CN103665109B - 成骨生长肽碳端五肽的合成方法 - Google Patents
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Abstract
一种成骨生长肽碳端五肽的合成方法，由以下步骤组成：合成Fmoc-Tyr(tbu)-COOSu、Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-OH、Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-OH活化，依次合成Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-OH、Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-COOSu、Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-OH、Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-ONp、Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-Gly-OH、NH2-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-Gly-OH、NH2-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OH。
Description
技术领域
本发明涉及多肽的合成，尤其是短肽的液相合成。
背景技术
成骨生长肽（OsteogenicGrowthPeptide）是有促进成骨和刺激造血作用的多肽类生长因子，一级结构为Ala-Leu-Lys-Arg-Gln-Gly-Arg-Thr-Leu-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly，其中碳端的五肽OGP（10～14）是保持成骨生长肽全部活性的最小片段，氨基酸序列为NH2-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OH。
成骨生长肽碳端五肽的制备方法有酶促合成法和固相合成法。其中固相合成法最为常用，即将保护甘氨酸接到固相载体上，按固定序列由碳端向氮端逐个延伸，通过缩合、脱除保护、再缩合、切割树脂、离心、干燥得到粗品，经高效液相制备得到纯度高于90%的产品。该方法使用了保护的氨基酸，并需过量的原料和试剂，导致增加了生产成本，污染了环境，浪费了原材料；且树脂载体的交换当量有限，只能进行小批量合成，不能满足实际生产需求。在成骨生长肽碳端五肽的制备方法技术领域，当前需迫切解决的一个技术问题是提供一种生产成本低、对环境污染少、收率高的合成方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述成骨生长肽碳端五肽制备方法的缺点，提供一种生产成本低、对环境污染少、收率高的成骨生长肽碳端五肽的合成方法。
解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成：
由下述步骤组成：
1、合成Fmoc-Tyr(tbu)-COOSu
将Fmoc-Tyr(tbu)-COOH置于反应瓶中，按每克Fmoc-Tyr(tbu)-COOH加入10mL1,4-二氧六环，室温搅拌，加入氮羟基丁二酰亚胺，再加入二环己基碳二亚胺，搅拌至溶解，Fmoc-Tyr(tbu)-COOH与氮羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺的摩尔比为1：1.2～1.8：1.2～2，室温反应10～12小时，减压过滤除去固体不溶物，滤液为溶有Fmoc-Tyr(tbu)-COOSu的1,4-二氧六环溶液。
2、合成Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-OH
将0.5mM/mL的甘氨酸水溶液和0.5mM/mL的碳酸氢钠水溶液等体积混合，混合液滴加到Fmoc-Tyr(tbu)-COOSu的1,4-二氧六环溶液中，Fmoc-Tyr(tbu)-COOSu与甘氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1：1.2～1.8：1.2～2，室温搅拌反应5～8小时，减压蒸除二氧六环，加1～5倍混合液体积的乙醚，搅拌，用质量分数为10%的柠檬酸水溶液调pH至2～3，析出白色固体，减压过滤收集白色固体，真空干燥箱内40℃以下干燥，得Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-OH。
3、Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-OH活化
将Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-OH置于反应瓶中，按每克Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-OH加入10mL乙酸乙酯，室温搅拌，加入氮羟基丁二酰亚胺或对硝基苯酚，再加入二环己基碳二亚胺，搅拌至溶解，Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-OH与氮羟基丁二酰亚胺或对硝基苯酚、二环己基碳二亚胺的摩尔比为1：1.2～1.8：1.2～2，室温反应12～15小时，减压过滤除去固体不溶物，滤液减压浓缩至干，得Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-COOSu或Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-ONp。
4、合成Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-OH
将步骤（3）所得的产物置于反应瓶中，按每克Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-COOSu或Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-ONp加入10mL四氢呋喃，室温搅拌，至完全溶解。
