CN101451993B - 抗Lp(a)抗体制备及检测Lp(a)的诊断试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗Lp(a)抗体制备及检测Lp(a)的诊断试剂盒。本发明所述的抗体制备是提取健康人群血清中的脂蛋白(a)(Lp(a))制备成抗原后，用其多次免疫敏感动物，获得的高免血清中含有与人血清中Lp(a)抗原有高度特异反应性的抗体，制备过程中应具有无须超速离心处理，制备时间短、抗体的效价高的特点；用该抗体所配制的检测试剂盒配合可见光/紫外半、全自动生化分析仪测定人血清中的脂蛋白(a)具有准确性高、重复性好、抗干扰能力强、基质稳定、线性范围宽等优点。

Description

抗Lp(a)抗体制备及检测Lp(a)的诊断试剂盒

【技术领域】

本发明涉及抗血清Lp(a)抗体的制备方法，以及用该抗体制成的用于临床上血清Lp(a)检测的体外诊断试剂盒，本发明属于检验医学及生物技术领域。

【背景技术】

脂蛋白(a)即LP(a)是一种类似低密度脂蛋白(LDL)的脂质，一种特殊独立的血浆脂蛋白，主要在肝脏合成后分泌入血，其含量的变化在血栓性疾病，肾脏疾病，糖尿病等疾病中具有非常重要的临床意义。

Lp(a)是1963年挪威遗传学家Berg在研究低密度脂蛋白的遗传学变异时发现的。人群中Lp(a)的浓度个体差异极大，浓度范围可在0～1000mg/L，这种差异最主要由apo(a)基因位点决定(《血清脂蛋白a(Lp(a))的生物学特性及临床应用分析》，齐鲁医学检验，2004年第15卷第4期。)。Lp(a)是一种富含胆固醇的脂蛋白，核心部分为中性脂质和apoB-100分子，其外围包绕着亲水性的apo(a)，二者以二硫键共价连接；其中apo(a)是Lp(a)的特征性糖蛋白成分，主要由一种被称为Kringle的，形状颇似丹麦蛋糕的结构组成。Kringle有多种，分别命名为K1、K2、K3、K4和K5。Lp(a)只含一个K5，K5的一端连接有37个K4，第36个K4中含有一个额外未配对的半胱氨酸，推测此处可能是apo(a)以二硫键与apoB100结合的部位。Lp(a)中的K4有75％～85％的氨基酸与纤维蛋白溶酶原(PG)Kringle 4的氨基酸残基相同，有共同的抗原簇，表现两者有交叉免疫反应(《脂蛋白(a)的研究近况-分子生物学与疾病的相关性》，国外医学遗传学分册1999年第22卷第2期)。

对脂蛋白(a)含量的临床意义，早期检测Lp(a)多用电泳法，但此法灵敏度低，多用于定性检测。随后相继研制开发出一些直接测定Lp(a)的免疫化学检测法，如辐射状免疫扩散法(RID)、电免疫扩散法(EID)、放射免疫测定法(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫浊度法[包括免疫散射比浊法(INA)和免疫透射比浊法(ITA)]、解离增强配体荧光免疫测定法(DELFIA)等。RID法与EID法因操作简便，不需特殊设备，仍有一些基层单位实验室采用，但缺点是灵敏度低。RIA法的缺点是操作复杂，有放射性核素污染。DELFIA法因需特殊仪器，国内也较少应用。各种方法测定Lp(a)所得参考值相近，目前国内外所采用的判断标准基本相同。一般认为300mg/L为临界水平，大于300mg/L以上为病理水平。目前主要采用的方法主要是：酶联免疫吸附测定法和免疫透射比浊法(《脂蛋白(a)的测定方法与临床意义》，检验医学信息网。)

酶联免疫吸附测定法不受Plg干扰，该法是根据Lp(a)含有apo(a)、apoB两种抗原位点而设计，其相关性好，但是操作繁琐，无法用于自动化分析仪器，易受外界污染等。

