CN103621560A

CN103621560A - 一种多粘类芽孢杆菌与苯醚甲环唑的复配杀菌剂及其应用

Info

Publication number: CN103621560A
Application number: CN201310614632.2A
Authority: CN
Inventors: 程东美; 向梅梅; 张云霞; 施祖荣
Original assignee: Zhongkai University of Agriculture and Engineering
Current assignee: Zhongkai University of Agriculture and Engineering
Priority date: 2013-11-28
Filing date: 2013-11-28
Publication date: 2014-03-12

Abstract

本发明提供一种复配杀菌剂，包括主剂和辅剂，所述的主剂包括苯醚甲环唑和多粘类芽孢杆菌，所述的苯醚甲环唑占复配杀菌剂的总重量的1~80%，多粘类芽孢杆菌为的加入量为1*10⁶-1*10⁸cfu每毫克复配杀菌剂。本发明采用的生防细菌与化学杀菌剂混合物能够提高微生物杀菌剂的速效性和减少农药残留，适应可持续发展的要求，适应当前农业生产的需求，对环境无污染、无残留，有利于延缓病菌抗药性的产生，尤其是对尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum引起的墨兰、建兰等兰花枯萎病有很好的防治效果。

Description

一种多粘类芽孢杆菌与苯醚甲环唑的复配杀菌剂及其应用

技术领域

本发明涉及一种菌和化合物的复配菌剂，更具体地，涉及一种多粘类芽孢杆菌与苯醚甲环唑的复配杀菌剂及其应用。

背景技术

类芽孢杆菌属（Paenibacillus ）是由Ash 等于1993 年建立的新属，包括11 个原属芽孢杆菌属的种，其模式种为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa )。研究表明，多粘类芽孢杆菌可以产生肽类、蛋白质类、核苷类等多种有抗菌作用的代谢产物，对多种植物病害具有防治作用。Kavitha 等（2005）从多粘类芽孢杆菌VLB16 发酵液中分离到一种分子量为37KDa 且耐高温的蛋白质，该蛋白能抑制稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae ）、稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani ）菌丝生长。孙长坡研究发现，P. polymyma Cp_S316 对包括黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum）在内的8 种病原真菌和4 种病原细菌都具有强烈的拮抗作用。Khan 等报道了P. polymyma 还可以通过固氮和溶磷作用为宿主植物提供营养成分，促进植株生长，提高植物的抗病性等。可见，多粘类芽孢杆菌（P.polymyma ）抗菌谱广，有效代谢产物多样，具有开发成为生物农药的潜力。

苯醚甲环唑（difenoconazole，恶醚唑）是三唑类杀菌剂中安全性比较高的杀菌剂，具有保护、治疗和一定的内吸活性，是甾醇脱甲基化抑制剂，抑制细胞壁甾醇的生物合成，阻止真菌的生长。对子囊菌、担子菌和包括链格孢属、壳二孢属、尾孢霉属、刺盘孢属、球痤菌属、茎点霉属、柱隔孢属、壳针孢属、黑星菌属在内的半知病，白粉菌科、锈菌目及某些种传病原菌有持久的保护和治疗作用。广泛应用于果树、蔬菜等作物，有效防治多种真菌引起的病害。

目前尚未发现有相关的多粘类芽孢杆菌（P.polymyma ）与苯醚甲环唑的复配杀菌剂。

发明内容

本发明先提供一种复配杀菌剂，包括主剂和辅剂，所述的主剂包括苯醚甲环唑和多粘类芽孢杆菌，所述的苯醚甲环唑占复配杀菌剂的总重量的1~80%，多粘类芽孢杆菌为的加入量为1*10⁶-1*10⁸cfu每毫克复配杀菌剂。

技术方案优选为，所述的苯醚甲环唑占复配杀菌剂的总重量的1~50%，多粘类芽孢杆菌为的加入量为1*10⁷-1*10⁸cfu每毫克复配杀菌剂.

进一步优选为，所述的苯醚甲环唑占复配杀菌剂的总重量的3~20%，多粘类芽孢杆菌为的加入量为1*10⁷-5*10⁷cfu每毫克复配杀菌剂.

