CN103210090B

CN103210090B - 改进纤维素在高稠度系统中的水解的方法

Info

Publication number: CN103210090B
Application number: CN201180052359.8A
Authority: CN
Inventors: P·J·E·哈尔里克; W·郑
Original assignee: Iogen Energy Corp
Current assignee: Iogen Energy Corp
Priority date: 2010-08-31
Filing date: 2011-08-30
Publication date: 2015-09-16
Anticipated expiration: 2031-08-30
Also published as: CA2808666C; US20140242684A1; US10738273B2; US20120052534A1; CA2808666A1; US8709770B2; BR112013004875A2; WO2012027843A1; CN103210090A; DE112011102846T5; BR112013004875B1

Abstract

提供一种用于由经预处理的纤维素原料将纤维素酶法水解以生产葡萄糖的方法。该方法包括提供经预处理的纤维素原料的含水浆体，该含水浆体具有的含水量小于经预处理的纤维素原料的最大持水量的约140%。将经预处理的纤维素原料的含水浆体进料至一个或多个非混合式水解反应器中并在其中使用纤维素酶来水解。在非混合式水解反应器中，纤维素酶将部分纤维素水解以产生可溶性糖，从而产生含有可溶性糖的部分水解的纤维素的混合物。通过将部分水解的纤维素的混合物进料至一个或多个水解反应器中，来将纤维素继续水解为葡萄糖。还提供用于进行前述酶法水解的系统。

Description

改进纤维素在高稠度系统中的水解的方法

技术领域

本发明涉及一种由纤维素原料生产可发酵糖的改进的方法。

背景技术

由于纤维素原料低廉的成本和广泛的可用性，近年来对于由纤维素原料——如农业废料和林业废料——来生产燃料和化学品（主要有乙醇）已经付出了很多关注和努力。这些农业和林业废料通常被焚烧并填埋：因此，使用这些纤维素原料来生产乙醇提供了一种相对于丢弃而言有吸引力的替代方案。

将纤维素原料转化为乙醇或其他发酵产物的第一化学处理步骤通常包括原料的预处理。预处理的目的是提高纤维素的表面积，纤维素向葡萄糖的转化有限。原料的预处理可用以下方法实现：在原料的半纤维素成分水解的条件下进行酸预处理，随后用纤维素酶将经预处理的纤维素原料中剩余的纤维素进行酶法水解。酶法水解通常在受控的pH、温度和混合条件下在一种或多种稀释混合型间歇式反应器中进行。

用于将纤维素水解为葡萄糖的纤维素酶包括包含外切纤维二糖水解酶（CBH）、内切葡聚糖酶（EG）和β-葡萄糖苷酶的混合酶。CBH和EG酶催化纤维素（β-1.4-D-葡萄糖苷键）的水解。CBH酶、CBHI和CBHII（根据糖苷水解酶家族命名法（Glycoside Hydrolase familydesignations）还被称作Cel7和Cel6）作用于纤维素微纤维中葡萄糖聚合物的末端并释放出纤维二糖，而EG酶（包括EGI、EGII、EGIII和EGV，还分别被称作Cel7、Cel5、Cel12和Cel45）作用于纤维素的随机区域。所述纤维素酶一起将纤维素水解为纤维二糖，其再由β-葡萄糖苷酶（β-G）水解为葡萄糖。

除了CBH、EG和β-葡萄糖苷酶之外，还存在一些辅助酶（accessoryenzymes）来协助纤维素的酶消化（参见共有的WO2009/026722(Scott)，其以引用的方式纳入本说明书，以及Harris et al.,2010,Biochemistry,49:3305-3316）。这些辅助酶包括EGIV（也被称作Cel61）、膨胀因子、扩展因子、lucinen和纤维素诱导蛋白(Cip)。可以由β-葡萄糖苷酶通过转糖苷反应将葡萄糖酶法转化为二聚体龙胆二糖、槐二糖、昆布二糖及其他。

在常规的水解反应器中，通过以下的方式来混合：机械混合器如顶置式、侧置式、或底置式叶轮、搅拌器或喷射器；快速移动的液态浆体流被泵入或通过容器；和/或在容器中引入或生成气体或蒸汽。此外，采用随着浆体沿反应器长度的方向流经混合区进行周期混合的反应器是已知的（参见下文讨论的美国专利No.5,733,758(Nguyen)）。

由葡萄糖生产乙醇的发酵作用通常使用酵母菌株(Saccharomycesspp.)进行。乙醇的回收通过蒸馏实现并且乙醇通过分子筛进一步浓缩。

向进入的原料中加入水以形成浆体可促进纤维素原料的输送和机械操作。所述浆体由在水中的纤维素原料碎片或颗粒组成。通常，为使浆体均匀地流动，存在的水的质量至少为存在的原料固体的质量的5至25倍。

然而，在工厂操作中，处理包含如此高含水量的浆体具有某些缺点。例如，在酸预处理过程中，进料浆体中的较高含水量需要大量的蒸汽用来加热，还需要大量的酸。此外，浆体中的大量的水导致设备尺寸的增加，其转而提高了资本成本。

WO2010/022511（Anand et al.）公开了一种方法，涉及在预处理反应器中，通过加压式螺旋压力机将大量的水从纤维素原料浆体中移除，然后通过蒸汽将其加热。有利地，由于通过挤压得到了较高的固含量，较少的液体需要被加热，由此降低了在随后的预处理过程中所需的蒸汽量。此外，浓缩的浆体也可减少催化原料水解所需的酸或碱的量。

然而，尽管有前述与较高固含量浆体相关的优势，它们在进行预处理的下游处理时可能会引发问题。例如，对于常规的搅拌反应器，为了在酶法水解过程中有效地混合高粘度的浆体，需要极大的能量输入。此外，需要专门的高固体稠度泵以运送较高固含量的浆体通过系统。这些需求可显著地增加水解过程的投资和操作成本。

已经有努力致力于水解反应器的开发，但是其主要集中于稀释系统。WO2006/063467(Foody et al.)公开了非混合的升流式水解反应器用于使用纤维素酶来酶法水解经预处理的纤维素原料的用途。进行水解以使浆体向上的速度减慢并使比浆体本体密度更大的固体颗粒趋向于比液体的向上流动更慢。含有纤维素的固体颗粒缓慢地向上流动使含有纤维素的固体和结合的纤维素酶比液体在反应器中停留更长的时间，从而提高纤维素向葡萄糖的转化。

美国专利No.5,258,293(Lynd)公开了一种方法，其中木质纤维素原料和微生物被连续地加入到反应容器中。流体也从反应容器的底部被连续地加入，但不存在对浆体进行机械搅拌。随着反应进行，处于水解中的木质纤维素原料趋向于堆积为空间非均匀层，而乙醇产物上升至顶层，并在顶层被移除。不溶的底物在底层堆积并可从容器中排出。这种排列引起了发酵底物的差别停留，其可使在反应容器中的停留时间增加。

在公开于美国专利No.5,837,506(Lynd)的另一种方法中，使用间歇式搅拌的、连续进料的生物反应器来生产乙醇。将木质纤维素浆体和微生物加入到反应器中；随后，在特定的时间间隔内，通过机械的方法或通过流体再循环来搅拌混合物，随后使其静置。随后将乙醇从反应器顶部移除，加入另外的底物，并继续循环。

Kleijntjens et al.（1986,Biotechnology Letters,8:667-672）用相似的方法使用升流式反应器在热纤维梭状芽孢杆菌（C.thermocellum）的存在下使含有纤维素的底物发酵。底物浆体沉淀以形成聚集的纤维床，所述沉淀通过缓慢的机械搅拌而加速。将底物周期性的加入，而将液体连续地进料至反应器中。乙醇产物在顶层积聚，并在顶层从反应器移除。

然而，美国专利No.5,258,293和No.5,837,506以及Kleijntjens et al.(supra)中描述的方法可能不适用于浓缩系统。

WO2009/045651(Hennessey et al.)公开了一种用于将经预处理的高干重的生物质糖化以生产可发酵糖的方法。该发明方法使用补料间歇式反应器系统，包括多个规模缩小的步骤以及在标准的垂直搅拌罐中彻底混合。将生物质加入配有悬挂式搅拌系统——如电动机和具有一个或多个叶轮的轴——的垂直反应罐中。

