A和图4B，中图)的二次模型(API的二阶)的拟合被发现是显著的(p值0.0154)。根据该模型，24小时治疗中的最大满意度函数值(即，在最后一次治疗后焦痂的最低百分比和最低AUC两者)在～3.5％的API浓度达到(图4A和图4B，下图)。

在治疗周期期间伤口的尺寸几乎没有变化，并且尺寸的任何变化都是非常平缓的。这适用于所有治疗组。

在恢复周期期间：对于凝胶媒介物组和EX01组两者，如果焦痂保留到第10次治疗后，则其在恢复周期期间被干燥并且从伤口脱落。因此，在恢复周期之后的焦痂百分比在所有组中都是0或接近0。恢复周期结束时的焦痂百分比或恢复周期期间的AUC和API浓度或治疗持续时间之间不存在显著的相关性。

一旦焦痂脱落，所有伤口开始闭合。因此，在伤口尺寸占初始尺寸的比和API浓度或治疗持续时间之间未发现显著的相关性。对于恢复周期期间的AUC也是如此。

结论

该研究的结果指示在所有API浓度和所有治疗持续时间，含有API的凝胶制剂对焦痂的去除显著比凝胶媒介物更有效。发现24小时治疗中的最佳效率是约3.5％w/w API，指示在24小时治疗中，高于凝胶制剂的总重量的3.5％w/w的更高的API浓度不会导致效力增加。该研究的结果进一步指示，就效力和安全性而言，较长时间的治疗可以通过较低浓度的API来补偿。

实施例3

凝胶制剂中的API的效力和安全性-临床研究

该研究的目标是评估EscharEx凝胶在具有难以愈合的静脉性腿部溃疡、糖尿病性下肢溃疡和创伤伤口/术后伤口的受试者中制备伤口床的效力和安全性。

在具有难以愈合的伤口的受试者中进行多中心、随机化、媒介物对照的、评估者不知情的研究，以评价本文以上在实施例1和实施例2中公开的凝胶制剂中的API用于在具有难以愈合的静脉性腿部溃疡、糖尿病性下肢溃疡和创伤伤口/术后伤口的患者中制备伤口床的效力和安全性。

该研究包括73名受试者，他们用EscharEx凝胶或凝胶媒介物以多达10次日治疗，每次4小时±15分钟的敷用时间来治疗。这段时间被定义为“治疗周期”。在每次敷用后，清洗伤口、对伤口拍照，并临床评估伤口尺寸、无活力组织的去除和肉芽组织的变化、伤口状态和安全性参数。在用EscharEx凝胶或凝胶媒介物进行每次清创治疗后，不知情的评估者决定治疗的继续，并且对伤口敷以完全润湿(moist-to-moist)的盐水纱布。

在“治疗周期”结束后，受试者在其中心按照标准程序对待，并且对其进行每周一次的评价(伤口评估)直至完全伤口闭合或持续到自最后一次治疗敷用起多达12周(总共多达12次每周随访)。

对于完成伤口闭合的受试者，进行另外的3次每月的随访(总共3次探访)以评估伤口闭合复发。研究的总持续时间是至多27周。

加入该研究的患者是在具有以下病因的难以愈合的伤口(伤口时间4周或更长)上具有>50％坏死/腐肉/纤维蛋白的无活力组织的成人受试者：静脉性腿部溃疡、糖尿病性下肢溃疡和创伤伤口/术后伤口。

为了制备EscharEx凝胶，在使用前，将2克无菌粉末混合在40克如本文以上在实施例1中描述的无菌凝胶媒介物中≤15分钟以获得5％EscharEx凝胶。在将粉末与凝胶媒介物混合后，每克所制备的EscharEx凝胶含有0.05g EscharEx粉末。按照随机分配，每200cm²伤口表面，将混合在40克凝胶媒介物中的2g粉末(EscharEx凝胶)或仅40g凝胶媒介物敷用于伤口表面。

安全性结果通过确定全身不良事件和局部不良事件的严重程度和发生率、生命体征、疼痛评估(使用VAS)、临床感染征象、安全性实验室指标(laboratory parameter)(血液化学、血液学、凝结)、身体检查和失血来评价。

