CN106405095A - 采用间接竞争elisa法检测动物源性过敏原牛血清白蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种采用间接竞争ELISA法检测动物源性过敏原牛血清白蛋白，属于分析检测领域。该方法采用BSA作为包被抗原及标准品，筛选高特异性、高纯度的抗BSA单克隆抗体作为一抗，羊抗鼠IgG辣根过氧化物(HRP)标记抗体为二抗，四甲基联苯胺(TMB)为底物，建立敏感、特异的间接竞争ELISA，并用数学方法对结果进行分析。该方法特异性强、灵敏度高、重复性好，可用于过敏原BSA的快速检测。
Description
技术领域
本发明属于分析检测领域，具体涉及一种采用间接竞争ELISA法检测动物源性过敏原牛血清白蛋白。
背景技术
食物过敏是一种人体对食物中抗原物质产生的由免疫介导的不良反应，由此引发身体产生一系列临床病理生理的变化，严重时可能产生过敏性休克，甚至危及生命。据世界卫生组织(WHO)统计，全世界约25％的人患有过敏性疾病，并且以每10年23倍的速度增加，在我国就有2亿多食物过敏原患者。近年来，随着工业化、城镇化、全球化进程不断加快，人们生活节奏、方式不断改变，生活压力不断加剧，以及食物种类、加工工艺越来越多，许多原来不过敏的人群逐渐演变成过敏性体质，潜在过敏人群不断扩大；同时，随着科技、医疗水平的提高，许多原来未认识到的过敏现象被不断揭示出来。食物过敏已成为全世界关注的公共卫生热点问题，而且这个问题正呈现出逐渐扩大的趋势。
过敏性疾病属于慢性病，所产生的直接或间接费用对过敏患者及其家庭，对卫生系统和全社会有严重的影响。据报道约90％的食物过敏反应主要是由常见的八类食物过敏原(大豆、花生、小麦、坚果、牛奶、蛋类、鱼类和甲壳纲动物)引起。其中，牛奶是一类非常重要的过敏原，在儿童中发病率约为0.3％～7.5％，在成年人中的发病率则小于1％。牛奶过敏引起的症状表现在呼吸道、消化道和皮肤过敏等，也有可能成为其他过敏性疾病的诱因。因此，牛奶过敏问题日益受到国内外学者的关注和研究。牛奶中引起过敏反应的蛋白包括：β-乳球蛋白(β-LG)、酪蛋白(CAS)、α-乳白蛋白(α-LA)、牛血清白蛋白(BSA)、乳铁蛋白(LF)以及免疫球蛋白(Igs)等。其中BSA的致敏性较为常见，美国约有50％牛乳过敏患者对BSA产生过敏，且其引发的过敏反应不受其它过敏原的影响。现还证实引起牛肉过敏的主要过敏原就是存在于血浆中的BSA。此外，BSA在医学临床及生物领域也有着广泛的应用，这使得过敏患者很难避免接触过敏原BSA而遭受健康威胁。
迄今为止，针对食物过敏尚无有效的治疗方法，在食品标签上标识过敏原的存在是避免过敏患者食入潜在过敏原的最有效的途径。因此，为保证过敏原标签、标识制度的实施，各国研究者纷纷开展了针对食物过敏原检测方法的研究。但目前针对过敏原BSA的检测方法报道较少。
发明内容
本发明的目的是针对上述存在的问题提供一种采用间接竞争ELISA法检测动物源性过敏原牛血清白蛋白。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种采用间接竞争ELISA法检测动物源性过敏原牛血清白蛋白，该方法包括以下步骤：
第一步，抗体的制备，具体的制备过程如下：
(1)动物免疫：选取雌性小鼠，将抗原BSA与弗氏完全佐剂混合首次皮下注射进行免疫，2～3周加强免疫1次，根据小鼠血清效价ELISA检测结果，选取效价在1：10000以上的小鼠脾细胞进行细胞融合；
(2)细胞融合：将骨髓瘤细胞和经BSA免疫后小鼠的脾细胞混合，通过PEG促使细胞融合；融合10d后开始进行筛选检测；
(3)融合筛选及亚克隆：将融合后的细胞采用ELISA进行检测，选取ELISA结果判断为阳性的细胞；根据有限稀释法将该阳性的细胞进行亚克隆，检测至100％阳性后，挑出单克隆孔扩大培养定株，获得1株稳定分泌抗BSA单克隆抗体的杂交瘤细胞株9G6；