US2009/0098616(Burke et al.)公开了一种方法，其中原料的细颗粒流经历两步酶法水解的过程。所述两步酶法水解可使原料的粘度在第一步降低并在第二步产生富含可发酵糖的工艺流。降低粘度在搅拌的反应容器中进行并被认为是通过木聚糖水解为可溶性低聚物而发生的。

美国专利No.5,733,758(Nguyen)公开了一种使用包括交替的混合区和非混合区的塔式水解反应器的方法。被引入水解的浆体的固体负载量大于10重量%。浆体以活塞流的方式向上流动通过反应器并在混合区进行间歇式混合，从而防止液体沟流（channeling）并确保均匀的热和质量传递。如其中所述，当浆体的粘度高时，在水解开始时需要频繁并充分的初始混合以获得如可通过连续混合得到的一样高的水解速率。

美国专利No.7,598,069(Felby)公开了一种用于水解含有多糖的生物质的方法，所述生物质最终的干物质含量大于20%，所述方法包括通过在水解过程中提供生物质机械降解的自由落体型混合进行的混合。混合器可以是滚筒式混合器、具有抬起生物质的旋转轴的混合器、或利用自由落体原理的类似混合设备。这类混合器一般非常大型且需要大量的能量以旋转容器。

尽管存在上述努力，仍然需要更有效且经济划算的方法用于在浓缩系统中酶法水解纤维素以得到可发酵的糖。特别地，本领域需要进一步地降低与这类方法相关的投资和操作成本从而使其在商业上可行。

发明内容

本发明通过考虑到在处理纤维素原料以得到可发酵糖期间所进行的步骤中遇到的困难，从而克服了一些现有技术中的缺点。

本发明的一个目标是提供一种用于由纤维素原料来生产可发酵糖的改进方法。

根据本发明的第一个方面，提供一种由预处理的纤维素原料来进行纤维素的酶法水解以生产葡萄糖的方法，该方法包括：(i)提供经预处理的纤维素原料的含水浆体，该含水浆体具有的含水量比经预处理的纤维素原料的最大持水量少约140%；(ii)将经预处理的纤维素原料的含水浆体加入到非混合式水解反应器中；(iii)在加入步骤（步骤ii）前、在加入步骤（步骤ii）过程中将纤维素酶加入到含水浆体中或加入到非混合式水解反应器中，或上述二者结合，其中在非混合式水解反应器中，纤维素酶将部分纤维素水解以产生可溶性糖，从而产生含有水溶性糖的部分水解的纤维素混合物；(iv)通过将含有水溶性糖的部分水解的纤维素混合物进料至进行所述混合物混合的混合式水解反应器中或包括进行所述混合物混合的混合式水解反应器的水解系统中，来将纤维素连续地水解为葡萄糖；以及(v)从步骤(iv)的混合式水解反应器或水解系统中提取含有葡萄糖和未反应的纤维素的物流。

根据本发明的第二个方面，提供一种由经预处理的纤维素原料来进行酶法水解纤维素以生产葡萄糖的方法，该方法包括：(i)提供经预处理的纤维素原料的含水浆体，该含水浆体具有的含水量比经预处理的纤维素原料的最大持水量少约140%；(ii)将经预处理的纤维素原料的含水浆体加入到非混合式水解反应器系统中；(iii)在加入步骤（步骤ii）前、在加入步骤（步骤ii）过程中将纤维素酶加入到含水浆体中、或加入到系统中的一个或多个非混合式水解反应器中，或二者结合，其中在非混合式水解反应器系统中，纤维素酶将部分纤维素水解以产生可溶性糖，从而产生含有可溶性糖的部分水解的纤维素混合物；(iv)通过将含有可溶性糖的部分水解的纤维素混合物进料至进行所述混合物混合的一个或多个水解反应器中，来将纤维素连续地水解为葡萄糖；(v)从步骤(iv)的一个或多个水解反应器中提取含有葡萄糖和未反应纤维素的物流。

根据本发明任一前述方面的实施方案，所述含水浆体的含水量为经预处理的纤维素原料的最大持水量的约40%至约140%，或约60%至约120%。

根据本发明的其他实施方案，在非混合式反应器中水解的纤维素的部分为约10重量%至约70重量%，或约15重量%至约40重量%。在本发明的另一实施方案中，在非混合式反应器中水解的纤维素的部分为约25重量%至约70重量%，或约35重量%至约70重量%。在非混合式水解后的部分水解的纤维素混合物中的可溶性糖包括葡萄糖、纤维二塘、龙胆二糖、葡萄糖低聚物、或其结合。

优选地，纤维素酶含有β-葡萄糖苷酶。

所述非混合式水解反应器可以为具有高度-直径比约0.2:1.0至约5.0:1.0的间歇式、补料间歇式或连续式反应器。

根据第三方面，本发明提供用于将纤维素水解为葡萄糖的系统，该系统包括：(i)一个或多个非混合式水解反应器，所述非混合式水解反应器用于接收经预处理的纤维素原料并使用纤维素酶使经预处理的纤维素原料部分水解从而产生部分水解的纤维素的混合物；和(ii)一个或多个用于将部分水解的纤维素混合物继续水解为葡萄糖的降流式混合式水解反应器。

根据本发明的第四方面，提供一种用于水解纤维素原料浆体以生产葡萄糖的系统，该系统包括：(i)用于接收纤维素原料浆体并使其脱水的脱水设备；(ii)用于接收和预处理纤维素原料浆体以产生经预处理的纤维素原料的位于脱水设备上游或下游的预处理反应器；(iii)一个或多个用于接收经预处理的纤维素原料和使用纤维素酶使经预处理的纤维素原料部分水解从而产生部分水解的纤维素的混合物的非混合式水解反应器；(iv)用于将部分水解的纤维素的混合物继续水解以产生葡萄糖的位于非混合式水解反应器下游的一个或多个混合式水解反应器。

根据本发明的一个实施方案，系统中的非混合式水解反应器为活塞流反应器。

本发明可提供许多优于用纤维素酶将浓缩纤维素浆体转化为可发酵糖的常规方法的优势。通过在非混合式水解反应器中降低经预处理的纤维素原料的粘度，可以显著地降低与降流式混合式反应器的混合相关的能量输入。此外，可以最大程度地减少用来输送高固含量的浆体通过系统的专门的高固体稠度泵的使用。

在酶法水解过程中减少与处理浓的高粘度浆体相关的投资和操作成本是将从纤维素原料生产可发酵糖的过程商业化的一大进步。

附图说明

图1示出了包括非混合式和混合式水解反应器的纤维素水解系统的几个构造。

图2A示出了在非混合式间歇水解并随后进行混合式间歇水解中（图标）以及在完全间歇式混合式水解中（基于完全混合式水解数据的曲线）纤维素转化分数随时间（小时）的变化。混合式水解在非混合式水解4小时后开始，如由菱形所示。

图2B示出了在非混合式间歇水解并随后进行混合式间歇水解中（图标）以及在完全间歇混合式水解中（基于完全混合式水解数据的曲线）纤维素的转化分数随时间（小时）的变化。混合式水解在非混合式水解8小时后开始，如由菱形所示。

图2C示出在非混合式间歇水解并随后进行混合式间歇水解中（图标）以及在完全间歇混合式水解中（基于完全混合式水解数据的曲线）纤维素的转化分数随时间（小时）的变化。混合式水解在非混合式水解24小时后开始，如由菱形所示。

图3示出了在非混合式水解反应器中进行非混合式水解（实心圆）和混合式水解（线）的纤维素的转化率（%）随采样时间的变化。

图4示出了对于经预处理的原料，完全混合所需的相对搅拌功率随纤维素转化率的变化，所述经预处理原料具有20%初始未溶解的固体(UDS)，其相当于如通过本文所述方法确定的经预处理原料持水量的93.2%的含水量。

具体实施方式

下文的描述是仅以举例的方式对优选实施方案的描述且不限制实现本发明效果所必需的特征的结合。给出的标题不旨在限制本发明的各个实施方案。术语如“包含”和“包括”不旨在限制。此外，除非另外说明，单数的使用包括复数，且“或”意指“和/或”。除非在本文中另有定义，本说明书使用的所有技术和科学术语具有本领域技术人员通常理解的含义。

