KR101717192B1 - 패혈증 진단용 프라이머 세트 및 이의 이용 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 패혈증 원인균 검출 및 패혈증 진단에 사용되는 프라이머 세트, 이를 포함하는 조성물 및 키트에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 패혈증 원인균을 검출 및 패혈증을 진단하는데 상기 프라이머 세트를 이용하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 패혈증 원인균 검출 및 패혈증 진단에 사용되는 프라이머 세트, 이를 포함하는 조성물 및 키트에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 패혈증 원인균을 검출 및 패혈증을 진단하는데 상기 프라이머 세트를 이용하는 방법에 관한 것이다.
병원균의 빠르고 정확한 감지는 적절한 항생제 치료를 통해 환자의 생명을 보호하고, 병원균의 타인으로의 전염을 방지하고, 감염원을 파악하여 제거 및 방지하여 병의 확산을 막는데 필수적이며, 병원에서의 병원균 뿐 아니라 가정이나 산업 현장에서도 병원균을 감지하는 기술이 필요하다.
또한, 병원균 뿐 아니라 식품, 운송, 무역, 국방, 농업 등 세균이 관련된 광범위한 기타 산업 및 사회 분야에서도 세균 감지 기술은 해당 산업 및 사회 시스템을 보호하기 위한 핵심적인 분야이다.
감염병은 크게 세균에 의한 경우와 바이러스에 의한 경우로 나눌 수 있다. 현재 기술적인 수월성으로 인해 바이러스 대상의 분자진단 제품(주로 PCR 기술 활용)은 시장에 많이 출시되어 상용화되고 있는 반면, 세균 진단의 경우 시장에서의 높은 요구, 임상의학적 중요성 및 시장 규모에도 불구하고 기술적 어려움으로 인해 상대적으로 기술 개발 및 상용화 수준이 낮은 실정이다.
따라서, 본 발명에서는 임상 시료에서 추출된 핵산으로부터 패혈증 원인균을 신속하고 정확하게 검출함으로써 패혈증을 진단할 수 있는 분석 기술을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 하나의 목적은 패혈증 진단용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는, 패혈증 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는, 패혈증 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용한, 패혈증 진단을 위한 방법을 제공하는 것이다.
일예로, 본 발명의 하나의 목적은 패혈증 진단용 프라이머 세트를 제공한다.
바람직하게, 상기 프라이머 세트는, 서열번호 1 내지 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함하는, 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis) 균주의 glnA 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 7 내지 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함하는, 클로스트리듐 디피실리(Clostridium difficile) 균주의 tcdA 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 13 내지 서열번호 18의 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함하는, 클로스트리듐 디피실리(Clostridium difficile) 균주의 tcdB 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트; 및 서열번호 19 내지 서열번호 24의 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함하는, 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens) 균주의 cpa 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트를 포함하는, 패혈증 진단용 프라이머 세트일 수 있다.
본 발명의 용어, '프라이머' 란 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로, 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지 NTP(nucleoside triphospate)의 존재 하에 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머 세트는 감염균 검출 및 질환 진단의 민감도와 특이도를 최대화할 수 있도록 세심하게 디자인된 것이다.
또한, 본 발명의 프라이머 세트를 구성하는 프라이머 쌍은, 각각 특정 유전자 조각만을 증폭시키고, 각각의 유전자 조각의 증폭이 다음 단계의 분석에 충분할 만큼 이루어지며, 증폭 반응시 프라이머 간의 방해가 없이 각 유전자 부위를 동시에 증폭시킬 수 있다. 또한, 상기 프라이머 쌍은 서로 다른 크기의 증폭 산물을 형성함으로써, 각 유전자의 존재를 보다 용이하게 확인할 수 있다.
본 발명의 프라이머는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 즉 핵산 서열이 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다. 또한 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 검출 가능한 시그날을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다.
다른 예로, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는, 패혈증 진단용 키트를 제공한다.