将0.5mM/mL的苯丙氨酸悬浮液和0.5mM/mL的碳酸氢钠水溶液等体积混合，混合液滴加到Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-COOSu或Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-ONp的四氢呋喃溶液中，苯丙氨酸与碳酸氢钠、Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-COOSu或Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-ONp的摩尔比为1.2～1.8：1.2～2：1，室温搅拌反应8～10小时，减压蒸除四氢呋喃，用质量分数为10%柠檬酸溶液调pH至2～3，有白色固体析出，减压过滤，蒸馏水淋洗滤饼，真空干燥箱内40℃以下干燥，得Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-OH。
5、合成Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-COOSu
将Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-OH置于反应瓶中，按每克Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-OH加入10mL1,4-二氧六环，采用步骤1的反应条件进行化学反应，得到溶有Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-COOSu的1,4-二氧六环溶液。
6、合成Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-OH
将0.5mM/mL的甘氨酸水溶液和0.5mM/mL的碳酸氢钠水溶液等体积混合，混合液滴加到Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-COOSu的1,4-二氧六环溶液中，Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-COOSu与甘氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1：1.2～1.8：1.2～2，室温搅拌反应10～15小时，减压蒸除二氧六环，用质量分数为10%柠檬酸溶液调pH为2～3，加乙酸乙酯萃取，分离有机相，有机相依次用水、质量浓度为26.5%氯化钠水溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥、过滤、滤液减压浓缩至干，得Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-OH粗品，用正己烷与乙醚体积比为1：3的混合液40KHz超声洗涤三次，真空干燥箱内40℃以下干燥，得到Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-OH纯品。
7、合成Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-ONp
将Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-OH置于反应瓶中，按每克Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-OH加入15mL二氯甲烷，室温搅拌，加入对硝基苯酚，再加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，搅拌至溶解，Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-OH与对硝基苯酚、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-碳酰二亚胺盐酸盐的摩尔比为1：1.2～1.8：1.2～2，室温反应15～17小时，水洗涤除去盐，有机相减压浓缩至干，得Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-ONp。
8、合成Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-Gly-OH
将步骤（7）所得的产物置于反应瓶中，按每克Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-ONp加入15mL四氢呋喃，室温搅拌至完全溶解。
将0.5mM/mL的甘氨酸水溶液和0.5mM/mL的碳酸氢钠水溶液等体积混合，混合液滴加到Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-ONp的四氢呋喃溶液中，Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-ONp与甘氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1：1.2～1.8：1.2～2，室温搅拌反应10～15小时，减压蒸除四氢呋喃，用质量分数为10%柠檬酸溶液调pH至2～3，白色固体析出，减压过滤，蒸馏水淋洗滤饼，真空干燥箱内40℃以下干燥，得Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-Gly-OH粗品，柱色谱分离，用乙酸乙酯冲洗杂质，再用甲醇与乙酸乙酯体积比为1：3的混合液冲洗目标物，收集，减压蒸干，得到Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-Gly-OH纯品。
9、合成NH2-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-Gly-OH
在每克Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-Gly-OH中加入10mL哌啶与1,4-二氧六环体积比为1：9的混合液，室温反应30分钟，减压蒸干，用水溶解，用二氯甲烷萃除杂质，水相减压浓缩至干，得NH2-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-Gly-OH。
10、合成NH2-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OH
在每克NH2-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-Gly-OH中加入10mL体积分数为95%的三氟乙酸水溶液，室温反应10分钟，减压浓缩，加浓缩体积7倍量的冷冻乙醚，搅拌，离心，分离出上清液，固体经真空干燥箱内40℃以下干燥，得NH2-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OH粗品，经反相色谱法纯化、浓缩、冻干得纯度大于93%的序列为NH2-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OH的成骨生长肽碳端五肽。
