CN103936828A - 卡非佐米中间体及卡非佐米的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及卡非佐米中间体及卡非佐米的制备方法，所述方法包括（1）使固相树脂载体在活化剂存在下偶联Fmoc-Phe-OH得到Fmoc-Phe-树脂；（2）通过固相合成法，使Fmoc-Phe-树脂依次偶联Fmoc-Leu-OH，Fmoc-HoPhe-OH，4-吗啉乙酸，得四肽中间体树脂，其中使所述偶联在偶联剂系统存在下进行，所述偶联剂系统包括缩合剂和反应溶剂，在进行所述偶联之前，先使树脂脱除Fmoc保护基；（3）采用裂解剂使四肽中间体树脂发生裂解，脱除树脂得到卡非佐米四肽中间体。本发明方法收率高，污染小，反应简单可控，适于工业化生产。

Description

卡非佐米中间体及卡非佐米的制备方法

技术领域

本发明涉及一种卡非佐米中间体及卡非佐米的制备方法。

背景技术

卡非佐米外文名或通用名为Carfilzomib，具有以下结构：

2012年7月20日，美国食品与药品管理局(FDA)批准了ONYXPHARMSINC公司产品卡非佐米(Carfilzomib)注射用冻干粉针剂的上市，Carfilzomib可用于治疗之前接受过至少两种药物(包括硼替佐米和免疫调节剂)治疗的多发性骨髓瘤患者。多发性骨髓瘤是一种浆细胞恶性克隆性疾病，发病率逐年增加，已位居血液肿瘤的第二位，随着治疗水平的提高，虽然完全缓解率较高，但生存率仍较低，主要原因之一是复发。Carfilzomib的获批，为那些经当前疗法治疗后复发的多发性骨髓瘤患者，提供了一种治疗选择。

卡非佐米是一个3个氨基酸和2个氨基酸衍生物组成的五肽，报道的合成路线主要使用一个3个氨基酸和1个甘氨酸衍生物(四肽，中间体I)+1个亮氨酸衍生物(中间体II)的方案来合成。

关于卡非佐米的合成报道诸如US20050245435，WO2009045497A，CN103641890A等均采用了全液相合成法，从原料到中间体I的合成过程中，中间体需要多次萃取分离过量反应组分，有些保护基还需要氢化脱除，有的还需要反相HPLC提纯。这些方法普遍存在一些问题，如合成收率低，各中间体萃取分离造成产物损失，因此消耗较多的起始原料；而且全液相合成反应类型多，反应条件及所用溶剂复杂多样，可控性差，不利于大规模工业生产。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种树脂型卡非佐米中间体(四肽中间体树脂)，其由树脂固相载体和偶联在所述固相树脂载体上的卡非佐米四肽中间体构成，其中卡非佐米四肽中间体具有式I所示的结构：

通过该中间体来制备卡非佐米，反应步骤少，反应条件温和，制备工艺简单可控，收率高，可操作性强。

本发明的目的之二是提供一种上述树脂型卡非佐米中间体的制备方法，该方法反反应步骤少，反应条件温和，制备工艺简单可控，收率高。该制备方法包括如下步骤：

(1)、使树脂固相载体在活化剂存在下偶联Fmoc-Phe-OH得到Fmoc-Phe-树脂，所述树脂固相载体具有可与所述Fmoc-Phe-OH的羧基发生反应的功能基团；

(2)、通过固相合成法，使所述Fmoc-Phe-树脂依次偶联Fmoc-Leu-OH，Fmoc-HoPhe-OH和4-吗啉乙酸，得到所述树脂型卡非佐米中间体，其中使所述偶联在偶联剂系统存在下进行，所述偶联剂系统包括缩合剂和反应溶剂，在进行所述偶联之前，先使树脂脱除Fmoc保护基。

根据本发明，所述的固相树脂载体可以为选自三苯甲基氯类型树脂和羟基类型树脂中的一种或多种的组合。所述三苯甲基氯类型树脂包括但不限于三苯甲基氯树脂、4-甲基三苯甲基氯树脂、4-甲氧基三苯甲基氯树脂及2-氯三苯甲基氯树脂(CTCResin)；所述的羟基类型树脂包括但不限于王树脂(Wang Resin)和对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯树脂(HMP Resin)。