상기 키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 더욱 포함할 수 있다. 예를 들어, DNA 중합효소, dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 반응 완충액, 증류수 등으로 구성된 증폭 반응 혼합물을 포함할 수 있으며, 증폭 산물의 검출 여부를 확인할 수 있는 아가로스 및 전기영동 완충액을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
다른 예로, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용한, 패혈증 진단을 위한 방법을 제공한다.
바람직하게, 본 발명은 개체의 시료로부터 추출된 핵산에 상기 프라이머 세트를 처리하여 핵산을 증폭하는 단계, 및 상기 증폭에 의한 생성물로부터 패혈증 균의 감염 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 패혈증 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 분석 가능한 '개체의 시료' 란 개체에서 유래한 핵 및/또는 미토콘드리아를 포함하여 유전자 분석이 가능한 모든 생물-유래 시료로서, 세포, 조직, 기관, 체액, 혈액 등의 시료일 수 있다. 또한, 상기 개체의 시료로부터 추출된 핵산은, 검출하고자 하는 감염균의 유전자 마커가 존재하는 표적 유전자의 전체 또는 일부를 포함하는 핵산으로서, DNA 또는 RNA 일 수 있다.
상기 증폭은 등온증폭반응(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)에 의해 수행될 수 있으며, 예를 들어, 62~65℃, 바람직하게는 63℃에서 수행될 수 있다.
등온증폭법은 기존의 PCR 방법과 유사하나, 기존 PCR 방법은 변성, 접합, 및 신장의 세 단계를 반복적으로 수행하면서 유전자의 증폭을 시행하기 때문에 반응과정 중 지속적으로 온도의 변화를 필요로 하는 반면, 등온증폭법은 고정된 일정 온도에서 접합 및 신장이 가능한 장점을 가지고 있다. 이는 기존 PCR 방법에 사용되는 Taq DNA 중합효소(polymerase)를 사용하는 대신, 핵산말단가수분해(exonuclease) 기능을 갖고 있는 Bst DNA 중합효소를 사용함으로서 열에 의존하지 않고 DNA의 이중나선 구조의 변성을 유발할 수 있기 때문이다. 따라서 등온증폭법은 유전자를 증폭하는 동안 온도의 변화를 필요로 하지 않기 때문에 전문장비 없이 손쉽게 고정된 온도에서 유전자 증폭을 가능하게 한다. 등온증폭반응을 이용하기 위해서는 4개의 프라이머(F3, B3, FIP, 및 BIP)가 하나의 세트로 작용하여야 하는데, 이 중 F3와 FIP(forward inner primer)는 유전자의 5' 방향에 결합하는 프라이머이며, B3와 BIP(backward inner primer)는 3' 방향에서 역방향으로 결합하는 프라이머이다. 또한 FIP와 BIP는 F2(혹은 B2)와 F1c(혹은 B1c)의 염기서열을 포함하도록 하는 프라이머이다.
증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 형광 표지(예를 들어, Cy-5 또는 Cy-3 등)를 표지하여 증폭을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 증폭 수행시 방사성 동위원소를 증폭 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
본 발명은 상기 등온증폭반응에 적합한 프라이머 세트를 이용하여, 패혈증 원인균 특이적 유전자 마커를 높은 민감도와 특이도로 검출할 수 있음을 확인하였으므로, 패혈증 진단에 유용한 기술을 제공할 수 있다.
본 발명을 이용한 병원균에 대한 진단 키트 개발 기술을 통해 감염성 질환의 유행에 대한 효과적인 조기 대응책을 신속히 마련할 수 있고, 불필요한 항생제 남용을 막을 수 있으며, 조기에 적절한 치료약을 투여함으로써 환자의 경제적 부담을 줄일 수 있을 것으로 기대된다.
도 1의 (a)는 Bacteroides fragilis_glnA 유전자에서 Gradient PCR을 통한 최적 온도 설정 결과를 나타내고, (b)는 Clostridium difficile_tcdA 유전자에서 Gradient PCR을 통한 최적 온도 설정 결과를 나타내고, (c)는 Clostridium difficile_tcdB 유전자에서 Gradient PCR을 통한 최적 온도 설정 결과를 나타내고, (d)는 Clostridium perfringens_cpa 유전자에서 Gradient PCR을 통한 최적 온도 설정 결과를 나타낸다.
