CN103308686A - 脂多糖酶联免疫吸附测定试剂盒的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脂多糖(LPS))酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒的制备方法，本发明利用化学反应原理对LPS进行改造，将LPS于BSA进行偶联，赋予LPS更好的免疫原性，促进小鼠体内特异性针对LPS的B细胞的增殖，进而提高单克隆抗体制备时的融合效率，最终获得高特异性，高亲和力，高灵敏度的抗LPS的抗体。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体而言，涉及脂多糖(LPS))酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒的制备方法。
背景技术
脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌的内毒素，由特异性多糖、核心多糖和脂类A组成，借疏水键与外膜相连。做为细胞壁的组成成份，LPS仅在细菌自溶或人工裂解后才释放出来。脂类A是LPS的毒性中心，也是内毒素的主要成份。脂类A无种属特异性，故各种不同革兰氏阴性菌感染，由内毒素产生的毒性作用大致相似。
LPS的生物学活性多种多样，尤其在机体内的表现，错综复杂，各单项活性之间常相互联系，相互促进或制约。LPS具有激活生物体内巨噬细胞等效应靶细胞诱导产生多种活性因子的作用。LPS作用于机体后可以刺激机体产生肿瘤坏死因子、IL-1、IL-6、干扰素、集落刺激因子等多种细胞因子，刺激产生大量活性氧，引起机体发热、弥散性血管内凝血、多脏器衰竭及休克等临床综合征。有实验证明给动物注射少量的LPS，早期白细胞数量减少，后期白细胞数量明显增加；另外LPS还具有激活补体活化的经典途径和旁路途径。活化过程中产生的C3a、C5a具有过敏性毒素作用；内毒素可导致动物发生什瓦茨曼(shwartzman)现象；LPS具有免疫佐剂活性；内毒素注射入实验动物，常可导致动物死亡等作用。
因此，制备一种能特异、灵敏、快速的检测LPS的工具是非常有需要的而且有意义的。它可以用来检测生物重组药物、食物、科学研究蛋白中LPS的残留。而酶联免疫吸附测定(ELISA)检测技术正好可以满足这些要求。ELISA检测技术是利用抗原-抗体之间特异性的免疫反应识别生物液体中的靶分子，并利用酶-底物的显色反应定量的反应待测样本中靶分子的含量。由于其特异性强、灵敏度、操作简便及不需大型仪器等优点，现广泛用于生物样本的定量检测实验中。实现该测定的重要环节是针对待测分子的高特异性、高亲和力抗体的制备。
LPS是一种结构十分复杂、具有多种异质性的生物大分子，而且属于胸腺非依赖抗原(TI抗原)。与蛋白质等胸腺依赖性抗原(TD抗原)不同，TI抗原不能诱导抗体亲和成熟，也不能诱导免疫记忆，所以按常规的免疫方法很难产生高亲和力、交叉反应性抗LPS的mAb。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种脂多糖(LPS))酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒的制备方法。为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案：
本发明一方面涉及一种脂多糖(LPS))酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒的制备方法，所述的方法包括如下步骤：
a、LPS与载体蛋白BSA偶联复合物的制备：
取LPS和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(质量比4-6∶2)溶解在PBS溶液中；搅拌状态下反应液里滴加含有碳二亚胺的PBS溶液中，室温反应过夜；将上清液逐滴加到含有BSA的磷酸盐缓冲液中；室温搅拌反应5h；装入透析袋透析、浓缩、干燥保存；
b、抗LPS抗体的制备：
选用BALB/C小鼠，将LPS-BSA蛋白浓度调整为1mg/mL，然后取0.4ml蛋白与等量完全弗氏佐剂混合、乳化，每只100ul，皮下多点及四脚掌初次免疫，14d后相同剂量腹腔加强免疫，每2周加强1次，加强后每隔7d眼眶采血，分别测定针对LPS和载体蛋白的抗体效价，于细胞融合前3d尾静脉加强免疫；用PEG融合处于对数生长期的骨髓瘤细胞和BALB/C小鼠脾细胞，制备杂交瘤细胞；2周后用间接ELISA法检测细胞上清液，选取P/N值最高的采用有限稀释法进行3-4次克隆；每次克隆后扩大培养建库的细胞上清。用硫酸铵沉淀法粗提单抗，用亲和层析法纯化分离得到特异性高的抗LPS的抗体；