根据一个具体方面：所述的固相树脂载体为三苯甲基氯类型树脂，所述的活化剂为选自NMM、DIEA或二者的组合。

根据又一具体方面：所述的固相树脂载体为羟基类型树脂，所述的活化剂由DIC、HOBt和DMAP组成。

进一步地，步骤(1)中，所制备的Fmoc-Phe-树脂的取代度为0.2～1.2mmol/g，优选为0.7～0.9mmol/g。

进一步地，步骤(2)包括以下步骤：

a、采用DBLK使Fmoc-Phe-树脂脱除Fmoc保护基，得到H-Phe-树脂，所述DBLK为哌啶和DMF按照体积比1:3～5组成的溶液；

b、使H-Phe-树脂与Fmoc-Leu-OH在偶联剂系统的存在下偶联得到Fmoc-Leu-Phe-树脂；

c、采用DBLK使Fmoc-Leu-Phe-树脂脱除Fmoc保护基，得到H-Leu-Phe-树脂；

d、使H-Leu-Phe-树脂与Fmoc-HoPhe-OH在偶联剂系统的存在下偶联得到Fmoc-HoPhe-Leu-Phe-树脂；

e、采用DBLK使Fmoc-HoPhe-Leu-Phe-树脂脱除Fmoc保护基，得到H-HoPhe-Leu-Phe-树脂；

f、使H-HoPhe-Leu-Phe-树脂与4-吗啉乙酸在偶联剂系统的存在下偶联得到所述四肽中间体树脂。

具体地，步骤(2)中，使树脂脱除Fmoc保护基的方法为：向树脂中加入由哌啶和DMF按照体积比1:3～5组成的溶液，搅拌。

根据本发明，步骤(2)中，所述的缩合剂可以选自：DIC与HOBt的组合；HBTU、HCTU、PyBOP其中之一或二者的组合与HoBt和DIEA、NMM其中之一或二者的组合；HATU、PyAOP其中之一三者的任意组合与HOAt和DIEA、NMM其中之一或二者的组合。更具体的偶联剂系统有诸如：HoBt/DIC，HOBt+HBTU/DIEA，HOBt+PyBOP/NMM，HOBt+HCTU/NMM，HOAt+HATU/NMM，HOAt+HBTU/NMM，HOAt+PyBOP/NMM等。

上述步骤b、d、f中采用的偶联剂系统可相同或不同。

优选地，在进行步骤(1)、步骤(2)的a～f的反应之前，使树脂处于充分溶胀的状态。一个具体的方法是：将树脂加入DCM或其他低沸点非反应性溶剂中，氮气吹拂搅拌，使树脂充分溶胀后再抽干溶剂。

进一步地，步骤(2)中，所述反应溶剂选自DMF、DCM、NMP、DMSO或它们之间的任意组合。

进一步地，步骤(2)中，可以且优选使偶联在室温条件下进行。

进一步地，步骤(2)中，所述Fmoc-Leu-OH，Fmoc-HoPhe-OH，4-吗啉乙酸与它们所偶联的树脂的投料摩尔比为1.2～6:1。优选为2.5～3.5:1。

进一步地，步骤(2)中，偶联时间可以为室温条件下60～300分钟。优选100～140分钟。

本发明的又一目的是提供一种卡非佐米四肽中间体的制备方法，卡非佐米四肽中间体具有式I所示的结构：

所述方法通过使本发明的树脂型卡非佐米中间体在裂解剂存在下发生裂解，得到卡非佐米四肽中间体，所述裂解剂为TFA或TFE或它们的组合，或者为TFA或TFE或二者的组合与DCM的混合，裂解剂与所述树脂型卡非佐米中间体的体积质量比为4～15ml/g。

进一步地优选地，裂解剂与所述树脂型卡非佐米中间体的体积质量比为7～9ml/g。

进一步地，裂解可在室温条件下进行，裂解时间可以为1～6小时，优选2～3小时。

根据一个具体方面，所述固相树脂载体为CTC Resin树脂，所述裂解剂为TFA与DCM的混合或TFE与DCM的混合。优选地，裂解剂为0.1％～0.2％的TFA/DCM溶液或15％～25％TFE/DCM溶液。

本发明采取的又一技术方案是：一种卡非佐米的制备方法，其包括使卡非佐米四肽中间体与中间体II

II反应生成卡非佐米的步骤，特别是，所述的制备方法还包括采取本发明上述的方法来制备卡非佐米四肽中间体的步骤。

卡非佐米四肽中间体与中间体II的反应可参照已有技术来实施。根据本发明的一个具体方法如下：将四肽中间体、中间体II溶于有机溶剂中，降温至5℃以下，滴入偶联剂的溶液，室温反应。其中有机溶剂可以为DCM、DMF或THF等；偶联剂可以为DCC/HOSu，EDCI/HOSu。配制偶联剂的溶液采用的溶剂可以是DCM、DMF或THF等。反应的时间可以为室温条件下60～300分钟，优选室温条件下100～140分钟。反应完毕后，通过常规简单的后处理得到卡非佐米粗品。一个具体的后处理方法是：过滤反应体系，滤液中加入纯化水充分洗涤后，过滤，滤液静置弃水相。有机相依次用饱和食盐水、纯化水洗涤，所得有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩滤液，将滤液倒入冰乙醚中，结晶，固体用少量乙醚洗涤后，真空干燥。得卡非佐米粗品，纯度约94％～99.2％。

进一步地，所述制备方法还包括对卡非佐米四肽中间体与中间体II反应生成的卡非佐米粗品进行纯化的步骤。

优选地，所述的纯化包括如下工序：

②_「DMSO或DMF溶解卡非佐米粗品，溶解完过滤，保留滤液；

②采用制备型液相色谱仪将卡非佐米粗品分离纯化，所述制备型液相色谱仪采用C18或C8色谱柱，定义色谱仪的检测波长为230nm，洗脱流速为20～90ml/min，梯度洗脱条件为：时间0～40min；A相体积比浓度从60％～65％变为30％～45％，B相体积比浓度从40％～35％变为70％～55％，A相为0.1wt％～0.2wt％的TFA水溶液，B相为乙腈，纯化出峰以后，按已经编好号的收集瓶，收集样品，然后根据HPLC分析检测，按峰前，峰顶，峰后分别并样，其中纯度大于99％为合格品，收集合并；纯度小于99％的样品，收集合并，对纯度小于99％的样品按以上纯化步骤进行多次纯化得到合格品；

③采用制备型液相色谱仪对工序②得到的合格品进行脱盐，所述制备型液相色谱仪采用C18或C8色谱柱，其填料为10～50um的烷基键合硅胶，定义色谱仪的检测波长为230nm，洗脱流速为20～90ml/min，洗脱条件如下：

