CN103613642A - 一种六胜肽的液相分段合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种六胜肽的液相分段合成方法，通过对六胜肽序列进行分段，分别合成了六胜肽序列中的三肽片段Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-OH和二肽片段H2N-Gln(Trt)-Arg-OH，然后以该三肽片段和二肽片段以活化酯方法合成了五肽片段Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-OH，再将该五肽片段与H-Arg-NH2·2HCl缩合得到了保护六肽Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-Arg-NH2，最终脱保护基得到六胜肽。本发明方法克服了固相反应中每步必须使用保护氨基酸、溶剂种类多、试剂明显过量及溶剂难以回收的缺点，具有合成方法简单、产品成本低、对环境更为绿色化等优点，可用于合成六胜肽。
Description
技术领域
本发明属于化妆品技术领域，具体涉及到多肽类中的短肽的合成方法。
背景技术
六胜肽是一种含有六个氨基酸的活性多肽，氨基酸序列为Ac-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-NH2，具有皮肤除皱的生物活性，广泛用于各种高级美容化妆品中。
目前，六胜肽的合成方法主要采用经典固相法合成。即将保护氨基酸由C端向N端逐个延伸，通过缩合、脱除保护、再缩合、切割树脂、离心、冻干和高效液相制备得到纯度高于90%的六胜肽产品。该方法中所需要的树脂市场价格较为昂贵，且其交换活度小，并且在合成中使用的溶剂种类多、且反应试剂量均明显过量，造成了六胜肽原料成本的增高。作为化妆品原料，目前六胜肽的市场价格大约为1000元/g，致使含有六胜肽的化妆品成品价格昂贵，使普通人群难以接受，因此，降低六胜肽生产成本的工艺方法研究具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述六胜肽固相合成方法的缺点，采用液相合成方法提供一种工艺方法简单、产品成本低、溶剂易于回收、对环境友好的六胜肽的合成方法。
解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成：
1、合成AcOSu
将N-羟基丁二酰亚胺或对硝基苯酚与二氯甲烷按质量-体积比为1g:8～10mL混合均匀，加入二异丙基乙胺，搅拌，冰浴降温至0～5℃，滴加乙酰氯，保持溶液温度小于20℃，N-羟基丁二酰亚胺或对硝基苯酚与二异丙基乙胺、乙酰氯的摩尔比为1:1.1～1.5:1.05～1.5，滴加完后撤去冰浴，自然升至室温反应2～3小时，分离纯化产物，得到AcOSu。
2、合成Ac-Glu(OtBu)-OH
将AcOSu与四氢呋喃或1,4-二氧六环按质量-体积比为1g:4～6mL混合，室温搅拌至溶解；将γ-叔丁酯谷氨酸和碳酸氢钠溶解于蒸馏水中，所得溶液滴加到AcOSu的四氢呋喃溶液或AcOSu的1,4-二氧六环溶液中，AcOSu与γ-叔丁酯谷氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.0～1.3:1.5～3，蒸馏水与四氢呋喃或1,4-二氧六环的体积比为2～3:1，室温搅拌反应5～8小时，反应液减压浓缩至粘稠状，冷却至5～10℃，用质量分数为20%的柠檬酸水溶液调节pH值至2～3，5～10℃静置2～3小时，过滤，滤饼经水洗、干燥，得到Ac-Glu(OtBu)-OH。
3、合成Ac-Glu(OtBu)-COOSu
将Ac-Glu(OtBu)-OH与四氢呋喃或1,4-二氧六环按质量-体积比为1g:8～10mL混合均匀，加入N-羟基丁二酰亚胺或对硝基苯酚，室温搅拌至溶解，加入二环己基碳二亚胺，Ac-Glu(OtBu)-OH与N-羟基丁二酰亚胺或对硝基苯酚、二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:1.0～1.5:1.2～1.5，室温搅拌反应5～6小时，过滤除去固体不溶物，得到Ac-Glu(OtBu)-COOSu的四氢呋喃溶液或Ac-Glu(OtBu)-COOSu的1,4-二氧六环溶液。
4、合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OH
将γ-叔丁酯谷氨酸和碳酸氢钠溶解于蒸馏水中，所得溶液滴加到步骤3得到的Ac-Glu(OtBu)-COOSu的四氢呋喃溶液或Ac-Glu(OtBu)-COOSu的1,4-二氧六环溶液中，Ac-Glu(OtBu)-OH与γ-叔丁酯谷氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.0～1.2:1.5～3，蒸馏水与四氢呋喃或1,4-二氧六环的体积比为1～2:1，室温搅拌反应8～10小时，分离纯化产物，得到Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OH。
5、合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-COOSu
将Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OH与四氢呋喃或1,4-二氧六环按质量-体积比为1g:8～10mL混合均匀，加入N-羟基丁二酰亚胺或对硝基苯酚，室温搅拌至溶解，加入二环己基碳二亚胺，Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OH与N-羟基丁二酰亚胺或对硝基苯酚、二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:1.0～1.5:1.2～1.5，室温搅拌反应5～6小时，过滤除去固体不溶物，得到Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-COOSu的四氢呋喃溶液或Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-COOSu的1,4-二氧六环溶液。
6、合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-OH
将蛋氨酸和碳酸氢钠溶解于蒸馏水中，所得溶液滴加到步骤5得到的Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-COOSu的四氢呋喃溶液或Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-COOSu的1,4-二氧六环溶液中，Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OH与蛋氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.0～1.2:1.5～3.0，蒸馏水与四氢呋喃或1,4-二氧六环的体积比为1:1～2，室温搅拌反应8～10小时，分离纯化产物，得到Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-OH。
7、合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-COONp
将Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-OH与二氯甲烷按质量-体积比为1g:8～10mL混合，室温搅拌至溶解，加入对硝基苯酚，搅拌至溶解，加入二环己基碳二亚胺，Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-OH与对硝基苯酚、二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:1.1～1.3:1.2～1.5，室温反应6～8小时，分离纯化产物，得到Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-COONp。
8、合成Fmoc-Gln(Trt)-COOSu
将Fmoc-Gln(Trt)-OH与四氢呋喃或1,4-二氧六环按质量-体积比为1g:8～10mL混合，室温搅拌至溶解，加入N-羟基丁二酰亚胺，搅拌至溶解，加入二环己基碳二亚胺，Fmoc-Gln(Trt)-OH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:1.0～1.3:1.2～1.5，室温反应5～8小时，过滤除去固体不溶物，得到Fmoc-Gln(Trt)-COOSu的四氢呋喃溶液或Fmoc-Gln(Trt)-COOSu的1,4-二氧六环溶液。
9、合成Fmoc-Gln(Trt)-Arg-OH
将精氨酸与碳酸氢钠溶解于蒸馏水中，所得溶液滴加到步骤8得到的Fmoc-Gln(Trt)-COOSu的四氢呋喃溶液或Fmoc-Gln(Trt)-COOSu的1,4-二氧六环溶液中，Fmoc-Gln(Trt)-OH与精氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.0～1.2:1.5～3.0，蒸馏水与四氢呋喃或1,4-二氧六环的体积比为1:1～3，室温搅拌反应10～12小时，分离纯化产物，得到Fmoc-Gln(Trt)-Arg-OH。
10、合成H2N-Gln(Trt)-Arg-OH
将Fmoc-Gln(Trt)-Arg-OH与二氯甲烷按质量-体积比为1g:8～10mL混合均匀，搅拌，加入哌啶或二乙胺，Fmoc-Gln(Trt)-Arg-OH与哌啶或二乙胺的摩尔比为1:3～5，室温搅拌反应20～24小时，分离纯化产物，得到H2N-Gln(Trt)-Arg-OH。
11、合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-OH
将步骤7得到的Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-COONp与N,N-二甲基甲酰胺按质量-体积比为1g:6～8mL混合均匀，加入步骤10得到的H2N-Gln(Trt)-Arg-OH，室温搅拌至溶解；将碳酸氢钠溶于蒸馏水中，所得溶液滴加到H2N-Gln(Trt)-Arg-OH与Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-COONp的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-COONp与H2N-Gln(Trt)-Arg-OH、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.0～1.2:1.5～3，N,N-二甲基甲酰胺与蒸馏水的体积比为3～5:1，室温搅拌反应20～24小时，分离纯化产物，得到Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-OH。
12、合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-Arg-NH2
将Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-OH与N,N－二甲基甲酰胺按质量-体积比为1g:10～12mL混合，室温搅拌至溶解，依次加入二环己基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑、H-Arg-NH2·2HCl、N-甲基吗啉，Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-OH与二环己基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑、H-Arg-NH2·2HCl、N-甲基吗啉的摩尔比为1:1.2～1.5:1.2～1.5:1.5～2:5～10，室温搅拌36～48小时，分离纯化产物，得到Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-Arg-NH2。
13、制备六胜肽
将Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-Arg-NH2加入二氯甲烷与三氟乙酸的体积比为1:1的混合液中，Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-Arg-NH2与混合液的质量-体积比为1g:10～16mL，室温搅拌至溶解，加入三异丙基硅烷，Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-Arg-NH2与三异丙基硅烷的摩尔比为1:5～10，室温搅拌反应4～6小时，分离纯化产物，得到六胜肽。
上述的合成H2N-Gln(Trt)-Arg-OH步骤10中，Fmoc-Gln(Trt)-Arg-OH与哌啶或二乙胺的摩尔比最佳为1:4；合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-OH步骤11中，Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-COONp与H2N-Gln(Trt)-Arg-OH、碳酸氢钠的摩尔比最佳为1:1.1:2；合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-Arg-NH2步骤12中，Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-OH与二环己基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑、H-Arg-NH2·2HCl、N-甲基吗啉的摩尔比最佳为1:1.3:1.3:1.8:8；制备六胜肽步骤13中，Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-Arg-NH2与三异丙基硅烷的摩尔比最佳为1:6。
本发明采用活化酯法分别合成了六胜肽序列中的三肽片段Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-OH和二肽片段H2N-Gln(Trt)-Arg-OH，然后以该三肽片段和二肽片段以活化酯方法合成了五肽片段Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-OH，再将该五肽片段与H-Arg-NH2·2HCl缩合得到了保护六肽Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-Arg-NH2，最终将保护六肽脱保护得到六胜肽。与固相法相比，本发明主要以游离氨基酸为原料，原料价格低廉，且反应主要以水和四氢呋喃或1,4-二氧六环作溶剂，所用溶剂回收后经简单处理后可重复使用，对环境更为绿色化，克服了固相反应中每步必须使用保护氨基酸、溶剂种类多、试剂明显过量及溶剂难以回收的缺点，合成方法简单，生产成本可降低40%～50%，可用于工业化合成六胜肽。
附图说明
图1是实施例1合成的六胜肽质谱图。
图2是实施例1合成的六胜肽液相色谱图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1
1、合成AcOSu
按照N-羟基丁二酰亚胺与二异丙基乙胺、乙酰氯的摩尔比为1:1.2:1.1，将11.5g N-羟基丁二酰亚胺置于250mL三口瓶中，加入100mL二氯甲烷，混合均匀，搅拌条件下加入20.7mL二异丙基乙胺，冰浴降温至0～5℃，待溶液变澄清，滴加7.9mL乙酰氯，滴加过程中保持溶液温度低于20℃，滴加完后撤去冰浴，自然升至室温搅拌反应3小时，将反应液用水洗3次、每次50mL，有机相经无水硫酸钠干燥、过滤、减压浓缩，得到AcOSu15.3g，收率为97.4%。
2、合成Ac-Glu(OtBu)-OH
按照AcOSu与γ-叔丁酯谷氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.1:2，蒸馏水与四氢呋喃的体积比为3:1，将15g AcOSu置于500mL三口反应瓶中，加入60mL四氢呋喃，室温搅拌至溶解，得到AcOSu的四氢呋喃溶液，将21.3gγ-叔丁酯谷氨酸和16g碳酸氢钠溶解于180mL蒸馏水中，然后滴加到AcOSu的四氢呋喃溶液中，室温搅拌反应6小时，过滤除去固体不溶物，将滤液减压浓缩至粘稠状，冷却至5～10℃，用质量分数为20%的柠檬酸水溶液调节pH值至2～3，5～10℃静置3小时，过滤，用水淋洗滤饼，50℃鼓风干燥，得到白色粉末状Ac-Glu(OtBu)-OH22g，收率为94%。
3、合成Ac-Glu(OtBu)-COOSu