免疫透射比浊法测定Lp(a)含量时，由于Plg与试剂中的抗体发生交叉免疫反应，从而对Lp(a)含量测定产生干扰，这也是该方法测定Lp(a)含量时的主要干扰因素。另外，由于Lp(a)与Plg具有高度同源性，致使Lp(a)抗体与Plg发生免疫交叉反应，进而干扰测定结果。这也是目前最主要的干扰因素，Lp(a)蛋白质分子颗粒大小的多态性和结构的复杂性，以致测定的结果受血清中apo(a)分子大小及抗体特性的影响，致使室间差很大。

同时，检测Lp(a)所需抗体的制备及抗原提取的方法直接关系到抗体质量的高低。已知的方法是采用倍比稀释的密度梯度超离心技术收集到电泳级别的抗原，再进行动物免疫实验。上述方法的缺点是超离心所用时间长，而且在提取过程中目标抗原蛋白容易变性而改变了目标抗原的免疫原性，得到的抗体血清自然效价很低。另外，采用该种方法得到的抗体容易与纤维溶酶原蛋白发生交叉免疫反应。

【发明内容】

[要解决的技术问题]

本发明的目的在于：为了克服上述背景技术中所提及目前检测Lp(a)方法的不足，提供一种具有准确性高、重复性好、抗干扰能力强、基质稳定、适用于可见光/紫外半、全自动生化分析仪等特点的用于检测Lp(a)的试剂盒。

[技术方案]

由健康人群中的多人份的混合血清中提取出Lp(a)与佐剂混合后制备成免疫用的Lp(a)免疫抗原，多次接种对Lp(a)抗原敏感但又不易产生免疫耐受的健康动物，获得的含抗Lp(a)抗体的高免血清；

利用该高免血清配制成含抗Lp(a)抗体的检测试剂及Lp(a)标准液；

本发明描述的Lp(a)检测双试剂盒，配合具有340nm波长、1cm光径、37℃恒温装置的自动生化分析仪进行人血样品脂蛋白(a)的检测。

本发明的具体实施方式抗Lp(a)抗体制备的基本操作的如下：

1.抗原的制备

(1)将300ml混合血清(从健康人群不同个体获得的血清的混合)与400ml的脂肪族表面活性剂(如：异丙基苯磺酸铵，羊毛脂等)在搅拌器中混匀，使其形成表面活性剂-血清复合物。

(2)将38％的磷钨酸-镁200ml在搅拌器上慢慢加入到以上表面活性剂-血清复合物中，脂蛋白沉淀后用生理盐水洗涤。

(3)将洗涤后的脂蛋白沉淀物加入到预冷的无水乙醇/无水乙醚(3∶2)混合液中，不断搅拌，12小时过夜后，在4℃离心，弃上清，将收集的沉淀物后重复一次该操作。

(4)将上述脱脂后的沉淀物用已知的SDS-PAGE凝胶电泳，将Lp(a)凝胶带收集，捣碎，析出Lp(a)，真空干燥后，于-20℃保存。

(5)免疫抗原的制备：将提取的真空干燥的Lp(a)抗原按(W/V)用生理盐水稀释成液体抗原(浓度为：100mg/ml)，再分别经FCA(弗氏完全佐剂)或FIA(弗氏不完全佐剂)等比例混合，置于混合器上使之剧烈振荡10min使抗原充分乳化，获得FCA免疫抗原和FIA免疫抗原。

2.抗体的制备用免疫抗原接种

本发明中抗体制备过程为：

(1)动物：本发明中的实验免疫动物的选择可以是：只要对Lp(a)抗原敏感但又不易产生免疫耐受的健康兔子，羊、牛中任一种动物制备含抗Lp(a)抗体的高免血清。本发明中优先选择的是同一直系兔做为免疫对象。