도 2는 균주 특이적으로 증폭된 PCR 산물을 분리 정제한 후 양방향 염기서열 분석을 실시한 결과를 나타낸다.
도 3은 glnA 유전자에 대하여 표준서열과 비교분석하여 타겟 마커를 확인하고, 다형성 여부를 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 tcdA 유전자에 대하여 표준서열과 비교분석하여 타겟 마커를 확인하고, 다형성 여부를 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 tcdB 유전자에 대하여 표준서열과 비교분석하여 타겟 마커를 확인하고, 다형성 여부를 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 cpa 유전자에 대하여 표준서열과 비교분석하여 타겟 마커를 확인하고, 다형성 여부를 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 glnA 유전자에 대한 특이도를, 탁도(Turbidity) 테스트를 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 tcdA 유전자에 대한 특이도를, 탁도(Turbidity) 테스트를 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 9는 tcdB 유전자에 대한 특이도를, 탁도(Turbidity) 테스트를 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 10은 cpa 유전자에 대한 특이도를, 탁도(Turbidity) 테스트를 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 11은 Bacteroides fragilis_glnA, Clostridium difficile_tcdA, Clostridium difficile_tcdB 및 Clostridium perfringens_cpa 마커에 대한 human genomic DNA 농도에 따른 간섭현상 결과를 나타낸다.
도 12는 마커의 온도에 따른 LAMP 반응 결과를 나타낸 것으로, (a)는 58도, (b)는 60도, (c)는 63도, (d)는 65도에서의 결과를 나타낸다.
도 13은 Bacteroides fragilis_glnA 에서의 최소검출한계(LOD) 실험 결과를 나타낸 것으로,(a)는 실제 증폭이 일어난 tube는 탁도가 변했음을 육안으로 확인 가능함을 나타내고,(b)는 LOD=1pg, R2=0.9966 를 나타낸다.
도 14는 Clostridium difficile_tcdA 에서의 최소검출한계(LOD) 실험 결과를 나타낸 것으로,(a)는 실제 증폭이 일어난 tube는 탁도가 변했음을 육안으로 확인 가능함을 나타내고,(b)는 LOD=1pg, R2=0.8899를 나타낸다.
도 15는 Clostridium difficile_tcdB 에서의 최소검출한계(LOD) 실험 결과를 나타낸 것으로,(a)는 실제 증폭이 일어난 tube는 탁도가 변했음을 육안으로 확인 가능함을 나타내고,(b)는 LOD=1pg, R2=0.897를 나타낸다.
도 16은 Clostridium perfringens_cpa 에서의 최소검출한계(LOD) 실험 결과를 나타낸 것으로,(a)는 실제 증폭이 일어난 tube는 탁도가 변했음을 육안으로 확인 가능함을 나타내고,(b)는 LOD=1pg, R2=0.9393를 나타낸다.
도 17은 SolgTM pfu polymerase를 사용한 증폭 산물(glnA, cpa, tcdA, tcdB)의 agarose gel 전기영동 결과를 나타낸다.
도 18은 B.fragilis_glnA 타겟에 대한 표준품 역가 검사 결과를 나타낸다(glnA: 표준균주 핵산 1ng, PC1, PC2 : 표준품 1, 표준품 2, NTC : Negative control).
도 19는 Clostridium difficile_tcdA 타겟에 대한 표준품 역가 검사 결과를 나타낸다(tcdA: 표준균주 핵산 1ng, PC1, PC2 : 표준품 1, 표준품 2, NTC : Negative control).
도 20은 Clostridium difficile_tcdB 타겟에 대한 표준품 역가 검사 결과를 나타낸다(tcdB: 표준균주 핵산 1ng, PC1, PC2 : 표준품 1, 표준품 2, NTC : Negative control).
도 21은 Clostridium perfringens_cpa 타겟에 대한 표준품 역가 검사 결과를 나타낸다(cpa: 표준균주 핵산 1ng, PC1, PC2 : 표준품 1, 표준품 2, NTC : Negative control).