对于接受EscharEx凝胶治疗的受试者，进行以下程序：在EscharEx敷用之前，使用利多卡因凝胶或4％利多卡因、0.05％肾上腺素、0.5％丁卡因的组合(LET凝胶)的预防性镇痛剂被应用于皮肤边缘和伤口本身，持续半小时。伤口周围的皮肤由凡士林软膏(在伤口边缘上)保护。无菌等渗(0.9％)氯化钠溶液被洒在伤口上。在该应用程序期间伤口保持湿润。在凝胶敷用后，将伤口用封闭的膜敷料覆盖，所述封闭的膜敷料粘附于被敷用的无菌粘合剂屏障材料上。EscharEx凝胶填充整个封闭敷料，并且特别注意不要在该封闭敷料中留下空气。将被施加敷料的伤口用将封闭敷料保持并稳定在原位的松散蓬松的绷带敷料覆盖。将敷料保留在原位持续4小时，并且特别注意保护敷料和不破坏敷料。在4小时治疗后，使用无菌技术去除封闭敷料。粘合剂屏障使用无菌钝端的仪器(例如压舌器)去除。通过用干燥纱布、压舌器等将溶解的无活力组织擦掉，随后用湿纱布擦拭，并且然后用水清洗伤口，将溶解的无活力组织从伤口去除。

结果

完全清创的发生率

如表1中所示，在意向治疗(ITT)群体中，EscharEx凝胶组中在清创周期结束(多达10个治疗日)时的完全清创(去除≥90％无活力组织)的发生率相比于凝胶媒介物组显著更高，即分别为55.1％对29.2％。

表1.治疗组(ITT群体)的完全清创频率

*用于组间比较的双侧Fisher精确检验。

还进行了根据伤口病因学对完全清创的发生率的分析。如表2中所示，EscharEx凝胶组和凝胶媒介物组之间的差异在‘糖尿病性下肢溃疡’病因学(分别为50.0％对14.3％)和‘静脉性腿部溃疡’病因学(分别为62.5％对25.0％)方面更为明显。

表2.依据病因学和治疗组(ITT群体)的完全清创频率

*用于组间比较的双侧Fisher精确检验

对‘糖尿病性下肢溃疡’和‘静脉性腿部溃疡’的组合患者群体(排除具有‘创伤伤口/术后伤口’的患者)中的完全清创频率的分析产生了EscharEx凝胶相比于凝胶媒介物效果更显著的结果(完全清创的频率分别为56.3％对20.0％，p＝0.028；表3)。

表3.糖尿病性下肢溃疡和静脉性腿部溃疡的组合患者群体中依据治疗组(ITT群体)的完全清创频率

*用于组间比较的双侧Fisher精确检验

完成清创的时间

在EscharEx凝胶组中，ITT群体在10个治疗日内完成清创的平均时间(平均7.6天)相比于凝胶媒介物组(平均8.4天)更短。图5显示治疗组完成清创的时间的Kaplan-Meier图。EscharEx凝胶组在每个时间点实现完全清创的患者的百分比相比于凝胶媒介物组更高(时序检验p＝0.075)。

依据病因学的亚组分析指示，在具有‘静脉性腿部溃疡’(分别为平均6.7天对10.5天)和‘糖尿病性下肢溃疡’(分别为平均7.9天对8.9天)的患者中，EscharEx凝胶组中完全清创的平均时间相比于凝胶媒介物组更短。对于‘静脉性腿部溃疡’的完成清创的时间的Kaplan-Meier图在图6中被呈现，并且对于‘糖尿病性下肢溃疡’在图7中被呈现。对组合的两个群体：‘糖尿病性下肢溃疡’和‘静脉性腿部溃疡’的分析产生了在EscharEx凝胶组中完成清创的时间(平均7.3天)相比于凝胶媒介物组(平均9.7天)显著更短的结果。

达到完全清创的敷用次数

表4显示ITT群体中通过就诊具有完全清创的受试者的百分比。

表4.通过就诊具有完全清创的受试者的百分比

如表4中所示，相比于凝胶媒介物组中的8.3％，EscharEx凝胶组中总共32.7％的受试者在4个治疗日内实现了完全清创。相比于凝胶媒介物组中的少于三分之一(29.2％)的受试者，EscharEx凝胶组中超过一半(51.0％)在7个治疗日内实现了完全清创。EscharEx凝胶组中实现完全清创的27名患者中的25名(93％)患者在7次敷用内实现了完全清创。