(2)动物免疫：待免疫的用兔移入接种动物舍，大概需要四天适应期，在免疫接种抗原前采取兔血，提取血清制备成用于抗体检测时作为阴性对照血清。

免疫方法可采用背部多点皮下注射法，剂量0.4～0.6ml/只，每点注0.1ml，每间隔2周后再于上述部位选不同点注射(不要选择临近位点，否则溃疡愈合不好)。在免疫3～4次后可以获得较高效价的抗体，为此第3次免疫后一周进行检测抗体效价的试血，用单向免疫扩散法测定抗体效价(《实用临床免疫学检验》，江苏科技出版社。)如抗体效价符合要求(抗人脂蛋白(a)抗体效价在1∶32～1∶64)，可于最后一次注射后一周放血。

用羊、牛制备高免血清免疫方法和程序相同，但免疫剂量应按体重增加，即按每千克体重0.2～0.3ml计，每点注射0.5～1.0ml。

(3)抗体的提取：

将上述颈动脉血置于25～30℃条件下24小时，3000r/min离心30min，弃沉淀，获得含Lp(a)抗体的血清。

可对Lp(a)抗体的血清中加入非还原型糖，丙三醇，乙二胺四乙酸二纳盐中的一种来保持抗体的效价稳定，同时可以用叠氮钠，乙基汞硫代硫酸钠等中的一种作为防腐。

3.检测人血清中Lp(a)含量试剂盒的制备：

测定人血清中Lp(a)含量的试剂盒的原理是：在缓冲体系中，样品血清中的Lp(a)与抗Lp(a)抗体发生免疫反应，生成的免疫复合物使光透射强度或散射强度发生变化；用Lp(a)校准品的浓度和与之相应的光透射强度或散射强度的标准曲线查出待检测样品中Lp(a)的含量。

由于本发明涉及的试剂盒用的是免疫透射比浊的检测方法，其显著的特色就是选择脂蛋白(a)与纤维蛋白溶酶原无同源的抗体结合位点，通过抗原决定簇掩蔽的方法消除了内源性同源蛋白(Plg)的干扰，同时利用链激酶-聚氧乙烯烷基芳醚溶液消除屏蔽，进一步减少Plg和其他杂蛋白的干扰。

用于血清中Lp(a)含量的检测试剂盒，它由：反应剂(试剂1)，抗体试剂(试剂2)和标准液组成。本试剂盒应用时必需配合具有340nm波长、1cm光径、37℃恒温装置的自动生化分析仪进行人血清样品脂蛋白(a)的检测。

(1)反应剂(试剂1)，其组成为：

Tris缓冲液(pH＝7.2)             250～350ml

氯化钠                          5～8g

聚乙烯二醇8000                  50～70g

对羟基苯甲酸酯                  4～6g

链激酶-聚氧乙烯烷基芳醚溶液^*    80～120ml

小牛血清白蛋白                  60～80g

其余为纯化水补足到1000ml

^*：链激酶-聚氧乙烯烷基芳醚溶液是将1000U链激酶溶解于100ml聚氧乙烯烷基芳醚，制成溶液，其中链激酶可以用尿激酶替代，聚氧乙烯烷基芳醚可以用聚苯乙烯苯醚或聚氧乙烯烷基醚替代。

本发明选取Tris缓冲液，缓冲液还可选择磷酸缓冲液、Tris缓冲液、PIPES缓冲液、HEPES缓冲液、TAPS缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液等替代，pH值为7.0～10.0。