预处理前的原料处理

用于处理的原料是纤维素材料。术语“纤维素原料”意指任何类型的植物生物质如，但不限于，栽培作物，例如但不限于草，例如但不限于C4型草（C4grasses），如柳枝稷（switch grass）、大米草、黑麦草、芒草、草芦（reed canary grass）、或其结合，糖加工残渣，例如，但不限于，蔗渣或甜菜渣，如甘蔗渣、甜菜浆、或其结合，农业废弃物，例如，但不限于，大豆秸秆、玉米秸秆、稻草、甘蔗秸秆、稻壳、大麦秸秆、玉米棒、小麦秸秆、油菜籽秸秆、燕麦秸秆、燕麦壳、玉米纤维、或其结合，林业生物质例如，但不限于，再生木浆纤维、锯屑、硬木，例如杨木、软木、或其结合。此外，纤维素原料可包括纤维素废料或林业废料如，但不限于，新闻用纸、纸板等。纤维素原料可包括一类纤维，或者纤维素原料可包括源自不同纤维素原料的纤维的混合物。此外，纤维素原料可包括新鲜的纤维素原料、部分干燥的纤维素原料、完全干燥的纤维素原料、或其结合。此外，新的木质纤维素原料种类可由通过植物育种或通过基因工程获得的上文任何列出的那些物种来产出。

纤维素原料所包含的纤维素的量大于约20%，更优选大于约30%，更优选大于约40%（重量/重量）。例如，纤维素材料可包含约20%至约50%（重量/重量）、或其间任何量的纤维素。此外，纤维素原料所包含的木质素的含量大于约10%，更通常大于约15%（重量/重量）。纤维素原料还可以包含少量蔗糖、果糖和淀粉。

颗粒尺寸小于约6英寸的纤维素原料不需要进行尺寸降低。即，这类原料可在水中简单浆化并随后泵入该处理的下游阶段。对于较大颗粒尺寸的原料，该纤维素原料通常通过以下的方法进行尺寸降低，所述方法包括，但不限于，磨碎（milling）、碾磨（grinding）、搅拌、切碎、压缩/碾轧、或其他类型的机械作用。通过机械作用进行的尺寸降低可通过适用于该目的的任意类型的设备进行，例如，但不限于，锤磨机、槽式研磨机（tub-grinders）、辊式挤压机、精炼机和水力散浆机（hydrapulpers）。优选地，由尺寸降低制得的颗粒中至少90体积%的颗粒具有小于约1/16至约6英寸的长度。用于颗粒尺寸降低的优选设备是WO2006/026863中公开的锤磨机、精炼机或辊式挤压机，其以引用的方式纳入本说明书。

在尺寸降低之前、过程中或之后，原料可以在水中浆化，浆化使原料可以被泵送。浆体中水与干纤维素原料固体之间所需的重量比由以下因素决定：例如可泵送性、管线要求、以及其他实际考虑。

纤维素原料含水浆体的固体浓度以未溶解固体(UDS)的浓度表示。在预处理前，纤维素原料浆体UDS通常为约3%至约30%或约4%至约20%。

干固体与含水浆体的重量比由实施例1的UDS方法测定。

原料纤维可以被水或含有酸的水溶液浸透。浸透可以通过以下的方式进行：将纤维素原料加入到罐中，在罐中将其以相对低的固体稠度与热水混合。通常，在将纤维素原料加入到进行浸泡的罐中之前可将其进行尺寸降低。此外，纤维素原料可以如WO02/070753（Griffin，其以引用的方式纳入本说明书）中所述被沥滤。

在浆化、沥滤和/或浸透后，随后可通过任意适当的技术使纤维素原料脱水。例如，脱水可通过利用在压力下从含水原料浆体中移除水的设备来进行。适用于本发明的脱水设备包括加压螺旋压力机，例如公开于WO2010/022511（以引用的方式纳入本说明书）中的那些加压螺旋压力机以及加压过滤器。为了在大气压或更高的压力下从原料浆体中抽出水，脱水工序任选包括预抽区。随后将该脱水的原料浆体运至一个或多个在压力下用于使浆体脱水的设备中。通过脱水的步骤从纤维素原料中挤出的水可在该工序中重复使用。

纤维素原料的预处理

在用纤维素酶进行酶法水解前，先将纤维素原料进行预处理。预处理通常旨在提供机械和化学作用的充分结合从而破坏纤维素原料的纤维结构并增加原料的表面积以使其易与纤维素酶接触。优选地，进行预处理以使半纤维素高度水解且仅少量的纤维素转化为葡萄糖。纤维素在随后使用纤维素酶的步骤中水解为葡萄糖。在本发明的一个实例中，将浓度约0.02%（重量/重量）至约5%（重量/重量）或其间任何量（以纯酸在干原料加上水溶液总重中的百分比计）的稀的无机酸用于预处理。

所述酸可以为硫酸、亚硫酸、盐酸或磷酸。优选地，所述酸为硫酸。加入纤维素原料中的酸的量可以变化，但其应当足以实现约0.02%至约2%重量/重量或其间任意量的最终酸浓度。得到的原料的pH为约pH0.4至约pH3.5，或其间任意的pH范围。

酸预处理优选在约160°C至约280°C的最高温度下进行。然而，在实践中，预处理过程中在原料达到该温度范围前会存在时间延迟。上述温度对应于在施用足够的热量以达到该范围内的温度后所达到的数值。原料在该温度下的保持时间可以为约6秒至约3600秒，或约15秒至约750秒或约30秒至约240秒。

预处理通常在压力下进行。例如，预处理过程中的压力可以为约50至约700psig或约75至约600psig，或其间任意的压力范围。

原料可以在预处理过程中或之前用蒸汽加热。不欲作为限制，一种进行蒸汽加热的方法是使用低压蒸汽来部分地加热原料，其随后被泵送至几个阶段的加热序列（train）中。可采用其他方法加热原料，如被设计通过喷雾喷嘴引入蒸汽和任选的酸的市售可得的混合设备。

一种进行原料的酸预处理的方法是使用美国专利No.4,461,648（Foody，其以引用的方式纳入本说明书）中列出的处理条件的蒸汽喷发。另一种预处理原料浆体的方法涉及连续预处理，即纤维素原料被连续泵送通过反应器。连续酸预处理为本领域技术人员熟知；参见，例如美国专利No.5,536,325(Brink)；WO2006/128304(Foody and Tolan)；以及美国专利No.4,237,226(Grethlein)，其均以引用的方式纳入本说明书。可根据需要使用本领域已知的其他技术，如美国专利No.4,556,430中公开的方法（Converse et al；其以引用的方式纳入本说明书）。

酸预处理产生含有经酸预处理的原料的组合物。在预处理过程中通过半纤维素水解产生的糖通常存在于该组合物中并且其包括木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖或其结合。

所述经预处理的原料组合物的水相也可含有在预处理过程中加入的酸。当在预处理中使用的酸为硫酸时，含有经预处理的原料的组合物还含有硫酸盐和/或硫酸氢盐。

含有经酸预处理的原料的组合物还包含在酸预处理过程中产生的乙酸。在该物流中乙酸的浓度可以为0.1至20g/L。在预处理过程中可以释放出其他有机酸，包括半乳糖醛酸、甲酸、乳酸和葡糖醛酸。预处理还可产生溶解的木质素和抑制剂如糠醛和羟甲基糠醛(HMF)。因此，含有经酸预处理的原料的组合物也可包含这些成份。

根据本发明一个示例性的实施方案，所述经预处理的原料组合物的可溶性成分与固体分离。这种分离可以通过以下的方式来进行：使用水溶液来洗涤经预处理的原料组合物以产生洗涤物流以及含有未水解的经预处理的原料的固体物流。或者，通过使用已知的方法如离心法、微滤法、板框过滤法、错流过滤法、压力过滤法、真空过滤法等使经预处理的原料组合物进行固液分离而将可溶性成分从固体中分离。任选地，可将洗涤步骤纳入固液分离中。随后，可将含有纤维素的分离的固体进行使用纤维素酶的酶法水解以使纤维素转化为葡萄糖。下文将更详细地描述使用纤维素酶进行的纤维素的酶法水解。

从上述分离方法分离出的可溶性成分——其包含在预处理过程中释放出的糖、预处理酸和其他可溶性成分——可随后使用微生物将其发酵，所述微生物能够使源自原料的半纤维素成分的糖发酵。

