CN103330950A - 一种以氧化石墨烯为载体的Gd3+磁共振造影剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种以氧化石墨烯为载体的Gd³⁺磁共振造影剂的制备方法，属于医用材料制备技术领域。包括以下步骤：1）取氧化石墨烯分散至蒸馏水中，得到氧化石墨烯分散液；2）向氧化石墨烯分散液中加入碱性物质以及氯乙酸或氯乙酸钠，超声分散后，经离心洗涤处理后，再经透析，得到羧基化氧化石墨烯；3）将羧基化氧化石墨烯分散至蒸馏水中，得到羧基化氧化石墨烯分散液；将钆盐的水溶液加入羧基化氧化石墨烯分散液中，搅拌反应后，加入DTPA水溶液，混匀得到混合溶液后，透析，得到表面负载Gd³⁺的羧基化氧化石墨烯，即Gd³⁺磁共振造影剂。本发明方法简单易行，Gd³⁺负载牢固，制得的磁共振造影剂水分散稳定性良好，纵向弛豫率高。

Description

一种以氧化石墨烯为载体的Gd3+磁共振造影剂的制备方法

技术领域

本发明属于医用材料制备技术领域，涉及一种磁共振造影剂的制备方法，具体涉及一种以氧化石墨烯为载体的Gd³⁺磁共振造影剂的制备方法。

背景技术

磁共振分子影像技术具有较高的分辨率，能同时获得解剖与生理信息，有利于活体状态下的疾病诊断。与氧化铁相比，Gd³⁺已成为临床常用的磁共振造影剂，主要原因为：①Gd³⁺存在半满的4f层，磁矩较大；②电子自旋弛豫时间较长；③以加速水质子的弛豫为作用机理反映阳性结果，便于观察。

但是，游离的Gd³⁺离子有毒，必须以螯合物的形式用于临床，比如钆喷酸葡氨(Gd-DTPA)注射液。然而，Gd-DTPA类小分子造影剂作用时间较短，信号较弱，在心血管成像和癌细胞成像方面的应用受到限制(Pharm.Res.,2005,22,596-602)。

针对这一问题，众多研究者从大分子改性、纳米载体的引入方面做了改进(Chem.Soc.Rev.,2008,38,372-390;J.Am.Chem.Soc.,2008,130,2154-2155)。纳米载体的引入除了能提高造影剂的弛豫性能外，还具有构筑多功能和多模态探针的潜力。Lin等人采用包裹了荧光染料的硅纳米颗粒作为载体，在硅纳米颗粒的外表面通过共价键修饰引入Gd³⁺-DTPA，制得了核壳结构的双模态探针，其纵向弛豫率(r₁)为19.7mM^-1S^-1(Angew.Chem.Int.Edit.,2007,46,3680-3682)。为了进一步提高r₁值，他们将亲水的磺化聚苯乙烯引入到分子中，增强了Gd³⁺与周围水分子的接触能力(J.Am.Chem.Soc.,2007,129,8962-8963)。

如上所述，已报道的纳米载体负载Gd³⁺的研究中，都必须先将DTPA类小分子配体通过共价键或非共价键作用连接在载体表面，或者要对载体进行改性提高亲水性以增加Gd³⁺周围水分子浓度，反应过程较为繁琐。因此，设计选择一种比表面积大、带有大量亲水基团和配位点的纳米材料作为负载Gd³⁺载体，一步制备高弛豫效率的磁共振造影剂，显得尤为重要。

氧化石墨烯所带的大量含氧官能团赋予其强大的可功能化潜力和亲水性。除此之外，氧化石墨烯比表面积较大、生物相容性好，作为载体在生物及医学领域已得到广泛应用(Small,2009.6:537-544)。但是，氧化石墨烯用于负载磁共振造影剂的研究报道较少，且局限于Fe₃O₄在氧化石墨烯片上的沉积(J.Mater.Chem.,2011,21:3448-3454)。Ai-Jun Shen等使用聚二烯丙基二甲基胺盐酸盐(PDDA)改性Gd³⁺-DTPA，利用静电吸附作用实现了Gd³⁺在氧化石墨烯表面的负载(J.Biomed.Mater.Res.A,2012.100A:2499-2506)。但该方法仍需DTPA螯合Gd³⁺，反应较为复杂，且静电作用受环境pH值影响较大；李永勇等以亲水高分子改性的氧化石墨烯为纳米载体，制备磁共振造影剂(CN102397563A)，该载体与Gd³⁺或钆的螯合物(Gd³⁺-DTPA)之间不能产生共价键作用，通过物理作用吸附Gd³⁺-DTPA，负载牢固度较差。