도 2는 균주 특이적으로 증폭된 PCR 산물을 분리 정제한 후 양방향 염기서열 분석을 실시한 결과를 나타낸다.
도 3은 glnA 유전자에 대하여 표준서열과 비교분석하여 타겟 마커를 확인하고, 다형성 여부를 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 tcdA 유전자에 대하여 표준서열과 비교분석하여 타겟 마커를 확인하고, 다형성 여부를 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 tcdB 유전자에 대하여 표준서열과 비교분석하여 타겟 마커를 확인하고, 다형성 여부를 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 cpa 유전자에 대하여 표준서열과 비교분석하여 타겟 마커를 확인하고, 다형성 여부를 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 glnA 유전자에 대한 특이도를, 탁도(Turbidity) 테스트를 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 tcdA 유전자에 대한 특이도를, 탁도(Turbidity) 테스트를 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 9는 tcdB 유전자에 대한 특이도를, 탁도(Turbidity) 테스트를 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 10은 cpa 유전자에 대한 특이도를, 탁도(Turbidity) 테스트를 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 11은 Bacteroides fragilis_glnA, Clostridium difficile_tcdA, Clostridium difficile_tcdB 및 Clostridium perfringens_cpa 마커에 대한 human genomic DNA 농도에 따른 간섭현상 결과를 나타낸다.
도 12는 마커의 온도에 따른 LAMP 반응 결과를 나타낸 것으로, (a)는 58도, (b)는 60도, (c)는 63도, (d)는 65도에서의 결과를 나타낸다.
도 13은 Bacteroides fragilis_glnA 에서의 최소검출한계(LOD) 실험 결과를 나타낸 것으로,(a)는 실제 증폭이 일어난 tube는 탁도가 변했음을 육안으로 확인 가능함을 나타내고,(b)는 LOD=1pg, R2=0.9966 를 나타낸다.
도 14는 Clostridium difficile_tcdA 에서의 최소검출한계(LOD) 실험 결과를 나타낸 것으로,(a)는 실제 증폭이 일어난 tube는 탁도가 변했음을 육안으로 확인 가능함을 나타내고,(b)는 LOD=1pg, R2=0.8899를 나타낸다.
도 15는 Clostridium difficile_tcdB 에서의 최소검출한계(LOD) 실험 결과를 나타낸 것으로,(a)는 실제 증폭이 일어난 tube는 탁도가 변했음을 육안으로 확인 가능함을 나타내고,(b)는 LOD=1pg, R2=0.897를 나타낸다.
도 16은 Clostridium perfringens_cpa 에서의 최소검출한계(LOD) 실험 결과를 나타낸 것으로,(a)는 실제 증폭이 일어난 tube는 탁도가 변했음을 육안으로 확인 가능함을 나타내고,(b)는 LOD=1pg, R2=0.9393를 나타낸다.
도 17은 SolgTM pfu polymerase를 사용한 증폭 산물(glnA, cpa, tcdA, tcdB)의 agarose gel 전기영동 결과를 나타낸다.
도 18은 B.fragilis_glnA 타겟에 대한 표준품 역가 검사 결과를 나타낸다(glnA: 표준균주 핵산 1ng, PC1, PC2 : 표준품 1, 표준품 2, NTC : Negative control).
도 19는 Clostridium difficile_tcdA 타겟에 대한 표준품 역가 검사 결과를 나타낸다(tcdA: 표준균주 핵산 1ng, PC1, PC2 : 표준품 1, 표준품 2, NTC : Negative control).
도 20은 Clostridium difficile_tcdB 타겟에 대한 표준품 역가 검사 결과를 나타낸다(tcdB: 표준균주 핵산 1ng, PC1, PC2 : 표준품 1, 표준품 2, NTC : Negative control).
도 21은 Clostridium perfringens_cpa 타겟에 대한 표준품 역가 검사 결과를 나타낸다(cpa: 표준균주 핵산 1ng, PC1, PC2 : 표준품 1, 표준품 2, NTC : Negative control).
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
1.