预处理也可在碱性条件下进行。适当的碱预处理方法的实例包括氨纤维膨胀(ammonia fiber expansion,AFEX)或稀氨预处理。

根据AFEX方法，纤维素生物质与氨或氢氧化铵——其通常是浓的——在压力容器中接触。所述接触持续足够长的时间以使氨或氢氧化铵能够溶胀（即，去晶化）纤维素纤维。随后快速降低压力以使氨闪蒸或沸腾并涨破（explode）纤维素纤维结构。然后可将闪蒸的氨根据已知的方法回收。AFEX方法可在约20°C至约150°C或约20°C至约100°C以及其间所有的温度下进行。该预处理的持续时间可以为约1分钟至约20分钟或其间任意的时间。

稀氨预处理使用比AFEX更稀的氨或氢氧化铵溶液。该预处理可以产生或不产生任何单糖。稀氨预处理可在约100°C至约150°C或其间任意温度的温度下进行。该预处理的持续时间可以为约1分钟至约20分钟，或其间任意的时间。

预处理后，经预处理的原料浆体通常在进行酶法水解前冷却以使其降低至纤维素酶有活性的温度。应当了解原料的冷却可使用闪蒸、热交换或其他适当的方法在多个阶段进行。在本发明的一个实施方案中，在酶法水解前将经预处理的原料冷却至约100°C或更低的温度。

非混合式酶法水解

将经预处理的纤维素原料的含水浆体进料至非混合式水解反应器中或非混合式水解反应器系统中以产生部分水解的纤维素的混合物，其随后被进料至一个或多个在搅拌下水解原料的水解反应器中，如后文所述。在非混合式反应器或反应器系统中，纤维素的酶法水解降低了经预处理的纤维素原料的粘度。有利地，通过由酶法水解降低经预处理的原料的粘度，使得在随后的混合式水解反应器中部分水解的纤维素的混合物的水解过程中与混合相关的能量需求减少。

粘度测量取决于被测量的流体的特性。经预处理的浆体表现出本质上可被定义为非牛顿的特性，即浆体的粘度是非恒定的且随其上施加的能量变化。施加在浆体上的能量可被解释为局部剪切速率。

因此，经预处理的原料粘度的定量测量必须参考测定粘度处的剪切速率。例如，与在高剪切速率下测定相比，经预处理的浆体在低剪切速率下表现出更高的粘度。

为了本说明书的目的，使用的术语“粘度”在定性的意义上表示浓或稀的浆体。

术语“非混合式水解反应器”表示适用于用其中的纤维素酶进行酶法水解的反应器，其不进行任何如通常在混合式水解反应器中采用的内容物的主动混合。尽管由于液体和固体被引入系统中和由系统排出，本发明的非混合式反应器的运行可伴随一定量的局部混合，但所述局部混合不会导致任何如在混合式反应器中发生的反应器内容物明显的分散或混合。例如，由于采用的旋转的底部刮刀或其他用于移除反应器内容物的设备的作用，少量局部混合可发生在非混合降流式反应器的底部。类似地，如果非混合式反应器是升流式反应器，则由于浆体的排出，少量局部混合可发生在非混合式反应器的顶部。排出浆体所需的能量小于使用具有常规翼形桨设计的混合式反应器来完全混合浆体所需的能量的5%、3%或1%。

相比之下，在常规的混合式水解反应器中，通过以下的方式来提供混合：机械混合器如顶置式、侧置式、或底置式叶轮、搅拌器或喷射器；被泵入或通过容器的液体浆体物流的快速移动；和/或在容器中加入或生成气体或蒸汽。此外，在浆体沿反应器长度的方向通过混合区过程中使用周期式混合的反应器是已知的（参见美国专利No.5,888,803(Nguyen)）。

非混合式水解可以是间歇地、补料间歇地或连续地操作。

非混合式间歇或连续水解反应器适当的高度-直径比为约0.2:1.0至约5.0:1.0，或其间任意的比例。

系统中非混合式水解反应器的数量取决于反应器的成本、含水浆体的体积和其他因素。对于商业规模的工厂，非混合式水解反应器的数量一般为例如1至10。

非混合式反应器可以为串联或并联配置。本领域的普通技术人员可通过衡量每种设计方案的优势和劣势容易地挑选适当的选择。

根据本发明的一些实施方案，经预处理的纤维素原料的含水浆体的含水量（重量/重量）小于经预处理的纤维素原料的最大持水量的约140%。即，经预处理的纤维素原料可含有一些自由水或不含自由水。本发明包括任何数值端点为最大持水量的40、50、60、70、80、90、100、110、120、130或140%的经预处理的纤维素原料的含水量范围。

在本发明的一个实施方案中，经预处理的纤维素原料具有的含水量为最大持水量的40%至140%，或最大持水量的50%至140%，或60%至140%，或70%至140%，或80%至140%，或其间的任意范围。在本发明的另一个实施方案中，经预处理的纤维素原料具有的含水量为最大持水量的40%至130%，或40%至120%，或40%至110%，或40%至100%，或40%至90%，或其间的任意范围。

含水浆体是否含有自由水可如实施例3所述的通过测量经预处理的纤维素原料的最大持水量来测定。经预处理的纤维素原料的最大持水量通过如下的方式测定：测量由已知质量的经预处理的纤维素原料吸收水直到加入原料中的额外水是自由水时的水量。

加入到非混合式水解反应器中的经预处理的纤维素原料浆体具有约12重量%至约40重量%，或其间任何范围的未溶解固体(UDS)。在本发明的另一个实施方案中，经预处理的纤维素原料浆体具有约14重量%至约28重量%，或其间任何范围的UDS或约18重量%至约24重量%的UDS。所述范围可包括数值端点为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40%（重量/重量）的情况。未溶解固体含量基于固体的干重计并根据实施例1中所述的方法测量。

前述固体稠度范围可在预处理前通过使各种原料制剂——包括例如经浸透原料、经沥滤原料或原料浆体——脱水来实现。或者，可在对预处理原料浆体预处理之后进行脱水步骤。不欲作为限制，适当的脱水设备包括螺旋压力机、过滤器、离心机和挤出机。在又一个实施方案中，可通过向已经历颗粒尺寸降低的原料中加入足够量的水或水溶液来制备浆体，以得到在所述范围内的固体含量（参见，例如WO2009/125292，其以引用的方式纳入本说明书）。

不考虑纤维素酶的来源，可以用适用于本发明目的并在所用的pH和其他条件下有效的任何类型的纤维素酶来进行纤维素水解为可溶性糖的酶法水解。在最广泛的研究中，被表征且商业生产的纤维素酶由曲霉菌属（Aspergillus）、腐质霉菌属（Humicola）、金孢菌属（Chrysosporium）、热白丝菌属（Melanocarpus）、毁丝霉属（Myceliopthora）、侧孢酶属（Sporotrichum）和木霉属（Trichoderma）的真菌和由芽孢杆菌属（Bacillus）和嗜热裂孢菌属（Thermobifida）的细菌获得。由丝状真菌长枝木霉（Trichoderma longihrachiatum）产生的纤维素酶包含至少两种被称为CBHI和CBHII的纤维二糖水解酶和至少四种EG酶。EGI、EGII、EGIII、EGV和EGVI纤维素酶也已经由Humicola insolens分离（参见Lynd et al.,2002,Microbiology andMolecular Biology Reviews,66(3):506-577for a review of cellulaseenzyme systems and Coutinho and Henrissat,1999,"Carbohydrate-active enzymes:an integrated database approach."InRecent Advances in Carbohydrate Bioengineering,Gilbert,Davies,Henrissat and Svensson eds..The Royal Society of Chemistry,Cambridge,pp.3-12,其均以引用的形式纳入本说明书）。

除了CBH、EG和β-葡萄糖苷酶之外，存在一些协助酶法消化纤维素的辅助酶（参见共有的WO2009/026722(Scott)，其以引用的方式纳入本说明书，以及Harris et al.,2010,Biochemistry,49:3305-3316）。这辅助酶包括EGIV——也被称作糖苷水解酶61、膨胀因子、扩展因子、lucinen和纤维素诱导蛋白(Cip)。葡萄糖可以由β-葡萄糖苷酶通过转糖苷反应来酶法地转化为二聚体龙胆二糖、槐二糖、昆布二糖及其他。