发明内容

针对上述现有技术中存在的缺点，本发明的目的在于提供一种以氧化石墨烯为载体的Gd³⁺磁共振造影剂的制备方法，该制备方法简单、Gd³⁺负载牢固，制得的磁共振造影剂水分散稳定性良好，纵向弛豫率高。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种以氧化石墨烯为载体的Gd³⁺磁共振造影剂的制备方法，包括以下步骤：

1）以质量份数计，取1～3份氧化石墨烯，50～120份碱性物质，50～100份氯乙酸或氯乙酸钠；

在超声波作用下，将氧化石墨烯分散至蒸馏水中，分散1～2h后，得到质量浓度为0.5～2.5mg·mL^-1的氧化石墨烯分散液；

向氧化石墨烯分散液中加入碱性物质，以及氯乙酸或氯乙酸钠，在30～40℃下，超声分散1～4h后，得到羧基化氧化石墨烯分散液，将羧基化氧化石墨烯分散液经离心、洗涤处理，得到稳定的羧基化氧化石墨烯分散液，将稳定的羧基化氧化石墨烯分散液的pH值调节为5～6.5后，进行透析，得到纯净的羧基化氧化石墨烯分散液，冷冻干燥后，得到羧基化氧化石墨烯；

2）以质量份数计，取100～150份羧基化氧化石墨烯，1～30份GdCl₃·6H₂O或Gd(NO₃)₃·6H₂O，10～300份的质量浓度为5%的DTPA水溶液；

超声作用下，将羧基化氧化石墨烯分散于蒸馏水中，得到质量浓度为0.2～3.5mg·mL^-1的羧基化氧化石墨烯分散液；取GdCl₃·6H₂O或Gd(NO₃)₃·6H₂O，配成质量浓度为0.5～10mg·mL^-1的钆盐的水溶液；

将钆盐的水溶液加入羧基化氧化石墨烯分散液中，在25～50℃下，搅拌反应7～12h后，加入质量浓度为5%的DTPA水溶液，充分混匀，得到混合溶液；

3）将混合溶液透析后，得到表面负载Gd³⁺的羧基化氧化石墨烯，即Gd³⁺磁共振造影剂。

所述的氧化石墨烯是经以下步骤制备得到的：

1）以质量份数计，取1份天然鳞片石墨，150份浓硫酸，1.5份硝酸钠，1.5～9份高锰酸钾，280份质量浓度为5%的硫酸溶液，6份质量浓度为30%的H₂O₂；

2）在冰浴下，将天然鳞片石墨、浓硫酸及硝酸钠混合，搅拌反应15～30min，得到混合液，将高锰酸钾加入混合液中，升温至30～40℃下，搅拌反应0.5h～120h后，加入质量浓度为5%的硫酸溶液，升温至98℃，反应1～3h后，降温至60℃，加入质量浓度为30%的H₂O₂，搅拌反应1～3h，得到氧化石墨烯。