当所述的复配杀菌剂为可湿性粉剂时，所述的辅剂为，按复配杀菌剂总重量的质量百分比计，

3-35%的湿润剂，所述的湿润剂为天然产物湿润剂和阴离子型湿润剂，可用茶枯、皂粉、无患子粉、蚕沙、月桂醇基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、洗衣粉、拉开粉中的一种或多种；

4-30%的分散剂，所述的分散剂为萘或烷基甲醛综合物及其盐、脂肪醇环氧乙烷加成物磺酸盐、烷基酚聚氧乙烯基醚磺酸盐、木质素及其衍生物磺酸盐、脂肪酸乙烷加成磷酸盐、烷基酚取氧乙烯基磷酸盐、羧甲基纤维素、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇中的一种或几种；

10-70%的填料，所述的填料为葡萄糖、乳糖、麦芽糖、硅胶、硅酸、高岭土、白炭黑、白云石、硅藻土、氧化镁、硫酸铵、磷化铵、硝酸铵、尿素、面粉、树皮粉、坚果壳粉、纤维素粉中的一种或多种。

0.5-15%的稳定剂，所述的稳定剂为丁基缩水甘油醚、甲苯基缩水甘油醚、聚乙烯基乙二醇二缩水甘油醚、山梨醇钠中的一种或多种，

以上的主剂和辅剂的重量的加和为100%。

当所述的复配杀菌剂为颗粒剂时，所述的辅剂为，按复配杀菌剂总重量的质量百分比计，

5-95％的载体，所述的载体为粘土、高岭土、云母、滑石、膨润土、酸性白土、硅砂、白炭黑、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、硅胶、硅酸、白炭黑、白云石、硅藻土、氯化镁、硫酸铵、硝酸铵、尿素、面粉、树皮粉、坚果壳粉、纤维素粉中的一种或多种，

0 .2-5％的湿润分散剂，所述的湿润分散剂为月桂醇在硫酸钠、萘或烷基甲醛综合物及其盐、木质素及其衍生物磺酸盐、烷基酚取氧乙烯基磷酸盐中的一种或多种，

0 .1-5％的粘结剂，所述的粘结剂为淀粉、糊精、阿拉伯树胶、明胶、硅酸钠、石膏、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、松香、石蜡中的一种或几种，

按质量计0 .5-3％崩解剂，助崩解剂为硫胺、氯化钙、食盐、氯化镁中的一种或多种，

以上的主剂和辅剂的重量的加和为100%。

当所述的复配杀菌剂为水分散粒剂时，所述的辅剂为，按复配杀菌剂总重量的质量百分比计，

2-20%的湿润剂，所述的湿润剂为皂素、亚硫酸纸浆废液、烷基硫酸盐、烷基苯磺酸碱金属盐和胺盐、二烷基丁二酸磺酸钠盐、脂肪醇、脂肪酰胺N-甲基牛磺酸钠盐、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠、烷基酚聚氧乙烯醚硫酸盐、烷基萘磺酸钠、脂肪酸或脂肪酸酯硫酸盐、木质素磺酸钠、石油磺酸钠、烷基联苯醚磺酸钠、萘酚磺酸甲醛缩合物钠盐、脂肪酸聚氧乙烯酯磺酸钠和铵盐、烷基酚聚氧乙烯醚、脂肪醇聚氧乙烯中的一种或多种，

1-15%分散剂，所述的分散剂为甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羧基淀粉钠、丙烯酸接枝淀粉、阳离子淀粉、羟乙基纤维素、丙烯共聚物、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚氧乙烯-聚氧丙烯、聚乙烯醇、木质素及其衍生物磺酸盐、脂肪酸乙烷加成磷酸盐、烷基酚取氧乙烯基磷酸盐、羧甲基纤维素、顺丁烯二酸共聚物、淀粉、蛋白质、果胶酸钠、藻蛋白酸钠中的一种或多种，

1-10%的粘结剂，所述的粘结剂为淀粉、糊精、阿拉伯树胶、明胶、硅酸钠、石膏、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、松香、石蜡、虫胶、大豆蛋白中的一种或多种，

2-20%的崩解剂，所述的崩解剂为氯化钠、硫酸钠、硝酸钠、硫酸铵、碳酸钠、硫铵、氯化钙、氯化镁、氯化铝、尿素、膨润土、羧甲基淀粉钠、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种，

0.5-15的稳定剂，所述的稳定剂为丁基缩水甘油醚、甲苯基缩水甘油醚、聚乙烯基乙二醇二缩水甘油醚、山梨醇钠、甲苯基缩水甘油醚中的一种或多种，

5-75%的载体，所述的载体为粘土、高岭土、轻质碳酸钙、滑石、膨润土、酸性白土、白炭黑、白炭黑、白云石、硅藻土、氯化镁、硫酸铵、硝酸铵、尿素、面粉、树皮粉、坚果壳粉、纤维素粉中的一种或多种，

