CN103257194A

CN103257194A - 同时分析卷烟主流烟气中三种多环芳烃和四种烟草特有亚硝胺的gc-ms/ms方法

Info

Publication number: CN103257194A
Application number: CN2013102268053A
Authority: CN
Inventors: 边照阳; 陈晓水; 唐纲岭; 陈再根; 刘珊珊; 杨飞; 刘洋; 张洪非; 李中皓; 胡清源
Original assignee: National Tobacco Quality Supervision and Inspection Center
Current assignee: National Tobacco Quality Supervision and Inspection Center
Priority date: 2013-06-08
Filing date: 2013-06-08
Publication date: 2013-08-21
Anticipated expiration: 2033-06-08
Also published as: CN103257194B

Abstract

一种同时分析卷烟主流烟气中三种多环芳烃和四种烟草特有亚硝胺的GC-MS/MS方法，是将捕集有卷烟主流烟气粒相物的剑桥滤片取出后，加入乙酸乙酯和内标物，振荡提取后，取萃取液经分散固相萃取（d-SPE）,然后取上清液氮吹浓缩后，以气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）进行测定。本发明的方法克服了现有技术样品处理方法对两种物质单独检测，且前处理繁琐的不足，针对卷烟主流烟气粒相物，优化了样品前处理方法和仪器检测条件。本发明的优点在于：样品前处理过程中以10mL乙酸乙酯对两类极性相差较大的目标物进行同时提取，提取效率较好。与国标方法相比，可减少有机溶剂使用量几倍至数十倍。且具有操作准确、灵敏度高及重复性好的特点。

Description

同时分析卷烟主流烟气中三种多环芳烃和四种烟草特有亚硝胺的GC-MS/MS方法

技术领域

本发明属于卷烟烟气中有害物质检测技术领域，主要涉及卷烟主流烟气中的苯并[a]蒽(BaA)、屈(Chrysene)、苯并[a]芘(BaP)等三种多环芳烃和NNN、NAT、NAB、NNK等四种烟草特有亚硝胺（TSNAs）的测定技术。

背景技术

以苯并[a]芘为代表的多环芳烃和以NNK为代表的烟草特有亚硝胺（TSNAs）是卷烟主流烟气中的两类主要有害物质，致癌作用强，对以往的动物或人体毒理学研究的权重分析表明，烟草中致癌作用最强的正是TSNAs与PAHs，它们一直都是人们研究的热点。

卷烟主流烟气中的苯并[a]芘和烟草特有N-亚硝胺常以两个不同的方法进行检测分析，以《GB/T 21130-2007 卷烟烟气总粒相物中苯并[a]芘的测定》和《GB/T 23228-2008 卷烟主流烟气总粒相物中烟草特有N-亚硝胺的测定气相色谱－热能分析联用法》为代表。对主流烟气中的TSNAs的测定方法主要是GC-TEA，近年来出现了LC-MS/MS的检测方法，GC/MS也被用于TSNAs的检测；分析BaP的方法主要是GC/MS，高效液相色谱法也被用于BaP的检测。

GC/MS法测卷烟主流烟气中的多环芳烃一般用含内标的正己烷或环己烷等有机溶剂浸提烟气总粒相物，萃取液用硅胶固相萃取柱净化，洗脱液经浓缩后，进行GC/MS分析，以选择离子监测（SIM）模式定量，具有回收率高，灵敏度高，重复性好，定量准确等特点，但样品前处理过程中需要繁琐的固相萃取过程及浓缩过程，费时费力，且对焦油含量小于1 mg/cig卷烟的主流烟气中多环芳烃的GC/MS检测过程中发现，苯并[a]芘的含量多低于1 ng/cig，此时苯并[a]芘的GC/MS色谱峰偏低，给定量带来一定的困难。

对于GC-TEA法测定主流烟气总粒相物中烟草特有N-亚硝胺，由于热能分析仪只对亚硝胺和亚硝酸酯响应，是专一性的检测器，所以具有相当高的选择性和灵敏度，但该法的缺点是纯化步骤多，分析时间长，且对于烟草特有N-亚硝胺含量特低的烤烟型卷烟，GC-TEA的灵敏度就略显不够。