时间0～15min，A相体积比浓度在75％～85％之间，B相体积比浓度在15％～25％之间，A相体积比和B相体积比之和为100％，A相为乙酸铵，B相为乙腈；

时间16～25min，A相体积比浓度在75％～85％之间，B相体积比浓度在15％～25％之间，A相体积比和B相体积比之和为100％，A相为纯水，B相为乙腈；

时间26～40min，A相体积比浓度在15％～25％之间，B相体积比浓度在75％～85％之间，A相体积比和B相体积比之和为100％，A相为纯水，B相为乙腈；纯化出峰以后，收集主峰，合并在收集瓶中；

④通过减压浓缩除去工序③所得溶液中的乙腈和水，之后采用真空冷冻干燥机冻干得白色粉末即为卡非佐米成品。

优选地，工序②中，设纯度大于99.2％为合格品。

优选地，工序④中，减压浓缩在30～40℃，真空度10mbar以下进行。

具体地，真空冷冻干燥过程如下：

1)预冻：将浓缩溶液置于冻干箱内隔板上进行预冻，温度下降至-40℃以下，维持1.5～2.5小时；

2)升华干燥：通过隔板下的加热系统缓缓加热，温度升至-22℃～-28℃，维持约8～12小时，然后温度升至-2℃～2℃，维持6～10小时；

3)解吸附：温度升至28℃～32℃，维持3～7小时，取出。

采取本发明的上述提纯方法可将卡非佐米纯度提高至99.8％以上，且目标产品损失小。

本发明涉及的英文缩写所对应的中文名称见下表：

根据本发明，所用到的原料、试剂及中间体Ⅱ均可从市场购得。

由于以上技术方案的采用，本发明与现有技术相比具有如下优点：

本发明采用固相合成法成功制备卡非佐米四肽中间体，反应步骤少，反应条件温和，反应收率高(可达82.3％～93.7％)，可操作性强，利于工业化生产。

本发明提供的卡非佐米的制备方法，污染小，工艺简单可控、总收率高(可达76.8％～88.4％)，适于工业化生产卡非佐米。

附图说明

图1为实施例4制备过程中所得H-Leu-Phe-树脂经裂解脱除树脂后的产物的质谱图；

图2为实施例4制备过程中所得H-Hophe-Leu-Phe树脂经裂解脱除树脂后的产物的质谱图；

图3为实施例11制备所得四肽中间体的质谱图；

图4为实施例11制备所得四肽中间体的核磁谱图(DMSO)；

图5为实施例23制备所得卡非佐米的HPLC谱图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明的基本原理、主要特征和优点，而本发明不受以下实施例的限制。实施例中采用的实施条件可以根据具体要求做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。

实施例1Fmoc-Phe-树脂的制备

取Wang Resin(1.7mmol/g)10g置于多肽反应器中，加入DCM100mL，氮气吹拂搅拌30分钟，使树脂充分溶胀后抽干DCM。称取Fmoc-Phe-OH19.8g，HOBt8.3g,加入DMF80mL搅拌溶解，冰浴5分钟，加入DIC9.5mL，冰浴活化15分钟。过滤，滤液加入多肽反应器中，氮气吹拂搅拌反应。取DMAP0.75g加入20mLDMF溶解后，滴入多肽反应器中，反应2小时后抽干反应液，DMF洗涤3次，每次100mL，1分钟。取醋酸酐8.0mL，吡啶6.8mL，DMF80mL加入多肽反应器，氮气吹拂搅拌反应6小时。抽干反应液，DMF洗涤3次，每次100mL，1分钟。DCM洗涤4次，每次100mL，10分钟。取出树脂，烘干。得Fmoc-Phe-Wang Resin14.8g。取代度为0.87mmol/g。

实施例2Fmoc-Phe-树脂的制备

取CTC Resin(1.5mmol/g)8g置于多肽反应器中，加入DCM80mL，氮气吹拂搅拌30分钟，使树脂充分溶胀后抽干DCM。称取Fmoc-Phe-OH13.9g,加入DMF80mL搅拌溶解，加入DIEA18.9mL，冰浴15分钟后加入多肽反应器中，氮气吹拂搅拌反应2小时后抽干反应液，DMF洗涤3次，每次80mL，1分钟。加入封闭试剂(无水甲醇/DIEA/DCM＝1/2/17(体积比))封闭两次每次80mL，10分钟。DCM洗涤4次，每次80mL，10分钟。取出树脂，烘干。得Fmoc-Phe-CTC Resin11.7g。取代度为0.76mmol/g。

实施例3Fmoc-Phe-树脂的制备

取CTC Resin(1.5mmol/g)80g置于多肽反应器中，加入DCM800mL，氮气吹拂搅拌30分钟，使树脂充分溶胀后抽干DCM。称取Fmoc-Phe-OH139g，加入DMF800mL搅拌溶解，加入DIEA189mL，冰浴15分钟后加入多肽反应器中，氮气吹拂搅拌反应2小时后抽干反应液，DMF洗涤3次，每次800mL，1分钟。加入封闭试剂(无水甲醇/DIEA/DCM＝1/2/17(体积比))封闭两次每次800mL，10分钟。DCM洗涤4次，每次800mL，10分钟。取出树脂，烘干。得Fmoc-Phe-CTC Resin108g。取代度为0.75mmol/g。

