CN103614371A - 一种同时提取血清、双拭子中动物dna病毒和rna病毒核酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同时提取血清、双拭子中动物DNA病毒和RNA病毒核酸的方法，包括步骤：对待提取物使用异硫氰酸胍裂解液裂解；硅胶膜吸附RNA；洗液Ⅰ除去杂蛋白；洗液Ⅱ洗去杂质；DEPC水洗脱核酸；上述异硫氰酸胍裂解液包括3-7M异硫氰酸胍、0.6%-1.0%TriTon-100、30-50mM Tris-Cl、5-15mM DTT、60-90μg/mL蛋白酶K、10-30mM EDTA，PH在4.3-4.6；上述洗液Ⅰ包括5-6M盐酸胍，53-59%无水乙醇，K70-90μg/mL蛋白酶，PH在6.4-6.6；上述洗液Ⅱ包括70-80%乙醇。本发明的优点在于提取过程简单、周期短、成本低、能同时提取动物血清样本、双拭子样本中的RNA病毒和DNA病毒核酸。
Description
技术领域
本发明涉及一种一种同时提取血清、双拭子中动物DNA病毒和RNA病毒核酸的方法，适用于生物技术领域。
背景技术
随着分子生物学的快速发展，基因诊断成为检测动物疫病最准确而有效地手段，进行基因诊断的过程中，病毒核酸的提取是进行检测的前提条件，核酸提取的质量也影响检测的准确性。当前，动物病毒核酸提取方法主要有经典Trizol提取法和以Trizol作为裂解液的硅胶模柱式提取法两种方法。经典Trizol提取法过程繁琐、周期长、提取效率低、技术要求高，以Trizol作为裂解液的硅胶模柱式提取法成本较高、提取RNA的质量不高、且只能提取RNA病毒。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种同时提取血清、双拭子中动物DNA病毒和RNA病毒核酸的方法，提取过程简单、周期短、成本低、能同时提取动物血清样本、双拭子样本中的RNA病毒和DNA病毒核酸。
本发明是通过以下技术方案来实现的。
一种同时提取血清、双拭子中动物DNA病毒和RNA病毒核酸的方法，包括步骤：对待提取物使用异硫氰酸胍裂解液裂解；硅胶膜吸附RNA；洗液Ⅰ除去杂蛋白；洗液Ⅱ洗去杂质；DEPC水洗脱核 酸；上述异硫氰酸胍裂解液包括3-7M异硫氰酸胍、0.6%-1.0%TriTon-100、30-50mM Tris-Cl、5-15mM DTT、60-90μg/mL蛋白酶K、10-30mM EDTA，PH在4.3-4.6；上述洗液Ⅰ包括5-6M盐酸胍，53-59%无水乙醇，K70-90μg/mL蛋白酶，PH在6.4-6.6；上述洗液Ⅱ包括70-80%乙醇。
进一步地，上述异硫氰酸胍裂解液包括5M异硫氰酸胍、0.8%TriTon-100、40mM Tris-Cl、10mM DTT、80μg/mL蛋白酶K、20mM EDTA，pH在4.5。
进一步地，上述洗液Ⅰ包括5.5M盐酸胍，56%无水乙醇，80μg/mL蛋白酶K，PH在6.5。
进一步地，上述洗液Ⅱ包括75%乙醇。
进一步地，上述操作步骤包括：
（1）取一干净离心管，100μL样品加入200μL的异硫氰酸胍裂解液中，振荡混匀，放置5分钟；
（2）加入与异硫氰酸胍裂解液等体积的无水乙醇，即200μL，颠倒反复混匀15秒；
（3）将过滤柱套在2mL收集管上，全部混合液移到过滤柱上，12，000rpm离心1分钟；
（4）弃收集管内的液体，往过滤柱加入600μL的洗液1，12000rpm离心1分钟；
（5）弃收集管内的液体，往过滤柱加入600μL的洗液2，12000rpm离心1分钟；
（6）重复步骤（5）一次；
（7）弃收集管内的液体，过滤柱套在收集管上，12000rpm离心1分钟；
（8）换新的1.5mL离心管套上过滤柱，加20μLDEPC到过滤柱膜上，室温放置1分钟，12，000rpm离心1分钟，收集滤液，保存。
本发明的有益效果：