在本发明的合成Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-OH步骤2中，将0.5mM/mL的甘氨酸水溶液和0.5mM/mL的碳酸氢钠水溶液等体积混合，混合液滴加到Fmoc-Tyr(tbu)-COOSu的1,4-二氧六环溶液中，Fmoc-Tyr(tbu)-COOSu与甘氨酸、碳酸氢钠的最佳摩尔比为1：1.5：1.5，室温搅拌反应5～8小时，减压蒸除二氧六环，加3倍混合液体积的乙醚，搅拌，用质量分数为10%的柠檬酸水溶液调pH至2～3，析出白色固体，减压过滤收集白色固体，真空干燥箱内40℃以下干燥，得Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-OH。
在本发明的合成Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-ONp步骤7中，将Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-OH置于反应瓶中，按每克Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-OH加入15mL二氯甲烷，室温搅拌，加入对硝基苯酚，再加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，搅拌至溶解，Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-OH与对硝基苯酚、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的最佳摩尔比为1：1.5：1.5，室温反应15～17小时，水洗除去盐，有机相减压浓缩至干，得Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-ONp。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
本发明采用由氮端向碳端逐个延伸的方法合成成骨生长肽碳端五肽，选用游离的氨基酸，避免使用过量的原料和试剂，适应于规模化生产；与固相合成法相比，降低了生产成本，减少了试剂污染，提高了产量，能够满足实际需求。
附图说明
图1是采用本发明实施例1合成的成骨生长肽碳端五肽的液相色谱图。
图2是采用本发明实施例1合成的成骨生长肽碳端五肽的质谱图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1
以所用原料Fmoc-Tyr(tbu)-COOH的摩尔量为30mM合成成骨生长肽碳端五肽为例，其合成方法如下：
1、合成Fmoc-Tyr(tbu)-COOSu
将Fmoc-Tyr(tbu)-COOH13.78g置于500mL反应瓶中，加入140mL的1,4-二氧六环（即每克Fmoc-Tyr(tbu)-COOH加入10mL1,4-二氧六环）室温搅拌，加入5.18g氮羟基丁二酰亚胺，再加入9.28g二环己基碳二亚胺，搅拌至溶解，Fmoc-Tyr(tbu)-COOH与氮羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺的摩尔比为1：1.5：1.5，室温反应11小时，减压过滤除去固体不溶物，滤液为溶有Fmoc-Tyr(tbu)-COOSu的1,4-二氧六环溶液；
2、合成Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-OH
将90mL的0.5mM/mL甘氨酸水溶液和90mL的0.5mM/mL碳酸氢钠水溶液混合，混合液滴加到Fmoc-Tyr(tbu)-COOSu的1,4-二氧六环溶液中，Fmoc-Tyr(tbu)-COOSu与甘氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1：1.5：1.5，室温搅拌反应7小时，减压蒸除二氧六环，加3倍混合液体积的乙醚，搅拌，用质量分数为10%的柠檬酸水溶液调pH至2～3，析出白色固体，减压过滤收集白色固体，真空干燥箱内40℃以下干燥，得Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-OH14.29g，产率92.19%。
3、Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-OH活化
将14.29g的Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-OH置于500mL反应瓶中，加入143mL的乙酸乙酯（即每克Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-OH加入10mL乙酸乙酯），室温搅拌，加入4.77g氮羟基丁二酰亚胺，再加入8.56g二环己基碳二亚胺，搅拌至溶解，Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-OH与氮羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺的摩尔比为1：1.5：1.5，室温反应13小时，减压过滤除去固体不溶物，滤液减压浓缩至干，得Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-COOSu。
4、合成Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-OH
将步骤3所得的产物置于500mL反应瓶中，按每克Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-COOSu加入10mL四氢呋喃，室温搅拌，至完全溶解；
将83mL的0.5mM/mL苯丙氨酸悬浮液和83mL的0.5mM/mL碳酸氢钠水溶液混合，混合液滴加到Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-COOSu的四氢呋喃溶液中，苯丙氨酸与碳酸氢钠、Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-COOSu的摩尔比为1.5：1.5：1，室温搅拌反应9小时，减压蒸除四氢呋喃，用质量分数为10%柠檬酸溶液调pH至2～3，有白色固体析出，减压过滤，蒸馏水淋洗滤饼，真空干燥箱内40℃以下干燥，得Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-OH15.56g，产率84.75%。
5、合成Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-COOSu