타겟
마커
선정 및 등온증폭반응용
프라이머
디자인
선행 논문, 특허 탐색을 통해 패혈증 등의 원인인 혐기성 세균 특이적인 후보 유전자를 발굴하였고, NCBI(National Center for Biotechnology Information) 유전NCBI(National Center for Biotechnology Information) 유전자 데이터베이스에 공개된 후보 유전자의 유전자 염기서열을 확보자 데이터베이스에 공개된 후보 유전자의 유전자 염기서열을 확보하였다. 최종 후보 유전자는 다음과 같다.
| 실험균주 | 기탁번호 | 타겟유전자 | 등록번호 |
| Bacteroides fragilis | KCTC 3688 | glnA | M28252.1 |
| Clostridium difficile | KCTC 5009 | tcdA | KC292070.1 |
| tcdB | KC292135.1 | ||
| Clostridium perfringens | KCTC 3269 | cpa | X13608.1 |
LAMP 프라이머 디자인 소프트웨어인 LAMP designer(Premier biosoft사)를 이용하여 후보 유전자 별로 프라이머 세트를 디자인하였다.
| 유전자 | 프라이머 이름 | 염기서열 |
| glnA | glnA_F3 | CCACAATCAGTTGGTAATGGA (서열번호 1) |
| glnA_B3 | TGTAGCTGACAGTTGTGAAC (서열번호 2) | |
| glnA_FIP | GGTTGATGCCTGTATCGGCAATGGCGTTAATGGTTCG (서열번호 3) | |
| glnA_BIP | AACGTATTAATGATGGTCCACATTCCGGCACTCATAATAGAAG (서열번호 4) | |
| glnA_LoopF | GAGCGACCAGTTGTTATGT (서열번호 5) | |
| glnA_LoopB | GAATCAGGATCTGTTGCGT (서열번호 6) | |
| tcdA | tcdA_F3 | AACAGAGGGGATACCTATTGT (서열번호 7) |
| tcdA_B3 | CCACTGAAGTTGCCTTATCA (서열번호 8) | |
| tcdA_FIP | TTGCTAAAACACCCACCTTAGCGGTGCAGCAATTAAGGAATTAC (서열번호 9) | |
| tcdA_BIP | AGCTGCAACTGTAGCTTCAATTTGCAGATATACCAGCTATAGGT (서열번호 10) | |
| tcdA_LoopF | AGTAATGGGTCATGTTCGTCT (서열번호 11) | |
| tcdA_LoopB | TGGAATAGGTGCTGAAGTTACT (서열번호 12) | |
| tcdB | tcdB_F3 | GCTGCTGCTTCTGACATAT (서열번호 13) |
| tcdB_B3 | TCACAGAAATTAGCCCTTGATT (서열번호 14) | |
| tcdB_FIP | AATGTTCTGAGGTATATTCTGGTACCTAGTTCAGTAACAGTGGA (서열번호 15) | |
| tcdB_BIP | GACATGTTAGACGAAGAAGTTCAGCCTCCATATCACCAAGTG (서열번호 16) | |
| tcdB_LoopF | GCTTCTAACTTTGTCATTTCCCA (서열번호 17) | |
| tcdB_LoopB | TCTGTTCTAGCTTCTAAGTCAGA (서열번호 18) | |
| cpa | cpa_F3 | GCTAGCATGAGTCATAGTTGG (서열번호 19) |
| cpa_B3 | CCTGGGTTGTCCATTTCC (서열번호 20) | |
| cpa_FIP | TCTGATACATCGTGTAAGAATCTGCAGCAAAGGTAACTTTAGC (서열번호 21) | |
| cpa_BIP | CCATCAGTTGGAAAGAATGTAAAGTCATCTGTTCCAGCATCTT (서열번호 22) | |
| cpa_LoopF | AAATATATCCCGCTGTTCCTTT (서열번호 23) | |
| cpa_LoopB | GCTTACATATCAACTAGTGGTGA (서열번호 24) |
실시예
2. 특이도 테스트를 위한 참조 균주 확보
국내외 균주 분양기관(병원체 자원은행, 미생물자원센터, ATCC)을 통한 유료 분양 및 경북대학교 병원 병원체 자원은행에 보관된 검체 이용하여, 특이도 테스트를 위한 참조 균주를 확보하였다.