实施例4四肽中间体树脂的制备

取Fmoc-Phe-Wang Resin11.5g(10mmol)置于多肽反应器中，加入DCM100mL，氮气吹拂搅拌30分钟，使树脂充分溶胀后抽干DCM。加入DBLK(由哌啶与DMF按体积比1:4组成)80mL脱Fmoc保护2次，5+15分钟，每次80mL。DMF洗涤5次，每次80mL，1分钟。称取Fmoc-Leu-OH10.6g(30mmol)，HOBt4.9g(36mmol)加入DMF80mL搅拌溶解，冰浴5分钟，加入DIC5.6mL(36mmol)，冰浴活化15分钟。过滤，滤液加入多肽反应器中，氮气吹拂搅拌反应2小时后抽干反应液，DMF洗涤3次，每次100mL，1分钟。按此方法依次接入Fmoc-HoPhe-OH，4-吗啉乙酸后DMF洗涤3次，每次80mL，1分钟。DCM洗涤4次，每次80mL，10分钟。取出肽树脂，烘干。得四肽中间体-Wang Resin肽树脂16.3g。在上述制备过程中，分别对H-Leu-Phe-树脂和H-Hophe-Leu-Phe树脂进行取样分析，将它们分别用裂解剂裂解脱去树脂后进行质谱分析，结果分别见图1和图2。

实施例5四肽中间体树脂的制备

取Fmoc-Phe-Wang Resin11.5g(10mmol)置于多肽反应器中，加入DCM100mL氮气吹拂搅拌30分钟，使树脂充分溶胀后抽干DCM。加入DBLK80mL脱Fmoc保护2次，5+15分钟，每次80mL。DMF洗涤5次，每次80mL，1分钟。称取Fmoc-Leu-OH10.6g(30mmol)，HOBt4.1g(30mmol)，HBTU10.2g(27mmol)加入DMF80mL搅拌溶解，冰浴5分钟，加入DIEA7.9mL(45mmol)，冰浴活化15分钟。过滤，滤液加入多肽反应器中，氮气吹拂搅拌反应2小时后抽干反应液，DMF洗涤3次，每次100mL，1分钟。按此方法依次接入Fmoc-HoPhe-OH，4-吗啉乙酸后DMF洗涤3次，每次80mL，1分钟。DCM洗涤4次，每次80mL，10分钟。取出肽树脂，烘干。得四肽中间体-Wang Resin肽树脂16.1g。

实施例6四肽中间体树脂的制备

取Fmoc-Phe-Wang Resin11.5g(10mmol)置于多肽反应器中，加入DCM100mL，氮气吹拂搅拌30分钟，使树脂充分溶胀后抽干DCM。加入DBLK80mL脱Fmoc保护2次，5+15分钟，每次80mL。DMF洗涤5次，每次80mL，1分钟。称取Fmoc-Leu-OH10.6g(30mmol)，HOBt4.1g(30mmol)，PyBOP14.1g(27mmol)加入DMF80mL搅拌溶解，冰浴5分钟，加入NMM9.9mL(90mmol)，冰浴活化15分钟。过滤，滤液加入多肽反应器中，氮气吹拂搅拌反应2小时后抽干反应液，DMF洗涤3次，每次100mL，1分钟。按此方法依次接入Fmoc-HoPhe-OH，4-吗啉乙酸后DMF洗涤3次，每次80mL，1分钟。DCM洗涤4次，每次80mL，10分钟。取出肽树脂，烘干。得四肽中间体-Wang Resin肽树脂15.8g。

实施例7四肽中间体树脂的制备

取Fmoc-Phe-Wang Resin11.5g(10mmol)置于多肽反应器中，加入DCM100mL，氮气吹拂搅拌30分钟，使树脂充分溶胀后抽干DCM。加入DBLK80mL脱Fmoc保护2次，5+15分钟，每次80mL。DMF洗涤5次，每次80mL，1分钟。称取Fmoc-Leu-OH10.6g(30mmol)，HOAt4.1g(30mmol)，HATU10.3g(27mmol)加入DMF80mL搅拌溶解，冰浴5分钟，加入NMM9.9mL(90mmol)，冰浴活化15分钟。过滤，滤液加入多肽反应器中，氮气吹拂搅拌反应2小时后抽干反应液，DMF洗涤3次，每次100mL，1分钟。按此方法依次接入Fmoc-HoPhe-OH，4-吗啉乙酸后DMF洗涤3次，每次80mL，1分钟。DCM洗涤4次，每次80mL，10分钟。取出肽树脂，烘干。得四肽中间体-Wang Resin肽树脂17.2g。

实施例8四肽中间体树脂的制备

取Fmoc-Phe-CTC Resin13.3g(10mmol)置于多肽反应器中，加入DCM100mL，氮气吹拂搅拌30分钟，使树脂充分溶胀后抽干DCM。加入DBLK80mL脱Fmoc保护2次，5+15分钟，每次80mL。DMF洗涤5次，每次80mL，1分钟。称取Fmoc-Leu-OH10.6g(30mmol)，HOBt4.9g(36mmol)，加入DMF80mL搅拌溶解，冰浴5分钟，加入DIC5.6mL(36mmol)，冰浴活化15分钟。过滤，滤液加入多肽反应器中，氮气吹拂搅拌反应2小时后抽干反应液，DMF洗涤3次，每次100mL，1分钟。按此方法依次接入Fmoc-HoPhe-OH，4-吗啉乙酸后DMF洗涤3次，每次80mL，1分钟。DCM洗涤4次，每次80mL，10分钟。取出肽树脂，烘干。得四肽中间体-CTC Resin肽树脂17.8g。