适当的纤维素酶剂量为每g纤维素约1.0至约40.0滤纸单位（FilterPaper Units）（FPU或IU），或其间的任意量。FPU是本领域技术人员熟知的标准量度并根据Ghose定义和测量（Pure and Appl.Chem.,1987,59:257-268;其以引用的方式纳入本说明书）。优选的纤维素酶剂量为每g纤维素约10至约20FPU。

纤维二糖转化为葡萄糖可通过酶β-葡萄糖苷酶进行。术语“β-葡萄糖苷酶”意指任何将葡萄糖二聚体纤维二糖水解为葡萄糖的酶。β-葡萄糖苷酶的活性由酶学委员会（Enzyme Commission）按EC#3.2.1.21通过其活性来定义。β-葡萄糖苷酶可来自各种来源；然而，在所有情况下，β-葡萄糖苷酶可将纤维二糖水解为葡萄糖。β-葡萄糖苷酶可以是家族1至家族3糖苷水解酶，但在本发明的实践中也可以使用其他的家族成员。用于本发明的优选的β-葡萄糖苷酶是来自里氏木霉（Trichoderma reesei）的Bgl1蛋白质。也可以考虑可以修饰β-葡萄糖苷酶使其包含纤维素结合结构域，从而使该酶与纤维素结合。

纤维素酶可以在其加入到非混合式水解反应器之前或过程中加入到含水原料浆体中或直接加入到非混合式水解反应器中。加入酶的方法的实例包括直接注射，其可包括混合三通的使用；静态或非旋转式混合；或动力驱动在线混合，其可采用在线旋转设备或在线粉碎机。或者，可将酶直接加入到水解反应器中，但在将经预处理的原料加入到水解反应器中前加入酶是优选的，其可将混合最优化并将用于混合的能量需求最小化。可将酶在水溶液中或作为粉末或颗粒来处理。

在非混合式反应器中的酶法水解产生可溶性糖，包括葡萄糖低聚物、二聚物和/或葡萄糖。酶混合物可不包括β-葡萄糖苷酶，尽管其优选在水解过程中包括β-葡萄糖苷酶，因为在不存在β-葡萄糖苷酶时葡萄糖的收率显著降低。

含水原料浆体通过反应器的流动可以向上或向下。即，含水浆体可在水解反应器的底部以净向上的流动加入或其可在水解反应器的顶部加入并向下流动。如果含水浆体在反应器中向上流动，则由于浆体相对高稠度，固体颗粒将不会比液体向上流动的更慢。

不欲作为限制，浆体可以活塞流的方式移动通过非混合式水解反应器。然而，应当了解，在实践中，含水浆体通过反应器的活塞流不会是理想的，因为含水原料浆体移动通过反应器时可能出现一些沟流或层流。

如本文使用的，“活塞流反应器”是升流式、降流式或水平式反应器，其被设计出以实现反应器内容物的活塞流。如上文讨论的，活塞流可以不是理想的，但是相对于浆体中的液体不存在固体的显著差别停留。

此外，反应器内容物的部分混合或其他扰动可随着例如通过底置式旋转刮刀将材料排出而发生。然而，在非混合式反应器的反应区，在径向没有或有非常有限的浆体移动。如本文使用的，术语“反应区”指的是非混合式水解反应器中的区域，其不包括从反应器顶部至反应器高度的90%处测量的反应器的体积以及从其底部至反应器高度的10%处的反应器的体积。

酶法水解通常在pH约4.0至6.0之间进行，因为其在大多数纤维素酶的最佳pH范围内。这包括其间的具有数值端点4.0、4.25、4.5、4.75、5.0、5.25、5.5、5.75或6.0的范围。当经预处理的纤维素原料的pH为酸性时，通常在酶水解前将其pH用碱升高至约pH4.0至约6.0，或更通常为约4.5至约5.5。然而，pH最佳值为更酸性且更碱性pH值的纤维素酶是已知的。

可在经预处理的原料冷却后、冷却前、或在冷却前和后两个时间点将碱加入。碱的加入时间点可以与纤维素酶的加入时间点一致，或碱的加入点可以是酶加入点的上游或下游。如果在碱加入点的上游加入酶，则通常使在经预处理的原料较低的pH下的酶的接触时间最小化以避免酶失活。不欲作为限制，优选在酶加入前或与其同时加入碱。

可以将碱在线加入到经预处理的原料中，例如加入到在线混合器、预处理下游的泵或直接加入到非混合式反应器中。可以使用包括化学注射部件，并促进混合的泵（如中等稠度泵）来同时分散碱和酶。不欲作为限制，可以使用在线混合设备分别加入碱和酶。

调节浆体的温度以使其在纤维素酶活性的最佳范围内。通常，约45°C至约70°C，或约45°C至约65°C，或其间的任何温度的温度适用于大多数纤维素酶。例如，浆体的温度可以调节为约45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64或65°C。然而，对于嗜热的纤维素酶，浆体的温度可以更高。

为了保持所需的水解温度，可以使用蒸汽、热水、或其他热源来包覆（jacket）水解反应器。此外可以使反应器隔热以保留热量。

非混合式反应器中的水力停留时间可以为2至36小时，4至24小时或6至12小时。该范围的上限通常由流动不稳定性限制。

酶水解和发酵优选在分别的容器中进行从而使每种生物反应可以在其各自最佳的温度下进行。然而，下文描述的非混合式水解和混合式水解可在同步糖化和发酵中与发酵同时进行。SSF通常在35-38°C的温度下进行，其为对于纤维素最佳的50°C和对于酵母最佳的28°C的折中。因此，这种中间温度可导致纤维素酶和酵母具有未达标准的性能。

根据本发明的一个实施方案，在非混合式水解结束后，在部分水解的纤维素的混合物中的纤维素转化率百分比为约10重量%至约70重量%，或约15重量%至约65重量%，或约10重量%至约50重量%，或约10重量%至约40重量%，或其间任何数值，包括具有数值端点10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或70重量%的范围。在该混合物中纤维素的水解百分比可根据实施例2的方法测定并在非混合式水解反应器的出口处测量或，如果使用非混合式反应器系统，在该系统的最后一个反应器的出口处测量。

可通过本领域技术人员已知的任何适当的设备将部分水解的纤维素从非混合式反应器中排出。不欲作为限制，在那些采用非混合式降流式反应器的实施方案中，反应器内容物可通过借助旋转底部刮刀的排出螺杆被运送出反应器。本领域普通技术人员应当了解，可以使用其他用于浆体排出的设备。例如，非混合式降流式反应器的底部可以是圆锥形的以促进反应器内容物的排出。后一种实施方案（底部是圆锥形的非混合式降流式反应器）适用于更稀的浆体，而底置式刮刀可移出更高稠度的浆体。

在采用非混合升流式反应器的实施方案中，扫臂可以位于反应器的顶部以将部分水解的纤维素扫入侧置式沟槽或管道。如果反应器内容物相对稠，则该特定实施方案适用。对于更稀的材料，反应器的顶部可以是圆锥形的以促进部分水解的纤维素排入置于反应器顶部的管道。

反应器内容物的粘度，以及由此使用的用于排出反应器内容物的具体方式将随着在非混合式反应器中的停留时间、酶浓度和其他因素变化。

由非混合式水解得到的部分水解的纤维素的混合物可呈现为栓状(plug)材料，或稠度可以使其呈现为含水浆体。如本文使用的，术语“含水浆体”指的是呈现为含水浆体的经预处理的原料或呈现为栓状材料的部分水解的纤维素混合物。

混合式水解

将由非混合式水解得到的部分水解的纤维素混合物加入到一个或多个进行浆体混合的水解反应器中。通常，通过泵将浆体加入到混合式水解反应器中。

图1示出了根据本发明可使用的并联、串联及其结合的非混合式和混合式反应器的各种示例性结构。结构1和2包含串联的非混合式和混合式反应器。在图1的结构1中，非混合式反应器10后为由20A和20B表示的混合式反应器1和2，其后可以是任何数量的另外的串联式混合反应器20C。除了在第一混合反应器20A的串联上游提供另外的非混合式反应器10B之外，结构2与结构1基本相同。结构3示出了两个或多个并联的非混合式反应器10A和10B，其具有下游串联的混合式反应器20A、20B和20C。在结构4中，两个或多个非混合式反应器是并联的10A和10B，其具有下游并联的混合式反应器，由20A、20C、20D和20E表示。结构5包含非混合式反应器10，其后是并联的混合式反应器20A、20C、20D和20E。在结构6中，两个或多个非混合式反应器以串联示出，由10和10B代表，其后是并联的混合反应器20A、20C、20D和20E。