按照Ac-Glu(OtBu)-OH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:1.1:1.3，将19.6g Ac-Glu(OtBu)-OH置于1000mL反应瓶中，加入180mL四氢呋喃，混合均匀，加入10.1g N-羟基丁二酰亚胺，室温搅拌至溶解，然后加入21.4g二环己基碳二亚胺，室温搅拌反应6小时，过滤除去固体不溶物，得到Ac-Glu(OtBu)-COOSu的四氢呋喃溶液。
4、合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OH
按照Ac-Glu(OtBu)-OH与γ-叔丁酯谷氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.1:2，蒸馏水与四氢呋喃的体积比为1.5:1，将17.8gγ-叔丁酯谷氨酸和13.4g碳酸氢钠溶解于270mL蒸馏水中，所得溶液滴加到步骤3得到的Ac-Glu(OtBu)-COOSu的四氢呋喃溶液中，室温搅拌反应8小时，过滤除去固体不溶物，滤液减压浓缩后用质量分数为20%的柠檬酸水溶液调节pH值至2～3，用乙酸乙酯萃取3次，每次100mL，有机相依次经水洗、饱和食盐水洗、无水硫酸钠干燥、过滤、减压浓缩，得到Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OH30.0g，收率为87.2%。
5、合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-COOSu
按照Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:1.1:1.3，将28g Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OH置于1000mL反应瓶中，加入240mL四氢呋喃，混合均匀，加入8.23g N-羟基丁二酰亚胺，室温搅拌至溶解，然后加入17.4g二环己基碳二亚胺，室温搅拌反应6小时，过滤除去固体不溶物，得到Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-COOSu的四氢呋喃溶液。
6、合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-OH
按照Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OH与蛋氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.1:2，蒸馏水与四氢呋喃的体积比为1:1.5，将10.7g蛋氨酸和10.9g碳酸氢钠溶解于160mL蒸馏水中，然后滴加到步骤5得到的Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-COOSu的四氢呋喃溶液中，室温搅拌反应8小时，过滤除去固体不溶物，滤液减压浓缩后用质量分数为20%的柠檬酸水溶液调节pH值至2～3，用乙酸乙酯萃取3次，每次100mL，有机相依次经水洗、饱和食盐水洗、无水硫酸钠干燥、过滤、减压浓缩，得到Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-OH28.5g，收率为78%。
7、合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-COONp
按照Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-OH与对硝基苯酚、二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:1.1:1.3，将28.1g Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-OH置于500mL反应瓶中，加入250mL二氯甲烷，室温搅拌至溶解，加入7.7g对硝基苯酚，搅拌至溶解，再加入13.4g二环己基碳二亚胺，室温搅拌反应6小时，减压过滤除去固体不溶物，用二氯甲烷淋洗固体不溶物3次，每次10mL，合并滤液，减压浓缩滤液，得到淡黄色固体Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-COONp33g，收率为96.7%。
8、合成Fmoc-Gln(Trt)-COOSu
按照Fmoc-Gln(Trt)-OH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:1.2:1.4，将61g Fmoc-Gln(Trt)-OH置于1000mL反应瓶中，加入500mL四氢呋喃，室温搅拌至溶解，加入13.8g N-羟基丁二酰亚胺，搅拌至溶解，再加入28.8g二环己基碳二亚胺，室温反应8小时，过滤除去固体不溶物，得到Fmoc-Gln(Trt)-COOSu的四氢呋喃溶液。
9、合成Fmoc-Gln(Trt)-Arg-OH
按照Fmoc-Gln(Trt)-OH与精氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.1:2，蒸馏水与四氢呋喃的体积比为1:2，将19.2g精氨酸与16.8g碳酸氢钠溶解于250mL蒸馏水中，然后滴加到步骤8得到的Fmoc-Gln(Trt)-COOSu的四氢呋喃溶液中，室温搅拌反应12小时，过滤，减压浓缩滤液，用质量分数为20%的柠檬酸水溶液调节浓缩液的pH值至2～3，10～15℃冷却2小时，室温搅拌30分钟，过滤，滤饼经水洗、40℃真空干燥，得到Fmoc-Gln(Trt)-Arg-OH68.8g，收率为89.8%。