实施例9四肽中间体树脂的制备

取Fmoc-Phe-CTC Resin13.3g(10mmol)置于多肽反应器中，加入DCM100mL，氮气吹拂搅拌30分钟，使树脂充分溶胀后抽干DCM。加入DBLK80mL脱Fmoc保护2次，5+15分钟，每次80mL。DMF洗涤5次，每次80mL，1分钟。称取Fmoc-Leu-OH10.6g(30mmol)，HOAt4.1g(30mmol)，PyAOP14.1g(27mmol)加入DMF80mL搅拌溶解，冰浴5分钟，加入NMM9.9mL(90mmol)，冰浴活化15分钟。过滤，滤液加入多肽反应器中，氮气吹拂搅拌反应2小时后抽干反应液，DMF洗涤3次，每次100mL，1分钟。按此方法依次接入Fmoc-HoPhe-OH，4-吗啉乙酸后DMF洗涤3次，每次80mL，1分钟。DCM洗涤4次，每次80mL，10分钟。取出肽树脂，烘干。得四肽中间体-CTC Resin肽树脂18.7g。

实施例10四肽中间体树脂的制备

取Fmoc-Phe-CTC Resin13.3g(10mmol)置于多肽反应器中，加入DCM100mL氮气吹拂搅拌30分钟，使树脂充分溶胀后抽干DCM。加入DBLK80mL脱Fmoc保护2次，5+15分钟，每次80mL。DMF洗涤5次，每次80mL，1分钟。称取Fmoc-Leu-OH10.6g(30mmol),HOBt4.1g(30mmol),HCTU11.2g(27mmol)加入DMF80mL搅拌溶解，冰浴5分钟，加入NMM9.9mL(90mmol)，冰浴活化15分钟。过滤，滤液加入多肽反应器中，氮气吹拂搅拌反应2小时后抽干反应液，DMF洗涤3次，每次100mL，1分钟。按此方法依次接入Fmoc-HoPhe-OH，4-吗啉乙酸后DMF洗涤3次，每次80mL，1分钟。DCM洗涤4次，每次80mL，10分钟。取出肽树脂，烘干。得四肽中间体-CTC Resin肽树脂18.5g。

实施例11裂解

取实施例4所得四肽中间体-Wang Resin10g，加入80mL TFA中，室温搅拌裂解2.5小时。滤去树脂，将滤液加入640mL冰乙醚中，离心弃上清液。所得固体乙醚洗涤三次后真空干燥。将固体研磨成粉，溶于500mL DCM，加入无水碳酸钾5g干燥8小时。过滤，旋干滤液，得固体2.86g，经质谱、核磁测试确证为四肽中间体(参见图3和图4)，收率82.3％。

实施例12裂解

取实施例8所得四肽中间体-CTC Resin10g，加入80mL TFA中，室温搅拌裂解2.5小时。滤去树脂，将滤液加入640mL冰乙醚中，离心弃上清液。所得固体乙醚洗涤三次后真空干燥。将固体研磨成粉，溶于500mL DCM，加入无水碳酸钾5g干燥8小时。过滤，旋干滤液，得四肽中间体2.63g，收率82.7％。

实施例13裂解

取实施例10所得四肽中间体-CTC Resin10g，加入80mL0.1％TFA/DCM溶液中，室温搅拌裂解2.5小时。滤去树脂，加入无水碳酸钾5g干燥8小时。过滤，旋干滤液，将所得固体烘干，得四肽中间体2.71g，收率88.7％。

实施例14裂解

取实施例9所得四肽中间体-CTC Resin10g，加入80mL20％TFE/DCM溶液中，室温搅拌裂解1.5小时。滤出树脂，再加入80mL20％TFE/DCM溶液中室温搅拌裂解1.5小时后滤去树脂，合并滤液，加入5g无水硫酸钠干燥8小时。过滤，旋干滤液，将所得固体烘干，得四肽中间体2.84g，收率93.7％。

实施例15卡非佐米的合成

取实施例11所得四肽中间体2.27g(4mmol)，HOSu0.69g(6mmol)，中间体Ⅱ0.82g(4.8mmol)溶于100mL DCM，降温至5℃。取DCC1.24g(6mmol),溶于10mLDCM，滴入上述已降温溶液中室温反应2小时。过滤，滤液中加入纯化水50mL充分震荡洗涤，过滤，滤液静置弃水相。有机相饱和食盐水洗涤4次，每次50mL；纯化水洗涤4次每次50mL。所得有机相无水硫酸钠干燥8小时，过滤，浓缩滤液，将滤液倒入8倍体积的冰乙醚中，固体用少量乙醚洗涤3次后，真空干燥。得卡非佐米2.69g，收率93.3％，纯度97.8％，总收率76.8％。

实施例16卡非佐米的合成

取实施例13所得四肽中间体2.27g(4mmol)，HOSu0.69g(6mmol)，中间体Ⅱ0.82g(4.8mmol),溶于100mL DCM，降温至5℃。取EDCI1.15g(6mmol),溶于10mLDCM，滴入上述已降温溶液中室温反应2小时。过滤，滤液用饱和食盐水洗涤4次，每次50mL；纯化水洗涤4次，每次50mL。所得有机相浓缩后倒入8倍体积的0℃纯化水中，固体用少量0℃纯化水洗涤3次后，干燥。得卡非佐米2.75g，收率95.7％，纯度94.2％，总收率84.9％。