本试剂盒的加速剂采用聚乙二醇8000，但也可以选用分子量1000～20000中其他的聚乙二醇。

本试剂盒的防腐剂采用对羟基苯甲酸酯。但也可以采用叠氮钠、乙基汞硫代硫酸钠。

以上处方中的小牛血清白蛋白也可以选用EDTA-Na、氯化镁、牛血清白蛋白、乙二醇、甘露醇等替代。

本试剂选用非离子表面活性剂：吐温系列、聚氧乙烯醚类。表面活性剂还可以选用阴离子表面活性剂、两性表面活性剂。

(2)抗体试剂(试剂2)，其组成为：

兔抗人Lp(a)抗体的血清稀释液                  1000ml

兔抗人Lp(a)抗体的血清(抗体效价1∶32～1∶64)  1000ml

柳氮磺胺吡啶-丙二醇溶液^*                     150ml

^*：柳氮磺胺吡啶-丙二醇溶液：将柳氮磺胺吡啶80g溶于50～150ml丙二醇中配成。

配方中的柳氮磺胺吡啶，可以采用丁基羟基茴香醚、硫代二丙酸二月桂酯、二丁基羟基甲苯、苯多酚、甘草抗氧化物、磷脂等。

其中：

兔抗人Lp(a)抗体的血清稀释液：

Tris缓冲液(pH＝7.2)    200～250ml

聚乙烯二醇8000         30～50g

对羟基苯甲酸酯         2～6g

小牛血清白蛋白         50～70g

纯化水  加到           1000ml

(3)标准液：

校准液是决定试剂准确度的重要因素之一。Lp(a)在液体状态下，在体外过度金属离子氧化、化学修饰、细胞氧化，均可引起Lp(a)发生氧化修饰，使标准液的值在短时间内发生很大的下降，所以用柳氮磺胺吡啶-丙二醇溶液来减缓其氧化速度。而目前大多数的氧化剂都根据其氧化剂自身的强还原性，从而阻止其标准液中的Lp(a)被氧化，因此抗氧化剂化效果随着时间的推移而下降。有研究发现，具有抗氧化作用物质在被还原的同时，会产生一定量的自由基。为了提高标准液在液态状态下的稳定性，我们在其中加入了适量的柠檬酸，增加柳氮磺胺吡啶-丙二醇溶液的稳定性，从而本发明制备的Lp(a)标准液，在2～8℃一年内保持几乎不变。本发明的Lp(a)标准液的定值为：10.0g/L，因此标准液制备时，加入纯度为90％(高压液相色谱法测定)、效价在1∶16～1∶32(单向免疫扩散法测定)的纯化Lp(a)抗原10.0g/L。

其标准液的主要组成包括：

pH 6～8Tris缓冲液                   200ml

Lp(a)抗原(抗体效价1∶16～1∶32)     10g

柳氮磺胺吡啶-丙二醇溶液^*            90～150ml

山梨酸盐                            0.1～0.5g

小牛血清白蛋白                      40～60g

过氧乙酸纳                          4～7g

柠檬酸                              4～7g

纯化水  加到                        1000ml

^*：柳氮磺胺吡啶-丙二醇溶液：将柳氮磺胺吡啶60g溶于150ml丙二醇中配成。

本标准液选取Tris缓冲液。也可采用PBS、TAPS、HEPPS、CHES、甘氨酸、双甘氨肽等替代。其中柳氮磺胺吡啶可以用丁基羟基茴香醚、硫代二丙酸二月桂酯、二丁基羟基甲苯、甘草抗氧化物等替代。

小牛血清白蛋白可以稳定标准液中的抗原，防止抗原蛋白氧化，变性等引发的活性降低。

4.检测人血清中Lp(a)含量试剂盒的使用

(1)检测仪器：本发明涉及的Lp(a)检测双试剂盒，必需配合具有340nm波长、1cm光径、37℃恒温装置的自动生化分析仪进行检测。

(2)检测样品的准备：样品为新鲜血清，血清中LP(a)室温保存可稳定1天，2～8℃可稳定7天，冰冻可稳定3个月。

(3)操作步骤如下：

1)在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10min，主波长340nm，副波长800nm。测定试剂和样品的体积比为20∶1，将最终反应物置于生化分析仪下，检测在主波长340nm吸光度的变化。

2)加样及记录结果：

表1  样品检测操作术式

结果计算：样品管Lp(a)的含重(mg/L)＝标准液浓度×ΔA_(样品管)/ΔA_(标准管)。

正常人群参考值为0～300mg/L。

(4)试剂盒检验结果验证：

特异性：通过采用本发明的试剂盒分别检测含Lp(a)和已除去Lp(a)的人血清，根据检测结果显示，含Lp(a)的人血清的检出率为99％，不含Lp(a)的人血清的检出率2％，但检测出的含量却很低。