将15.56g的Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-OH置于500mL反应瓶中，加入160mL的1,4-二氧六环（即每克Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-OH加入10mL1,4-二氧六环），采用步骤1的反应条件进行化学反应，得到溶有Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-COOSu的1,4-二氧六环溶液。
6、合成Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-OH
将70mL的0.5mM/mL甘氨酸水溶液和70mL的0.5mM/mL碳酸氢钠水溶液混合，混合液滴加到Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-COOSu的1,4-二氧六环溶液中，Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-COOSu与甘氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1：1.5：1.5，室温搅拌反应13小时，减压蒸除二氧六环，用质量分数为10%柠檬酸溶液调pH为2～3，加乙酸乙酯萃取，分离有机相，有机相依次用水、质量浓度为26.5%氯化钠水溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥、过滤、滤液减压浓缩至干，得Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-OH粗品，用正己烷与乙醚体积比为1：3的混合液40KHz超声洗涤三次，真空干燥箱内40℃以下干燥，得到Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-OH纯品12.67g，产率75.01%，纯度大于89%。
7、合成Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-ONp
将12.67g的Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-OH置于500mL反应瓶中，加入190mL二氯甲烷(即每克Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-OH加入15mL二氯甲烷)，室温搅拌，加入3.67g对硝基苯酚，再加入5.05g的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，搅拌至溶解，Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-OH与对硝基苯酚、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的摩尔比为1：1.5：1.5，室温反应16小时，水洗涤除去盐，有机相减压浓缩至干，得Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-ONp。
8、合成Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-Gly-OH
将步骤7所得的产物置于500mL反应瓶中，按每克Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-ONp加入15mL四氢呋喃，室温搅拌至完全溶解；
将52.8mL的0.5mM/mL的甘氨酸水溶液和52.8mL的0.5mM/mL的碳酸氢钠水溶液混合，混合液滴加到Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-ONp的四氢呋喃溶液中，Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-ONp与甘氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1：1.5：1.5，室温搅拌反应13小时，减压蒸除四氢呋喃，用质量分数为10%柠檬酸溶液调pH至2～3，白色固体析出，减压过滤，蒸馏水淋洗滤饼，真空干燥箱内40℃以下干燥，得Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-Gly-OH粗品，柱色谱分离，用乙酸乙酯冲洗杂质，再用甲醇与乙酸乙酯体积比为1：3的混合液冲洗目标物，收集，减压蒸干，得到Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-Gly-OH纯品9.7g，产率70.96%，纯度大于99%。
9、合成NH2-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-Gly-OH
在9.7g的Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-Gly-OH中加入97mL哌啶与1,4-二氧六环体积比为1：9的混合液（即每克Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-Gly-OH中加入10mL混合液），室温反应30分钟，减压蒸干，用水溶解，用二氯甲烷萃除杂质，水相减压浓缩至干，得NH2-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-Gly-OH6.82g，产率98.43%。
10、合成NH2-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OH
在6.82g的NH2-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-Gly-OH中加入70mL体积分数为95%的三氟乙酸水溶液，室温反应10分钟，减压浓缩至20mL，加浓缩液体积7倍量的冷冻乙醚，搅拌，离心，分离出上清液，固体经真空干燥箱内40℃以下干燥，得NH2-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OH粗品5.98g，产率97.51%，纯度大于80%，经反相色谱法纯化，浓缩，冻干得纯度大于93%的序列为NH2-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OH的成骨生长肽碳端五肽4.78g，总收率31.93%。
实施例2
以所用原料Fmoc-Tyr(tbu)-COOH的摩尔量为30mM合成成骨生长肽碳端五肽为例，其合成方法如下：
1、合成Fmoc-Tyr(tbu)-COOSu