(4)腹水制备及纯化：向预处理过的小鼠腹腔内注射杂交瘤细胞株9G6，7～10d后取腹水，将所收集的腹水离心取上清液，准备好蛋白A琼脂糖介质并装柱，将腹水上清液用PBS缓冲液稀释10倍后缓慢上样，上样结束后用PBS缓冲液洗涤至紫外检测仪达到最低值，甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，即得到所需纯化抗体；
第二步，标准曲线的绘制，具体过程如下：
①抗原包被：将抗原稀释，每孔100μL包被酶标板，37℃包被2h，弃包被液，用PBST洗涤5次，拍干；
②封闭：按每孔200μL加入封闭液，室温封闭2h，弃封闭液，用PBST洗涤5次，拍干；
③竞争结合：用封闭液将抗原稀释为460ng/mL，然后做2倍梯度稀释，共计23个浓度梯度，按每孔50μL将各梯度的稀释液加入孔内；随即每孔加入50μL稀释过的纯化后的抗体，与之前加入的不同浓度梯度的抗原标准溶液混合，室温反应2h，弃溶液，用PBST洗涤5次，拍干；
④加酶标二抗：加入羊抗鼠IgG辣根过氧化物标记抗体，每孔100μL，室温反应1h，弃溶液，用PBST洗涤5次，拍干；
⑤显色：加入TMB显色液，每孔100μL，室温避光显色30min，加终止液，每孔50μL，在酶标仪上测定OD450值；
⑥标准曲线绘制：以抗原浓度的对数为横坐标，各浓度孔的OD450值为纵坐标，绘制标准曲线，并根据标准曲线计算半数效应浓度；
⑦线性范围确定：根据标准曲线呈明显相关的区段，以标准品浓度的对数为横坐标，以抑制率[(A标/A0)×100％]为纵坐标绘制拟合后的标准曲线，其中A0为零标准品孔OD450值，A标为各浓度标准品孔OD450值；
第三步，将待测样品采用如下测定程序进行测定：
①抗原包被：用包被缓冲液将待测样品稀释至工作浓度，加入酶标板，每孔100μL，37℃包被2h，弃包被液，用PBST洗涤5次，拍干；
②封闭：按每孔200μL加入封闭液，室温封闭2h，弃封闭液，用PBST洗涤5次，拍干；
③竞争结合：先将待测样品加入酶标板，每孔50μL，再加入纯化后的抗体，每孔50μL，室温竞争反应2h，弃溶液，用PBST洗涤5次，拍干；
④加酶标二抗：加入羊抗鼠IgG辣根过氧化物标记抗体，每孔100μL，室温反应1h，弃溶液，用PBST洗涤5次，拍干；
⑤显色：加入TMB显色液，每孔100μL，室温避光显色30min，加终止液，每孔50μL，在酶标仪上测定OD450值；
⑥采用第二步拟合的标准曲线，计算得到待测样品的浓度。
本发明技术方案的第二步①中，抗原包被浓度为0.25μg/mL。
本发明技术方案的第二步③中，抗体稀释终浓度为1:32000。
本发明技术方案的第三步①中，工作浓度为0.25μg/mL。
附图说明
图1单克隆抗体SDS-PAGE电泳图；
图2单克隆抗体免疫分析结果；
图3包被抗原工作浓度和抗体稀释倍数对反应灵敏度的影响；
图4标准曲线；
图5线性拟合曲线；
图6特异性检测。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围不限于此：
细胞及实验动物
鼠骨髓瘤细胞SP2/0购自中国科学研究院上海细胞研究所。6～8周龄BALB/c雌性小鼠购自中国科学院上海实验动物中心。
主要试剂
牛血清白蛋白(BSA)、聚乙二醇(PEG)，购自美国Sigma公司；蛋白定量试剂盒(BCAProtein Assay kit)，美国Novagen公司；弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)、四甲基联苯胺(TMB)显色液，购自美国Promega公司；羊抗鼠IgG辣根过氧化物(HRP)标记抗体购自美国Proteintech公司；聚偏二氟乙烯膜(PVDF)购自美国Miliipore公司。主要设备