步骤1）所述的碱性物质为氢氧化钠、氨水、乙二胺和1,2-丙二胺中的一种或几种。

步骤1）所述的羧基化氧化石墨烯分散液的离心、洗涤处理，具体分为两个阶段：

第一阶段，对羧基化氧化石墨烯分散液反复离心、洗涤操作2～3次，每次均弃除上清液，收集最后一次离心得到的沉淀；

第二阶段，对第一阶段得到的沉淀洗涤后离心，再对得到的沉淀反复洗涤、离心直至离心时再无沉淀产生，合并每次离心的上清液，得到稳定的羧基化氧化石墨烯分散液；

其中，所述的离心是在9000～14000r/min下，离心5～10min；所述的洗涤是采用蒸馏水对沉淀进行洗涤。

步骤1）所述的透析是将pH值为5～6.5的、稳定的氧化石墨烯分散液置于截留分子量为1000～3500D的透析袋中，在去离子水中透析48～120h。

步骤1）是采用浓度为0.1mol·L^-1的盐酸、硫酸、硝酸或氢溴酸调节pH值。

步骤1）所述的冷冻干燥是将纯净的羧基化氧化石墨烯分散液置于冷冻干燥机中，冷冻至-60℃后，将冻结的羧基化氧化石墨烯样品真空干燥6～10h。

步骤3）所述的透析是将混合溶液置于截留分子量为1000～3500D的透析袋中，在去离子水中透析48～120h。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明首次采用羧基化氧化石墨烯为载体牢固负载Gd³⁺，制备得到水分散稳定性好、纵向弛豫效率高的Gd³⁺磁共振造影剂，具有以下优点：

1、羧基化氧化石墨烯上的羧基具有配位活性，相互距离较近的羧基可以直接螯合Gd³⁺，克服了其它载体必须经过共价键或非共价键引入多齿配体的缺陷；

2、羧基化氧化石墨烯的比表面积较大，亲水性较强，制得的Gd³⁺磁共振造影剂分散性较好，并有利于Gd³⁺与周围水分子的接触；

3、羧基化氧化石墨烯的可功能化潜力较大，因此，氧化石墨烯负载的Gd³⁺磁共振造影剂可被进一步功能化，具有制备多模态、靶向功能的和诊断与治疗同步的分子探针的潜力。

本发明方法简单易行，Gd³⁺负载牢固，制得的磁共振造影剂水分散稳定性良好，纵向弛豫率高，通过本发明方法制备得到的Gd³⁺磁共振造影剂，采用GE3.0T磁共振测试，显示其纵向弛豫率高达109.6mM^-1S^-1，比含等浓度Gd³⁺的临床用钆喷酸葡胺注射液高23倍，可减少注射剂量，延长体内作用时间，具有临床应用潜力。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

实施例1

1）Hummers氧化法制备氧化石墨烯

在0℃下，取1份天然鳞片石墨，150份浓硫酸和1.5份硝酸钠，混匀后，持续搅拌反应20min，得到混合液，将1.5份KMnO₄缓慢滴加入上述混合液中，滴加过程中温度不能高于20℃；滴加完毕后，撤除冰浴，升温至35℃，继续搅拌反应0.5h后，加入280份质量浓度为5%的硫酸溶液，升温至98℃，加热2h后，降温至60℃，并加入6份质量浓度为30%的H₂O₂，搅拌反应2h后，得到氧化石墨烯；

2）氧化石墨烯的羧基化

在超声波作用下，将1份氧化石墨烯分散至蒸馏水中，分散1h后，得到质量浓度为2.5mg·mL^-1的氧化石墨烯分散液，向氧化石墨烯分散液中加入50份氢氧化钠和50份氯乙酸，在30℃下，超声分散2h后，得到羧基化氧化石墨烯分散液；

将羧基化氧化石墨烯分散液，反复离心、洗涤操作2～3次，每次均弃除上清，收集最后一次离心得到的沉淀；将沉淀洗涤后离心，反复离心、洗涤操作直至离心时再无沉淀产生，合并每次离心的上清液，即得到稳定的羧基化氧化石墨烯分散液，所述的离心是在9000r/min下离心10min；

然后用浓度为0.1mol·L^-1的盐酸调节稳定的羧基化氧化石墨烯分散液pH值约为6后，置于截留分子量为1000D的透析袋中，在去离子水中透析120h，得到纯净的羧基化氧化石墨烯分散液，将纯净的羧基化氧化石墨烯分散液置于冷冻干燥机中，冷冻至-60℃后，将冻结的羧基化氧化石墨烯样品真空干燥6h后，得到羧基化氧化石墨烯（CGO）；

3）在羧基化氧化石墨烯表面负载Gd³⁺

在超声波作用下，将100份CGO加入到蒸馏水中，得到浓度为3.5mg·mL^-1的稳定的CGO分散液，将1份的Gd(NO₃)₃·6H₂O配制成浓度为10mg·mL^-1的水溶液后，加入上述的CGO分散液中，在25℃下，恒温搅拌12h后，向反应体系中加入10份质量浓度为5%的DTPA水溶液（用以螯合掉过量的钆离子），充分混匀后，得到混合溶液，将混合溶液移至截留分子量为1000D的透析袋中，在去离子水中透析120h，除去Gd-DTPA及其他小分子，得到表面负载Gd³⁺的羧基化氧化石墨烯（Gd³⁺-CGO），即Gd³⁺磁共振造影剂。