将Fmoc-Tyr(tbu)-COOH13.78g置于500mL反应瓶中，加入140mL的1,4-二氧六环（即每克Fmoc-Tyr(tbu)-COOH加入10mL1,4-二氧六环）室温搅拌，加入4.14g氮羟基丁二酰亚胺，再加入7.42g二环己基碳二亚胺，搅拌至溶解，Fmoc-Tyr(tbu)-COOH与氮羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺的摩尔比为1：1.2：1.2，室温反应10～12小时。该步骤中的其他步骤与实施例1相同。
2、合成Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-OH
将72mL的0.5mM/mL甘氨酸水溶液和72mL的0.5mM/mL碳酸氢钠水溶液混合，混合液滴加到Fmoc-Tyr(tbu)-COOSu的1,4-二氧六环溶液中，Fmoc-Tyr(tbu)-COOSu与甘氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1：1.2：1.2，室温搅拌反应5～8小时，减压蒸除二氧六环，加1倍混合液体积的乙醚，搅拌。该步骤中的其他步骤与实施例1相同。
3、Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-OH活化
将Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-OH置于反应瓶中，按每克Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-OH加入10mL乙酸乙酯，室温搅拌，加入3.82g氮羟基丁二酰亚胺，再加入6.85g二环己基碳二亚胺，搅拌至溶解，Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-OH与氮羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺的摩尔比为1：1.2：1.2，室温反应12～15小时。该步骤中的其他步骤与实施例1相同。
4、合成Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-OH
将步骤3所得的产物置于500mL反应瓶中，按每克Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-COOSu加入10mL四氢呋喃，室温搅拌，至完全溶解；
将66.4mL的0.5mM/mL苯丙氨酸悬浮液和66.4mL的0.5mM/mL碳酸氢钠水溶液混合，混合液滴加到Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-COOSu的四氢呋喃溶液中，苯丙氨酸与碳酸氢钠、Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-COOSu的摩尔比为1.2：1.2：1，室温反应8～10小时。该步骤中的其他步骤与实施例1相同。
5、合成Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-COOSu
该步骤与实施例1相同。
6、合成Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-OH
将56mL的0.5mM/mL甘氨酸水溶液和56mL的0.5mM/mL碳酸氢钠水溶液混合，混合液滴加到Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-COOSu的1,4-二氧六环溶液中，Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-COOSu与甘氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1：1.2：1.2，室温搅拌反应10～15小时。该步骤中的其他步骤与实施例1相同。
7、合成Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-ONp
将Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-OH置于500mL反应瓶中，按每克Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-OH加入15mL二氯甲烷，室温搅拌，加入2.94g对硝基苯酚，再加入4.04g的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，搅拌至溶解，Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-OH与对硝基苯酚、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的摩尔比为1：1.2：1.2，室温反应15～17小时。该步骤中的其他步骤与实施例1相同。
8、合成Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-Gly-OH
将步骤7所得的产物置于500mL反应瓶中，按每克Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-ONp加入15mL四氢呋喃，室温搅拌至完全溶解；
将42.3mL的0.5mM/mL的甘氨酸水溶液和42.3mL的0.5mM/mL的碳酸氢钠水溶液混合，混合液滴加到Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-ONp的四氢呋喃溶液中，Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-ONp与甘氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1：1.2：1.2，室温搅拌反应10～15小时。该步骤中的其他步骤与实施例1相同。
其他步骤与实施例1相同。合成成序列为NH2-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OH的成骨生长肽碳端五肽。
实施例3
以所用原料Fmoc-Tyr(tbu)-COOH的摩尔量为30mM合成成骨生长肽碳端五肽为例，其合成方法如下：
1、合成Fmoc-Tyr(tbu)-COOSu
将13.78g的Fmoc-Tyr(tbu)-COOH置于500mL反应瓶中，加入140mL的1,4-二氧六环（即每克Fmoc-Tyr(tbu)-COOH加入10mL1,4-二氧六环）室温搅拌，加入6.21g氮羟基丁二酰亚胺，再加入12.37g二环己基碳二亚胺，搅拌至溶解，Fmoc-Tyr(tbu)-COOH与氮羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺的摩尔比为1：1.8：2，室温反应10～12小时。该步骤中的其他步骤与实施例1相同。
