JP5876481B2 - 超高速核酸精製方法 - Google Patents

Description

本発明は、超高速核酸精製方法に関し、より詳細には、シリカ膜（ｓｉｌｉｃａ ｍｅｍｂｒａｎｅ）、カオトロピック塩、及びサルコシネート（ｓａｒｃｏｓｉｎａｔｅ）を含有する緩衝液を用いた超高速核酸精製方法に関する。

核酸を含有した試料から核酸を精製するためには、物理的及び／又は化学的な精製過程を経る必要がある。通常、核酸を精製するための過程において、大きい粒子を有する固形成分を溶液上で除去する段階が必要な場合が多い。

特に、生体試料を溶解して核酸を得るためには、細胞に含有された各種タンパク質性物を含む不純物などを除去する必要があるが、一般的に使用される方法は遠心分離による沈殿法を用いて除去するか、フィルタで濾過して除去する方法が挙げられる。前者の方法は実験室で一般的に使用しているが、多量の試料を処理するには適しておらず、自動化することが難しい。一方、後者の方法は、減圧又は加圧装置が取り付けられた自動化機器に適用して多量の試料を連続して処理するために好適である。

形質転換された大腸菌又は細菌細胞からプラスミドのみを抽出する過程において、染色体ＤＮＡを分離する必要があるが、これは遺伝子増幅、塩基配列分析、遺伝子組み換え過程などにおいて、染色体ＤＮＡによって所望しない反応が行われることを防止するためである。

組織試料から核酸を分離する方法は、２つの段階に大別される。第一の過程は、組織細胞を溶解して全ての核酸を含む全ての細胞構成物を溶出させる過程である。この細胞の溶解過程は物理的あるいは化学的な方法によって行われることができる。しかし、核酸の分離のために核酸の損傷を最小化し、組織細胞を効果的に溶解するために化学的な方法が広く使用されており、特に、ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ；ＳＤＳ）のような陰イオン性界面活性剤が主に用いられる。

第二の過程は、細胞溶解液から不純物を除去して純粋な核酸を分離する過程である。このような核酸を抽出する方法は、主にフェノール−クロロホルムのような有機溶媒の処理、塩析、カオトロピック塩などを使用する。

前記二つの過程を経て組織細胞から核酸を分離する方法が広く使用されているため、従来の核酸分離方法は組織細胞から核酸を容易に溶出するために界面活性剤を含有した細胞溶解液を第一の核酸抽出用緩衝液に使用する。核酸分離過程で二番目に重要な緩衝液は、カオトロピック塩のような高濃度の塩が含有された緩衝液を使用するものである。このような高濃度の塩を含有する緩衝液は塩析を介して核酸から不純物を除去するために非常に重要な役目をする。

高純度の核酸を分離するために、前記二つの形態の緩衝液は段階的に組織細胞に適用され、細胞溶解及び塩析による不純物除去に使用される。特に、ドデシル硫酸ナトリウムを含有する細胞溶解液で溶解された細胞溶解液は、高濃度の塩を含有する緩衝液と混合された後、塩析により不純物が容易に沈殿されるようにする。これは、高純度の核酸分離において非常に重要なものであり、従来の核酸分離方法において効果的な細胞溶解のための細胞溶解緩衝液に最も広く使用される。

最近は知られた核酸分離技術はシリカ膜（ｓｉｌｉｃａ ｍｅｍｂｒａｎｅ）又はイオン交換クロマトグラフィー法を用いて細胞溶解液（ｌｙｓａｔｅ）から核酸を分離するために使用する。特に、現在最も広く使用されている方法はシリカ膜に核酸を結合して他の不純物から核酸を分離し、結合された核酸を洗浄（ｗａｓｈｉｎｇ）及び溶出（ｅｌｕｔｉｏｎ）により得る方法［Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｉｓｏｌａｔｉｎｇ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ（特許文献１）］である。

しかし、この方法はシリカ膜に核酸を結合して不純物から分離することはできるが、核酸を分離するほとんどの段階において遠心分離段階が必須であり、そのため核酸分離過程が複雑になり、実験室レベルでしか実行できないという欠点がある。