实施例2

1）采用Hummers氧化法制备氧化石墨烯

在0℃下，取1份天然鳞片石墨，150份浓硫酸和1.5份硝酸钠，混匀后，持续搅拌20min，得到混合液，将3份KMnO₄缓慢加入上述混合液中，且加入过程中温度不能高于20℃；加完后撤除冰浴，升温至35℃，继续搅拌反应5h后，加入280份质量浓度为5%的硫酸溶液，升温至98℃，加热2h后，降温至60℃，并加入6份质量浓度为30%的H₂O₂，搅拌反应2h后，得到氧化石墨烯；

2）氧化石墨烯的羧基化

在超声波作用下，将1份氧化石墨烯分散至蒸馏水中，分散1h后，得到质量浓度为1.5mg·mL^-1的氧化石墨烯分散液，向氧化石墨烯分散液中加入96份乙二胺和84份氯乙酸，在35℃下，超声分散2h后，得到羧基化氧化石墨烯分散液；

将羧基化氧化石墨烯分散液，反复离心、洗涤操作2～3次，每次均弃除上清，收集最后一次离心得到的沉淀；将沉淀洗涤后离心，反复离心、洗涤操作直至离心时再无沉淀产生，合并每次离心的上清液，即得到稳定的羧基化氧化石墨烯分散液，所述的离心是在10000r/min下离心8min；

然后用浓度为0.1mol·L^-1的硫酸调节稳定的羧基化氧化石墨烯分散液pH值约为6后，置于截留分子量为2000D的透析袋中，在去离子水中透析72h，得到纯净的羧基化氧化石墨烯分散液，将纯净的羧基化氧化石墨烯分散液置于冷冻干燥机中，冷冻至-60℃后，将冻结的羧基化氧化石墨烯样品真空干燥8h后，得到羧基化氧化石墨烯（CGO）；

3）在羧基化氧化石墨烯表面负载Gd³⁺

在超声波作用下，将100份CGO加入到蒸馏水中，得到浓度为2.5mg·mL^-1的稳定的CGO分散液，将10份的GdCl₃·6H₂O配制成浓度为8mg·mL^-1的水溶液后，加入上述稳定的CGO分散液中，在25℃下，恒温搅拌10h后，向反应体系中加入100份质量浓度为5%的DTPA水溶液（用以螯合掉过量的钆离子），充分混匀后，得到混合溶液，将混合溶液移至截留分子量为2000D的透析袋中，在去离子水中透析72h，除去Gd-DTPA及其他小分子，得到表面负载Gd³⁺的羧基化氧化石墨烯（Gd³⁺-CGO），即Gd³⁺磁共振造影剂。

实施例3

1）采用Hummers氧化法制备氧化石墨烯

在0℃下，取1份天然鳞片石墨，150份浓硫酸和1.5份硝酸钠，混匀后，持续搅拌20min，得到混合液，将4份的KMnO₄缓慢加入上述混合液中，且加入过程中温度不能高于20℃；加完后撤除冰浴，升温至40℃，继续搅拌反应12h后，加入280份质量浓度为5%的硫酸溶液，升温至98℃，加热1h后，降温至60℃，并加入6份质量浓度为30%的H₂O₂，搅拌反应2h后，得到氧化石墨烯；

2）氧化石墨烯的羧基化

在超声波作用下，将2份氧化石墨烯分散至蒸馏水中，分散2h后，得到质量浓度为0.5mg·mL^-1的氧化石墨烯分散液，向氧化石墨烯分散液中加入96份氨水和84份氯乙酸，在40℃下，超声分散2h后，得到羧基化氧化石墨烯分散液；

将羧基化氧化石墨烯分散液，反复离心、洗涤操作2～3次，每次均弃除上清，收集最后一次离心得到的沉淀；将沉淀洗涤后离心，反复离心、洗涤操作直至离心时再无沉淀产生，合并每次离心的上清液，即得到稳定的羧基化氧化石墨烯分散液，所述的离心是在13000r/min下离心6min；