在混合式水解反应器中的混合可通过任何常规的方式来实现，包括机械混合器如顶置式、侧置式、或底置式叶轮、搅拌器或喷射器；泵入或通过容器的液态浆体流的快速移动；和/或在容器中引入或生成气体或蒸汽。

特别适合的混合式水解反应器是连续搅拌釜反应器或CSTR反应器。

与非混合式水解类似，在混合式水解中的酶法水解通常在约4.0至约6.0的pH下进行，因为其在大多数纤维素酶的最佳pH范围内。该范围包括其间的具有数值端点为4.0、4.25、4.5、4.75、5.0、5.25、5.5、5.75或6.0的范围。然而，pH的最佳值为更酸性且更碱性pH值的纤维素酶是已知的。

将混合式水解过程中的浆体温度调节至纤维素酶活性的最佳范围内。通常，约45°C至约70°C，或约45°C至约65°C，或其间的任何温度的温度适用于大多数纤维素酶。然而，对于嗜热的纤维素酶，浆体的温度可以更高。

混合式水解反应器可以进行轻度的搅拌，通常具有的最大能量输入为最高达0.8hp/1000加仑，或可接受最高达20hp/1000加仑的强力搅拌。

任选地，可以在混合式水解中加入额外的纤维素酶。

当水解在包含多个混合式水解反应器的系统中进行时，系统中混合式水解反应器的数量取决于反应器的成本、含水浆体的体积、和其他因素。对于商业规模的工厂，水解反应器的数量一般为例如3至12。优选地，所述混合的酶法水解是连续的过程，伴随着经预处理的纤维素原料的连续进料和葡萄糖的排出。然而，应当理解间歇和补料间歇的方法也包括于本发明的范围内。

为了保持所需的水解温度，任选加热或冷却水解反应器的内容物。可使用加热或冷却夹套或通过与再循环的浆体进行热交换来进行加热或冷却。在热交换器或在所述夹套中使用的加热或冷却流体可包括蒸汽、热水、冷水、乙二醇或盐水。应当理解在混合式水解过程中可不加热或冷却反应器内容物而将反应器内容物的温度保持在所需的范围内。

混合式水解系统的其他设计参数可根据需要调节。例如，在纤维素酶水解系统中的混合式水解反应器的体积可为约100,000L至约20,000,000L，或其间的任意体积，例如200,000至5,000,000L，或其间的任意值。浆体在水解系统中的总停留时间为约12小时至约200小时，或其间的任意值。

在混合式水解结束后，产物为葡萄糖以及任何未反应的纤维素。可在任何进一步地加工前使用常规的固液分离技术将在生成的物流中存在的不溶固体（包括木质素）移除。然而，在某些情况下可取的是将糖物流中的固体和液体均送入进一步处理。

根据本发明的一个实施方案，在经预处理的原料浆体中约75%至约100%（重量/重量）——或约85%至约95%或其间的任何范围——的纤维素在混合式水解结束时转化为葡萄糖和/或纤维二糖。这包括数值端点为75、80、85、90、95或100%的范围。纤维素转化率的测定如实施例2所述。

发酵

由水解生成葡萄糖的发酵可产生一种或多种选自醇、糖醇、有机酸和其结合的发酵产物。

发酵通常在约4.0至约6.0，或约4.5至约6.0的pH下进行。为达到上述用于发酵的pH范围，可能有必要向含有葡萄糖的物流中加入碱。

在本发明的一个实施方案中，发酵产物是醇，如乙醇或丁醇。对于乙醇的生产，通常使用酵母菌属（Saccharomyces spp.）酵母进行发酵。通过野生型的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）可以将糖物流中存在的葡萄糖和其他己糖发酵为乙醇，但也可以使用如下文讨论的基因修饰酵母。随后，可蒸馏乙醇以得到浓的乙醇溶液。可以通过微生物如丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）由葡萄糖生产丁醇并随后通过蒸馏浓缩。

源自半纤维素的木糖和阿拉伯糖也可由酵母菌株发酵为乙醇，所述酵母菌株天然具有，或已经被改造成具有将这些糖发酵为乙醇的能力。已经过基因修饰用来发酵木糖的微生物的实例包括重组的酵母菌株，其中已经插入源自毕赤酵母（Pichia stipitis）的(a)木糖还原酶基因(XR)和木糖醇脱氢酶(XDH)基因（美国专利No.5,789,210、No.5,866,382、No.6,582,944和No.7,527,927以及欧洲专利No.450530），或插入(b)真菌或细菌木糖异构酶(XI)基因（美国专利No.6,475,768和No.7,622,284）。已经过基因修饰以发酵L-阿拉伯糖的酵母的实例包括但不限于其中已经插入源自真菌（美国专利No.7,527,951）或细菌（WO2008/041840）的阿拉伯糖代谢途径的基因的重组的酵母菌株。

在发酵过程中可产生的有机酸包括乳酸、柠檬酸、抗坏血酸、马来酸、丁二酸、丙酮酸、羟基丙酸、衣康酸和乙酸。在一个非限制性的实例中，乳酸是有用的发酵产物。用于由葡萄糖生产乳酸的最著名的工业微生物是乳酸杆菌（Lactobacillus）属、芽孢杆菌（Bacillus）属和根霉（Rhizopits）属物种。

此外，木糖和其他戊糖可由选自假丝酵母（Candida）、毕赤氏酵母（Pichia）、管囊酵母（Pachysolen）、Hansemtla、德巴利氏酵母（Debaryomyces）、克鲁维酵母（Kluyveromyces）和酵母菌的酵母菌株发酵为木糖醇。也已知可用于生产木糖醇的细菌，包括棒状杆菌、液化肠杆菌（Enterobacter liquefaciens）和耻垢分枝杆菌（Mycobacteriumsmegmatis）。

在实践中，发酵通常在处于或接近发酵微生物的最佳温度和pH的条件下进行。用于使用酿酒酵母将葡萄糖发酵为乙醇的典型的温度范围为约25°C至约35°C，尽管如此，如果酵母天然或基因修饰为热稳定的，则温度可以更高。发酵微生物的剂量取决于其他因素，如发酵微生物的活性、所需的发酵时间、反应器体积和其他参数。应当了解这些参数可由本领域技术人员按需调节以实现最佳的发酵条件。

也可以为发酵补充发酵微生物的生长所需的额外营养素。可将例如，酵母提取物、特定的氨基酸、磷酸盐、氮源、盐、微量元素和维生素加入到水解产物的浆体中以支持其生长。

发酵可以间歇、连续或补料间歇的方式在搅拌或不搅拌的条件下进行。优选地，发酵反应器利用机械搅拌来轻度搅拌。常规的商业规模的发酵可用多个反应器进行。发酵微生物可以循环回发酵器中或不经循环而被送至蒸馏。

如果发酵产物为乙醇或丁醇，则通过蒸馏进行回收，通常通过分子筛或膜提取来进一步地浓缩。

被送至蒸馏的发酵液是含有固体的稀的醇溶液，包含未转化的纤维素和在发酵过程中加入的支持微生物生长的任何成分。

微生物在蒸馏过程中的存在可能性取决于其是否在发酵过程中循环。发酵液优选被脱气以移除二氧化碳并随后被泵送通过一个或多个蒸馏塔以将醇与发酵液中的其他成分分离。蒸馏系统的运行模式取决于醇是否具有比水低或高的沸点。最常见地，就像乙醇被蒸馏时一样，醇具有比水低的沸点。

在浓缩乙醇的那些实施方案中，蒸馏单元中的塔优选以连续的方式运行，但应当理解本发明也包括间歇式方法。用于蒸馏过程的热量可通过直接蒸汽注入或通过热交换器非直接地在一个或多个时间点加入。所述蒸馏单元可包括一个或多个独立的啤酒塔和精馏塔，在这种情况下稀啤酒被运送至将啤酒部分浓缩的啤酒塔中。从啤酒塔出来后，蒸汽进入用于进一步纯化的精馏塔中。或者，使用包含整合富集或精馏区段的蒸馏塔。