それだけでなく、従来の一般的な前記二つの形態の緩衝液は混合するとすぐ結晶化されるため混合した形態で使用されることができず、これを用いて溶解された細胞溶解液はシリカ膜に適用されることができず、超高速の核酸抽出溶液として使用するには非常に不適である。

一方、イオン交換クロマトグラフィー法を用いて核酸を分離する技術は、陽イオン交換樹脂に陰電荷を帯びる核酸を結合させ、不純物から核酸を分離する技術であって、遠心分離を利用した核酸分離を行う必要があり、熟練した技術が必要で且つ複雑な段階を有するため、ポイントオブケア検査のための核酸分離に不適である。

また、核酸を含有する試料からカルボキシル基が結合された磁性粒子（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅ）に核酸を結合した後、不純物から核酸を分離する方法の場合、多量の試料を使用する必要があり、磁性粒子を使用する複雑な分離段階と、遠心分離又は磁石を用いて核酸が結合された磁性粒子を分離するなどの複雑な核酸分離段階を有するため、ポイントオブケア検査（Ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−Ｃａｒｅ Ｔｅｓｔｉｎｇ；ＰＯＣＴ）のための核酸分離に不適である。

米国特許第５，２３４，８０９号明細書

本発明者らは、核酸を含有する生体試料から核酸を効率的に分離するために鋭意研究した結果、カオトロピック塩及びサルコシネート（ｓａｒｃｏｓｉｎａｔｅ）を含有する緩衝液が細胞溶解及び溶出された核酸に対するシリカ膜に吸着力を向上させ、血液及び組織試料内の高純度の核酸を高速かつ簡単に分離することができることを見出して、本発明を完成した。

本発明の目的は、従来の核酸分離方法より少量の試料から特殊の装備を使用せずに、高速かつ簡単に核酸を分離して核酸分離過程を単純化することで、ポイントオブケア検査のような迅速な診断を下すための超高速の核酸分離方法を提供することにある。

前記目的を果たすために、本発明は、ペーパークロマトグラフィー法（ｐａｐｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で高純度の核酸を生物学試料から分離する超高速核酸精製方法を提供する。

本発明による超高速核酸精製方法は、シリカ膜上に試料内の核酸を含有する細胞溶解液を点滴（ｓｐｏｔｔｉｎｇ）した後、点滴された細胞溶解液からシリカ膜上に核酸の吸着、液体移動相緩衝液による汚染物質の分離及び核酸の精製が段階的に行われることを特徴とする。

本発明による超高速核酸精製方法は、３種類の緩衝液システムを順に利用するものであって、より詳細には、シリカ膜をチオシアン酸グアニジン（Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ラウリルサルコシネートナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｌａｕｒｙｌ ｓａｒｃｏｓｉｎａｔｅ）を主成分とする細胞溶解液、チオシアン酸グアニジン（Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）を主成分とする移動相緩衝液及びアルコール成分の核酸洗浄緩衝液に順に浸漬して行うことで高純度の核酸のみを溶出させることを特徴とする。

本発明による超高速核酸精製方法は、前記方法で得られるシリカ膜上に集積した核酸をポリメラーゼ連鎖反応に直接使用することでポイントオブケア検査（Ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−Ｃａｒｅ Ｔｅｓｔｉｎｇ；ＰＯＣＴ）に効率的に利用することができることを特徴とする。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明は、ペーパークロマトグラフィー法（ｐａｐｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で高純度の核酸を生物学試料から分離する超高速核酸精製方法であって、１）生物学試料から分離した核酸をシリカ膜（ｓｉｌｉｃａ ｍｅｍｂｒａｎｅ）に吸着させる段階と、２）前記核酸が吸着されたシリカ膜からペーパークロマトグラフィー法を用いて汚染物質を分離する段階と、３）前記汚染物質が分離されたシリカ膜から緩衝液を用いて高純度の核酸のみを溶出するか、又はシリカ膜に結合された核酸に直接ＰＣＲ、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲから選択される一つ以上を適用する段階と、を含むことを特徴とする超高速核酸精製方法を提供する。

本発明において、前記１）段階は、細胞溶解緩衝液によって溶解された細胞から溶出された核酸をペーパークロマトグラフィー法を用いてシリカ膜に吸着させることを特徴とする。