然后用浓度为0.1mol·L^-1的硝酸调节稳定的羧基化氧化石墨烯分散液pH值约为6.5后，置于截留分子量为2000D的透析袋中，在去离子水中透析72h，得到纯净的羧基化氧化石墨烯分散液，将纯净的羧基化氧化石墨烯分散液置于冷冻干燥机中，冷冻至-60℃后，将冻结的羧基化氧化石墨烯样品真空干燥6h后，得到羧基化氧化石墨烯（CGO）；

3）在羧基化氧化石墨烯表面负载Gd³⁺

在超声波作用下，将120份CGO加入到蒸馏水中，得到浓度为2.5mg·mL^-1的稳定的CGO分散液，将12.5份的GdCl₃·6H₂O配制成浓度为5mg·mL^-1的水溶液后，加入上述稳定的CGO分散液中，在35℃下，恒温搅拌10h后，向反应体系中加入125份质量浓度为5%的DTPA水溶液（用以螯合掉过量的钆离子），充分混匀后，得到混合溶液，将混合溶液移至截留分子量为1000D的透析袋中，在去离子水中透析80h，除去Gd-DTPA及其他小分子，得到表面负载Gd³⁺的羧基化氧化石墨烯（Gd³⁺-CGO），即Gd³⁺磁共振造影剂。

实施例4

1）采用Hummers氧化法制备氧化石墨烯

在0℃下，将1份天然鳞片石墨，150份浓硫酸和1.5份硝酸钠，混匀后，持续搅拌30min，得到混合液，将5份的KMnO₄缓慢加入上述混合液中，且加入过程中温度不能高于20℃；加完后撤除冰浴，升温至35℃，继续搅拌反应24h后，加入280份质量浓度为5%的硫酸溶液，升温至98℃，加热2h后，降温至60℃，并加入6份质量浓度为30%的H₂O₂，搅拌反应1h后，得到氧化石墨烯；

2）氧化石墨烯的羧基化

在超声波作用下，将3份氧化石墨烯分散至蒸馏水中，分散2h后，得到质量浓度为1.0mg·mL^-1的氧化石墨烯分散液，向氧化石墨烯分散液中加入120份混合碱液（由60份氢氧化钠和60份氨水组成）和100份氯乙酸钠，在35℃下，超声分散2h后，得到羧基化氧化石墨烯分散液；

将羧基化氧化石墨烯分散液，反复离心、洗涤操作2～3次，每次均弃除上清，收集最后一次离心得到的沉淀；将沉淀洗涤后离心，反复离心、洗涤操作直至离心时再无沉淀产生，合并每次离心的上清液，即得到稳定的羧基化氧化石墨烯分散液，所述的离心是在12000r/min下离心7min；

然后用浓度为0.1mol·L^-1的氢溴酸调节稳定的羧基化氧化石墨烯分散液pH值约为6后，置于截留分子量为3000D的透析袋中，在去离子水中透析52h，得到纯净的羧基化氧化石墨烯分散液，将纯净的羧基化氧化石墨烯分散液置于冷冻干燥机中，冷冻至-60℃后，将冻结的羧基化氧化石墨烯样品真空干燥10h后，得到羧基化氧化石墨烯（CGO）；

3）在羧基化氧化石墨烯（CGO）表面负载Gd³⁺

在超声波作用下，将100份CGO加入到蒸馏水中，得到浓度为1mg·mL^-1的稳定的CGO分散液，将20份的GdCl₃·6H₂O配制成浓度为2.5mg·mL^-1的水溶液后，加入上述稳定的CGO分散液中，在35℃下，恒温搅拌8h后，向反应体系中加入200份质量浓度为5%的DTPA水溶液（用以螯合掉过量的钆离子），充分混匀后，得到混合溶液，将混合溶液移至截留分子量为3000D的透析袋中，在去离子水中透析55h，除去Gd-DTPA及其他小分子，得到表面负载Gd³⁺的羧基化氧化石墨烯（Gd³⁺-CGO），即Gd³⁺磁共振造影剂。