以上的主剂和辅剂的重量的加和为100%。

所述的多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyma）菌株为SHL-1，菌株保存号为CCTCC M 2011441，于2011 年12 月2 日在中国典型培养物保藏中心保藏。

更进一步提供一种根上述的复配杀菌剂在制备杀灭微生物的药物中的应用。

另外提供一种上述的复配杀菌剂在制备治疗植物枯萎病的药物中的应用。

所述的微生物为非洲菊白绢病菌（Sclerotium rolfsii ）、大叶伞菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）及蝴蝶兰花梗腐烂病菌（Fusarium fujikuroi）。

所述多粘类芽孢杆菌与苯醚甲环唑的复配剂的加工方法可通过常规方法实施。如加工可湿性粉剂时，可将一定量菌液与充分干燥粉碎的填料混合，然后将苯醚甲环唑、湿润剂、分散剂、稳定剂等充分干燥、冷却，再与菌液与填料的混合物充分混合，气流磨碎，即得产品。

施用方法取决于特定的环境和防治对象，在各种情况下，须保证它们的分散尽可能细致和均匀，药液或颗粒主要施于植物茎基部、茎基部土壤或其他栽培基质。

本发明组合物施用时，根据作物种类、施用时间、气候条件等因素的不同，一般为50—1000 g a.i/ha(有效成分/公顷)，优选为50－200 g a.i/ha，可湿性粉剂、水分散性粒剂采用淋根、浸根、灌根或对植物基部喷淋或喷雾施用，颗粒剂采用撒施方法。

本发明所提供的混剂有如下优点：

（1）本发明采用的多粘类芽孢杆菌是从中国广东省广州市石斛兰感病叶片上分离出来的，为中国本土菌种，能适应本地的自然环境。

（2）多粘类芽孢杆菌与苯醚甲环唑混配后，不仅保持了多粘类芽孢杆菌对镰刀菌引起的枯萎病的优点，而且混用后可降低杀菌剂的用量，提高生防细菌的速效性和减少农药残留，适应可持续发展的要求，对环境无污染、无残留，有利于延缓病菌抗药性产生。

（3）本发明的防治效果优于只用一种药剂的防治效果。经室内抑菌生物测定，多粘类芽孢杆和苯醚甲环唑复配杀菌剂对发酵液对非洲菊白绢病菌（Sclerotium rolfsii）、大叶伞菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum ）及蝴蝶兰花梗腐烂病菌（Fusarium fujikuroi ）都有很好的抑菌效果。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备和方法为本技术领域常规市购的试剂、设备和常规使用的方法，稳定剂、助剂和填料可参照本领域常规使用。

以下百分比均为质量百分比，多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyma）菌株为SHL-1，菌株保存号为CCTCC M 2011441，于2011 年12 月2 日在中国典型培养物保藏中心保藏。

实施例1：5%苯醚甲环唑＋2.5＊10⁷cfu/ml多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂的配制，各组分配比是：