c、试剂盒的制备
使用96孔聚苯乙烯试剂板(PS)作为固相载体，先将其置于紫外光下辐照2小时，使PS板活化；在试剂板微孔条上预先包被一定浓度的抗LPS抗体，4℃过夜，经洗板及牛血清白蛋白封闭处理后制成包被好的酶标板；配制以生物素化的LPS为活性成分的检测液A。
具体实施方式
下面通过实施例详细叙述本发明的技术内容：
1.LPS酶联免疫试剂盒的制备方法，其具体步骤为
a、LPS与载体蛋白BSA偶联复合物的制备：
采用碳二亚胺法制备LPS-BSA.取LPS50mg和20mgN-羟基硫代琥珀酰亚胺NHS(质量比5∶2)溶解在2ml0.01M PBS溶液中；搅拌状态下反应液里滴加1.0ml含有20mg碳二亚胺EDC的0.01M PBS溶液中，室温反应过夜；将上清液逐滴加到10ml含有20mgBSA的0.01M磷酸盐缓冲液中；室温搅拌反应5h；装入透析袋透析、浓缩、干燥保存。
b、抗LPS抗体的制备：
选用BALB/C小鼠，将LPS-BSA蛋白浓度调整为1mg/mL，然后取0.4ml蛋白与等量完全弗氏佐剂混合、乳化，每只100ul，皮下多点及四脚掌初次免疫，14d后相同剂量腹腔加强免疫，每2周加强1次，加强后每隔7d眼眶采血，分别测定针对LPS和载体蛋白的抗体效价，于细胞融合前3d尾静脉加强免疫。用PEG融合处于对数生长期的骨髓瘤细胞和BALB/C小鼠脾细胞，制备杂交瘤细胞。2周后用间接ELISA法检测细胞上清液，选取P/N值最高的采用有限稀释法进行3-4次克隆。每次克隆后扩大培养建库的细胞上清。
用硫酸铵沉淀法粗提单抗，用亲和层析法纯化分离得到特异性高的抗LPS的抗体。将200-300ml细胞培养上清样本直接从LPS抗原偶联的层析柱进样口上样，流速为1ml/min。用0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液(30-40ml)洗脱杂蛋白后，再用0.01mol/L pH8.0磷酸缓冲液(20-30ml)洗脱，流速为2ml/min。最后用0.1mol/L Gly-HCl洗脱缓冲液洗脱，流速为1.5ml/min，收集样本洗脱液，透析浓缩后备用。采用间接ELISA法进行鉴定，抗体效价为1∶100000-1∶300000。
c、ELISA试剂盒的制备：
本试剂盒应用竞争抑制酶联免疫分析法测定血清、血浆、组织裂解液、细胞裂解液和细胞培养上清等样本中LPS的水平。试剂盒的主要组分包括：包被抗体、LPS标准品、生物素标记的LPS、HRP标记的亲和素、5，5′-四甲基联苯胺(TMB)和终止液(硫酸)。制备过程如下：使用96孔聚苯乙烯试剂板(PS)作为固相载体，先将其置于紫外光下辐照2小时，使PS板活化。在试剂板微孔条上预先包被一定浓度的抗LPS抗体，4℃过夜，经洗板及牛血清白蛋白封闭处理后制成包被好的酶标板。检测时，依次加入不同浓度的标准品/待测标本及生物素化的LPS，形成标准品/待测标本中的LPS和生物素化的LPS竞争结合酶标板上包被的抗体的局面，未结合的LPS经过洗涤去除；再通过亲和素化辣根过氧化物酶(HRP)放大信号，加入催化底物5，5′-四甲基联苯胺(TMB)产生蓝色可溶性物质，最后加入硫酸终止后呈黄色，于450nm检测标准品孔及样本孔O.D.值。在试剂盒的检测范围内，待测物浓度越高，样本O.D.值则越低，样本浓度值与OD值呈现负相关系。
2.为验证试剂盒的各项性能，分别检测了试剂盒的标准曲线、特异性、精密度、回收率及样本稀释的线性，具体实验方法和结果如表1所示，从检测结果可知该标准曲线具有良好的线性关系。
a.标准曲线(表1)
表1：LPS试剂盒标准曲线测值
b.灵敏度：LPS ELISA法检测血清标本时最低检测限为4.44pg/ml；
c.特异性检测：
检测该试剂盒能否与LPS的结构类似物或相关蛋白反应，所测值用交叉反应率来表示，即类似物的测定浓度与实际添加值的比值。具体测定方法如下，在阴性血清中添加下述物质，使其终浓度为100ng/ml，使用该试剂盒检测并计算交叉反应率。
表2：LPS ELISA试剂盒交叉反应率测试
| 类似物 | 交叉反应率 |
| 人HSA | 0.1％ |
| 人载脂蛋白A | 0.1％ |
| 人载脂蛋白B | 1.1％ |
| 牛BSA | 0.1％ |
| 鸡OVA | 0.1％ |
d.回收率：用同一血清样本分别添加不同量的定值标准品，作回收试验(n＝5)。平均回收率98％(表3)。
表3ELISA法测定LPS的回收试验
| 定值标准品(pg/ml) | 回收率(％) |
| 800 | 91 |
| 300 | 104 |
| 50 | 98 |
| 平均回收率 | 98 |
e.