前記本発明の生物学試料は少量のＮａ−ＥＤＴＡ又はヘパリンで処理された非凝固血液（ｎｏｎ−ｃｏａｇｕｌａｔｉｎｇ ｂｌｏｏｄ）又は組織試料を使用することができ、核酸はシリカ膜に容易に結合するため、不純物が本発明による緩衝液移動相によって特定の装備を利用しなくても核酸から除去される。従って、超高速で高純度の核酸を分離することができる。

本発明において、前記細胞溶解緩衝液は、組織細胞を効果的に溶解（ｌｙｓｉｓ）して破砕された細胞からＤＮＡを溶出するための緩衝液であって、チオシアン酸グアニジン（Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ラウリルサルコシネートナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｌａｕｒｙｌ ｓａｒｃｏｓｉｎａｔｅ）を主成分とし、ＲＮＡを溶出するための緩衝液の場合、抗酸化化学物質、より好ましくは２−メルカプトエタノール（２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）又はジチオトレイトール（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）をさらに含むことができる。

本発明において、前記２）段階は、核酸が吸着されたシリカ膜を移動相緩衝液を用いた溶出により一次展開させて汚染物質を分離するものであり、前記移動相緩衝液はチオシアン酸グアニジン（Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）を主成分とすることを特徴とする。

本発明において、前記２）段階後に行われる３）段階は、２）段階の汚染物質が分離されたシリカ膜を核酸洗浄緩衝液で二次展開させることで細胞溶解緩衝液と、２）段階の移動相緩衝液に含まれた高濃度の塩を除去して高純度の核酸が精製することができる。

より詳細には、高純度の核酸を得るために、組織細胞から効果的に核酸を溶出し、シリカ膜上に核酸を効率的に結合させ、核酸と混合した不純物を効果的に除去し、核酸の純度を高めるために洗浄する段階が必要である。

本発明による精製方法は、シリカ膜を用いたペーパークロマトグラフィー法でシリカ膜に吸着された核酸を高純度の核酸で分離することを特徴とし、前記段階的なペーパー展開は、液体移動相の緩衝液を用いて、シリカ膜上に核酸の吸着、汚染物質の分離、及び核酸の精製を段階的に行うことを特徴とする。

より詳細には、本発明に使用される３つの緩衝液システムを順に用いることで生物学試料から高純度の核酸を段階的に分離することができ、第一の段階で、細胞溶解緩衝液を用いて組織細胞の効果的な溶解及び今後核酸を効率的に溶出させてシリカ膜上に結合させることができる。前記細胞溶解緩衝液はラウリルサルコシネートナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｌａｕｒｙｌ ｓａｒｃｏｓｉｎａｔｅ）を含んでおり、組織細胞を効果的に溶解させ、核酸を容易に溶出し、また、高濃度のチオシアン酸グアニジン（Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）を含んでおり、溶出された核酸をシリカ膜に効果的に結合させる。

第二の段階において、高濃度のチオシアン酸グアニジン（Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）を含有する移動相緩衝液を用いてシリカ膜に結合された核酸から水溶性のタンパク質及びその他の不純物を移動相によるクロマトグラフィー法により効果的に除去すると共に、核酸のシリカ膜に対する結合力を高めることができる。前記移動相緩衝液は高濃度のチオシアン酸グアニジン（Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）を含有する核酸結合緩衝液（Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ）を使用する。

最後に、核酸の純度を高め、脂質成分の不純物を除去するためにエタノール成分の核酸洗浄緩衝液（Ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）を移動相に使用した。

本発明の具体的な実施例で本発明によるペーパークロマトグラフィー法及び従来の遠心分離を用いたスピンカラム（ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎ）方式を用いて血液から核酸を分離した後、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応及びリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を用いて標的遺伝子の増幅能を確認した。

その結果、従来の核酸分離方法より少量の試料から特殊の装備を使用せずに高速かつ簡単に核酸を分離できることが確認できた。

本発明による超高速の核酸の分離方法は、病因の診断や標的遺伝子を検出するために非常に有用な方法であって、複雑で特殊な装備を使用しなければならない従来の核酸分離方法に比べて迅速かつ簡単に病因の分子診断に使用されることができ、特に、ポイントオブケア検査（ＰＯＣＴ）のための最適の核酸分離方法として使用されることができる利点がある。