2、合成Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-OH
将108mL的0.5mM/mL甘氨酸水溶液和120mL的0.5mM/mL碳酸氢钠水溶液混合，混合液滴加到Fmoc-Tyr(tbu)-COOSu的1,4-二氧六环溶液中，Fmoc-Tyr(tbu)-COOSu与甘氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1：1.8：2，室温搅拌反应5～8小时，减压蒸除二氧六环，加5倍混合液体积的乙醚，搅拌。该步骤中的其他步骤与实施例1相同。
3、Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-OH活化
将Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-OH置于反应瓶中，按每克Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-OH加入10ml乙酸乙酯，室温搅拌，加入5.73g氮羟基丁二酰亚胺，再加入11.42g二环己基碳二亚胺，搅拌至溶解，Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-OH与氮羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺的摩尔比为1：1.8：2，室温反应12～15小时。该步骤中的其他步骤与实施例1相同。
4、合成Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-OH
将步骤3所得的产物置于500mL反应瓶中，按每克Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-COOSu加入10mL四氢呋喃，室温搅拌，至完全溶解；
将99.6mL的0.5mM/mL苯丙氨酸悬浮液和110.6mL的0.5mM/mL碳酸氢钠水溶液混合，混合液滴加到Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-COOSu的四氢呋喃溶液中，苯丙氨酸与碳酸氢钠、Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-COOSu的摩尔比为1.8：2：1，室温反应8～10小时。该步骤中的其他步骤与实施例1相同。
5、合成Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-COOSu
该步骤与实施例1相同。
6、合成Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-OH
将84mL的0.5mM/mL甘氨酸水溶液和93.3mL的0.5mM/mL碳酸氢钠水溶液混合，混合液滴加到Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-COOSu的1,4-二氧六环溶液中，Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-COOSu与甘氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1：1.8：2，室温搅拌反应10～15小时。该步骤中的其他步骤与实施例1相同。
7、合成Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-ONp
将Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-OH置于500mL反应瓶中，按每克Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-OH加入15mL二氯甲烷，室温搅拌，加入4.41g对硝基苯酚，再加入6.73g的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，搅拌至溶解，Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-OH与对硝基苯酚、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的摩尔比为1：1.8：2，室温反应15～17小时。该步骤中的其他步骤与实施例1相同。
8、合成Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-Gly-OH
将步骤7所得的产物置于500mL反应瓶中，按每克Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-ONp加入15mL四氢呋喃，室温搅拌至完全溶解；
将63.4mL的0.5mM/mL的甘氨酸水溶液和70.5mL的0.5mM/mL的碳酸氢钠水溶液混合，混合液滴加到Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-ONp的四氢呋喃溶液中，Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-ONp与甘氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1：1.8：2，室温搅拌反应10～15小时。该步骤中的其他步骤与实施例1相同。
其他步骤与实施例1相同。合成成序列为NH2-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OH的成骨生长肽碳端五肽。
实施例4
在以上的实施例1～3的Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-OH活化步骤3中，所用的氮羟基丁二酰亚胺用等摩尔的对硝基苯酚替换，该步骤的其他步骤与相应的实施例相同。得Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-ONp。在合成Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-OH步骤4中，所用的Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-COOSu用等摩尔的Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-ONp替换，该步骤的其他步骤与相应的实施例相同。得Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-OH。