准确性：取710mg/L的Lp(a)定值标准血清，采用同批次的本试剂盒在外部条件相同的条件下，用自动生化分析仪测定，测定结果如下表2：

表2  准确性测定结果表

测定次数	结果(mg/L)
		1	684
2	684.9
		3	685.1
4	687.3
		5	692.1
6	686.9
		7	693.2
8	698.6
		9	684.9
10	695.5

准确度为：-0.029％

重复性测定数据如下表3：

表3重复性测定数据结果表

本试剂盒的精密度的批内差为CV≤8％。

批间差为CV≤10％。

准确度的相对偏差控制在±10％的范围内。

线性范围控制在0～1000mg/L。

本发明的积极意义在于：本发明所述的抗体制备是提取健康人群血清中的脂蛋白(a)(Lp(a))制备成抗原后，用其多次免疫敏感动物，获得的高免血清中含有与人血清中Lp(a)抗原有高度特异反应性的抗体，制备过程中应具有无须超速离心处理，制备时间短、抗体的效价高的特点；用该抗体所配制的检测试剂盒配合可见光/紫外半、全自动生化分析仪测定人血清中的脂蛋白(a)具有准确性高、重复性好、抗干扰能力强、基质稳定、线性范围宽等优点。

本发明中所使用的各种试剂和药品均购置于国内试剂公司和药品商店的分析纯或化学纯级。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。

实施例1  抗原的制备

取300ml混合血清(从健康人群不同个体获得的血清的混合)与400ml的脂肪族表面活性剂(羊毛脂)在搅拌器中混匀，再慢慢加入38％的磷钨酸-镁200ml，待形成脂蛋白沉淀后用生理盐水对其进行洗涤；将洗涤后的脂蛋白沉淀物加入到预冷的无水乙醇/无水乙醚(3∶2)混合液中，不断搅拌，12小时过夜后，在4℃离心，弃上清，将收集的沉淀物后重复一次该操作；将上述脱脂后的沉淀物用已知的SDS-PAGE凝胶电泳，将Lp(a)凝胶带收集，捣碎，析出Lp(a)，真空干燥成Lp(a)冻干制品，保存于-20℃。

将提取的真空干燥的Lp(a)冻干制品按(W/V)用生理盐水稀释成液体抗原(浓度为：100mg/ml)，再分别经FCA(弗氏完全佐剂)或FIA(弗氏不完全佐剂)等比例混合，置于混合器上使之剧烈振荡10min使抗原充分乳化，获得FCA免疫抗原乳剂和FIA免疫抗原乳剂。

实施例2抗体的制备

选取20只健康家兔作为免疫动物移入兔房后，经过4天的适应期，在免疫接种抗原乳剂前采取兔血，提取血清制备成用于抗体检测时作为阴性对照。

第一次免疫接种采用FCA免疫抗原乳剂，免疫方法可采用背部多点皮下注射法，剂量0.4～0.6ml/只，每点注0.1ml，从第二次免疫接种起改用FIA免疫抗原乳剂。每间隔2周后再于上述部位选不同点注射。第3次免疫后一周进行检测抗体效价的试血，用单向免疫扩散法测定抗体效价，如抗体效价达到1∶32以上，可于第4次注射后一周颈动脉放血并提取血清，即为含Lp(a)抗体的血清。