また、本発明による超高速の核酸の分離方法は、熟練した技術を要求しないため、普通の人が直接病因を分析するために核酸を分離することができ、病院、診療所又は医療センターを訪問してのみ病因検査のための核酸分離が可能であった従来の複雑さを解決することができる利点がある。

本発明の細胞溶解緩衝液にプロティナーゼＫ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ）を添加したか否かによる超高速ＤＮＡ分離方法の比較模式図を示す図面である。 図３で確認された超高速核酸精製方法で分離したＤＮＡから標的ＤＮＡに対するポリメラーゼ連鎖反応分析結果を示す図面である。 本発明による変形された細胞溶解緩衝液を用いて全体核酸が分離されたか否かを電気泳動で確認した結果を示す図面である。 本発明による超高速核酸精製方法で分離した全体核酸から標的ＲＮＡに対する逆転写ポリメラーゼ連鎖反応分析結果を示す図面である。 本発明による超高速核酸精製方法で分離した全体核酸から標的ＲＮＡに対するＲｏｔｏｒ−Ｓｐｉｎ方式のＱｉａｇｅｎ ＲｏｔｏｒＧｅｎｅ Ｑリアルタイム定量ＰＣＲ分析器を用いた分析結果を示す図面である。 本発明による超高速核酸精製方法で分離した全体核酸から標的ＲＮＡに対するサーモブロック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｂｌｏｃｋ）方式のＡＢＩ７９００ＨＴリアルタイム定量ＰＣＲ分析器を用いた分析結果を示す図面である。 本発明による超高速核酸精製方法に対する模式図及び分析方法に対する概略図を示す図面である。

下記実施例を参照して本発明をより具体的に説明する。しかし、下記実施例は本発明を容易に理解するためのものに過ぎず、どのような意味でも本発明の範囲は前記実施例によって限定されるものではない。

ここで使用される技術用語及び科学用語において他の定義がない限り、本発明が属する技術分野において通常の知識を有した者が通常理解している意味を有し、下記の説明及び添付図面で本発明の要旨を不明確にする恐れがある公知機能及び構成に対する説明は省略する。

［実施例１］シリカ膜（ｓｉｌｉｃａ ｍｅｍｂｒａｎｅ）を用いて核酸が分離したか否かを確認
非凝固血液試料から細胞溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ）を用いて核酸を抽出した後、シリカ膜（ｓｉｌｉｃａ ｍｅｍｂｒａｎｅ）に対する核酸の結合及び分離が可能であるか否かを実験した。

核酸分離の材料として少量のＮａ−ＥＤＴＡ又はヘパリンで処理されたヒトの非凝固血液（ｎｏｎ−ｃｏａｇｕｌａｔｉｎｇ ｂｌｏｏｄ）試料を使用した。２５μｌ又は５０μｌの血液試料を下記表１に記載のそれぞれ互いに異なる組成を有した３種類の細胞溶解緩衝液（Ａ、Ｂ、Ｃ）５００μｌに添加して混合し、物理的な力を印加して強く攪拌（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）した。各細胞溶解液に溶解液に対して０．６倍の体積比を有するイソプロパノール（２−ｐｒｏｐａｎｏｌ）を混合した後、シリカ膜（横０．５ｃｍ×縦０．５ｃｍ）を細胞溶解液に浸漬した。

その後、シリカ膜を８０％のエタノールで洗浄してから乾燥し、１００μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で満たされたチューブからシリカ膜に結合された核酸を溶出（ｅｌｕｔｉｏｎ）した。この方法によって分離した核酸が分離されたか否かとその量を確認するために残存した細胞溶解液から従来の遠心分離を用いたスピンカラム（ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎ）方式で核酸を抽出して比較分析し、下記表２に示した。前記分析は、Ｎａｎｏ−Ｄｒｏｐ ＵＶ−Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（分光光度計）を用いて２６０ｎｍの波長で分離したＤＮＡの波長吸収値による定量法で確認して下記表２に示した。