实施例5

1）采用Hummers氧化法制备氧化石墨烯

在0℃下，将1份天然鳞片石墨，150份浓硫酸和1.5份硝酸钠，混匀后，持续搅拌25min，得到混合液，将6份的KMnO₄缓慢加入上述混合液中，且加入过程中温度不能高于20℃；加完后撤除冰浴，升温至30℃，继续搅拌反应3d后，加入280份质量浓度为5%的硫酸溶液，升温至98℃，加热3h后，降温至60℃，并加入6份质量浓度为30%的H₂O₂，搅拌反应2h后，得到氧化石墨烯；

2）氧化石墨烯的羧基化

在超声波作用下，将1份氧化石墨烯分散至蒸馏水中，分散1.5h后，得质量浓度为2.0mg·mL^-1的氧化石墨烯分散液，向氧化石墨烯分散液中加入107份混合碱液（40份氢氧化钠和67份乙二胺组成）和100份氯乙酸钠，在40℃下，超声分散4h后，得到羧基化氧化石墨烯分散液；

将羧基化氧化石墨烯分散液，反复离心、洗涤操作2～3次，每次均弃除上清，收集最后一次离心得到的沉淀；将沉淀洗涤后离心，反复离心、洗涤操作直至离心时再无沉淀产生，合并每次离心的上清液，即得到稳定的羧基化氧化石墨烯分散液，所述的离心是在14000r/min下离心5min；

然后用浓度为0.1mol·L^-1的盐酸调节稳定的羧基化氧化石墨烯分散液pH值约为5后，置于截留分子量为3500D的透析袋中，在去离子水中透析48h，得到纯净的羧基化氧化石墨烯分散液，将纯净的羧基化氧化石墨烯分散液置于冷冻干燥机中，冷冻至-60℃后，将冻结的羧基化氧化石墨烯样品真空干燥8h后，得到羧基化氧化石墨烯（CGO）；

3）在羧基化氧化石墨烯（CGO）表面负载Gd³⁺

在超声波作用下，将100份CGO加入到蒸馏水中，得到浓度为0.5mg·mL^-1的稳定的CGO分散液，将25份的GdCl₃·6H₂O配制成浓度为1mg·mL^-1的水溶液后，加入上述稳定的CGO分散液中，在40℃下，恒温搅拌9h后，向反应体系中加入250份质量浓度为5%的DTPA水溶液（用以螯合掉过量的钆离子），充分混匀后，得到混合溶液，将混合溶液移至截留分子量为3500D的透析袋中，在去离子水中透析48h，除去Gd-DTPA及其他小分子，得到表面负载Gd³⁺的羧基化氧化石墨烯（Gd³⁺-CGO），即Gd³⁺磁共振造影剂。

实施例6

1）采用Hummers氧化法制备氧化石墨烯

在0℃下，将1份天然鳞片石墨，150份浓硫酸和1.5份硝酸钠，混匀后，持续搅拌15min，得到混合液，将9份的KMnO₄缓慢加入上述混合液中，且加入过程中温度不能高于20℃；加完后撤除冰浴，升温至35℃，继续搅拌反应5d后，加入280份质量浓度为5%的硫酸溶液，升温至98℃，加热2h后，降温至60℃，并加入6份质量浓度为30%的H₂O₂，搅拌反应3h后，得到氧化石墨烯；

2）氧化石墨烯的羧基化

在超声波作用下，将1份氧化石墨烯分散至蒸馏水中，分散1h后，得到质量浓度为2.5mg·mL^-1的氧化石墨烯分散液，向氧化石墨烯分散液中加入120份混合碱液（30份氢氧化钠、30份氨水和60份1,2-丙二胺组成）和100份氯乙酸钠，在30℃下，超声分散1h后，得到羧基化氧化石墨烯分散液；

将羧基化氧化石墨烯分散液，反复离心、洗涤操作2～3次，每次均弃除上清，收集最后一次离心得到的沉淀；将沉淀洗涤后离心，反复离心、洗涤操作直至离心时再无沉淀产生，合并每次离心的上清液，即得到稳定的羧基化氧化石墨烯分散液，所述的离心是在12000r/min下离心8min；

然后用浓度为0.1mol·L^-1的盐酸调节稳定的羧基化氧化石墨烯分散液pH值约为5.5后，置于截留分子量为1000D的透析袋中，在去离子水中透析120h，得到纯净的羧基化氧化石墨烯分散液，将纯净的羧基化氧化石墨烯分散液置于冷冻干燥机中，冷冻至-60℃后，将冻结的羧基化氧化石墨烯样品真空干燥7h后，得到羧基化氧化石墨烯（CGO）；