실시예
3. 최적의 등온 증폭 반응 조건 확립을 위한 테스트 진행
3-1. 특이도 테스트
일반 PCR을 통해 프라이머 성능을 확인하고 특이도를 테스트하였다. 타겟 마커별로 프라이머세트를 디자인하여 테스트하였다. Gradient PCR로 최적 온도를 확인한 후 single PCR 을 진행하였다(도 1). 표준서열과 비교분석하여 타겟 마커를 확인하고, 다형성 여부도 확인하였다. 이를 위하여, 균주 특이적으로 증폭된 PCR 산물을 분리 정제한 후 양방향 염기서열 분석을 실시하였다(도 2). 또한, 표준서열과 비교분석하여 타겟 마커를 확인하고, 다형성 여부를 확인하였다(도 3 내지 도 6).
3-2. 분석적 특이도
다른 병원체와의 교차반응, 과량의 인간 유전체에 의한 interfering 검증을 통해 특이도를 테스트하였다. 이를 위하여, 일반 PCR에서 특이적으로 반응하는 것을 확인한 후 LAMP 반응 진행하였다. 참조균주를 포함한 다수의 균주를 대상으로 동시 진행하였다. Eiken사의 LoopAmp DNA Amplification Kit를 사용하여 LA-500 등온증폭기에서 결과를 확인하였다. 반응 조건은 다음과 같다.
| Sample reaction | Vol ( ul ) |
| 2X Reaction mix(RM) | 12.5 |
| Primer mixture | 1.3 |
| Bst DNA Polymerase | 1.0 |
| Distilled Water(DW) | 9.2 |
| Template(1ng) | 1.0 |
| Total Volume | 25.0 |
반응 온도는 63℃에서 60분간 등온증폭반응을 진행하면서 실시간 탁도를 측정하고, 80℃에서 5분간 불활성화를 진행하여 반응을 완료하였다. 탁도(Turbidity)가 0.1을 넘는 시간을 Tt(Threshold time)이라고 정의하며, 목표 검출 시간인 30분~1시간을 만족하는 프라이머 세트를 선별하였다(도 7 내지 도 10).
| 균주 | 타겟 | 특이도 |
Tt
( mm:ss ) |
비고 |
|
Bacteroides
fragilis |
glnA | 도 7 | 23:24 |
Rf1:C
.
perfringens
Rf2:C . difficile Rf3:S . agalactiae Rf4:S . pneumoniae Rf5:S . aureus Rf6:S . epidermidus Rf7:M . fortuitum Rf8:M . tuberculosis complex NTC: Neg control |
|
Clostridium
difficile |
tcdA | 도 8 | 22:24 |
Rf1:B
.
fragilis
Rf2:C . perfringens Rf3:S . agalactiae Rf4:S . pneumoniae Rf5:S . aureus Rf6:S . epidermidus Rf7:M . fortuitum Rf8:M . tuberculosis complex NTC: Neg control |
| tcdB | 도 9 | 24:54 | ||
|
Clostridium
perfringens |
cpa | 도 10 | 20:24 |
Rf1:B
.
fragilis
Rf2:C . difficile Rf3:S . agalactiae Rf4:S . pneumoniae Rf5:S . aureus Rf6:S . epidermidus Rf7:M . fortuitum Rf8:M . tuberculosis complex NTC: Neg control |
또한, 인간 유전체에 의한 간섭현상을 spiked-sample을 사용하여 확인하였다. 표준 균주 1ng에 human genomic DNA 5ng, 10ng을 각각 첨가한 뒤 검출 시간을 관찰하한 결과, human genomic DNA와는 관계없이 일정한 검출 시간을 보였다(도 11).
| 균종 | 타겟 | 검출 시간( Tt : Threshold time ) | 비고 | ||
| 표준균주 1ng |
Human
gDNA
5ng
+ 표준균주 1ng |
Human
gDNA
10ng
+ 표준균주 1ng |
|||
| B. fragilis | glnA | 32:06 | 33:00 | 32:42 | |
| C. difficile | tcdA | 22:18 | 21:36 | 20:48 | |
| tcdB | 24:48 | 25:12 | 25:24 | ||
| C. perfringens | cpa | 18:36 | 19:24 | 18:54 | |
3-3. 분석적 민감도
LAMP 반응 온도를 결정하고, 농도에 따른 반응 여부를 확인하였고, 최적의 반응 결과를 나타내는 반응 온도를 결정하였다. 그 결과 63도에서 최적의 반응 결과를 얻을 수 있었다(도 12).