その結果、前記表２から確認できるように、細胞溶解緩衝液から溶出された核酸がシリカ膜に容易に結合し、分離することが確認され、さらに、従来の遠心分離を用いたスピンカラム（ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎ）方式で抽出した核酸より多い量の核酸を抽出することができることが確認できた。

［実施例２］ペーパークロマトグラフィー法を適用した超高速ＤＮＡ分離
（１）超高速ＤＮＡ分離
前記実施例１の実験を通じて、非凝固血液試料から溶出された核酸がシリカ膜（ｓｉｌｉｃａ ｍｅｍｂｒａｎｅ）に容易に結合し、分離することができることを確認した。また、３種類の細胞溶解緩衝液を用いてＤＮＡ成分の核酸を分離する際、クエン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）を含有したか否かに関係なく全ての緩衝液で核酸抽出及びシリカ膜への吸着による溶出が可能であるため、実験した３種類の細胞溶解緩衝液からｐＨ７．０の緩衝液Ａを選択し、前記結果に基づき超高速の核酸分離のためにペーパークロマトグラフィー法を適用して核酸が分離されたか否かを確認し、標的ＤＮＡがＰＣＲ増幅したか否かを実験した。

通常、組織細胞から核酸を分離するために、不純物を除去する過程は非常に重要である。特に、組織細胞の溶解によって生成されたタンパク質成分の不純物を除去することは高純度の核酸を分離するために非常に重要である。従って、多くの核酸分離方法においてタンパク質を効果的に除去するために、核酸分離用緩衝液にタンパク質分解酵素を適用する。タンパク質分解酵素の適用はタンパク質成分の不純物を除去するためには効果的であるが、血液試料のような特定の組織試料では前記酵素を適用せずに高純度の核酸を分離することができる。従って、実施例２で確認した緩衝液Ｂでタンパク質分解酵素であるプロテイナーゼＫ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ）を適用した細胞溶解緩衝液（Ａ−１）と、適用していない細胞溶解緩衝液（Ａ−２）を用いてペーパークロマトグラフィー法を適用した核酸が分離したか否かを実験した。

このために下記表３の組成を有した２５μｌの細胞溶解緩衝液（Ａ−１、Ａ−２）で満たされたチューブに５μｌの非凝固血液試料を添加して混合した後、物理的な力を印加して強く攪拌（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）した。その後、細胞溶解液に溶解液に対して０．６倍の体積比を有するイソプロパノール（ｉｓｏｐｒｏａｎｏｌ）を添加して混合し、細胞溶解液（ｌｙｓａｔｅ）を用意した。

前記細胞溶解液に溶出された核酸をシリカ膜に結合させてペーパークロマトグラフィー法による移動相溶液の展開により不純物を除去させる方法を用いて核酸を分離するために図１に示した方法で核酸分離を実験した。このために前記細胞溶解液をシリカ膜（横０．５ｃｍ×縦１０ｃｍ）の下部から０．５ｃｍの部分を浸漬し、溶出された核酸を結合した。細胞溶解液に浸漬されたシリカ膜の端部を１００μｌの第一の移動相緩衝液である下記表４の組成を有した核酸結合緩衝液（Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）で満たされたチューブに浸漬した後、シリカ膜に結合された核酸はそのまま維持しながら不純物を移動相溶液でペーパークロマトグラフィー法を用いて分離してから除去した。

次に、第二の移動相緩衝液である核酸洗浄緩衝液（ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）４００μｌ（８０％ ｅｔｈａｎｏｌ）で満たされたチューブにシリカ膜の端部を浸漬し、不純物をさらに除去して核酸を洗浄（ｗａｓｈｉｎｇ）した。そして、細胞溶解液に浸漬されたシリカ膜の一部分から直径２ｍｍサイズの断片を打ち抜きにより分離した後、標的ＤＮＡのＰＣＲ検出テストを行い、残りの部分は１００μｌのＤＮＡ溶出緩衝液（ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）であるＴＥ緩衝液に浸漬してＤＮＡを溶出し、Ｎａｎｏ−Ｄｒｏｐ ＵＶ−Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（分光光度計）を用いて分離したＤＮＡを定量して下記表５に示した。