各种量程微量移液器，德国Eppendorf公司；酶标仪(iMark)、凝胶成像仪(Gel Doc XR)，美国Bio-Rad公司；CO2恒温培养箱(MCO-15AC)，日本SANYO公司；台式高速冷冻离心机(Allegra 64R)，美国Beckman公司；紫外可见分光光度计(SpectrumLab54型)，上海棱光技术有限公司；精密酸度计(PHS-2C)，上海雷磁仪器厂；ELISA酶标板(96孔)，美国Corning Incorporated公司)；电泳仪(DYY-6C)，北京六一仪器厂。
缓冲液及其它溶液配制
10×PBS缓冲液(0.1mol/L，pH7.4)：称取80g NaCl，2g KCl，2.58g KH2PO4，29gNa2HPO4·12H2O，加蒸馏水至1000mL，抽滤，室温长期保存，用时取100mL加900mL蒸馏水配成1×PBS缓冲液。
包被缓冲液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH9.6)：称取0.17g Na2CO3，0.258g NaHCO3，加蒸馏水至100mL，4℃保存。
洗涤液(PBST，pH7.4)：含0.05％(v/v)Tween-20的0.01mol/L，pH7.4PBS。
封闭液：含10％(w/v)马血清的pH7.4PBST，4℃保存。
终止液(2mol/L H2SO4溶液)：量取11.1mL浓H2SO4，加入到80mL蒸馏水中，冷却后，定容至100mL。
动物免疫
选取6只6～8周龄雌性BALB/c小鼠，将抗原(BSA)与弗氏完全佐剂混合首次免疫，皮下注射100μg，2～3周加强免疫1次，采用弗氏不完全佐剂与抗原混合，皮下注射100μg。四免后采血检测，根据小鼠血清效价ELISA检测结果，选取效价在1：10000以上的小鼠进行122细胞融合。未免疫的小鼠血清为阴性血清，-20℃冻存。
细胞融合
融合前1周准备好Sp2/0骨髓瘤细胞。小鼠在融合前3d终免，腹腔注射抗原100μg。融合当天用颈椎脱臼法安乐死要融合的小鼠。用75％酒精浸泡5min，无菌取脾脏，经过研磨、过网、冲洗、离心等操作，收集脾细胞计数。混合骨髓瘤细胞和脾细胞，使骨髓瘤细胞同脾细胞数量比在1:20为宜。通过PEG促使细胞融合，把融合的细胞铺到96孔板中，每孔100μL。然后将细胞培养板放到CO2培养箱中培养。融合后4d观察，杂交瘤细胞克隆率在50％以上，细胞生长状态良好。融合10d后开始进行筛选检测。
融合筛选及亚克隆
(1)融合筛选：吸取细胞上清100μL/孔进行间接ELISA检测，根据ELISA结果判断阳性孔(样品孔OD值/阴性孔OD值≥2.1则判定为阳性孔)，选择其中较高读数的10株阳性细胞进行亚克隆。
(2)亚克隆：根据有限稀释法进行亚克隆，检测至100％阳性后，挑出单克隆孔扩大培养定株，获得1株稳定分泌抗BSA单克隆抗体的杂交瘤细胞株9G6。
腹水制备及纯化
(1)腹水制备：向预处理过的小鼠腹腔内注射杂交瘤细胞。按每只小鼠注射1×106个细胞的量，注射杂交瘤细胞。7～10d，用注射器针头小心采出尽可能多的液体。小鼠在最后一次采集后颈椎脱位法处死。
(2)纯化：将所收集的腹水离心取上清，准备好蛋白A琼脂糖介质并装柱，将腹水用PBS缓冲液稀释10倍后缓慢上样，上样结束后用PBS缓冲液洗涤至紫外检测仪达到最低值，甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，即得到所需纯化抗体，立即在PBS缓冲液中进行4℃透析过夜，隔日进行浓度、纯度和效价的测定。
抗BSA单克隆抗体的效价测定
①抗原包被：用包被缓冲液将抗原稀释至5μg/mL，加入酶标板，每孔100μL，4℃包被过夜，弃包被液，用PBST洗涤5次，拍干。