同时提取动物血清样本、双拭子样本中的RNA病毒和DNA病毒核酸，具有方法简便、快速、成本低的特点。该方法为建立动物RNA病毒和DNA病毒多重PCR方法奠定核酸提取基础。
具体实施方式
下面根据实施例对本发明作进一步详细说明。
实施案例1：
制备使用液剂：
异硫氰酸胍裂解液：成分为5M异硫氰酸胍、0.8%TriTon-100、40mM Tris-Cl、10mM DTT、80μg/mL蛋白酶K、20mM EDTA，pH在4.5。
洗液Ⅰ：成分为5.5M盐酸胍，56%无水乙醇，80μg/mL蛋白酶K，PH在6.5。
洗液Ⅱ：成分为75%乙醇。
实施案例2：
同时提取血清、双拭子中动物DNA病毒和RNA病毒核酸的方 法，包括步骤：
（1）取一干净离心管，100μL样品加入200μL的异硫氰酸胍裂解液中，振荡混匀，放置5分钟；
（2）加入与异硫氰酸胍裂解液等体积的无水乙醇，即200μL，颠倒反复混匀15秒；
（3）将过滤柱套在2mL收集管上，全部混合液移到过滤柱上，12，000rpm离心1分钟；
（4）弃收集管内的液体，往过滤柱加入600μL的洗液1，12000rpm离心1分钟；
（5）弃收集管内的液体，往过滤柱加入600μL的洗液2，12000rpm离心1分钟；
（6）重复步骤（5）一次；
（7）弃收集管内的液体，过滤柱套在收集管上，12000rpm离心1分钟；
（8）换新的1.5mL离心管套上过滤柱，加20μLDEPC到过滤柱膜上，室温放置1分钟，12，000rpm离心1分钟，收集滤液，保存。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (5)
1.一种同时提取血清、双拭子中动物DNA病毒和RNA病毒核酸的方法，其特征在于，包括步骤：对待提取物使用异硫氰酸胍裂解液裂解；硅胶膜吸附RNA；洗液Ⅰ除去杂蛋白；洗液Ⅱ洗去杂质；DEPC水洗脱核酸；所述异硫氰酸胍裂解液包括3-7M异硫氰酸胍、0.6%-1.0%TriTon-100、30-50mM Tris-Cl、5-15mM DTT、60-90μg/mL蛋白酶K、10-30mM EDTA，PH在4.3-4.6；所述洗液Ⅰ包括5-6M盐酸胍，53-59%无水乙醇，K70-90μg/mL蛋白酶，PH在6.4-6.6；所述洗液Ⅱ包括70-80%乙醇。
2.根据权利要求1所述的同时提取血清、双拭子中动物DNA病毒和RNA病毒核酸的方法，其特征在于，所述异硫氰酸胍裂解液包括5M异硫氰酸胍、0.8%TriTon-100、40mM Tris-Cl、10mM DTT、80μg/mL蛋白酶K、20mM EDTA，pH在4.5。
3.根据权利要求1所述的同时提取血清、双拭子中动物DNA病毒和RNA病毒核酸的方法，其特征在于，所述洗液Ⅰ包括5.5M盐酸胍，56%无水乙醇，80μg/mL蛋白酶K，PH在6.5。
4.根据权利要求1所述的同时提取血清、双拭子中动物DNA病毒和RNA病毒核酸的方法，其特征在于，所述洗液Ⅱ包括75%乙醇。
5.根据权利要求1-4所述的同时提取血清、双拭子中动物DNA病毒和RNA病毒核酸的方法，其特征在于，所述操作步骤包括：
（1）取一干净离心管，100μL样品加入200μL的异硫氰酸胍裂解液中，振荡混匀，放置5分钟；
（2）加入与异硫氰酸胍裂解液等体积的无水乙醇，即200μL，颠倒反复混匀15秒；
（3）将过滤柱套在2mL收集管上，全部混合液移到过滤柱上，12，000rpm离心1分钟；
（4）弃收集管内的液体，往过滤柱加入600μL的洗液1，12000rpm离心1分钟；
（5）弃收集管内的液体，往过滤柱加入600μL的洗液2，12000rpm离心1分钟；
（6）重复步骤（5）一次；
（7）弃收集管内的液体，过滤柱套在收集管上，12000rpm离心1分钟；
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