10、合成H2N-Gln(Trt)-Arg-OH
按照Fmoc-Gln(Trt)-Arg-OH与哌啶的摩尔比为1:4，将38.4g Fmoc-Gln(Trt)-Arg-OH置于500mL反应瓶中，加入350mL二氯甲烷，混合均匀，搅拌，加入19.8mL哌啶，室温搅拌反应24小时，减压浓缩反应液，加入100mL乙酸乙酯，室温搅拌30分钟，过滤，滤饼经乙酸乙酯淋洗、50℃干燥，得到白色粉末状固体H2N-Gln(Trt)-Arg-OH26.7g，收率为98%。
11、合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-OH
按照Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-COONp与H2N-Gln(Trt)-Arg-OH、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.1:2，N,N-二甲基甲酰胺与蒸馏水的体积比为4:1，将27.3gAc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-COONp置于500mL反应瓶中，加入200mL N,N-二甲基甲酰胺，混合均匀，加入24g H2N-Gln(Trt)-Arg-OH，室温搅拌至溶解；将6.72g碳酸氢钠溶于50mL蒸馏水中，然后滴加到H2N-Gln(Trt)-Arg-OH与Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-ONp的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，室温搅拌反应24小时，将反应液倾入到500mL冰水中，然后用质量分数为20%的柠檬酸水溶液调节pH值至2～3，用乙酸乙酯萃取3次，每次30mL，水相用二氯甲烷萃取3次，每次60mL，合并二氯甲烷相，二氯甲烷相依次经水洗、饱和食盐水洗、无水硫酸钠干燥、过滤、减压浓缩，得到淡黄色粉末状固体Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-OH33g，收率为75.8%。
12、合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-Arg-NH2
按照Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-OH与二环己基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑、H-Arg-NH2·2HCl、N-甲基吗啉的摩尔比为1:1.3:1.3:1.8:8，将21.8gAc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-OH置于500mL反应瓶中，加入230mLN,N－二甲基甲酰胺，室温搅拌至溶解，依次加入5.4g二环己基碳二亚胺、3.51g1-羟基苯并三唑、8.85g H-Arg-NH2·2HCl、17.7mL N-甲基吗啉，室温搅拌48小时，过滤，将滤液倾入到500mL冰水中，用质量分数为5%的盐酸水溶液调节pH值至2～3，用乙酸乙酯萃取3次，每次30mL，水相用二氯甲烷萃取3次，每次50mL，合并二氯甲烷相，二氯甲烷相依次用水洗2次、质量分数为10%的氯化钠水溶液洗2次，每次100mL，再经无水硫酸钠干燥、过滤、减压浓缩，得到糖浆状物，向糖浆状物中加入50mL冷乙醚，超声15分钟，过滤，滤饼经冷乙醚淋洗、40℃真空干燥，得到Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-Arg-NH219g，收率为76.3%。
13、制备六胜肽
按照Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-Arg-NH2与三异丙基硅烷的摩尔比为1:6，将10g Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-Arg-NH2置于500mL反应瓶中，加入140mL二氯甲烷与三氟乙酸的体积比为1:1的混合液，室温搅拌至溶解，加入9.8mL三异丙基硅烷，室温搅拌反应6小时，减压浓缩反应液，得到粘稠物，向粘稠物中加入20mL冷无水乙醚，超声15分钟，离心分离，固体产物常温真空干燥后，用反相高效液相色谱分离纯化（填料为F型粒径为30～50μm的SBC MCI GEI反相色谱填料，由成都科谱生物有限公司提供，流动相A是用质量分数为28%的氨水溶液调节pH值至8.5的超纯水，流动相B是用质量分数为28%的氨水溶液调节pH值至8.5的甲醇，流动相梯度选择为0～40分钟，A:B由83:17到73:27），得到六胜肽6.7g，收率为94.3%。
发明人采用质谱仪对得到的产物进行结构表征，结果见图1。由图1可见，所得产物的分子量及分子离子峰与六胜肽分子量以及分子离子峰一致，说明制备产物为六胜肽。采用液相色谱仪对得到的产物的纯度进行测定，液相色谱图见图2。由图2可见，所制备的六胜肽的纯度为98%。
实施例2
本实施例的合成Ac-Glu(OtBu)-OH步骤2、合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OH步骤4、合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-OH步骤6、合成Fmoc-Gln(Trt)-Arg-OH步骤9中，所用的碳酸氢钠的摩尔量是实施例1中碳酸氢钠摩尔量的1.5倍。其他步骤与实施例1相同，得到6.4g六胜肽，收率为90.1%，HPLC检测表明纯度为90%。