その結果、表５から確認できるように、二つの細胞溶解緩衝液Ａ−１とＡ−２からタンパク質分解酵素であるプロテイナーゼＫ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ）を適用したか否かに関係なく効率的に核酸が抽出されることが確認できた。これは、本発明のペーパークロマトグラフィー法を用いた超高速の核酸分離方法において、タンパク質分解酵素を処理する過程は核酸を分離するために使用される組織試料によって適用されることができることを示す結果でもある。

（２）ＤＮＡからの標的ＤＮＡのＰＣＲ検出
前記実施例２の（１）の方法を用いてシリカ膜に結合された状態で分離したＤＮＡから標的ＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）を通じて検出（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）できるか否かを確認した。

そのためにヒトの染色体ＤＮＡ塩基配列上でβグロビン（ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ）遺伝子部位からデザインされたプライマーセット、それぞれ１０ｐｍｏｌｅｓの順方向プライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）５´−ＧＧＧＡＴＧＡＴＡＧＴＣＴＧＡＣＴＴＴＣＣＴＡＡＣＣＴ−３´と逆方向プライマー（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）５´−ＧＣＣＴＴＣＡＧＴＣＡＴＧＣＣＴＡＧＧＣＣＴＧＣＡ−３´及び１．２５ｕｎｉｔｓのＨｅｌｉｘＡｍｐ（商標） Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、最終濃度２．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．２５ｍＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘを含有する反応緩衝液（Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）を用いてペーパークロマトグラフィー法によって分離したＤＮＡが結合されている部分から直径２ｍｍサイズのシリカ膜をとり、ＰＣＲ検出反応を行った。ＰＣＲ反応は９５℃、２０秒／６８℃１分（３５ｃｙｃｌｅｓ）条件下で５０μｌ反応体積（ｒｅａｃｔｉｏｎ ｖｏｌｕｍｅ）で行われ、ＰＣＲ反応後に１０μｌのＰＣＲ生成物が１％のアガロースゲル（ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ）で電気泳動によって分析された。

図２から確認できるように、ＰＣＲ反応結果、ＤＮＡが結合されているシリカ膜から目的とする５５０ｂｐサイズのβグロビンＤＮＡ部分が検出されることにより、前記実施例２の核酸の精製方法が高純度の核酸を生物学試料から高速かつ簡単に分離してＰＣＲ法を用いた多様な核酸分析に使用することができることが確認できた。

［実施例３］ペーパークロマトグラフィー法を活用して血液試料から全体核酸の分離。
（１）血液試料から全体核酸の分離
病因診断及び分子検出は病因のＤＮＡだけでなくＲＮＡから行われることができる。これはほとんどの分子的診断において非常に重要である。従って、前記実施例２の方法で分離したＤＮＡとＲＮＡを全て含む全体核酸の分離を実験し、分離した全体核酸から標的ＲＮＡに対するＲＴ−ＰＣＲ検出を実験した。通常組織試料から核酸を分離する過程、特に、ＲＮＡを分離する過程において、ＲＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅ）の汚染によるＲＮＡの分解が標的ＲＮＡの検出を困難にし、ポイントオブケア検査においてさらに深刻な問題をもたらす可能性がある。このような核酸分離過程においてＲＮＡ分解酵素の汚染を防止し、効果的にＤＮＡ及びＲＮＡを分離するために、２−メルカプトエタノールとジチオトレイトール（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）のような抗酸化化学物質（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｃｈｅｍｉｃａｌ）が使用されるが、この化学物質はＲＮＡ分解酵素分子内のジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）を切断してＲＮＡ分解能を不活性化させると知られている。

本実施例ではＤＮＡとＲＮＡを含む全体核酸にペーパークロマトグラフィー法を適用して超高速で核酸を分離するために、実施例２の（１）の細胞溶解緩衝液Ａ−２に対して抗酸化化学物質である２−メルカプトエタノールを適用してＤＮＡ及びＲＮＡを含む全体核酸が分離されたか否かを実験した。全体核酸のペーパークロマトグラフィー法による分離を確認するために、下記表６に示した実施例２の（１）で提示された細胞溶解緩衝液Ａ−２（緩衝液Ａ−２）と２−メルカプトエタノールを適用した変形された細胞溶解緩衝液（変形された緩衝液Ａ−２）を用いて、従来の遠心分離を用いたスピンカラム（ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎ）方式の核酸分離方法で血液からＤＮＡ及びＲＮＡ全てが分離されるか否かを確認した。