实施例17卡非佐米的合成

取实施例11所得四肽中间体2.27g(4mmol)，HOSu0.69g(6mmol)，中间体Ⅱ0.82g(4.8mmol)溶于100mL50％TFH/DCM溶液中，降温至5℃。取DCC1.24g(6mmol),溶于10mL DCM，滴入上述已降温溶液中室温反应2小时。过滤，滤液中加入饱和食盐水50mL充分震荡洗涤，过滤，滤液静置弃水相。有机相饱和食盐水洗涤4次，每次50mL；纯化水洗涤4次每次50mL。所得有机相无水硫酸钠干燥8小时，过滤，浓缩滤液，将滤液倒入8倍体积的冰正己烷中，固体用少量正己烷洗涤3次后，干燥。得卡非佐米2.72g，收率94.3％，纯度99.1％，总收率88.4％。

实施例18卡非佐米的纯化

①样品溶解：将实施例15方法制备的卡非佐米用DMSO按1g/20ml的浓度溶解，溶解完用滤纸过滤，得滤液。

②纯化过程：采用制备型液相色谱仪将卡非佐米粗品分离纯化。本例采用的液相色谱仪器为北京创新通恒P3000A制备型液相色谱仪，色谱柱为C18，该柱为直径3cm，孔径为120A的反相硅胶中低压制备柱，其填料为50um的十八烷基硅烷键合硅胶，定义色谱仪的检测波长为230nm，洗脱流速为30ml/min，上样量为2克。梯度洗脱条件如表所示。

时间(min)	A相(％,V/V)	B相(％,V/V)
			0～40	60～30	40～70

表中A相为TFA体积浓度为0.1％溶液，通过如下方法制得：将1ml的TFA加入950ml的水中，定容至1L，即得TFA溶液；B相为乙腈。A相的体积浓度从60％变为30％，B相的体积浓度从40％变为70％。

纯化出峰以后，按已经编好号的收集瓶，适时适量收集样品，然后根据HPLC分析检测，按峰前，峰顶，峰后分别并样。其中纯度大于99％为合格品，收集合并；纯度小于99％的样品，收集合并。对纯度小于99％的样品按以上纯化步骤进行多次纯化得到合格品。

③脱盐：采用制备型液相色谱仪将纯化得到的合格品脱盐，液相色谱仪器为北京创新通恒LC6000制备型液相色谱仪，色谱柱为C18，该柱为直径3cm，孔径为120A的反相硅胶中低压制备柱，其填料为50um的十八烷基硅烷键合硅胶，定义色谱仪的检测波长为230nm，洗脱流速为30ml/min，上样量为1.72克。洗脱条件如下表所示。

时间(min)	A相(％,V/V)	B相(％,V/V)
			0～15	80(50mmol乙酸铵)	20(乙腈)

15～25	80(纯水)	20(乙腈)
			25～40	20(纯水)	80(乙腈)

表中A相分别为乙酸铵和纯水。50mmol乙酸铵溶液通过如下方法制得：称取乙酸铵固体3.85克，加纯水溶解定容至1L，得50mmol乙酸铵溶液。B相为乙腈

收集样品的主峰，合并在收集瓶中。

④浓缩：脱盐后所收集的合格溶液马上经减压浓缩去处乙腈和部分水。浓缩条件为：温度35℃，真空度10mbar以下。浓缩液存放在玻璃培养皿中，准备冻干；

⑤冻干：采用真空冷冻干燥机冻干。将上步浓缩好的溶液放入冷冻干燥机中冷冻干燥得白色粉末，即得卡非佐米。具体冻干过程如下：

1)预冻：将浓缩溶液置于冻干箱内隔板上进行预冻，温度下降至-40℃以下，维持2小时。

2)升华干燥：通过隔板下的加热系统缓缓加热，温度升至-25℃左右，维持约10小时，然后温度升至0℃左右，维持10小时。

3)解吸附：温度升至30℃左右，维持6小时，取出，称量，纯化结果如下：

产品投放量	理论产量	实际产量	产品纯度	收率
					2.00克	1.82克	1.72克	99.4％	94.6％

实施例19卡非佐米的纯化

本例基本同实施例18，不同的是：本例中，纯化步骤采用的液相色谱仪器为北京创新通恒LC6000制备型液相色谱仪，色谱柱为C18中低压色谱柱，该柱为直径5cm，其填料为50um的十八烷基硅烷键合硅胶。设定洗脱流速为80ml/min，上样量为9克。梯度洗脱条件如下表所示。

时间(min)	A相(％,V/V)	B相(％,V/V)
			0～40	60～30	40～70

表中A相为TFA体积浓度为0.1％溶液，通过如下方法制得：将1ml的TFA加入950ml的水中，定容至1L，即得TFA溶液；B相为乙腈。A相的体积浓度从60％变为30％，B相的体积浓度从40％变为70％。纯化出峰以后，按已经编好号的收集瓶，适时适量收集样品，然后根据HPLC分析检测，按峰前，峰顶，峰后分别并样。其中纯度大于99％为合格品，收集合并；纯度小于99％的样品，收集合并。对纯度小于99％的样品按以上纯化步骤进行多次纯化得到合格品。

本例纯化结果如下：

产品投放量	理论产量	实际产量	产品纯度	收率
					9.00克	8.19克	7.61克	99.41％	92.9％

实施例20卡非佐米的纯化

本例基本同实施例18，不同的是：纯化色谱柱是直径3cm,孔径为120A的反相硅胶高压色谱制备柱，其填料为10um的十八烷基硅烷键合硅胶，定义洗脱流速为25ml/min，上样量为2克。梯度洗脱条件如下表所示：