实施例3

可用健康的绵羊、牛和马等，只要对抗原敏感但又不易产生免疫耐受的动物取代实施例中的家兔制备含Lp(a)抗体的血清。

实施例4

检测Lp(a)的诊断试剂盒各组分中相关溶液的配制：

1.链激酶-聚氧乙烯烷基芳醚溶液

1000U链激酶溶解于100ml聚氧乙烯烷基芳醚，制成溶液。

2.柳氮磺胺吡啶-丙二醇溶液

柳氮磺胺吡啶80g溶于150ml丙二醇中配成。

3.兔抗人Lp(a)抗体的血清稀释液

pH 7.2 Tris缓冲液     200ml

聚乙烯二醇8000        50g

对羟基苯甲酸酯    4g

小牛血清白蛋白    60g

纯化水加至        1000ml

实施例5

实施例4中链激酶-聚氧乙烯烷基芳醚溶液的配方中可以选聚苯乙烯苯醚，聚氧乙烯烷基醚取代聚氧乙烯烷基芳醚；选用尿激酶替代链激酶。

实施例6

实施例4柳氮磺胺吡啶-丙二醇溶液配方中的柳氮磺胺吡啶，可以采用丁基羟基茴香醚、硫代二丙酸二月桂酯、二丁基羟基甲苯、苯多酚、甘草抗氧化物、磷脂等替代。

实施例7

检测Lp(a)的诊断试剂盒各组分的配制：

1.试剂I：

pH＝7.2 Tris缓冲液           250ml

氯化钠                       5g

聚乙烯二醇8000               50g

对羟基苯甲酸酯               4g

链激酶-聚氧乙烯烷基芳醚溶液  80ml

小牛血清白蛋白               60g

纯化水加至                   1000ml

2.试剂II：

兔抗人Lp(a)抗体的血清稀释液                  1000ml

兔抗Lp(a)抗体的血清(抗体效价1∶32～1∶64)    1000ml

柳氮磺胺吡啶-丙二醇溶液                      150ml

3.标准液：

pH 7.2 Tris缓冲液                         200ml

Lp(a)抗原(抗体效价1∶16～1∶32)           10g

柳氮磺胺吡啶-丙二醇溶液    90ml

山梨酸盐                   0.3g

小牛血清白蛋白             40g

过氧乙酸纳                 4g

柠檬酸                     4g

纯化水加至                 1000ml

实施例8：

检测Lp(a)的诊断试剂盒各组分的配制：

1.试剂I：

pH＝7.2Tris缓冲液              300ml

氯化钠                         7g

聚乙烯二醇8000                 60g

对羟基苯甲酸酯                 6g

尿激酶-聚氧乙烯烷基芳醚溶液    90ml

小牛血清白蛋白                 60g

纯化水加至                     1000ml

2.试剂II：

兔抗人Lp(a)抗体的血清稀释液                    1000ml

兔抗人Lp(a)抗体的血清(抗体效价1∶32～1∶64)    1000ml

柳氮磺胺吡啶-丙二醇溶液                        150ml

3.标准液：

HEPPS缓冲液                        200ml

Lp(a)抗原(抗体效价1∶16～1∶32)    10g

丁基羟基茴香醚--丙二醇溶液         90ml

叠氮钠                             0.5g

小牛血清白蛋白                     45g

过氧乙酸纳                         7g

柠檬酸                 6g

纯化水加至             1000ml

实施例9：

检测Lp(a)的诊断试剂盒各组分的配制：

1.试剂I：

磷酸缓冲液                 250ml

氯化钠                     7g

聚乙烯二醇8000             70g

叠氮钠                     6g

尿激酶-聚苯乙烯苯醚溶液    100ml

小牛血清白蛋白             70g

纯化水加至                 1000ml

2.试剂II：

兔抗Lp(a)抗体的血清稀释液                      1000ml

兔抗人Lp(a)抗体的血清(抗体效价1∶32～1∶64)    1000ml

柳氮磺胺吡啶-丙二醇溶液                        150ml

3.标准液：