蒸馏后，可通过分子筛树脂、膜提取、或本领域技术人员已知的其他通常通过蒸馏浓缩乙醇至超过95%的方法将残留的水从蒸汽中移出。随后可将蒸汽冷凝并改变状态。

乙醇蒸馏后剩余的并含有固体的含水物流——本文中指的是“仍为底部物流”——从蒸馏单元的一个或多个塔的底部排出。该物流可含有无机盐、未发酵糖和有机盐。

当醇类具有比水更高的沸点时，如丁醇，进行蒸馏以从醇中移除水和其他挥发性化合物。水蒸汽从蒸馏塔的顶部离开并被称作“顶流”。

实施例

实施例1：测定纤维素原料浆体中未溶解固体的浓度

未溶解固体（UDS）含量的测定如下进行：

将固定量的浆体分置于塑料称重盘中并使用分析天平来精确地记录浆体重量。将大小适用于布氏漏斗的滤纸圆片（filter paper circle）放置于铝制称重罐上并记录罐和滤纸的总重量。在将预称重的滤纸转移至布氏漏斗后，使预称重的浆体通过滤纸来分离固体。使用少量去离子水以确保固体由称重盘被定量地转移至布氏漏斗中。随后使用过量的去离子水来洗涤固体，随后将经洗涤的样品和滤纸转移至预称重的铝罐中。应当注意确保固体被定量地转移。将铝罐在105°C的烘箱中干燥过夜之后，精确称重内容物并且通过测定每克浆体的干固体的克数的百分比对UDS进行定量。

实施例2：在非混合式或混合式水解后测定纤维素的转化程度

纤维素的转化程度通过测量初始纤维素、葡萄糖和纤维二糖的浓度以及在非混合式或混合式水解发生后葡萄糖和纤维二糖的浓度来测定，并采用以下的等式：

X = [\frac{(G - G_{o}) + 1.053 (G_{2} - G_{20})}{G_{\max}}] 100

G_{\max} = \frac{1.11 C_{o} [1.02 + 0.041 (C_{o} + \frac{X_{o}}{1000})]}{1 - C_{o}}

X=纤维素的转化率(%)

G=葡萄糖的转化率(g/L)

Go=葡萄糖的初始浓度(g/L)

G₂=二聚物的浓度(g/L)；包括初始的纤维二糖，以及龙胆二糖和其他二聚物

G₂₀=二聚物的初始浓度(g/L)；包括初始的纤维二糖，以及龙胆二糖和其他二聚物

Gmax=100%纤维素转化率下的葡萄糖的浓度

Co=纤维素的初始浓度(%)

Xo=木糖的浓度(g/L)

实施例3：测定经预处理的纤维素原料的最大持水量

将纤维素原料用酸预处理，例如，如美国专利No.7,754,457所述（以引用的方式纳入本说明书）。将已知干重的经预处理的纤维素原料的样品置于未加压的容器中。逐渐向样品中加入水直至额外加入的水是自由水的时间点为止。该时间点被认为是水在纤维素原料上形成薄的连续层的时间点。将容器倾斜以移除自由水。随后将湿的原料称重以测定存在的水的总量，所述水包括加入的水和样品中初始存在的水。单位质量的干木素纤维素原料的最大持水量通过将样品中存在的水的质量除以原料的干质量来计算。

持水量和样品中持水量百分比的测定考虑了样品中溶解的固体的存在。下文给出详细的计算以说明如何进行所述测定。

得到经预处理的小麦秸秆的样品并由实施例1给出的方法测量UDS。UDS测定为22.0%。该样品不含有任何自由水并在UDS测量前使用10M氢氧化钠调节pH至5.0。

样品中的溶解固体含量通过以下的方式测定：在25°C下，将25g样品加入到在250mL锥形烧瓶中的100mL去离子水中并将得到的混合物手动振荡30秒以将固体分散在水中。随后通过Fisher或Whatman玻璃纤维过滤器过滤浆体。将2.80g滤液的等分样品在105°C的烘箱中干燥过夜。记录干重为0.0271g。则样品的未溶解固体量：

因此，经预处理的小麦秸秆的样品为22.0%UDS，4.63%未溶解固体，和73.37%水（重量%）。

然后，如下测定持水量（其考虑了未溶解固体）：将5.08g质量的样品置于称重盘中。将水加入到样品中并在固体中分散直至形成单独的水层。将单独的水层倒出以生成处于其持水量的样品。在此时将样品称重且重量为5.87g。则样品的持水量是

22.0%UDS的样品含有（73.37%水/22.0%UDS）=3.33g水/gUDS。该样品为3.33/4.04=持水量的82.5%。

实施例4：使用非混合式水解随后进行混合式水解的纤维素水解

如美国专利No.7,754,457（以引用方式纳入本说明书）所述的用硫酸预处理小麦秸秆。随后用纤维素酶和由里氏木霉分泌的β-葡萄糖苷酶将经预处理的原料在非混合式和随后的混合式水解中水解。

通过过滤将经预处理的原料浆体的稠度增加至20重量%未溶解固体(UDS)。该稠度对应于如通过实施例3的方法测定的为经预处理原料浆体持水量的93.2%的水量。

非混合式水解反应的时间为0（完全混合）、4、8、和24小时，随后进行混合式水解，水解总的持续时间为73小时。用于非混合式和随后的混合式水解的实验条件如下文的表1所示。

表1：非混合式和随后的混合式水解的实验条件

初始UDS，%	20%（通过过滤浓缩）
		批量大小	50g浆体
pH	5.0
		剂量，mg/g纤维素酶	35
温度，°C	50
		非混合式水解时间（小时）	0、4、8或24
水解总时间，小时	73
		混合式水解的RPM	250

非混合式水解随后进行混合式水解的结果示于图2A、2B和2C中。每幅图中的数据点（空心圆和实心菱形）表示在各个时间点进行非混合式水解随后进行混合式水解的纤维素的转化分数。非混合式水解切换为混合式水解的时间点用实心菱形表示。图中示出的曲线描述了对应的完全混合式水解。

图2A、2B和2C示出了对于非混合式随后进行混合式水解的水解结束时——即73小时——达到的纤维素的转化分数与完全混合式水解相似。即，在非混合式/混合式水解73小时后可以实现与在整个时间过程中将内容物混合式水解相似的转化水平。这是有利的，因为其说明了可以在水解的第一个24小时内免除混合而不减少纤维素的转化或葡萄糖的产生。

实施例5：在非混合式水解反应器中的非混合式水解。

如美国专利No.7,754,457（以引用的方式纳入本说明书）所述用酸预处理小麦秸秆并随后在滗水器（decanter）系统中将其离心以产生经预处理的原料的经预处理的滗水饼，其具有24重量%的稠度。随后用纤维素酶和由里氏木霉分泌的β-葡萄糖苷酶在非混合式水解反应器中如下水解经预处理的原料。

将补料间歇式方法用于非混合式水解机制。在混合罐中将确定重量的滗水饼（55kg）与足以达到pH5的量的碱混合并将得到的混合物加热至52°C。随后，将用来实现60mg/g的目标酶剂量的量的纤维素酶加入混合罐中。目标未溶解固体浓度为21重量%。该稠度对应于如通过实施例3的方法测定的经预处理原料浆体的持水量的87.6%的含水量。在进行短时间的混合以使酶在浆体中分散后，将浆体转移至配有底部刮刀和排出螺杆的600L的非混合式反应器中并开始非混合式水解。

对于非混合式水解的目标反应时间是4小时。随后用加热带加热非混合式反应器以保持浆体的温度为52°C。在第一批料进料至反应器中4小时后，将水解产物材料从反应器底部连续提取。采集浆体样品并使样品中的酶即刻失活。

在600L非混合式反应器中的非混合式水解的结果示于图3（实心圆），以及由数据点以上的线示出的混合的纤维素的转化率。如图3所示，在非混合式反应器中进行水解的纤维素转化率的百分数接近完全混合式水解达到的纤维素的转化率。