95％苯醚甲环唑原药为质量比5.26%，

多粘类芽孢杆菌菌体浓度为10*10⁷cfu/ml菌液25％，

湿润剂：十二烷基苯磺酸钠为5％质量比，

分散剂：木质素磺酸钠为5％质量比，

填料：硅藻土为59.74％。

将多粘类芽孢杆菌发酵菌液与一定量粉碎的硅藻土混合，混合物及苯醚甲环唑原药、十二烷基苯磺酸钠、木质素磺酸钠等充分干燥、冷却、混合、气流粉碎磨细即可产品。

实施例2：3%苯醚甲环唑＋2＊10⁷cfu/ml多粘类芽孢杆菌颗粒剂的配制，各组分配比是：

95％苯醚甲环唑原药为质量比3.16%，

多粘类芽孢杆菌菌体浓度为10*10⁷cfu/ml菌粉20％，

湿润分散剂：十二烷基苯磺酸钠为1％质量比，

粘结剂：聚醋酸乙烯酯为1％质量比，

助崩解剂：尿素为2％质量比，

吸附剂：白炭黑2％质量比，

稳定剂：丁基缩水甘油醚为7％质量比，

载体：活性白土为 63.84%。

将原药、菌液、十二烷基苯磺酸钠、聚醋酸乙烯酯、尿素、白炭黑、丁基缩水甘油醚、活性白土充分混合，超细粉碎、造粒，干燥，筛分，分级即得产品。

实施例3：8%苯醚甲环唑＋1＊10⁷cfu/ml多粘类芽孢杆菌水分散粒剂的配制，各组分配比是：

95％苯醚甲环唑原药为质量比8.42%，

多粘类芽孢杆菌菌体浓度为10*10⁷cfu/ml菌粉10％，

湿润剂：木质素磺酸钠为8％质量比，

粘结剂：聚醋酸乙烯酯为9％质量比，

助崩解剂：尿素为15％质量比，

稳定剂：丁基缩水甘油醚为4％质量比，

载体：活性白土为 45.58%。

将各组分进行上超细粉碎后造粒、干燥、筛分，分级即得产品。

实施例4：10%苯醚甲环唑＋4＊10⁷cfu/ml多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂的配制，各组分配比是：

95％苯醚甲环唑原药为质量比10.52%，

多粘类芽孢杆菌菌体浓度为10*10⁷cfu/ml菌液40％，

湿润剂：十二烷基苯磺酸钠为3％质量比，

分散剂：木质素磺酸钠为5％质量比，

填料：硅藻土为41.48％。

将硅藻土干燥、粉碎，将多粘类芽孢杆菌发酵菌液与硅藻土充分混合，混合物、苯醚甲环唑原药、十二烷基苯磺酸钠、木质素磺酸钠等充分干燥、冷却、混合、气流粉碎磨细即可产品。

实施例5：10%苯醚甲环唑＋1＊10⁷cfu/ml多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂的配制，各组分配比是：

95％苯醚甲环唑原药为质量比10.52%，

多粘类芽孢杆菌菌体浓度为10*10⁷cfu/ml菌液10％，

湿润剂：十二烷基苯磺酸钠为6％质量比，

分散剂：木质素磺酸钠为7％质量比，

填料：高岭土为66.48％。

将高岭土干燥、粉碎，将多粘类芽孢杆菌发酵菌液与硅藻土充分混合，混合物、苯醚甲环唑原药、十二烷基苯磺酸钠、木质素磺酸钠等充分干燥、冷却、混合、气流粉碎磨细即可产品。

实施例6, 生物活性测定试验

生物活性实施例1：对引起墨兰枯萎病的病菌尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum的室内抑菌作用测定：

1、供试病菌：从广州增城市广州市怡香兰花科技有限公司感病墨兰植株上分离出尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum，在室内以PDA培养基在25度下培养，试验选取培养4－5天，菌落边缘处的菌丝块供试。

2、95％苯醚甲环唑原药，山东东泰农化有限公司；

多粘类芽孢杆菌菌体浓度为1×10⁸cfu/ml菌粉：将Paenibacillus polymyma SHL-1接种至pH7.0的LB液体培养基，于28℃下200 r/min振荡培养48 h，得发酵液，测定菌数，以离心机浓缩，将发酵液浓缩一定体积，然后根据发酵液的含菌数及浓缩倍数计算含菌数10×10⁸cfu/ml，然后加入填料、稳定剂等制成含菌数为1×10⁸cfu/g的菌粉。

3、生物测定方法：

（1）两种单剂的抑制作用测定：

将单剂多粘类芽孢杆菌菌粉（含量为1×10⁸cfu/g菌粉）配置成以下5 浓度梯度药液，分别是:1000、2000、4000、8000、10000μg/ml（对应稀释的倍数分别为1000、500、250、125和100倍），实际含菌量分别为： 1 × 10⁵、2 × 10⁵、4 × 10⁵、8 × 10⁵、1 × 10⁶ cfu/ml。同时将单剂苯醚甲环唑配置成以下5 个质量浓度梯度的药液，分别是: 1、5、10、50、100 μg/ml。抑菌作用采用生长速率法测定，方法是: 将两种单剂分别配成不同质量浓度的PDA 平板，将尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum菌饼( 直径6 mm) 接入含药平板，以加入等量无菌水为空白对照( CK) ，每个处理3 次重复。将尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum菌饼( 直径6 mm) 接入上述5个浓度梯度的药液中，浸5s后取出接于PDA平板上，以无菌水处理为空白对照( CK) ，每个处理3 次重复。待对照组菌落长到平皿边缘时，采用十字交叉法测量各含药平板的菌落直径，按下式计算抑菌率：