PBS缓冲液                             200ml

Lp(a)抗原(抗体效价1∶16～1∶32)       10g

柳氮磺胺吡啶-丙二醇溶液               100ml

叠氮钠                                0.3g

小牛血清白蛋白                        50g

过氧乙酸纳                            5g

柠檬酸                                5g

纯化水加到                            1000ml

实施例10

 1.试剂I

Tris缓冲液(pH＝7.2)            300ml

氯化钠                         8g

聚乙烯二醇8000                 70g

对羟基苯甲酸酯                 6g

链激酶-聚氧乙烯烷基芳醚溶液    120ml

小牛血清白蛋白                 80g

纯化水补足到                   1000ml

2.试剂II：

兔抗人Lp(a)抗体的血清稀释液                   1000ml

兔抗人Lp(a)抗体的血清(抗体效价1∶32～1∶64)   1000ml

柳氮磺胺吡啶-丙二醇溶液                       150ml

(3)标准液：

PBS缓冲液                             200ml

Lp(a)抗原(抗体效价1∶16～1∶32)       10g

柳氮磺胺吡啶-丙二醇溶液               150ml

山梨酸盐                              0.5g

小牛血清白蛋白                        60g

过氧乙酸纳                            7g

柠檬酸                                7g

纯化水加到                            1000ml

Claims (4)

1.一种抗Lp(a)抗体的制备方法，其特征在于： 

（1）抗原的制备 

1）将从健康人群不同个体获得的血清的混合物与脂肪族表面活性剂混匀，使其形成表面活性剂-血清复合物；将38%的磷钨酸-镁慢慢加入到以上表面活性剂-血清复合物中，脂蛋白沉淀后用生理盐水洗涤； 

2）将洗涤后的脂蛋白沉淀物加入到预冷的体积比为3:2的无水乙醇/无水乙醚混合液中，不断搅拌，12小时过夜后，在4℃离心，弃上清，收集沉淀物再加入到预冷的体积比为3:2的无水乙醇/无水乙醚混合液中，不断搅拌，12小时过夜后，在4℃离心，弃上清，收集沉淀物； 

3）将上述脱脂后的沉淀物用已知的SDS-PAGE凝胶电泳，将Lp(a)凝胶带收集，捣碎，析出Lp(a),真空干燥后，于－20℃保存； 

4）将提取的真空干燥的Lp(a)抗原用生理盐水稀释成浓度为100mg/ml的液体抗原，再分别经弗氏佐剂等比例混合、乳化，获得FCA免疫抗原和FIA免疫抗原； 

（2）用免疫抗原多次接种对Lp(a)抗原敏感但又不易产生免疫耐受的健康兔子，羊、牛中任一种，获得含抗Lp(a)抗体的高免血清。 

2.一种检测Lp(a)的诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒含有由权利要求1制备的含抗Lp(a)抗体的高免血清配制而成的抗体试剂、由权利要求1的由多人份的混合血清中提取出的Lp(a)配制的标准液和反应剂，该反应剂是由以下成分所配制：pH=7.2 Tris缓冲液250～350ml，氯化钠5～8g，聚乙烯二醇8000 50～70g，对羟基苯甲酸酯4～6g，链激酶-聚氧乙烯烷基芳醚溶液80～120ml，小牛血清白蛋白60～80g，纯化水补足到1000ml，其中链激酶-聚氧乙烯烷基芳醚溶液是由以下成分所配制：1000U链激酶溶解于100ml聚氧乙烯烷基芳醚，制成溶液。 

3.如权利要求2所述的一种检测Lp(a)的诊断试剂盒，其特征在于抗体试剂是由以下成分所配制：兔抗人Lp(a)抗体的血清稀释液1000ml，效价为1:32～1:64的兔抗人Lp(a)抗体的血清1000ml，柳氮磺胺吡啶-丙二醇溶液150ml，其中柳氮磺胺吡啶-丙二醇溶液是由 柳氮磺胺吡啶80g溶于150ml丙二醇中配成。 

4.如权利要求2所述的一种检测Lp(a)的诊断试剂盒，其特征在于标准液是由以下成分所配制：pH6～8的Tris缓冲液200ml,效价为1:16～1:32的Lp（a）抗原10g,柳氮磺胺吡啶-丙二醇溶液90～150ml,叠氮钠0.5g,小牛血清白蛋白40～60g,过氧乙酸纳4～7g,柠檬酸4～7g，纯净水加至1000ml。