其他步骤与相应的实施例相同。合成序列为NH2-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OH的成骨生长肽碳端五肽。
为了验证本发明的有益效果，发明人对实施例1合成的序列为NH2-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OH的成骨生长肽碳端五肽采用液相色谱仪测定纯度，见图1，纯度为93.04%，并采用质谱仪测定其结构，见图2，所合成的序列为NH2-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OH的成骨生长肽碳端五肽的分子量及分子离子峰与相应的分子量以及分子离子峰一致。
Claims (3)
1.一种成骨生长肽碳端五肽的合成方法，由下述步骤组成：
⑴合成Fmoc-Tyr(tbu)-COOSu
将Fmoc-Tyr(tbu)-COOH置于反应瓶中，按每克Fmoc-Tyr(tbu)-COOH加入10mL1,4-二氧六环，室温搅拌，加入氮羟基丁二酰亚胺，再加入二环己基碳二亚胺，搅拌至溶解，Fmoc-Tyr(tbu)-COOH与氮羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺的摩尔比为1：1.2～1.8：1.2～2，室温反应10～12小时，减压过滤除去固体不溶物，滤液为溶有Fmoc-Tyr(tbu)-COOSu的1,4-二氧六环溶液；
⑵合成Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-OH
将0.5mM/mL的甘氨酸水溶液和0.5mM/mL的碳酸氢钠水溶液等体积混合，混合液滴加到Fmoc-Tyr(tbu)-COOSu的1,4-二氧六环溶液中，Fmoc-Tyr(tbu)-COOSu与甘氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1：1.2～1.8：1.2～2，室温搅拌反应5～8小时，减压蒸除二氧六环，加1～5倍混合液体积的乙醚，搅拌，用质量分数为10％的柠檬酸水溶液调pH至2～3，析出白色固体，减压过滤收集白色固体，真空干燥箱内40℃以下干燥，得Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-OH；
⑶Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-OH活化
将Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-OH置于反应瓶中，按每克Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-OH加入10mL乙酸乙酯，室温搅拌，加入氮羟基丁二酰亚胺或对硝基苯酚，再加入二环己基碳二亚胺，搅拌至溶解，Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-OH与氮羟基丁二酰亚胺或对硝基苯酚、二环己基碳二亚胺的摩尔比为1：1.2～1.8：1.2～2，室温反应12～15小时，减压过滤除去固体不溶物，滤液减压浓缩至干，得Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-COOSu或Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-ONp；
⑷合成Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-OH
将步骤(3)所得的产物置于反应瓶中，按每克Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-COOSu或Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-ONp加入10mL四氢呋喃，室温搅拌，至完全溶解；
将0.5mM/mL的苯丙氨酸悬浮液和0.5mM/mL的碳酸氢钠水溶液等体积混合，混合液滴加到Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-COOSu或Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-ONp的四氢呋喃溶液中，苯丙氨酸与碳酸氢钠、Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-COOSu或Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-ONp的摩尔比为1.2～1.8：1.2～2：1，室温搅拌反应8～10小时，减压蒸除四氢呋喃，用质量分数为10％柠檬酸溶液调pH至2～3，有白色固体析出，减压过滤，蒸馏水淋洗滤饼，真空干燥箱内40℃以下干燥，得Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-OH；
⑸合成Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-COOSu
将Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-OH置于反应瓶中，按每克Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-OH加入10mL1,4-二氧六环，采用步骤(1)的反应条件进行化学反应，得到溶有Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-COOSu的1,4-二氧六环溶液；
⑹合成Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-OH
将0.5mM/mL的甘氨酸水溶液和0.5mM/mL的碳酸氢钠水溶液等体积混合，混合液滴加到Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-COOSu的1,4-二氧六环溶液中，Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-COOSu与甘氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1：1.2～1.8：1.2～2，室温搅拌反应10～15小时，减压蒸除二氧六环，用质量分数为10％柠檬酸溶液调pH为2～3，加乙酸乙酯萃取，分离有机相，有机相依次用水、质量浓度为26.5％氯化钠水溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥、过滤、滤液减压浓缩至干，得Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-OH粗品，用正己烷与乙醚体积比为1：3的混合液40KHz超声洗涤三次，真空干燥箱内40℃以下干燥，得到Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-OH纯品；