抑菌率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径—6mm）100%

将抑菌率换算成抑制机率值( Y) ，根据药剂质量浓度对数( X) 与抑制机率值( Y) ，求得回归方程Y = aX + b，并计算出各药剂的抑制中浓度EC₅₀及其置信区间、相关系数r 值。

（2）混配杀菌剂的抑制作用测定：

根据单剂毒力测定结果，配制两单剂有效中浓度药液。再按A(多粘类芽孢杆菌) ∶ B(苯醚甲环唑) = 10∶0、10∶1、5∶ 1、1∶1、1∶ 5、1∶10、0∶ 10 不同配比进行复配。以等量无菌水为空白对照( CK) 。采用十字交叉法测量各含菌药平板的菌落直径，计算抑菌率、抑制不浓度EC₅₀，采用孙云沛法计算各配比的共毒系数CTC，并确定最佳配比，共毒系数显著大于100时表示增效作用，接近100时表示相加作用，显著小于100时表示拮抗作用。

试验结果见表１.从表中可以看出，多粘类芽孢杆菌与苯醚甲环唑几种比例组合，所得的共毒系数在91.91—197.76范围内，均具有相加或增效作用。其中，在这几种比例中，苯醚甲环唑与多粘类芽孢杆菌菌粉为１：１时增效最大，增效系数为197.76.

表1 苯醚甲环唑（A）与多粘类芽孢杆菌SHL-1（B）不同配比对秋兰枯萎菌(尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum）的毒力及共毒系数测定结果

Figure 2013106146322100002DEST_PATH_IMAGE002

注：A为苯醚甲环唑，B为多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyma）SHL-1。按质量计，A：B=1：1即表示（1g 95% 苯醚甲环唑原粉）：（1g 多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyma）SHL-1含量为1×10⁸cfu/ml菌粉）。

Claims

1. 一种复配杀菌剂，包括主剂和辅剂，其特征在于，所述的主剂包括苯醚甲环唑和多粘类芽孢杆菌，所述的苯醚甲环唑占复配杀菌剂的总重量的1~80%，多粘类芽孢杆菌为的加入量为1*10⁶-1*10⁸cfu每毫克复配杀菌剂。

2. 根据权利要求1所述的复配杀菌剂，其特征在于，所述的苯醚甲环唑占复配杀菌剂的总重量的1~50%，多粘类芽孢杆菌为的加入量为1*10⁷-1*10⁸cfu每毫克复配杀菌剂。

3.根据权利要求2所述的复配杀菌剂，其特征在于，所述的苯醚甲环唑占复配杀菌剂的总重量的3~20%，多粘类芽孢杆菌为的加入量为1*10⁷-5*10⁷cfu每毫克复配杀菌剂。

4.根据权利要求1所述的复配杀菌剂，其特征在于，当所述的复配杀菌剂为可湿性粉剂时，所述的辅剂为，按复配杀菌剂总重量的质量百分比计，

10-70%的填料，所述的填料为葡萄糖、乳糖、麦芽糖、硅胶、硅酸、高岭土、白炭黑、白云石、硅藻土、氧化镁、硫酸铵、磷化铵、硝酸铵、尿素、面粉、树皮粉、坚果壳粉、纤维素粉中的一种或多种；

以上的主剂和辅剂的重量的加和为100%。

5. 据权利要求1所述的复配杀菌剂，其特征在于，当所述的复配杀菌剂为颗粒剂时，所述的辅剂为，按复配杀菌剂总重量的质量百分比计，

以上的主剂和辅剂的重量的加和为100%。

6. 据权利要求1所述的复配杀菌剂，其特征在于，当所述的复配杀菌剂为水分散粒剂时，所述的辅剂为，按复配杀菌剂总重量的质量百分比计，

以上的主剂和辅剂的重量的加和为100%。

7. 据权利要求1所述的复配杀菌剂，其特征在于，所述的多粘类芽孢杆菌的菌株为SHL-1，菌株保存号为CCTCC M 2011441，于2011 年12 月2 日在中国典型培养物保藏中心保藏。

8. 一种根据权利要求1所述的复配杀菌剂在制备杀灭微生物的药物中的应用。

9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的微生物为非洲菊白绢病菌、大叶伞菌核病菌及蝴蝶兰花梗腐烂病菌。

10. 一种根据权利要求1所述的复配杀菌剂在制备治疗植物枯萎病的药物中的应用。