时间(min)	A相(％,V/V)	B相(％,V/V)
			0～40	65～40	35～60

表中A相为TFA体积浓度为0.2％溶液，通过如下方法制得：将2ml的TFA加入950ml的水中，定容至1L，即得TFA溶液；B相为乙腈。A相的体积浓度从65％变为40％，B相的体积浓度从35％变为60％。

纯化出峰以后，按已经编好号的收集瓶，适时适量收集样品，然后根据HPLC分析检测，按峰前，峰顶，峰后分别并样。其中纯度大于99％为合格品，收集合并；纯度小于99％的样品，收集合并。对纯度小于99％的样品按以上纯化步骤进行多次纯化得到合格品。

本例纯化结果如下：

产品投放量	理论产量	实际产量	产品纯度	收率
					2.00克	1.82克	1.70克	99.70％	93.4％

实施例21卡非佐米的纯化

本例基本同实施例18，不同的是：不同的是：纯化色谱柱是C18，该柱为直径3cm,孔径为120A的反相硅胶中低压制备柱，其填料为50um的十八烷基硅烷键合硅胶，定义色谱仪的检测波长为230nm，洗脱流速为30ml/min，上样量为2克。梯度洗脱条件如下表所示：

时间(min)	A相(％,V/V)	B相(％,V/V)
			0～40	65～40	35～60

表中A相为TFA体积浓度为0.2％溶液，通过如下方法制得：将2ml的TFA加入950ml的水中，定容至1L，即得TFA溶液；B相为乙腈。A相的体积浓度从65％变为40％，B相的体积浓度从35％变为60％。

纯化出峰以后，按已经编好号的收集瓶，适时适量收集样品，然后根据HPLC分析检测，按峰前，峰顶，峰后分别并样。其中纯度大于99％为合格品，收集合并；纯度小于99％的样品，收集合并。对纯度小于99％的样品按以上纯化步骤进行多次纯化得到合格品。

本例纯化结果如下：

产品投放量	理论产量	实际产量	产品纯度	收率
					2.00克	1.82克	1.69克	99.6％	93.2％

实施例22卡非佐米的纯化

本例基本同实施例18，不同的是：本例中，纯化步骤采用的液相色谱仪器为北京创新通恒LC6000制备型液相色谱仪，色谱柱为C18中低压色谱柱，该柱为直径5cm，其填料为50um的十八烷基硅烷键合硅胶。设定洗脱流速为80ml/min，上样量为10克。梯度洗脱条件如下表所示：

时间(min)	A相(％,V/V)	B相(％,V/V)
			0～40	65～40	35～60

表中A相为TFA体积浓度为0.2％溶液，通过如下方法制得：将2ml的TFA加入950ml的水中，定容至1L，即得TFA溶液；B相为乙腈。A相的体积浓度从65％变为40％，B相的体积浓度从35％变为60％。

纯化出峰以后，按已经编好号的收集瓶，适时适量收集样品，然后根据HPLC分析检测，按峰前，峰顶，峰后分别并样。其中纯度大于99％为合格品，收集合并；纯度小于99％的样品，收集合并。对纯度小于99％的样品按以上纯化步骤进行多次纯化得到合格品。

产品投放量	理论产量	实际产量	产品纯度	收率
					10.00克	9.1克	8.64克	99.5％	95.0％

实施例23卡非佐米的纯化

本例基本同实施例18，不同的是：本例中，纯化步骤采用的液相色谱仪器为北京创新通恒LC6000制备型液相色谱仪，色谱柱为C8中低压色谱柱，该柱为直径5cm，其填料为50um的十八烷基硅烷键合硅胶。设定洗脱流速为80ml/min，上样量为9克。梯度洗脱条件如下表所示：

时间(min)	A相(％,V/V)	B相(％,V/V)
			0～40	64～42	36～58

表中A相为TFA体积浓度为0.2％溶液，通过如下方法制得：将2ml的TFA加入950ml的水中，定容至1L，即得TFA溶液；B相为乙腈。A相的体积浓度从64％变为42％，B相的体积浓度从36％变为58％。

纯化出峰以后，按已经编好号的收集瓶，适时适量收集样品，然后根据HPLC分析检测，按峰前，峰顶，峰后分别并样。其中纯度大于99％为合格品，收集合并；纯度小于99％的样品，收集合并。对纯度小于99％的样品按以上纯化步骤进行多次纯化得到合格品。

本例所得卡非佐米的HPLC谱图参见图5。

本例纯化结果如下：

产品投放量	理论产量	实际产量	产品纯度	收率
					9.00克	8.19克	7.70克	99.8％	94.1％

以上对本发明做了详尽的描述，实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (14)

1.一种树脂型卡非佐米中间体，其特征在于：它由树脂固相载体和偶联在所述树脂固相载体上的卡非佐米四肽中间体构成，所述卡非佐米四肽中间体具有式I所示的结构：

2.一种权利要求1所述的树脂型卡非佐米中间体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)、使树脂固相载体在活化剂存在下偶联Fmoc-Phe-OH得到Fmoc-Phe-树脂，所述树脂固相载体具有可与所述Fmoc-Phe-OH的羧基发生反应的功能基团；

(2)、通过固相合成法，使所述Fmoc-Phe-树脂依次偶联Fmoc-Leu-OH，Fmoc-HoPhe-OH和4-吗啉乙酸，得到所述树脂型卡非佐米中间体，其中使所述偶联在偶联剂系统存在下进行，所述偶联剂系统包括缩合剂和反应溶剂，在进行所述偶联之前，先使树脂脱除Fmoc保护基。