发明内容：

本发明的目的正是基于上述现有技术状况而提供一种同时分析卷烟主流烟气中三种多环芳烃和四种烟草特有亚硝胺的GC-MS/MS方法，利用该方法简化了吸烟过程，简化了样品前处理的操作，同时提高了检测仪器的灵敏度。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：本发明的同时分析卷烟主流烟气中三种多环芳烃和四种烟草特有亚硝胺的GC-MS/MS方法，是将捕集有卷烟主流烟气粒相物的剑桥滤片取出后，加入乙酸乙酯和内标物，振荡提取后，取萃取液经分散固相萃取（d-SPE）,然后取上清液氮吹浓缩后，以气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）进行测定，具体步骤如下：

a、内标溶液的配制：配制d₄-NNN、d₄-NAT、d₄-NAB、d₄-NNK和d₁₂-BaP浓度均为4 μg/mL的丙酮溶液；

b、准备标准工作溶液：分别称取0.010 g（精确至0.1 mg）标准品，置于同一10 mL容量瓶中，用丙酮溶解并定容，然后用乙酸乙酯稀释并最终配制成具有浓度梯度的各种目标物的标准工作溶液；

c、样品制备：按ISO 3308:2000方法收集5支卷烟的粒相物后，取下剑桥滤片；

d、振荡萃取：准确加入10 mL乙酸乙酯和100 μL内标溶液，在振荡仪上以200 rpm 振荡萃取30 min；

e、基质分散固相萃取（d-SPE）：取5 mL萃取液加入到基质分散固相萃取离心管中（内含900 mg MgSO₄，250 mg PSA）,在漩涡混合振荡器上以2000 rpm的转速振荡2 min，在高速离心机上以6000 rpm离心3 min。

f、取上清液3 mL在45 ℃恒温水浴中氮气浓缩至干后，用1 mL乙酸乙酯复溶，过0.22 μm有机滤膜后，收集在自动进样色谱小瓶中；

g、GC-MS/MS测定:b中的标准工作溶液或f中的样品提取液可上机测定;

h、测定结果的计算:以内标法进行目标物的定量分析，即以目标物和相应内标的二级选择离子峰面积比对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线；对提取后的样品进行测定，测得检出目标物和对应内标的二级选择离子峰面积比，代入标准曲线，求得样品中的苯并[a]蒽、屈、苯并[a]芘和NNN、NAT、NAB、NNK的含量。

在本发明中，标准工作溶液的配制方式如下：分别称取0.010 g（精确至0.1 mg）各种标准品，置于同一10 mL容量瓶中，用丙酮溶解并定容，配制成各目标物浓度为1 mg/mL的混合标准溶液Ⅰ；然后准确移取1 mL混合标准溶液Ⅰ，置于100 mL容量瓶中，以丙酮定容，配制成浓度为10 μg/mL的混合标准溶液Ⅱ；然后准确移取1 mL混合标准溶液Ⅱ，置于10 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容，配制成浓度为1 μg/mL的混合标准溶液Ⅲ；准确移取0.01 mL、0.02 mL、0.05 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL和1 mL的混合标准溶液Ⅲ，置于10 mL容量瓶中，准确加入100 μL内标溶液，用乙酸乙酯定容，即得系列标准工作溶液。配制的系列标准溶液浓度为：1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL。

在GC-MS/MS测定时，采用的色谱条件为：色谱柱：DB-35MS弹性石英毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度：250 ℃；程序升温：初始温度50 ℃，保持1 min后以25 ℃/min升至150 ℃；然后以5 ℃/min升至260 ℃，保持5 min；最后以10 ℃/min升至280 ℃，保持8 min；不分流进样，不分流时间1 min；载气：氦气（纯度为99.999%）；恒流模式，流速为1.0 mL/min；进样量：1 μL。总运行时间为42 min

采用的质谱条件为：EI电离模式，电离能70 eV；灯丝电流：50 μA；离子源温度：250 ℃；传输线温度：280 ℃；Q2碰撞气：氩气（纯度99.999%），碰撞池压力为1.0 mTorr；溶剂延迟5 min；扫描方式：多反应监测（MRM）。目标物及内标的保留时间和质谱参数见表1。