实施例3
本实施例的合成Ac-Glu(OtBu)-OH步骤2、合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OH步骤4、合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-OH步骤6、合成Fmoc-Gln(Trt)-Arg-OH步骤9中，所用的碳酸氢钠的摩尔量是实施例1中碳酸氢钠摩尔量的3/4。其他步骤与实施例1相同，得到6.47g六胜肽，收率为91%，HPLC检测表明纯度大于90%。
实施例4
本实施例的合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-Arg-NH2步骤12中，所用的N-甲基吗啉的摩尔量是实施例1中N-甲基吗啉摩尔量的5/8。其他步骤与实施例1相同，得到6.36g六胜肽，收率为89.5%，HPLC检测表明纯度大于90%。
实施例5
本实施例的合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-Arg-NH2步骤12中，所用的N-甲基吗啉的摩尔量是实施例1中N-甲基吗啉摩尔量的1.25倍。其他步骤与实施例1相同，得到6.63g六胜肽，收率为93.2%，HPLC检测表明纯度大于90%。
实施例6
本实施例的制备六胜肽步骤13中，所用的Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-Arg-NH2与三异丙基硅烷的摩尔比为1:5。其他步骤与实施例1相同，得到6.3g六胜肽，收率88.6%，HPLC检测表明纯度大于90%。
实施例7
本实施例的制备六胜肽步骤13中，所用的Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-Arg-NH2与三异丙基硅烷的摩尔比为1:10。其他步骤与实施例1相同，得到6.2g六胜肽，收率87.2%，HPLC检测表明纯度大于90%。
实施例8
在实施例1～7的合成H2N-Gln(Trt)-Arg-OH步骤10中，所用的哌啶用等摩尔的二乙胺替换。其他步骤与相应实施例相同，制备成六胜肽。
实施例9
在实施例1～8的合成AcOSu步骤1、合成Ac-Glu(OtBu)-COOSu步骤3、合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-COOSu步骤5中，所用的N-羟基丁二酰亚胺用等摩尔的对硝基苯酚替换。其他步骤与相应实施例相同，制备成六胜肽。
实施例10
在实施例1～9的合成Ac-Glu(OtBu)-OH步骤2、合成Ac-Glu(OtBu)-COOSu步骤3、合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-COOSu步骤5、合成Fmoc-Gln(Trt)-COOSu步骤8中，所用的四氢呋喃用等体积的1,4-二氧六环替换。其他步骤与相应实施例相同，制备成六胜肽。
Claims (8)
1.一种六胜肽的液相分段合成方法，其特征在于它由下述步骤组成：
（1）合成AcOSu
将N-羟基丁二酰亚胺或对硝基苯酚与二氯甲烷按质量-体积比为1g:8～10mL混合均匀，加入二异丙基乙胺，搅拌，冰浴降温至0～5℃，滴加乙酰氯，保持溶液温度小于20℃，N-羟基丁二酰亚胺或对硝基苯酚与二异丙基乙胺、乙酰氯的摩尔比为1:1.1～1.5:1.05～1.5，滴加完后撤去冰浴，自然升至室温反应2～3小时，分离纯化产物，得到AcOSu；
（2）合成Ac-Glu(OtBu)-OH
将AcOSu与四氢呋喃或1,4-二氧六环按质量-体积比为1g:4～6mL混合，室温搅拌至溶解；将γ-叔丁酯谷氨酸和碳酸氢钠溶解于蒸馏水中，所得溶液滴加到AcOSu的四氢呋喃溶液或AcOSu的1,4-二氧六环溶液中，AcOSu与γ-叔丁酯谷氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.0～1.3:1.5～3，蒸馏水与四氢呋喃或1,4-二氧六环的体积比为2～3:1，室温搅拌反应5～8小时，反应液减压浓缩至粘稠状，冷却至5～10℃，用质量分数为20%的柠檬酸水溶液调节pH值至2～3，5～10℃静置2～3小时，过滤，滤饼经水洗、干燥，得到Ac-Glu(OtBu)-OH；
（3）合成Ac-Glu(OtBu)-COOSu
将Ac-Glu(OtBu)-OH与四氢呋喃或1,4-二氧六环按质量-体积比为1g:8～10mL混合均匀，加入N-羟基丁二酰亚胺或对硝基苯酚，室温搅拌至溶解，加入二环己基碳二亚胺，Ac-Glu(OtBu)-OH与N-羟基丁二酰亚胺或对硝基苯酚、二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:1.0～1.5:1.2～1.5，室温搅拌反应5～6小时，过滤除去固体不溶物，得到Ac-Glu(OtBu)-COOSu的四氢呋喃溶液或Ac-Glu(OtBu)-COOSu的1,4-二氧六环溶液；
（4）合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OH