3.根据权利要求2所述的树脂型卡非佐米中间体的制备方法，其特征在于：所述树脂固相载体为选自三苯甲基氯类型树脂和羟基类型树脂中的一种或多种的组合。

4.根据权利要求3所述的树脂型卡非佐米中间体的制备方法，其特征在于：所述三苯甲基氯类型树脂包括三苯甲基氯树脂、4-甲基三苯甲基氯树脂、4-甲氧基三苯甲基氯树脂及2-氯三苯甲基氯树脂；所述的羟基类型树脂包括王树脂和对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯树脂。

5.根据权利要求3或4所述的树脂型卡非佐米中间体的制备方法，其特征在于：所述的树脂固相载体为三苯甲基氯类型树脂，所述的活化剂为NMM、DIEA或二者的组合；或者所述的树脂固相载体为羟基类型树脂，所述的活化剂由DIC、HOBt和DMAP组成。

6.根据权利要求2所述的树脂型卡非佐米中间体的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的Fmoc-Phe-树脂的取代度为0.2～1.2mmol/g。

7.根据权利要求2所述的树脂型卡非佐米中间体的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，使树脂脱除Fmoc保护基的方法为：向树脂中加入由哌啶和DMF按照体积比1:3～5组成的溶液，搅拌。

8.根据权利要求2所述的树脂型卡非佐米中间体的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的缩合剂选自：DIC与HOBt的组合；HBTU、HCTU、PyBOP其中之一或三者的任意组合与HoBt和DIEA、NMM其中之一或二者的组合；HATU、PyAOP其中之一或二者的组合与HOAt和DIEA、NMM其中之一或二者的组合。

9.根据权利要求2或8所述的树脂型卡非佐米中间体的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述反应溶剂选自DMF、DCM、NMP、DMSO或它们之间的任意组合。

10.根据权利要求2所述的树脂型卡非佐米中间体的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，使偶联在室温条件下进行，所述Fmoc-Leu-OH，Fmoc-HoPhe-OH，4-吗啉乙酸与它们所偶联的树脂的投料摩尔比为1.2～6:1。

11.一种卡非佐米四肽中间体的制备方法，所述卡非佐米四肽中间体具有式I所示的结构：

其特征在于：所述方法通过使权利要求1所述的树脂型卡非佐米中间体在裂解剂存在下发生裂解，得到所述的卡非佐米四肽中间体，所述裂解剂为TFA或TFE或它们的组合，或者为TFA或TFE或二者的组合与DCM的混合，裂解剂与所述树脂型卡非佐米中间体的体积质量比为4～15ml/g。

12.根据权利要求11所述的卡非佐米四肽中间体的制备方法，其特征在于：所述方法还包括采取权利要求2-10中任一项权利要求所述的树脂型卡非佐米中间体的制备方法来制备所述的树脂型卡非佐米中间体。

13.一种卡非佐米的制备方法，其包括使卡非佐米四肽中间体与中间体II

II反应生成卡非佐米的步骤，其特征在于：所述的制备方法还包括采取权利要求11或12所述的方法来制备所述的卡非佐米四肽中间体的步骤。

14.根据权利要求13所述的卡非佐米的制备方法，其特征在于：所述制备方法还包括对卡非佐米四肽中间体与中间体II反应生成的卡非佐米粗品进行纯化的步骤，所述的纯化包括如下工序：

①用DMSO或DMF溶解卡非佐米粗品，溶解完过滤，保留滤液；

②采用制备型液相色谱仪将卡非佐米粗品分离纯化，所述制备型液相色谱仪采用C18或C8色谱柱，定义色谱仪的检测波长为230nm，洗脱流速为20～90ml/min，梯度洗脱条件为：时间0～40min；A相体积比浓度从60％～65％变为30％～45％，B相体积比浓度从40％～35％变为70％～55％，A相为0.1wt％～0.2wt％的TFA水溶液，B相为乙腈，纯化出峰以后，按已经编好号的收集瓶，收集样品，然后根据HPLC分析检测，按峰前，峰顶，峰后分别并样，其中纯度大于99％为合格品，收集合并；纯度小于99％的样品，收集合并，对纯度小于99％的样品按以上纯化步骤进行多次纯化得到合格品；

③采用制备型液相色谱仪对工序②得到的合格品进行脱盐，所述制备型液相色谱仪采用C18或C8色谱柱，其填料为10～50um的烷基键合硅胶，定义色谱仪的检测波长为230nm，洗脱流速为20～90ml/min，洗脱条件如下：

时间0～15min，A相体积比浓度在75％～85％之间，B相体积比浓度在15％～25％之间，A相体积比和B相体积比之和为100％，A相为乙酸铵，B相为乙腈；

时间16～25min，A相体积比浓度在75％～85％之间，B相体积比浓度在15％～25％之间，A相体积比和B相体积比之和为100％，A相为纯水，B相为乙腈；

时间26～40min，A相体积比浓度在15％～25％之间，B相体积比浓度在75％～85％之间，A相体积比和B相体积比之和为100％，A相为纯水，B相为乙腈；纯化出峰以后，收集主峰，合并在收集瓶中；

④通过减压浓缩除去工序③所得溶液中的乙腈和部分水，之后采用真空冷冻干燥机冻干得白色粉末即为卡非佐米成品。