实施例6：

非混合式水解随后进行混合式水解与完全混合式水解的能量消耗的比较

常规设计的20L混合罐装配有工业标准的翼型桨并以间歇式模式运行。功率消耗由轴扭矩的在线测量测定。混合罐在装有18.8L浆体下运行并将温度保持在50°C。能量需求定义为使在罐壁的四个位置——底部、两侧（相距180°）和顶部——可观察到完全的运动。这确保在罐中任何可见的位置都不存在浆体的明显停滞，且在壁处具有约1cm/s的速度。为了达到该条件，设定搅拌功率以实现特定的RPM，持续约10分钟，随后进行观察。如果在壁上观察到可见的停滞，则进一步地增加功率并重复该过程直至观察到完全运动。

经预处理的原料具有的初始UDS为20重量%，其对应于如通过实施例3所述的方法测定的经预处理原料持水量的93.2%的含水量。

已知（Levenspiel,1999,Chemical Reaction Engineering,ThirdEdition,John Wiley and Sons,Chapter5）在恒定密度的系统中，理想的非混合式反应器（活塞流）比理想的混合式反应器（CSTR）更有效且非混合式活塞流反应器与间歇式反应器更相似。因此，认为四个小时的非混合式阶段在罐体积上近似等于实现相同的输出产率的四个小时的混合式罐。图4中的结果表明了对于纤维素转化率为25%的混合式第一阶段水解，相对的能量消耗近似为在酶加入前搅拌初始浆体所需量的10%。相比之下，对于非混合式第一反应器，相对的能量消耗近似为零。当系统采用两个或多个串联的混合式反应器时，如果混合式反应器的上游使用非混合式反应器，则总能量消耗将降低。例如，如果在酶加入前初始浆体需要100HP/1000加仑以完全混合，则第一混合式反应器需要10HP/1000加仑，且非混合式反应器需要0HP/1000加仑。对于1000加仑的两个串联的混合式反应器，总能量需求为10HP+0.9HP=10.9HP，而串联的非混合式反应器与混合式反应器总能量需求为0HP+0.9HP=0.9HP，其近似节约92%的能量，同时保持最终的目标纤维素的转化率。不欲作为禁止，在本实施例中的第一混合阶段使用常规的混合设备将导致在商业规模上过大的发动机尺寸。非混合式反应器的纳入极大地减小了发动机的尺寸限制并使常规的混合设备可用于所有的混合罐，这简化了设计。

应当了解实施例仅为说明目的且不应以任何限制本发明的方式解释。

Claims

1.用于由经预处理的纤维素原料来酶法水解纤维素以生产葡萄糖的方法，该方法包括：

(i)提供经预处理的纤维素原料的含水浆体，该含水浆体具有的未溶解固体含量为12重量％至40重量％；

(ii)将经预处理的纤维素原料的含水浆体加入到非混合式水解反应器中；

(iii)在加入步骤(步骤ii)前、在加入步骤(步骤ii)过程中将纤维素酶加入到含水浆体中、加入到非混合式水解反应器中，或二者结合，其中在非混合式水解反应器中，纤维素酶将部分纤维素水解以产生可溶性糖并降低含水浆体的粘度，从而产生含有可溶性糖的部分水解的纤维素的混合物；

(iv)通过将含有可溶性糖的部分水解的纤维素的混合物进料至进行所述混合物混合的混合式水解反应器中或包括进行所述混合物混合的混合式水解反应器的水解系统中，来将纤维素继续水解为葡萄糖；

(v)从步骤(iv)的混合式水解反应器或水解系统中提取含有葡萄糖和未反应的纤维素的物流，

其中与所述方法相关的能量消耗相对于在步骤(iii)中使用混合式水解反应器的相同方法降低。

2.权利要求1的方法，其中在非混合式反应器中水解的纤维素部分为10重量％至70重量％。

3.权利要求2的方法，其中在非混合式反应器中水解的纤维素部分为25重量％至70重量％。

4.权利要求3的方法，其中在非混合式反应器中水解的纤维素部分为35重量％至70重量％。

5.权利要求1的方法，其中纤维素酶包括β-葡萄糖苷酶。

6.权利要求1的方法，其中含水浆体的含水量为经预处理的纤维素原料的最大持水量的40％至140％。

7.权利要求6的方法，其中含水浆体的含水量为经预处理的纤维素原料的最大持水量的60％至120％。

8.权利要求1的方法，其中非混合式水解反应器是高度-直径比为0.2:1.0至5.0:1.0的间歇式、补料间歇式或连续式反应器。

9.权利要求1的方法，其中在部分水解的纤维素的混合物中的可溶性糖包括葡萄糖、纤维二糖、葡萄糖低聚物、或其结合。

10.用于将纤维素水解为葡萄糖的系统，该系统包括：

(i)经预处理的纤维素原料的含水浆体；

(ii)纤维素酶；

(iii)一个或多个非混合式水解反应器，其用于接收经预处理的纤维素原料的含水浆体并使用纤维素酶来使经预处理的纤维素原料的含水浆体部分水解并降低含水浆体的粘度从而产生部分水解的纤维素的混合物；

(iv)一个或多个用于将部分水解的纤维素的混合物继续水解为葡萄糖的降流混合式水解反应器，

其中与所述系统相关的能量消耗相对于使用一个或多个混合式水解反应器来降低含水浆体的粘度的相同系统降低。

11.用于水解纤维素原料浆体以生产葡萄糖的系统，该系统包括：

(i)纤维素原料浆体；

(ii)纤维素酶；

(iii)用于接收纤维素原料浆体并使其脱水的脱水设备；

(iv)脱水设备上游或下游的预处理反应器，其用于接收纤维素原料浆体并将纤维素原料浆体预处理以产生经预处理的纤维素原料；

(v)一个或多个非混合式水解反应器，其用于接收经预处理的纤维素原料并使用纤维素酶使经预处理的纤维素原料部分水解并降低经预处理的纤维素原料的粘度从而产生部分水解的纤维素的混合物；

(vi)非混合式水解反应器下游的一个或多个混合式水解反应器，其用于将部分水解的纤维素的混合物继续水解以产生葡萄糖，

其中与所述系统相关的能量消耗相对于使用一个或多个混合式水解反应器来降低经预处理的纤维素原料的粘度的相同系统降低。

12.权利要求11的系统，其中非混合式水解反应器是活塞流反应器。

13.用于由经预处理的纤维素原料进行纤维素酶法水解以生产葡萄糖的方法，该方法包括：

(ii)将经预处理的纤维素原料的含水浆体加入到非混合式水解反应器系统中；

(iii)在加入步骤(步骤ii)前、在加入步骤(步骤ii)过程中将纤维素酶加入到含水浆体中、或加入到所述系统中的一个或多个非混合式水解反应器中，或二者结合，其中在非混合式水解反应器系统中，纤维素酶水解部分纤维素以产生可溶性糖并降低含水浆体的粘度，从而产生含有可溶性糖的部分水解的纤维素的混合物；

(iv)通过将含有可溶性糖的部分水解的纤维素的混合物进料至进行所述混合物混合的一个或多个水解反应器中，来将纤维素继续水解为葡萄糖；

(v)从步骤(iv)的一个或多个水解反应器中提取含有葡萄糖和未反应的纤维素的物流，

其中与所述方法相关的能量消耗相对于在步骤(iii)中使用一个或多个混合式水解反应器的系统的相同方法降低。

14.权利要求13的方法，其中在非混合式反应器系统中水解的纤维素部分为10重量％至70重量％。

15.权利要求14的方法，其中在非混合式反应器中水解的纤维素部分为25重量％至70重量％。

16.权利要求15的方法，其中在非混合式反应器系统中水解的纤维素部分为35重量％至70重量％。

17.权利要求13的方法，其中纤维素酶包括β-葡萄糖苷酶。

18.权利要求13的方法，其中含水浆体的含水量为经预处理的纤维素原料的最大持水量的40％至140％。

19.权利要求18的方法，其中含水浆体的含水量为经预处理的纤维素原料的最大持水量的60％至120％。

20.权利要求14的方法，其中非混合式水解反应器是高度-直径比为0.2:1.0至5.0:1.0的间歇式、补料间歇式或连续式反应器。

21.权利要求13的方法，其中在部分水解的纤维素的混合物中的可溶性糖包括葡萄糖、纤维二糖、龙胆二糖、葡萄糖低聚物、或其结合。