将γ-叔丁酯谷氨酸和碳酸氢钠溶解于蒸馏水中，所得溶液滴加到步骤（3）得到的Ac-Glu(OtBu)-COOSu的四氢呋喃溶液或Ac-Glu(OtBu)-COOSu的1,4-二氧六环溶液中，Ac-Glu(OtBu)-OH与γ-叔丁酯谷氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.0～1.2:1.5～3，蒸馏水与四氢呋喃或1,4-二氧六环的体积比为1～2:1，室温搅拌反应8～10小时，分离纯化产物，得到Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OH；
（5）合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-COOSu
将Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OH与四氢呋喃或1,4-二氧六环按质量-体积比为1g:8～10mL混合均匀，加入N-羟基丁二酰亚胺或对硝基苯酚，室温搅拌至溶解，加入二环己基碳二亚胺，Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OH与N-羟基丁二酰亚胺或对硝基苯酚、二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:1.0～1.5:1.2～1.5，室温搅拌反应5～6小时，过滤除去固体不溶物，得到Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-COOSu的四氢呋喃溶液或Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-COOSu的1,4-二氧六环溶液；
（6）合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-OH
将蛋氨酸和碳酸氢钠溶解于蒸馏水中，所得溶液滴加到步骤（5）得到的Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-COOSu的四氢呋喃溶液或Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-COOSu的1,4-二氧六环溶液中，Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OH与蛋氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.0～1.2:1.5～3.0，蒸馏水与四氢呋喃或1,4-二氧六环的体积比为1:1～2，室温搅拌反应8～10小时，分离纯化产物，得到Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-OH；
（7）合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-COONp
将Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-OH与二氯甲烷按质量-体积比为1g:8～10mL混合，室温搅拌至溶解，加入对硝基苯酚，搅拌至溶解，加入二环己基碳二亚胺，Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-OH与对硝基苯酚、二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:1.1～1.3:1.2～1.5，室温反应6～8小时，分离纯化产物，得到Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-COONp；
（8）合成Fmoc-Gln(Trt)-COOSu
将Fmoc-Gln(Trt)-OH与四氢呋喃或1,4-二氧六环按质量-体积比为1g:8～10mL混合，室温搅拌至溶解，加入N-羟基丁二酰亚胺，搅拌至溶解，加入二环己基碳二亚胺，Fmoc-Gln(Trt)-OH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:1.0～1.3:1.2～1.5，室温反应5～8小时，过滤除去固体不溶物，得到Fmoc-Gln(Trt)-COOSu的四氢呋喃溶液或Fmoc-Gln(Trt)-COOSu的1,4-二氧六环溶液；
（9）合成Fmoc-Gln(Trt)-Arg-OH
将精氨酸与碳酸氢钠溶解于蒸馏水中，所得溶液滴加到步骤（8）得到的Fmoc-Gln(Trt)-COOSu的四氢呋喃溶液或Fmoc-Gln(Trt)-COOSu的1,4-二氧六环溶液中，Fmoc-Gln(Trt)-OH与精氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.0～1.2:1.5～3.0，蒸馏水与四氢呋喃或1,4-二氧六环的体积比为1:1～3，室温搅拌反应10～12小时，分离纯化产物，得到Fmoc-Gln(Trt)-Arg-OH；
（10）合成H2N-Gln(Trt)-Arg-OH
将Fmoc-Gln(Trt)-Arg-OH与二氯甲烷按质量-体积比为1g:8～10mL混合均匀，搅拌，加入哌啶或二乙胺，Fmoc-Gln(Trt)-Arg-OH与哌啶或二乙胺的摩尔比为1:3～5，室温搅拌反应20～24小时，分离纯化产物，得到H2N-Gln(Trt)-Arg-OH；
（11）合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-OH