3）在羧基化氧化石墨烯表面负载Gd³⁺

在超声波作用下，将150份CGO加入到蒸馏水中，得到浓度为1.5mg·mL^-1的稳定的CGO分散液，将30份的Gd(NO₃)₃·6H₂O配制成浓度为0.5mg·mL^-1的水溶液后，加入上述稳定的CGO分散液中，在50℃下，恒温搅拌7h后，向反应体系中加入300份质量浓度为5%的DTPA水溶液（用以螯合掉过量的钆离子），充分混匀后，得到混合溶液，将混合溶液移至截留分子量为1000D的透析袋中，在去离子水中透析120h，除去Gd-DTPA及其他小分子，得到表面负载Gd³⁺的羧基化氧化石墨烯（Gd³⁺-CGO），即Gd³⁺磁共振造影剂。

综上所述，本发明通过新型载体的设计与选择，一方面简化了传统纳米载体构建Gd³⁺磁共振造影剂的过程；另一方面使磁共振造影剂的纵向弛豫率显著增加。本发明的优点体现在以下几个方面：

1）选择氧化石墨烯，且经羧基化处理的氧化石墨烯为纳米载体，制备了Gd³⁺磁共振造影剂；

2）选用的羧基化氧化石墨烯纳米载体带有活性配位点，无须经过共价键或非共价键改性连接小分子配体（如DTPA），可简化制备Gd³⁺磁共振造影剂的制备过程；

3）选用的羧基化氧化石墨烯纳米载体含有较多亲水官能团，便于Gd³⁺与周围水分子接触，有利于提高磁共振造影剂的纵向弛豫效率；

4）通过本发明方法制备的Gd³⁺磁共振造影剂在水中具有较好的分散稳定性，其磁共振信号强度远远大于临床应用的钆喷酸葡胺注射液，并且其纵向弛豫率较钆喷酸葡胺注射液显著增加，具有临床应用潜力，可减少注射剂量，延长体内作用时间，实现双、多模态造影和靶向定位目的。

通过本发明方法制备得到的Gd³⁺磁共振造影剂，采用GE3.0T磁共振测试，通过反转恢复法（TI=100、TI=300、TI=600,TR/TE=4000ms/9.2ms）测定了Gd³⁺浓度相同（0.5mM）的Gd³⁺-CGO和临床应用的钆喷酸葡胺注射液及水的纵向弛豫时间T₁(s)。通过公式(1/T₁)_obsd=(1/T₁)_dia+r₁×[M]计算纵向弛豫速率r₁(mM^-1S^-1)，式中(1/T₁)_obsd为水质子的弛豫速率，(1/T₁)_dia为含顺磁性物质的水溶液中水质子的弛豫速率，[M]为溶液中Gd³⁺浓度。

本发明制备得到的Gd³⁺磁共振造影剂的纵向弛豫速率为109.6mM^-1S^-1，比临床用钆喷酸葡胺注射液高23倍。这种效果是已报道的载体型磁共振造影剂未能达到的。这将对影像医学的发展带来很大的推动作用，并对药物的研发、新的医疗模态的形成和人类健康产生深远的影响。

Claims (10)

1.一种以氧化石墨烯为载体的Gd³⁺磁共振造影剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）以质量份数计，取1～3份氧化石墨烯，50～120份碱性物质，50～100份氯乙酸或氯乙酸钠；

在超声波作用下，将氧化石墨烯分散至蒸馏水中，分散1～2h后，得到质量浓度为0.5～2.5mg·mL^-1的氧化石墨烯分散液；

向氧化石墨烯分散液中加入碱性物质，以及氯乙酸或氯乙酸钠，在30～40℃下，超声分散1～4h后，得到羧基化氧化石墨烯分散液，将羧基化氧化石墨烯分散液经离心、洗涤处理，得到稳定的羧基化氧化石墨烯分散液，再调节其pH值为5～6.5后进行透析，得到纯净的羧基化氧化石墨烯分散液，冷冻干燥后，得到羧基化氧化石墨烯；