通过病因学对ITT群体中具有完全清创的受试者的百分比的亚组分析指示，在EscharEx凝胶组中，具有‘糖尿病性下肢溃疡’和‘静脉性腿部溃疡’的一半受试者分别在7天和5天内实现了完全清创；在凝胶媒介物组中，分别仅有14.3％和25.0％在7个治疗日后实现了完全清创。相比于凝胶媒介物组中的44.4％，在具有‘创伤性术后伤口’的受试者中，52.9％仅在用EscharEx凝胶9个治疗日后实现了完全清创。

无活力组织的面积

“治疗周期”之前，无活力组织的平均面积在EscharEx凝胶组中为25.3cm²，而在凝胶媒介物组中为22.7cm²。在ITT群体中的所有研究性就诊阶段，与凝胶媒介物组相比，EscharEx凝胶组中的无活力组织的百分比减少更大。在治疗周期结束时，EscharEx凝胶组中无活力组织的面积的平均相对减少率为67.4％，与凝胶媒介物组中的46.0％相对。

通过病因学对无活力组织的平均面积的分析指示，在所有病因中，EscharEx凝胶组中无活力组织的平均面积在所有时间点的减少率与凝胶媒介物组相比更大。

安全性

该研究中的大多数患者经历了轻度AE和中度AE，占所报告的AE的85.0％(130/153)。报告了44个严重的不良事件(SAE)；报告SAE的患者的比例在两组中类似，EscharEx凝胶组中39％(19/49)对凝胶媒介物组中的33％(8/24)。报告AE的大多数患者(93.5％)经历了无关的AE(87.6％)；极微相关的AE占AE的少于5％(7/153)，且可能相关的AE、很可能相关的和相关的AE占AE的少于10％。不存在导致提早停止治疗的AE。

在任一研究组中对于≥5％的患者报告的最常见的局部AE在SOC‘损伤、中毒和手术并发症’(伤口并发症和伤口裂开)以及‘感染和侵扰’(蜂窝组织炎和伤口感染)之下。在整个研究群体中，在任一研究组中，对于≥5％的受试者报告了在SOC‘全身性病症和施用部位状况’(发热)、‘血液和淋巴系统病症’(贫血)、‘胃肠道病症’(便秘和恶心)、‘皮肤和皮下组织病症’(瘙痒症)和‘代谢和营养障碍’(低钾血症)之中的常见AE。

实验室指标(血液化学、血液学和凝血因子)、生命体征(血压、脉搏率和温度)、身体检查和伴随药物使用的评价未揭示EscharEx凝胶组和凝胶媒介物组之间的任何明显差异。不存在连贯性或累积性的变化。大多数实验室异常现象存在于在研究之前。

在治疗就诊期间，研究治疗组之间的疼痛评分几乎相同，敷用前和敷用后的变化极小。在治疗周期期间，存在重度感染的迹象极少(经由针对蜂窝组织炎/骨髓炎的临床征兆来评价)。

因此，EscharEx凝胶疗法是良好耐受的，并且与所评价的身体系统中的明显的病理变化无关或与实验室指标、生命体征、疼痛评估和伴随药物使用的一贯性变化无关。

结论

该研究证实，在难以愈合的伤口的治疗中，5％EscharEx凝胶是有效的酶促去除剂。它针对慢性伤口，特别是针对糖尿病性下肢溃疡和静脉性腿部溃疡提供有效和快速的非手术清创治疗的临床益处。

实施例4

凝胶制剂中的API的效力和安全性-临床研究

在具有难以愈合的伤口的受试者中进行多中心、前瞻性、随机化、具有对照的、评估者不知情的研究，以评价本文以上在实施例1和实施例2中公开的凝胶制剂中的API用于制备具有难以愈合的溃疡的患者中的伤口床的效力和安全性。

该研究包括通过EscharEx凝胶或凝胶媒介物治疗的32名受试者(仅2种病因：静脉性腿部溃疡和糖尿病性下肢溃疡)。总之，以多达8次敷用，20名患者以24±2小时的敷用时间治疗(第一队)，而12名受试者以48±2小时的敷用时间治疗(第二队)。在“治疗周期”完成后，按照标准程序对待患者，并且对其进行每周一次评价(伤口评估)直至完全伤口闭合或持续到自最后一次敷用起多达12周多达12次探访)。如果发生伤口闭合，则在最后一次每周探访2周后确认。该研究的总持续时间是上至19周。