분석적 특이도 시험을 확인한 후 1ng(균종에 따라 1.78×105∼2.84×105 copies)부터 균주 DNA를 단계별로 희석하는데, 게놈 크기를 환산하여 1 copy까지 준비한 뒤 등온증폭 반응을 실시하여 다음과 같이 분석적 민감도를 확인하였다.
| 균주 | 타겟 | 프라이머 | LOD (R 2 ≥0.9) | Tt ( mm:ss ) |
| Bacteroides fragilis | glnA | glnA set | 1pg | 23:24 |
| Clostridium difficile | tcdA | tcdA set | 1pg | 22:24 |
| tcdB | tcdB set | 1pg | 25:06 | |
| Clostridium perfringens | cpa | cpa set | 100fg | 18:24 |
| 합계 | 4타겟 | 4세트 |
3-4. 최소검출한계(
LOD
) 테스트
마커에 따른 최소검출한계(LOD)를 검증하였다. 이를 위하여, 균주 핵산을 1ng(균종에 따라 1.78×105∼2.84×105 copies)부터 1 copy까지 농도구배하여 준비하고, LOD 검출을 위해 R2 ≥0.9 기준에 따라 선별하였다(도 13 내지 도 16).
3-5. 표준 대조물질 제조 및 검정
플라스미드(Plasmid)를 이용하여 균종별 타겟 마커에 대한 핵산재조합 표준품을 제조하였다 (Plasmid DNA standard). 이를 위하여, 마커별 타겟 유전자를 증폭하는 프라이머(F3, B3)를 사용하여 증폭하였다. 솔젠트사의 SolgTM pfu polymerase를 사용하여 증폭하였고, 2% agarose gel 상에서 전기영동하여 증폭 산물을 확인하였다. GeneAll사의 ExpinTM PCR SV kit로 증폭 산물을 회수하였다(도 17). 솔젠트사의 T-BluntTM PCR cloning kit를 사용하여 cloning하고, E. coli(DH5 alpha)에 형질전환한 뒤 배양시켜 colony PCR을 수행하여 삽입유전자를 확인하였다. 액체 배지에 colony를 배양한 후 plasmid를 회수하였고, 제노텍에 염기서열 분석을 의뢰하여 참조서열과 동일함을 확인하였다. 1ng의 표준균주 핵산에 대응하는 표준품의 copy number를 계산한 뒤, 동일한 copy number를 사용한 LAMP 반응을 수행하여 제조한 표준품의 역가검증을 실시하였다(도 18 내지 도 21).
<110> D&P Biotech Ltd.