2）以质量份数计，取100～150份羧基化氧化石墨烯，1～30份GdCl₃·6H₂O或Gd(NO₃)₃·6H₂O，10～300份的质量浓度为5%的DTPA水溶液；

超声作用下，将羧基化氧化石墨烯分散于蒸馏水中，得到质量浓度为0.2～3.5mg·mL^-1的羧基化氧化石墨烯分散液；

取GdCl₃·6H₂O或Gd(NO₃)₃·6H₂O，配成质量浓度为0.5～10mg·mL^-1的钆盐的水溶液；

将钆盐的水溶液加入羧基化氧化石墨烯分散液中，在25～50℃下，搅拌反应7～12h后，加入质量浓度为5%的DTPA水溶液，充分混匀，得到混合溶液；

3）将混合溶液透析后，得到表面负载Gd³⁺的羧基化氧化石墨烯，即Gd³⁺磁共振造影剂。

2.根据权利要求1所述的一种以氧化石墨烯为载体的Gd³⁺磁共振造影剂的制备方法，其特征在于，所述的氧化石墨烯是经以下步骤制备得到的：

1）以质量份数计，取1份天然鳞片石墨，150份浓硫酸，1.5份硝酸钠，1.5～9份高锰酸钾，280份质量浓度为5%的硫酸溶液，6份质量浓度为30%的H₂O₂；

2）在冰浴下，将天然鳞片石墨、浓硫酸及硝酸钠混合，搅拌反应15～30min，得到混合液，将高锰酸钾加入混合液中，升温至30～40℃下，搅拌反应0.5h～120h后，加入质量浓度为5%的硫酸水溶液，升温至98℃，反应1～3h后，降温至60℃，加入质量浓度为30%的H₂O₂，搅拌反应1～3h，得到氧化石墨烯。

3.根据权利要求1所述的一种以氧化石墨烯为载体的Gd³⁺磁共振造影剂的制备方法，其特征在于，步骤1）所述的碱性物质为氢氧化钠、氨水、乙二胺和1,2-丙二胺中的一种或几种。

4.根据权利要求1所述的一种以氧化石墨烯为载体的Gd³⁺磁共振造影剂的制备方法，其特征在于，步骤1）所述的羧基化氧化石墨烯分散液的离心、洗涤处理，具体分为两个阶段：

第一阶段，对羧基化氧化石墨烯分散液反复离心、洗涤操作2～3次，每次均弃除上清液，收集最后一次离心得到的沉淀；

第二阶段，对第一阶段得到的沉淀洗涤后离心，再对得到的沉淀反复洗涤、离心直至离心时再无沉淀产生，合并每次离心的上清液，得到稳定的羧基化氧化石墨烯分散液。

5.根据权利要求4所述的一种以氧化石墨烯为载体的Gd³⁺磁共振造影剂的制备方法，其特征在于，所述的离心是在9000～14000r/min下，离心5～10min。

6.根据权利要求4所述的一种以氧化石墨烯为载体的Gd³⁺磁共振造影剂的制备方法，其特征在于，所述的洗涤是采用蒸馏水对沉淀进行洗涤。

7.根据权利要求1所述的一种以氧化石墨烯为载体的Gd³⁺磁共振造影剂的制备方法，其特征在于，步骤1）所述的透析是将pH值为5～6.5的、稳定的氧化石墨烯分散液置于截留分子量为1000～3500D的透析袋中，在去离子水中透析48～120h。

8.根据权利要求1所述的一种以氧化石墨烯为载体的Gd³⁺磁共振造影剂的制备方法，其特征在于，步骤1）是采用浓度为0.1mol·L^-1的盐酸、硫酸、硝酸或氢溴酸调节pH值。

9.根据权利要求1所述的一种以氧化石墨烯为载体的Gd³⁺磁共振造影剂的制备方法，其特征在于，步骤1）所述的冷冻干燥是将纯净的羧基化氧化石墨烯分散液置于冷冻干燥机中，冷冻至-60℃后，将冻结的羧基化氧化石墨烯样品真空干燥6～10h。

10.根据权利要求1所述的一种以氧化石墨烯为载体的Gd³⁺磁共振造影剂的制备方法，其特征在于，步骤3）所述的透析是将混合溶液置于截留分子量为1000～3500D的透析袋中，在去离子水中透析48～120h。