⑺合成Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-ONp
将Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-OH置于反应瓶中，按每克Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-OH加入15mL二氯甲烷，室温搅拌，加入对硝基苯酚，再加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，搅拌至溶解，Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-OH与对硝基苯酚、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-碳酰二亚胺盐酸盐的摩尔比为1：1.2～1.8：1.2～2，室温反应15～17小时，水洗涤除去盐，有机相减压浓缩至干，得Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-ONp；
⑻合成Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-Gly-OH
将步骤(7)所得的产物置于反应瓶中，按每克Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-ONp加入15mL四氢呋喃，室温搅拌至完全溶解；
将0.5mM/mL的甘氨酸水溶液和0.5mM/mL的碳酸氢钠水溶液等体积混合，混合液滴加到Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-ONp的四氢呋喃溶液中，Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-ONp与甘氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1：1.2～1.8：1.2～2，室温搅拌反应10～15小时，减压蒸除四氢呋喃，用质量分数为10％柠檬酸溶液调pH至2～3，白色固体析出，减压过滤，蒸馏水淋洗滤饼，真空干燥箱内40℃以下干燥，得Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-Gly-OH粗品，柱色谱分离，用乙酸乙酯冲洗杂质，再用甲醇与乙酸乙酯体积比为1：3的混合液冲洗目标物，收集，减压蒸干，得到Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-Gly-OH纯品；
⑼合成NH2-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-Gly-OH
在每克Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-Gly-OH中加入10mL哌啶与1,4-二氧六环体积比为1：9的混合液，室温反应30分钟，减压蒸干，用水溶解，用二氯甲烷萃除杂质，水相减压浓缩至干，得NH2-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-Gly-OH；
⑽合成NH2-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OH
在每克NH2-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-Gly-OH中加入10mL体积分数为95％的三氟乙酸水溶液，室温反应10分钟，减压浓缩，加浓缩体积7倍量的冷冻乙醚，搅拌，离心，分离出上清液，固体经真空干燥箱内40℃以下干燥，得NH2-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OH粗品，经反相色谱法纯化、浓缩、冻干得序列为NH2-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OH的成骨生长肽碳端五肽。
2.按照权利要求1所述的成骨生长肽碳端五肽的合成方法，其特征在于：在合成Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-OH步骤(2)中，将0.5mM/mL的甘氨酸水溶液和0.5mM/mL的碳酸氢钠水溶液等体积混合，混合液滴加到Fmoc-Tyr(tbu)-COOSu的1,4-二氧六环溶液中，Fmoc-Tyr(tbu)-COOSu与甘氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1：1.5：1.5，室温搅拌反应5～8小时，减压蒸除二氧六环，加3倍混合液体积的乙醚，搅拌，用质量分数为10％的柠檬酸水溶液调pH至2～3，析出白色固体，减压过滤收集白色固体，真空干燥箱内40℃以下干燥，得Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-OH。
3.按照权利要求1所述的成骨生长肽碳端五肽的合成方法，其特征在于：在合成Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-ONp步骤(7)中，将Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-OH置于反应瓶中，按每克Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-OH加入15mL二氯甲烷，室温搅拌，加入对硝基苯酚，再加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，搅拌至溶解，Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-OH与对硝基苯酚、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的摩尔比为1：1.5：1.5，室温反应15～17小时，水洗除去盐，有机相减压浓缩至干，得Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-ONp。
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