図３で変形された細胞溶解緩衝液（変形された緩衝液Ａ−２）ではＤＮＡ及びＲＮＡが全て分離された反面、２−メルカプトエタノールを含有しない実施例２での細胞溶解緩衝液（緩衝液Ａ−２）ではＤＮＡのみが分離することが確認できた。

前記の結果に基づき、変形された細胞溶解緩衝液（変形された緩衝液Ａ−２）を使用して前記実施例２の方法を変形して全体核酸を超高速ペーパークロマトグラフィー法を用いて分離した。実施例２の核酸分離過程で細胞溶解液に浸漬したシリカ膜部分は１、２次移動相緩衝液で展開させる過程で一部の不純物が完全に除去されない欠点が確認された。

今回の実験では前記問題点を解消するために、図７に示されたようにシリカ膜（横０．５ｃｍ×縦１０ｃｍ）の端部から１ｃｍ上方の部分に細胞溶解液を点滴し、移動相緩衝液にはシリカ膜の端部から０．５ｃｍ部分のみ濡らして試料が細胞溶解液が点滴された部分の不純物がより効果的に展開されて除去されるようにし、残りの核酸分離過程は実施例２と同様な方法で行った。

前記の結果は、本発明の変形された細胞溶解緩衝液（変形された緩衝液Ａ−２）と前記実施例２の超高速の核酸の分離及び精製方法において、効率的に全体核酸を分離するだけでなく標的ＲＮＡ（Ｔａｒｇｅｔ ＲＮＡ）も確認可能であることを示す結果でもある。

（２）全体核酸からの標的ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ検出
前記実施例３の（１）の方法でシリカ膜に結合された状態で分離した全体核酸から標的ＲＮＡ（ｔａｒｇｅｔ ＲＮＡ）を逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（Ｒｅｖｅｒａｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ）により検出（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）できるか否かを確認した。

このために、ヒトβグロビン（ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ）遺伝子に対する転写体塩基配列（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）からデザインされたプライマーセット、それぞれ１０ｐｍｏｌｅｓの順方向プライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）５´−ＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＧＴＧＧＡＴＧＡＡＧ−３´と逆方向プライマー（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）５´−ＧＧＣＡＧＡＡＴＣＣＡＧＡＴＧＣＴＣＡＡ−３´及び１．２５ｕｎｉｔｓのＨｅｌｉｘＡｍｐ（商標） Ｈｏｔ−Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎａｎｏｈｅｌｉｘ、韓国）と２５ｕｎｉｔｓのＨｅｌｉｘＣｒｉｐｔ（商標） Ｔｈｅｒｍｏ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｎａｎｏｈｅｌｉｘ、韓国）、最終濃度２．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．２５ｍＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘを含有する反応緩衝液（Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）を用いて、５０℃（４０分）、１ｃｙｃｌｅ／９５℃（１５分）、１ｃｙｃｌｅ／９５℃（２０秒）−５５℃（４０秒）−７２℃（１分）、３５ｃｙｃｌｅｓの条件下で、前記実施例３の（１）の方法でシリカ膜に結合された状態で分離した全体核酸部分から直径２ｍｍサイズのシリカ膜をとり、標的ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ検出反応を行った。

図４で確認できるように、ＲＴ−ＰＣＲの結果、全体核酸が結合されているシリカ膜から４００ｂｐサイズのβグロビン（ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ）ＲＮＡ転写体を検出することができ、標的ＲＮＡの検出は、全体細胞溶解液（ｌｙｓａｔｅ）から５μｌのみを点滴（ｓｐｏｔｔｉｎｇ）したシリカ膜でも確認をすることができた。

前記の結果から本発明の超高速の核酸の分離方法は従来の核酸分離方法より少量の試料から特殊な装備を使用せずに高速かつ簡単に核酸を分離することができることが確認できた。