研究群体包括在具有以下病因的难以愈合的伤口上具有>50％坏死/腐肉/纤维蛋白的无活力组织的成人：

1.静脉性腿部溃疡

2.糖尿病性下肢溃疡

在每次敷用EacharEx凝胶或凝胶媒介物后，清洗伤口、对伤口拍照，并且评估伤口尺寸、无活力组织的去除和肉芽组织的变化(通过数字平面几何软件)、伤口状态和安全性参数。在每次清创治疗之后，将伤口敷上完全润湿的盐水纱布。

在使用前，将2克无菌粉末混合在40克无菌凝胶媒介物(1:20的比例)中≤15分钟，以获得EscharEx凝胶。

在将粉末与凝胶媒介物混合后，每克所制备的EscharEx凝胶含有0.05g粉末。

每次分配，按照随机化设计，每200cm²的伤口表面，每次敷用将混合在40克凝胶媒介物中的2gr粉末(EscharEx凝胶)或仅40g凝胶媒介物单独地敷用于伤口表面，持续24±1小时和48±2小时(2个治疗组)，并敷用多达10次或直至实现完全清创，以先发生者为准。

入选标准如下:

1.年龄在18岁和90岁之间的男性或女性患者；

2.具有静脉性腿部溃疡或糖尿病性(下肢)溃疡或创伤伤口/术后伤口的患者(通过病史和身体检查确定)；

3.伤口持续至少4周未愈合；

4.坏死/腐肉/纤维蛋白的无活力组织区域是伤口面积的至少50％(通过临床评价来评估)；

5.伤口表面积(长度X宽度)在5cm²-200cm²的范围内；

主要终点是在清创周期(多达10次治疗)结束时完全清创(无活力组织去除)的发生率。

次要终点包括：

1.实现完全清创的时间(多达10次治疗)(存活分析)；

2.实现完全清创的敷用次数；

3.实现>75％清创的时间(多达10次治疗)；

4.>75％清创的发生率(多达10次治疗)；

5.评估在治疗周期期间伤口清创状态的变化：无活力组织的减少百分比(在10次治疗期间的每一天)；

6.得到为愈合和闭合准备的伤口床(可以成功地自体移植的床)的时间；

7.实现完全肉芽化的时间和实现>75％肉芽化的时间(多达12周)；

8.完全肉芽化的发生率和>75％肉芽化的发生率(在第12周)；

9.肉芽组织随时间的变化百分比(在基线-12周期间的每一周)；

10.完全伤口闭合的发生率(多达12周)；

11.完成伤口闭合的时间(多达12周)；

12.伤口面积减少：伤口尺寸随时间变化的缩小百分比(从基线直至12周的每一周)；

13.如通过腿部溃疡测量工具(LUMT)评估的伤口状况(伤口愈合状态)的变化(清创结束和伤口闭合随访结束)；

14.如通过SF-36评估的生活质量的变化(伤口闭合随访结束和伤口闭合随访期后3个月)；

15.伤口的复发率(伤口闭合后3个月)；

16.伤口复发的时间(闭合后3个月期间)。

评价安全性结果测量。这样的测量包括：全身不良事件和局部不良事件的严重程度和发生率、生命体征、疼痛评估(使用VAS)、感染迹象、临床实验室指标(血液化学、血液学、凝结)、身体检查和失血来评价。

本领域技术人员将理解本发明不限于本文以上已经被具体展示和描述的内容。而是，本发明的范围由随后的权利要求书来限定。

Claims (38)

1.一种清创组合物，所述清创组合物包含：

(a)从菠萝蛋白酶获得的包含茎菠萝蛋白酶(EC 3.4.22.32)和ananain(EC3.4.22.31)的蛋白水解酶混合物，所述蛋白水解酶混合物呈干燥形式或冻干形式；

(b)pH调节剂；和

(c)载体，所述载体包含：

(i)丙烯酸的交联聚合物；

(ii)极性共溶剂；和

(iii)水；

其中，在使用前，所述蛋白水解酶混合物(a)与所述pH调节剂(b)和所述载体(c)混合以形成凝胶形式的清创组合物，所述清创组合物的特征在于具有约10,000厘泊(cP)至约45,000cP范围内的粘度和范围从约6.0至约8.0的pH，并且其中所述蛋白水解酶混合物以范围从所述载体的总重量的约1％(w/w)至约7％(w/w)的量存在于所述清创组合物中。