将步骤（7）得到的Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-COONp与N,N-二甲基甲酰胺按质量-体积比为1g:6～8mL混合均匀，加入步骤（10）得到的H2N-Gln(Trt)-Arg-OH，室温搅拌至溶解；将碳酸氢钠溶于蒸馏水中，所得溶液滴加到H2N-Gln(Trt)-Arg-OH与Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-COONp的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-COONp与H2N-Gln(Trt)-Arg-OH、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.0～1.2:1.5～3，N,N-二甲基甲酰胺与蒸馏水的体积比为3～5:1，室温搅拌反应20～24小时，分离纯化产物，得到Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-OH；
（12）合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-Arg-NH2
将Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-OH与N,N－二甲基甲酰胺按质量-体积比为1g:10～12mL混合，室温搅拌至溶解，依次加入二环己基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑、H-Arg-NH2·2HCl、N-甲基吗啉，Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-OH与二环己基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑、H-Arg-NH2·2HCl、N-甲基吗啉的摩尔比为1:1.2～1.5:1.2～1.5:1.5～2:5～10，室温搅拌36～48小时，分离纯化产物，得到Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-Arg-NH2；
（13）制备六胜肽
将Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-Arg-NH2加入二氯甲烷与三氟乙酸的体积比为1:1的混合液中，Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-Arg-NH2与混合液的质量-体积比为1g:10～16mL，室温搅拌至溶解，加入三异丙基硅烷，Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-Arg-NH2与三异丙基硅烷的摩尔比为1:5～10，室温搅拌反应4～6小时，分离纯化产物，得到六胜肽。
2.根据权利要求1所述的六胜肽的液相分段合成方法，其特征在于：在合成H2N-Gln(Trt)-Arg-OH步骤（10）中，所述的Fmoc-Gln(Trt)-Arg-OH与哌啶或二乙胺的摩尔比为1:4。
3.根据权利要求1或2所述的六胜肽的液相分段合成方法，其特征在于：在合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-OH步骤（11）中，所述的Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-COONp与H2N-Gln(Trt)-Arg-OH、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.1:2。
4.根据权利要求1或2所述的六胜肽的液相分段合成方法，其特征在于：在合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-Arg-NH2步骤（12）中，所述的Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-OH与二环己基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑、H-Arg-NH2·2HCl、N-甲基吗啉的摩尔比为1:1.3:1.3:1.8:8。
5.根据权利要求3所述的六胜肽的液相分段合成方法，其特征在于：在合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-Arg-NH2步骤（12）中，所述的Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-OH与二环己基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑、H-Arg-NH2·2HCl、N-甲基吗啉的摩尔比为1:1.3:1.3:1.8:8。
6.根据权利要求1、2或5所述的六胜肽的液相分段合成方法，其特征在于：在制备六胜肽步骤（13）中，所述的Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-Arg-NH2与三异丙基硅烷的摩尔比为1:6。
7.根据权利要求3所述的六胜肽的液相分段合成方法，其特征在于：在制备六胜肽步骤（13）中，所述的Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-Arg-NH2与三异丙基硅烷的摩尔比为1:6。
8.根据权利要求4所述的六胜肽的液相分段合成方法，其特征在于：在制备六胜肽步骤（13）中，所述的Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-Arg-NH2与三异丙基硅烷的摩尔比为1:6。
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