②封闭：按每孔200μL加入封闭液，室温封闭2h，弃封闭液，用PBST洗涤5次，拍干。
③抗体检测：加入待测抗体，每孔100μL，室温竞争反应2h，弃溶液，用PBST洗涤5次，拍干。
④加酶标二抗：加入羊抗鼠IgG辣根过氧化物(HRP)标记抗体(1:2500倍稀释)，每孔100μL，室温反应1h，弃溶液，用PBST洗涤5次，拍干。
⑤显色：加入TMB显色液，每孔100μL，室温避光显色30min，加终止液，每孔50μL，通过间接ELISA法测定其OD450值。
单克隆抗体的蛋白免疫印迹分析
过敏原溶液(0.5mg/mL)经SDS-PAGE电泳后转膜到PVDF膜上，用10％马血清室温封闭2h(或4℃过夜)，用PBST洗涤3次，加入制备的抗BSA单克隆抗体(1:1000倍稀释)，室温作用1.5h，用PBST洗涤3次，加入羊抗鼠IgG辣根过氧化物(HRP)标记抗体(1:5000倍稀释)，室温作用1.5h，PBST洗涤3次，于TMB显色液中显色2min。
将纯化后抗体进行SDS-PAGE电泳，可见抗体纯化后纯度较高，在95％以上(图1)。纯化的单克隆抗体有两条条带，一条是分子量约为25KD的轻链，一条是分子量约为50KD的重链。将所纯化的抗体进行蛋白免疫印迹反应分析，试验结果表明单克隆抗体可与过敏原BSA发生免疫印迹反应，证明可用所制备的单克隆抗体建立免疫学检测方法，以检测食品中BSA成分(图2)。
最佳包被抗原浓度和抗体稀释度的确定
①抗原包被：用包被缓冲液将抗原BSA分别稀释为8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0μg/mL，横向加入酶标板，每孔100μL，37℃包被2h(或4℃包被过夜)，弃包被液，用PBST洗涤5次，拍干。②封闭：按每孔200μL加入封闭液，室温封闭2h，弃封闭液，用PBST洗涤5次，拍干。③抗原抗体反应：用封闭液将抗BSA单克隆抗体分别进行1/1000、1/2000、1/4000、1/8000、1/16000、1/32000、1/64000稀释，纵向加入酶标板，每孔100μL，同时设置阴性对照，室温反应2h，弃溶液，用PBST洗涤5次，拍干。④加酶标二抗：加入羊抗鼠IgG辣根过氧化物(HRP)标记抗体(1:2500倍稀释)，每孔100μL，室温反应1h，弃溶液，用PBST洗涤5次，拍干。⑤显色：加入TMB显色液，每孔100μL，室温避光显色30min，加终止液，每孔50μL，在酶标仪上测定OD450值。
用矩阵法确定最佳包被抗原工作浓度和抗体稀释倍数。一般来说，在OD值为1.0时，误差相对最小，所以选择OD450值为1.0，阴性对照小、阳性对照/阴性对照值大的抗原包被浓度及抗体稀释倍数为理想工作浓度，结果见表1和图3。抗原包被浓度过高或过低均会影响反应的灵敏度，浓度过低，抗原包被量不足，微孔内吸附的抗原少，可供抗体结合的抗原决定簇少；包被浓度过高，微孔内吸附的抗原多，产生空间位阻，同样可控抗体结合的抗原决定簇少，从而影响包被抗原进一步与抗体的结合，降低灵敏度。因此确定本试验的最适包被浓度为0.25μg/mL，抗体工作浓度为1:32000。
表1最佳包被抗原工作浓度和抗体稀释倍数的确定
标准曲线的制作及线性范围的确定
①抗原包被：将抗原BSA稀释至0.25μg/mL，每孔100μL包被酶标板，37℃包被2h(或4℃包被过夜)，弃包被液，用PBST洗涤5次，拍干。
②封闭：按每孔200μL加入封闭液，室温封闭2h，弃封闭液，用PBST洗涤5次，拍干。
③竞争结合：用封闭液将抗原稀释为460ng/mL，然后做2倍梯度稀释，共计23个浓度梯度(含460ng/mL)，按每孔100μL将各梯度的稀释液加入孔内；随即每孔加入100μL最适浓度的抗BSA单克隆抗体，室温反应2h，弃溶液，用PBST洗涤5次，拍干。