2.根据权利要求1所述的清创组合物，其中所述蛋白水解酶混合物以范围从所述载体的总重量的约1％(w/w)至约5％(w/w)的量存在于所述清创组合物中。

3.根据权利要求1所述的清创组合物，其中所述蛋白水解酶混合物以所述载体的总重量的2.5％(w/w)的量存在于所述清创组合物中。

4.根据权利要求3所述的清创组合物，其中所述蛋白水解酶混合物以所述载体的总重量的5％(w/w)的量存在于所述清创组合物中。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的清创组合物，其中所述pH调节剂选自由磷酸钠、碳酸钠和碳酸钾组成的组。

6.根据权利要求5所述的清创组合物，其中所述pH调节剂是磷酸钠。

7.根据权利要求6所述的清创组合物，其中所述磷酸钠是无水磷酸氢二钠。

8.根据权利要求1所述的清创组合物，其中所述丙烯酸的交联聚合物是卡波姆。

9.根据权利要求8所述的清创组合物，其中所述卡波姆是丙烯酸与烯丙基蔗糖或烯丙基季戊四醇交联的聚合物。

10.根据权利要求9所述的清创组合物，其中所述卡波姆是980NF。

11.根据权利要求10所述的清创组合物，其中980NF以范围从所述载体的总重量的约0.5％(w/w)至1.5％(w/w)的量存在。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的清创组合物，其中所述极性共溶剂选自由以下组成的组：甘油、聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚甘油、丙二醇、乙醇、异丙醇及其组合。

13.根据权利要求12所述的清创组合物，其中所述极性共溶剂是甘油。

14.根据权利要求13所述的清创组合物，其中甘油以范围从所述载体的总重量的约2％(w/w)至约15％(w/w)的量存在。

15.根据权利要求14所述的清创组合物，其中甘油以所述载体的总重量的约10％(w/w)的量存在。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的清创组合物，其中所述清创组合物的粘度范围为从约10,000cP至约30,000cP。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的清创组合物，其中所述清创组合物的粘度范围为从约15,000cP至约25,000cP。

18.根据权利要求1至18中任一项所述的清创组合物，其中所述清创组合物的pH范围为从约6.0至约7.0。

19.根据权利要求1至18中任一项所述的清创组合物，所述清创组合物包含：

(a)从菠萝蛋白酶获得的包含茎菠萝蛋白酶(EC 3.4.22.32)和ananain(EC3.4.22.31)的蛋白水解酶混合物，所述蛋白水解酶混合物以范围从所述载体的总重量的约1％w/w至约7％w/w的量存在；

(b)pH调节剂；和

(c)载体，所述载体包含：

(i)丙烯酸与烯丙基蔗糖或烯丙基季戊四醇交联的聚合物；

(ii)甘油；和

(iii)水。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的清创组合物，所述清创组合物包含：

(a)从菠萝蛋白酶获得的包含茎菠萝蛋白酶(EC 3.4.22.32)和ananain(EC3.4.22.31)的蛋白水解酶混合物，所述蛋白水解酶混合物以范围从所述载体的总重量的约1％w/w至约7％w/w的量存在；

(b)pH调节剂；和

(c)载体，所述载体包含：

(i)范围从所述载体的总重量的约0.5％至约1.5％(w/w)的量的980NF；

(ii)甘油；和

(iii)水。

21.根据权利要求1至20所述的清创组合物，所述清创组合物包含：

(a)从菠萝蛋白酶获得的包含茎菠萝蛋白酶(EC 3.4.22.32)和ananain(EC3.4.22.31)的蛋白水解酶混合物，所述蛋白水解酶混合物以范围从所述载体的总重量的约1％(w/w)至约7％(w/w)的量，优选地以范围从所述载体的总重量的约1％(w/w)至约5％(w/w)的量存在于第一容器中；