精密度实验：
用该方法对高、中、低值质控品分别进行精密度实验，每个样本重复测定20次，表4中结果可见ELISA方法精密度较好。
表4ELISA试剂盒精密度测试
| 批内差CV(％) | 批间差CV(％) |
| 高 | 5.7 | 7.2 |
| 中 | 5.5 | 6.9 |
| 低 | 5.2 | 6.4 |
3、本发明将目的蛋白LPS与另一个大分子蛋白进行偶联，赋予LPS一定的特性，促使其能更好的刺激小鼠B细胞产生特异性，稳定性强的抗体原料；同时我们采用了生物素和亲和素级联放大系统，增加了试剂盒的灵敏性，比常规的检测方法灵敏度更高、特异性好。采用本发明所生产的ELISA试剂盒和目前革兰氏阴性细菌检测方法，可见ELISA试剂盒较培养涂片法检测LPS有很多优势。
表5ELISA试剂盒和细菌培养涂片法的比较
| ELSIA试剂盒 | 细菌培养涂片检测 | |
| 样本前处理 | 无需 | 需要先培养细胞，再进行细胞染色处理 |
| 检测限 | 12.35-1,000pg/ml | 无，定性检测 |
| 灵敏度 | 4.44pg/ml | 低 |
| 仪器 | 酶标仪(价格较低) | 显微镜(价格较低) |
| 操作 | 简单，无需特殊培训 | 繁琐，对操作人员技术要求较高 |
| 检测时间 | 5小时 | 根据细胞特性，时间1-4天 |
| 检测成本 | 大批量检测成本较低 | 成本不高 |
结论：
本专利改变传统的直接拿LPS免疫动物制备抗体的方法，利用化学反应原理对LPS进行改造，将LPS于BSA进行偶联，赋予LPS更好的免疫原性，促进小鼠体内特异性针对LPS的B细胞的增殖，进而提高单克隆抗体制备时的融合效率，最终获得高特异性，高亲和力，高灵敏度的抗LPS的抗体。有了高质量的原料，我们成功的制备了检测LPS的ELISA试剂盒，该试剂盒能特异性的检测血清、血浆、组织、细胞中的LPS含量。该试剂盒较平时常用的细菌培养涂片法诸多优势：1.涂片法只能做定性检测，而ELISA可以精准定量；2.涂片法耗时长，一般细菌培养就需要1-4天，而ELISA只需要5小时；3.涂片法要先取样培养，才能检测；而ELSIA试剂盒可以直接检测，无需样本前处理。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
Claims (1)
1.一种脂多糖(LPS))酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒的制备方法，所述的方法包括如下步骤：
a、LPS与载体蛋白BSA偶联复合物的制备：
取LPS和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(质量比6-4∶2)溶解在PBS溶液中；搅拌状态下反应液里滴加含有碳二亚胺的PBS溶液中，室温反应过夜；将上清液逐滴加到含有BSA的磷酸盐缓冲液中；室温搅拌反应5h；装入透析袋透析、浓缩、干燥保存；
b、抗LPS抗体的制备：
选用BALB/C小鼠，将LPS-BSA蛋白浓度调整为1mg/mL，然后取0.4ml蛋白与等量完全弗氏佐剂混合、乳化，每只100ul，皮下多点及四脚掌初次免疫，14d后相同剂量腹腔加强免疫，每2周加强1次，加强后每隔7d眼眶采血，分别测定针对LPS和载体蛋白的抗体效价，于细胞融合前3d尾静脉加强免疫；用PEG融合处于对数生长期的骨髓瘤细胞和BALB/C小鼠脾细胞，制备杂交瘤细胞；2周后用间接ELISA法检测细胞上清液，选取P/N值最高的采用有限稀释法进行3-4次克隆；每次克隆后扩大培养建库的细胞上清。用硫酸铵沉淀法粗提单抗，用亲和层析法纯化分离得到特异性高的抗LPS的抗体；
c、试剂盒的制备
试剂盒的主要组分包括：包被抗体、LPS标准品、生物素标记的LPS、HRP标记的亲和素、5，5′-四甲基联苯胺(TMB)和终止液(硫酸)；使用96孔聚苯乙烯试剂板(PS)作为固相载体，先将其置于紫外光下辐照2小时，使PS板活化；在试剂板微孔条上预先包被一定浓度的抗LPS抗体，4℃过夜，经洗板及牛血清白蛋白封闭处理后制成包被好的酶标板。
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