④加酶标二抗：加入羊抗鼠IgG辣根过氧化物(HRP)标记抗体(1:2500倍稀释)，每孔100μL，室温反应1h，弃溶液，用PBST洗涤5次，拍干。
⑤显色：加入TMB显色液，每孔100μL，室温避光显色30min，加终止液，每孔50μL，在酶标仪上测定OD450值。
⑥标准曲线绘制：以抗原浓度的对数为横坐标，各浓度孔的OD450值为纵坐标，绘制标准曲线，并根据标准曲线计算半数抑制浓度(IC50)。
⑦线性范围确定：根据标准曲线呈明显相关的区段，以标准品浓度的对数为横坐标，以抑制率[(A标/A0)×100％]为纵坐标绘制标准曲线，并根据曲线的具体情况选择最佳的拟合模型，其中A0为零标准品孔OD450值，A标为各浓度标准品孔OD450值。
在上述最佳包被抗原工作浓度和抗体稀释倍数条件下，通过间接竞争ELISA程序，以不同待测抗原浓度梯度的对数为横坐标，各浓度孔的OD450值为纵坐标，作图得标准曲线(图4)。根据标准曲线公式算出IC50为52.3ng/mL。本试验还根据标准曲线呈明显相关的区段，选择合适的抗原浓度梯度(3.5938～460ng/mL)，确定其线性关系，见图5。结果显示，拟合的线性回归直线方程为y＝－47.4489x+135.8663(R2＝0.9973)，符合线性关系的判定标准。
灵敏度试验
随机选择10个孔做零标准品间接竞争ELISA检测，求所得10个孔OD450值的均值和标准差(SD)，在标准曲线上对应的标准品浓度即为此方法的灵敏度(最低检测限)。
灵敏度测定结果见表2。在标准曲线上对应的标准品浓度为6.71ng/mL，即最低检测限。
表2灵敏度测定
特异性试验
将竞争结合步骤中将马血清、猪血清、兔血清、羊血清、狗血清、鸡血清、小鼠血清(阴性对照)分别稀释，各取100μL，分别与100μL抗BSA单克隆抗体一起加入酶标板，利用间接竞争ELISA检测其交叉反应性。
按照本试验建立的方法分别对马血清、猪血清、兔血清、羊血清、狗血清、鸡血清和小鼠血清(阴性对照)进行交叉反应检测。结果表明该方法特异性良好，与所检测的其他种属血清白蛋白无交叉反应(图6)。
精密度试验
本试验严格控制反应条件，按照标准进行操作，对建立的间接竞争ELISA检测方法进行精密度测试，结果以批内和批间变异系数(CV)表示该方法的精密度。分别设3个浓度梯度的待测样品，同一样品测定两个批次，每个批次重复测定32次。以每批次内3个水平变异系数的均值代表各批内变异系数，总的批内变异系数为两批次批内变异系数之均值。批间变异系数是将两批次每个水平按64次重复计算变异系数，再取平均值。
分别设200、100和50ng/mL 3个水平标准品浓度。分两批每批32个重复，测定结果见表3。ELISA方法第一批次批内变异系数为3.21％，第二批次批内变异系数为3.03％，总的批内变异系数为3.12％。批间变异系数为3.12％。本检测方法批内与批间的变异系数均小于5％，可知本方法精确度较高，重复性较好。
表3精密度测定
1.2.8回收率试验
将不同溶度的BSA与小麦粉蛋白提取液中搅拌均匀，作为待测样品，检测待测样品中BSA浓度，根据如下公式计算回收率。以小麦粉蛋白提取液作为空白对照检测。
回收率(％)＝(测量质量溶度/实际质量溶度)×100
将不同浓度的BSA标准品添加至小麦粉蛋白提取液中，制备不同污染浓度的样品，以间接竞争ELISA法检测样品中BSA的回收率，每个浓度重复32次，见表4。当添加BSA的质量浓度在50～200ng/mL范围时，随着样品中BSA质量浓度的增加，回收率变异系数减小，精确度提高，可知本研究的间接竞争ELISA法满足检测要求。
表4 BSA加标回收率测定
Claims (4)
1.一种采用间接竞争ELISA法检测动物源性过敏原牛血清白蛋白，其特征在于：该方法包括以下步骤：