(b)存在于第二容器中的载体，所述载体包含：

(i)所述载体的总重量的约0.9％(w/w)的量的980NF；

(ii)所述载体的总重量的约10％(w/w)的量的甘油；

(iii)以所述载体的总重量的约0.25％(w/w)的量存在的无水磷酸氢二钠；和

(iv)水，

其中，所述组合物的粘度范围为从约15,000cP至约25,000cP，并且pH范围为从约6.0至约7.0。

22.一种用于伤口清创的方法，所述方法包括对需要这样的治疗的受试者的伤口部位敷用治疗有效量的根据权利要求1至21中任一项所述的清创组合物的步骤。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述清创组合物包含：

(a)从菠萝蛋白酶获得的包含茎菠萝蛋白酶(EC 3.4.22.32)和ananain(EC3.4.22.31)的蛋白水解酶混合物，所述蛋白水解酶混合物以范围从所述载体的总重量的约1％(w/w)至约7％(w/w)的量，优选地以范围从所述载体的总重量的约1％(w/w)至约5％(w/w)的量存在于容器的第一隔室中；

(b)存在于第二容器中的载体，所述载体包含：

(i)所述载体的总重量的约0.9％(w/w)的量的980NF；

(ii)所述载体的总重量的约10％(w/w)的量的甘油；

(iii)以所述载体的总重量的约0.25％(w/w)的量存在的无水磷酸氢二钠；和

(iv)水，

其中，所述组合物的粘度范围为从约15,000cP至约25,000cP，并且pH范围为从约6.0至约7.0。

24.根据权利要求22和23中任一项所述的方法，其中所述伤口是慢性伤口或难以愈合的伤口。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述慢性伤口选自由糖尿病性溃疡、静脉瘀滞性溃疡、动脉功能不全性溃疡、压迫性溃疡、术后伤口和创伤后伤口组成的组。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述慢性伤口选自由糖尿病性下肢溃疡、静脉性腿部溃疡、术后伤口和创伤后伤口组成的组。

27.根据权利要求22至26中任一项所述的方法，其中敷用所述清创组合物以至少一次敷用的方案进行，其中每次敷用，所述清创组合物与所述伤口部位保持接触持续约4小时。

28.根据权利要求27所述的方法，其中敷用所述清创组合物以至少10次敷用的方案进行或直至伤口被清创，其中每次敷用，所述清创组合物与所述伤口部位保持接触持续约4小时。

29.根据权利要求28所述的方法，其中持续连续10天每天进行敷用所述清创组合物，其中每次敷用，所述清创组合物与所述伤口部位保持接触持续约4小时。

30.根据权利要求22至26中任一项所述的方法，其中敷用所述清创组合物以至少一次敷用的方案进行，并且其中每次敷用，所述清创组合物与所述伤口部位保持接触持续约24小时。

31.根据权利要求30所述的方法，其中敷用所述清创组合物以至少10次敷用的方案进行或直至伤口被清创，并且其中每次敷用，所述清创组合物与所述伤口部位保持接触持续约24小时。

32.根据权利要求31所述的方法，其中持续连续10天每天进行敷用所述清创组合物，并且其中每次敷用，所述清创组合物与所述伤口部位保持接触持续约24小时。

33.根据权利要求22至26中任一项所述的方法，其中敷用所述清创组合物以至少一次敷用的方案进行，其中每次敷用，所述清创组合物与所述伤口部位保持接触持续约48小时。

34.根据权利要求33所述的方法，其中敷用所述清创组合物以至少10次敷用的方案进行或直至伤口被清创，其中每次敷用，所述清创组合物与所述伤口部位保持接触持续约48小时。

35.根据权利要求22至26中任一项所述的方法，其中敷用所述清创组合物以每周三次持续至少一周来进行，并且其中所述清创组合物与所述伤口部位保持接触持续选自由每次敷用48小时和每次敷用72小时组成的组的持续时间。

36.根据权利要求22至26中任一项所述的方法，其中敷用所述清创组合物以至少一次敷用的方案进行，其中每次敷用，所述清创组合物与所述伤口部位保持接触持续约72小时。

37.根据权利要求36所述的方法，其中敷用所述清创组合物以至少10次敷用的方案进行或直至伤口被清创，其中每次敷用，所述清创组合物与所述伤口部位保持接触持续约72小时。

38.根据权利要求27至37中任一项所述的方法，其中所述方案被重复一次、两次或更多次，直至伤口被完全清创和/或获得伤口闭合。