<120> Primer set for diagnosing sepsis and use thereof
<130> d
<160> 24
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> glnA_F3
<400> 1
ccacaatcag ttggtaatgg a 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> glnA_B3
<400> 2
tgtagctgac agttgtgaac 20
<210> 3
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> glnA_FIP
<400> 3
ggttgatgcc tgtatcggca atggcgttaa tggttcg 37
<210> 4
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> glnA_BIP
<400> 4
aacgtattaa tgatggtcca cattccggca ctcataatag aag 43
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> glnA_LoopF
<400> 5
gagcgaccag ttgttatgt 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> glnA_LoopB
<400> 6
gaatcaggat ctgttgcgt 19
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tcdA_F3
<400> 7
aacagagggg atacctattg t 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tcdA_B3
<400> 8
ccactgaagt tgccttatca 20
<210> 9
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tcdA_FIP
<400> 9
ttgctaaaac acccacctta gcggtgcagc aattaaggaa ttac 44
<210> 10
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tcdA_BIP
<400> 10
agctgcaact gtagcttcaa tttgcagata taccagctat aggt 44
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tcdA_LoopF
<400> 11
agtaatgggt catgttcgtc t 21
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tcdA_LoopB
<400> 12
tggaataggt gctgaagtta ct 22
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tcdB_F3
<400> 13
gctgctgctt ctgacatat 19
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tcdB_B3
<400> 14
tcacagaaat tagcccttga tt 22
<210> 15
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tcdB_FIP
<400> 15
aatgttctga ggtatattct ggtacctagt tcagtaacag tgga 44
<210> 16
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tcdB_BIP
<400> 16
gacatgttag acgaagaagt tcagcctcca tatcaccaag tg 42
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tcdB_LoopF
<400> 17
gcttctaact ttgtcatttc cca 23
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tcdB_LoopB
<400> 18
tctgttctag cttctaagtc aga 23
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cpa_F3
<400> 19
gctagcatga gtcatagttg g 21
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cpa_B3
<400> 20
cctgggttgt ccatttcc 18
<210> 21
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cpa_FIP
<400> 21
tctgatacat cgtgtaagaa tctgcagcaa aggtaacttt agc 43
<210> 22
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cpa_BIP
<400> 22
ccatcagttg gaaagaatgt aaagtcatct gttccagcat ctt 43
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cpa_LoopF
<400> 23
aaatatatcc cgctgttcct tt 22
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cpa_LoopB
<400> 24
gcttacatat caactagtgg tga 23
Claims (7)
- 서열번호 1 내지 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함하는, 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis) 균주의 glnA 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트,
서열번호 7 내지 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함하는, 클로스트리듐 디피실리(Clostridium difficile) 균주의 tcdA 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트,
서열번호 13 내지 서열번호 18의 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함하는, 클로스트리듐 디피실리(Clostridium difficile) 균주의 tcdB 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트, 및
서열번호 19 내지 서열번호 24의 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함하는, 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens) 균주의 cpa 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트를 포함하는,
패혈증 진단용 프라이머 세트.
- 제1항의 프라이머 세트를 포함하는, 패혈증 진단용 조성물.
- 제1항의 프라이머 세트를 포함하는, 패혈증 진단용 키트.
- 제3항에 있어서, 상기 키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 더욱 포함하는 것인, 패혈증 진단용 키트.
- 개체의 시료로부터 추출된 핵산에 제1항의 프라이머 세트를 처리하여 핵산을 증폭하는 단계, 및
상기 증폭에 의한 생성물로부터 패혈증 균의 감염 여부를 확인하는 단계를 포함하는,
패혈증 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 증폭은 등온증폭반응에 의해 수행되는 것인, 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 등온증폭반응은 62 내지 65℃에서 수행되는 것인, 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020150137736A KR101717192B1 (ko) | 2015-09-30 | 2015-09-30 | 패혈증 진단용 프라이머 세트 및 이의 이용 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020150137736A KR101717192B1 (ko) | 2015-09-30 | 2015-09-30 | 패혈증 진단용 프라이머 세트 및 이의 이용 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| KR101717192B1 true KR101717192B1 (ko) | 2017-03-17 |
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ID=58502143
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020150137736A Expired - Fee Related KR101717192B1 (ko) | 2015-09-30 | 2015-09-30 | 패혈증 진단용 프라이머 세트 및 이의 이용 |
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|---|---|
| KR (1) | KR101717192B1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102342483B1 (ko) * | 2020-06-25 | 2021-12-24 | 대한민국 | 캠필로박터균 및 클로스트리디움균 검출용 프라이머 세트 및 검출 방법 |
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| KR101193765B1 (ko) | 2011-05-16 | 2012-10-24 | (주)나노헬릭스 | 초고속 핵산의 정제방법 |
| KR20130137952A (ko) * | 2012-06-08 | 2013-12-18 | 삼성전자주식회사 | 클로스트리디움 디피실리 균주 검출용 조성물과 키트 및 이를 이용한 검출 방법 |
-
2015
- 2015-09-30 KR KR1020150137736A patent/KR101717192B1/ko not_active Expired - Fee Related
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