第一步，抗体的制备，具体的制备过程如下：
(1)动物免疫：选取雌性小鼠，将抗原BSA与弗氏完全佐剂混合首次皮下注射进行免疫，2～3周加强免疫1次，根据小鼠血清效价ELISA检测结果，选取效价在1：10000以上的小鼠脾细胞进行细胞融合；
(2)细胞融合：将骨髓瘤细胞和经BSA免疫后小鼠的脾细胞混合，通过PEG促使细胞融合，融合10d后开始进行筛选检测；
(3)融合筛选及亚克隆：将融合后的细胞采用ELISA进行检测，选取ELISA结果判断为阳性的细胞；根据有限稀释法将该阳性的细胞进行亚克隆，检测至100％阳性后，挑出单克隆孔扩大培养定株，获得1株稳定分泌抗BSA单克隆抗体的杂交瘤细胞株9G6；
(4)腹水制备及纯化：向预处理过的小鼠腹腔内注射杂交瘤细胞株9G6，7～10d后取腹水，将所收集的腹水离心取上清液，准备好蛋白A琼脂糖介质并装柱，将腹水上清液用PBS缓冲液稀释10倍后缓慢上样，上样结束后用PBS缓冲液洗涤至紫外检测仪达到最低值，甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，即得到所需纯化抗体；
第二步，标准曲线的绘制，具体过程如下：
①抗原包被：将抗原稀释，每孔100μL包被酶标板，37℃包被2h，弃包被液，用PBST洗涤5次，拍干；
②封闭：按每孔200μL加入封闭液，室温封闭2h，弃封闭液，用PBST洗涤5次，拍干；
③竞争结合：用封闭液将抗原稀释为460ng/mL，然后做2倍梯度稀释，共计23个浓度梯度，按每孔50μL将各梯度的稀释液加入孔内；随即每孔加入50μL稀释过的纯化后的抗体，与之前加入的不同浓度梯度的抗原标准溶液混合，室温反应2h，弃溶液，用PBST洗涤5次，拍干；
④加酶标二抗：加入羊抗鼠IgG辣根过氧化物标记抗体，每孔100μL，室温反应1h，弃溶液，用PBST洗涤5次，拍干；
⑤显色：加入TMB显色液，每孔100μL，室温避光显色30min，加终止液，每孔50μL，在酶标仪上测定OD450值；
⑥标准曲线绘制：以抗原浓度的对数为横坐标，各浓度孔的OD450值为纵坐标，绘制标准曲线，并根据标准曲线计算半数效应浓度；
⑦线性范围确定：根据标准曲线呈明显相关的区段，以标准品浓度的对数为横坐标，以抑制率[(A标/A0)×100％]为纵坐标绘制标准曲线，其中A0为零标准品孔OD450值，A标为各浓度标准品孔OD450值；
第三步，将待测样品采用如下测定程序进行测定：
①抗原包被：用包被缓冲液将待测样品稀释至工作浓度，加入酶标板，每孔100μL，37℃包被2h，弃包被液，用PBST洗涤5次，拍干；
②封闭：按每孔200μL加入封闭液，室温封闭2h，弃封闭液，用PBST洗涤5次，拍干；
③竞争结合：先将待测样品加入酶标板，每孔50μL，再加入纯化后的抗体，每孔50μL，室温竞争反应2h，弃溶液，用PBST洗涤5次，拍干；
④加酶标二抗：加入羊抗鼠IgG辣根过氧化物标记抗体，每孔100μL，室温反应1h，弃溶液，用PBST洗涤5次，拍干；
⑤显色：加入TMB显色液，每孔100μL，室温避光显色30min，加终止液，每孔50μL，在酶标仪上测定OD450值；
⑥采用第二步线性范围确定后标准曲线，计算得到待测样品的浓度。
2.根据权利要求1所述的采用间接竞争ELISA法检测动物源性过敏原牛血清白蛋白，其特征在于：第二步①中，抗原包被浓度为0.25μg/mL。
3.根据权利要求1所述的采用间接竞争ELISA法检测动物源性过敏原牛血清白蛋白，其特征在于：第二步③中，抗体稀释终浓度为1:32000。
4.根据权利要求1所述的采用间接竞争ELISA法检测动物源性过敏原牛血清白蛋白，其特征在于：第三步①中，工作浓度为0.25μg/mL。
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