表1 目标物及内标物的保留时间和MRM参数

本发明的方法克服了现有技术样品处理方法对两种物质单独检测，且前处理繁琐的不足，针对卷烟主流烟气粒相物，优化了样品前处理方法和仪器检测条件。与现有国标方法中使用旋蒸方法进行浓缩相比，氮吹浓缩适合于大批量样品的同时处理，可有效提高样品前处理通量；而浓缩至干后再复溶的方法，与直接浓缩至一定体积相比，其定容体积更准确，定量效果更佳。

与现有技术相比本发明方法具有如下优良效果：

⑴本发明方法样品前处理过程中以10 mL乙酸乙酯对两类极性相差较大的目标物进行同时提取，提取效率较好。与国标方法相比，可减少有机溶剂使用量几倍至数十倍。

⑵本发明方法样品前处理过程中，多环芳烃和TSNAs的萃取、净化和上机检测都是同时进行的，与以往所说的“同时检测”（一次萃取，但净化或检测都分开进行）相比，更简单，耗时更短，效率更高。

⑶本发明方法在净化处理时选择基质分散固相萃取（d-SPE）作为净化手段，与国标方法固相萃取相比，其操作更简单，价格更便宜。

⑷本发明方法采用了高灵敏度和强抗干扰能力的GC-MS/MS对多环芳烃和TSNAs进行同时检测，因此具有操作准确、灵敏度高及重复性好的优点。

①本发明方法的定量限：

对标准溶液中的目标物响应信号，以10倍信噪比（S/N = 10）计算检测限（LOQ），定量限在0.04~0.27 ng/cig之间。

②本发明方法的重复性和加标回收率：

在空白滤片中加入标准溶液，然后分别进行前处理和GC-MS/MS分析，并按照加标量和测定值计算其回收率，结果见表2。由表2可以看出，目标物的回收率在85~107％之间，平均相对标准偏差（RSD）小于6.5%，说明本发明方法的回收率高，重复性好。

附图说明

图1为本发明的测定方法流程图（该图作为摘要附图）。

具体实施方式

本发明以下结合实例做进一步描述，但并不是限制本发明。

实例1：

1．仪器与试剂：

目标物：BaA、Chrysene、BaP、NNN、NAT、NAB、NNK，内标：d₄-NNN、d₄-NAT、d₄-NAB、d₄-NNK、d₁₂-BaP，均为标准品；丙酮、乙酸乙酯，均为色谱级试剂。

美国Thermo Fisher TSQ Quantum GC 气相色谱-三重四级杆串联质谱仪；瑞士Mettler AE 163电子天平（感量：0.0001g）；美国Labnet VtexMixer VX200振荡器；德国Sigma高速冷冻离心机。

2．样品处理：

按ISO 3308:2000方法收集5支卷烟的粒相物后，取下剑桥滤片；

准确加入10 mL乙酸乙酯和100 μL内标溶液，在振荡仪上以200 rpm 振荡萃取30 min；

取5 mL萃取液加入到基质分散固相萃取离心管中（内含900 mg MgSO₄，250 mg PSA）,在漩涡混合振荡器上以2000 rpm的转速振荡2 min，在高速离心机上以10000 rpm离心3 min。

取上清液3 mL在45 ℃恒温水浴中氮气浓缩至干后，用1 mL乙酸乙酯复溶，过0.22 μm有机滤膜后，收集在自动进样色谱小瓶中；

3.准备标准工作溶液：分分别称取0.01 g（精确至0.1 mg）标准品，置于同一10 mL容量瓶中，用丙酮溶解并定容，配制成目标物浓度为1 mg/mL的混合标准溶液Ⅰ；然后准确移取1 mL混合标准溶液Ⅰ，置于100 mL容量瓶中，以丙酮定容，配制成目标物浓度为10 μg/mL的混合标准溶液Ⅱ；然后准确移取2 mL混合标准溶液Ⅱ，置于10 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容，配制成浓度为2 μg/mL的混合标准溶液Ⅲ；准确移取0.01 mL、0.02 mL、0.05 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL和1 mL的混合标准溶液Ⅲ，置于10 mL容量瓶中，准确加入100 μL内标溶液，用乙酸乙酯定容，即得系列标准工作溶液。配制的系列标准溶液浓度为：1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL。