（３）全体核酸のリアルタイムＰＣＲ増幅の確認
最近の分子診断はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）と共にリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ）が標的ＤＮＡ又はＲＮＡの検出に使用される。

本発明ではペーパークロマトグラフィー方法で分離してシリカ膜に結合された核酸からリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応により標的ＲＮＡの検出可能性を実験した。ヒトβグロビン（ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ）遺伝子に対する転写体塩基配列（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）からデザインされたプライマーセット、順方向プライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）５´−ＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＧＴＧＧＡＴＧＡＡＧ−３´と逆方向プライマー（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）５´−ＡＴＴＡＧＣＣＡＣＡＣＣＡＧＣＣＡＣＣＡＣ−３´を用いて、前記実施例３の（１）の方法でシリカ膜に結合された状態で分離した全体核酸部分から直径２ｍｍサイズのシリカ膜をとり、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応に使用した。

リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応は２５ｕｎｉｔｓ ＨｅｌｉｘＣｒｉｐｔ（商標） Ｔｈｅｒｍｏ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ及び１．２５ｕｎｉｔｓ ＨｅｌｉｘＡｍｐ（商標） Ｈｏｔ−Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅと０．２５ｍＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ蛍光試薬を含有する反応緩衝液、そしてβグロビン（ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ）遺伝子の転写体塩基配列からデザインされたそれぞれ１０ｐｍｏｌｅｓのプライマーを用いて５０℃（４０分）、１ｃｙｃｌｅ／９５℃（１５分）、１ｃｙｃｌｅ／９５℃（２０秒）−５５℃（４０秒）−７２℃（１分）、３５ｃｙｃｌｅｓ条件下でリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を行った。

リアルタイム標的ＤＮＡが増幅したか否かはサイバーグリーン（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ）蛍光試薬を用いてロータスピン（Ｒｏｔｏｒ−Ｓｐｉｎ）方式のＱｉａｇｅｎ ＲｏｔｏｒＧｅｎｅ Ｑとサーモブロック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｂｌｏｃｋ）方式のＡＢＩ７９００ＨＴリアルタイム定量ＰＣＲ分析器を用いて分析された。

図５及び図６から確認できるように、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応の結果、全体核酸が結合されているシリカ膜から３５０ｂｐサイズのβグロビン（ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ）ＲＮＡ転写体を検出することができ、２種類のリアルタイム定量ＰＣＲ分析器の両方で本発明による超高速の核酸の分離方法を用いて分離した核酸を用いた分析が可能であることが確認できた。

Claims (3)

1. ペーパークロマトグラフィー法（ｐａｐｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で高純度の核酸を生物学試料から分離する超高速核酸精製方法であって、
   １）生物学試料から界面活性剤、チオシアン酸グアニジン（Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ラウリルサルコシネートナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｌａｕｒｙｌ ｓａｒｃｏｓｉｎａｔｅ）および抗酸化化学物質を主成分とする細胞溶解緩衝液によって溶解された核酸をペーパークロマトグラフィー法を用いてシリカ膜（ｓｉｌｉｃａ ｍｅｍｂｒａｎｅ）に吸着させる段階と、
   ２）前記核酸が吸着されたシリカ膜をチオシアン酸グアニジン及びラウリルサルコシネートナトリウムを含有する移動相緩衝液を移動相として一次展開してペーパークロマトグラフィー法を用いて汚染物質を分離する段階と、
   ３）前記汚染物質が分離されたシリカ膜をエタノール成分を含む核酸洗浄緩衝液を移動相として二次展開して高純度の核酸を得る段階と、
   を含み、
   前記抗酸化化学物質が２−メルカプトエタノールであることを特徴とする超高速核酸精製方法。
2. 前記シリカ膜に吸着された核酸を、シリカ膜を用いた段階的なペーパークロマトグラフィーの展開方法で分離して、高純度の核酸を得ることを特徴とする請求項１に記載の超高速核酸精製方法。
3. 前記段階的なペーパークロマトグラフィーの展開方法において、緩衝液の液体移動相を用いて、シリカ膜上に核酸の吸着、汚染物質の分離、及び核酸の精製が段階的に行われることを特徴とする請求項２に記載の超高速核酸精製方法。

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