4.测定方法: 将配制好的不同浓度的标准溶液注入GC-MS/MS，以内标法进行目标物的定量分析，即以目标物与相应氘代内标的二级选择离子峰面积比对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线；对提取后的样品进行测定，测得目标物与相应氘代内标的二级选择离子峰面积比，代入标准曲线，求得滤片中BaA、Chrysene、BaP、NNN、NAT、NAB、NNK的含量见表3。

表3 卷烟A中多环芳烃和TSNAs的检测结果

序号	名称	目标物的含量（ng/cig）
			1	NNN	45.95
2	NAT	21.77
			3	NAB	2.73
4	NNK	12.91
			5	BaA	12.73
6	Chrysene	13.34
			7	BaP	7.97

采用的质谱条件为：EI电离模式，电离能70 eV；灯丝电流：50 μA；离子源温度：250 ℃；传输线温度：280 ℃；Q2碰撞气：氩气（纯度99.999%），碰撞池压力为1.0 mTorr；溶剂延迟5 min；扫描方式：多反应监测（MRM）。两种目标物及相应内标的保留时间和质谱参数见表1。

实例2：

如实施例1所述，选择另一品牌卷烟样品B，测得样品苯并芘和NNK的含量见表4。

表4 卷烟B中多环芳烃和TSNAs的检测结果

序号	名称	目标物的含量（ng/cig）
			1	NNN	5.76
2	NAT	12.73
			3	NAB	2.44
4	NNK	5.63
			5	BaA	12.79
6	Chrysene	14.48
			7	BaP	8.01

实例3：

如实施例1所述，选择另一品牌卷烟样品C，测得样品中苯并芘和NNK的含量见表5。

表5 卷烟C中多环芳烃和TSNAs的检测结果

序号	名称	目标物的含量（ng/cig）
			1	NNN	8.06
2	NAT	17.76
			3	NAB	0.93
4	NNK	8.10
			5	BaA	12.30
6	Chrysene	13.40
			7	BaP	7.34

实例4：

如实施例1所述，选择另一品牌卷烟样品D，测得样品中苯并芘和NNK的含量见表6。

表6 卷烟D中多环芳烃和TSNAs的检测结果

序号	名称	目标物的含量（ng/cig）
			1	NNN	5.76
2	NAT	13.70
			3	NAB	1.56
4	NNK	5.78
			5	BaA	14.45
6	Chrysene	16.06
			7	BaP	8.95

Claims

1. 一种同时分析卷烟主流烟气中三种多环芳烃和四种烟草特有亚硝胺的GC-MS/MS方法，其特征在于：是将捕集有卷烟主流烟气粒相物的剑桥滤片取出后，加入乙酸乙酯和内标物，振荡提取后，取萃取液经分散固相萃取（d-SPE）,然后取上清液氮吹浓缩后，以气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）进行测定，具体步骤如下：

b、准备标准工作溶液：分别称取苯并[a]蒽、屈、苯并[a]芘、NNN、NAT、NAB、NNK标准品各0.010 g，置于同一10 mL容量瓶中，用丙酮溶解并定容，然后用乙酸乙酯稀释并最终配制成具有浓度梯度的各种目标物的标准工作溶液；

e、基质分散固相萃取（d-SPE）：取5 mL萃取液加入到基质分散固相萃取离心管中（内含900 mg MgSO₄，250 mg PSA）,在漩涡混合振荡器上以2000 rpm的转速振荡2 min，在高速离心机上以6000 rpm离心3 min;

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：配制的系列标准工作溶液浓度为：1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在GC-MS/MS测定时，采用的色谱条件为：色谱柱：DB-35MS弹性石英毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度：250 ℃；程序升温：初始温度50 ℃，保持1 min后以25 ℃/min升至150 ℃；然后以5 ℃/min升至260 ℃，保持5 min；最后以10 ℃/min升至280 ℃，保持8 min；不分流进样，不分流时间1 min；载气：氦气；恒流模式，流速为1.0 mL/min；进样量：1 μL；总运行时间为42 min；

采用的质谱条件为：EI电离模式，电离能70 eV；灯丝电流：50 μA；离子源温度：250 ℃；传输线温度：280 ℃；Q2碰撞气：氩气，碰撞池压力为1.0 mTorr；溶剂延迟5 min；扫描方式：多反应监测（MRM）。