FI118012B - Menetelmä etanolin valmistamiseksi - Google Patents

Description

118012

MENETELMÄ ETANOLIN TUOTTAMISEKSI

Keksinnön tausta 5 Keksinnön ala

Esillä oleva keksintö koskee etanolin tuottoa. Erityisesti esillä oleva keksintö koskee uutta menetelmää kuitumaisen lignoselluloosamateriaalin muuntamiseksi etanoliksi fermentaatiolla.

10

Vastaavan alan kuvaus

Biomassan muuntaminen polttoaine-energiaksi on saanut osakseen kasvavaa huomiota keinona korvata fossiilisista polttoaineista johdettua energiaa. Nestemäisistä 15 biopolttoaineista (etanoli, metanoli, rasvahapon metyyliesteri) etanolilla on pitkään todennettu historia ja ympäristöllisiä etuja. Sitä voidaan tuottaa monenlaisista raaka- aineista. Etanolia on perinteisesti tuotettu tärkkelykseen tai sokeriin perustuvista maataloustuotteista, mutta nykyään keskitytään erilaisiin maatalouden ja metsäteollisuuden jätteisiin tai metsäteollisuuden sivuvirtoihin. Etanolintuoton hyvin merkittävä ympäristöetu . . 20 on se, että siinä syntyy vähän C02.'ta, edellyttäen, että käytetään raaka-ainetta uusiutuvista • · · • · · ' jätejäämistä tai puusta. Tällä hetkellä lignoselluloosapitoisista raaka-aineista tuotetun • · • * · !. etanolin kustannukset ovat monista syistä yhä liian korkeita. Esteiden joukossa ovat • * · lignoselluloosan muuntamistekniikoiden korkeat kustannukset, etanolin alhainen pitoisuus • · ja saanto, sekä alhaiset tuotantomäärät, jotka kaikki kohottavat .···. 25 lignoselluloosamateriaaleista tuotetun etanolin kustannuksia tärkkelykseen tai sokeriin • · 1 »·· perustuvista raaka-aineista tuotettuun etanoliin verrattuna.

• · * • * * • * *

Puu-tai maatalousperäisten lignoselluloosamateriaalien muuntaminen sokereiksi ja * * « * . edelleen etanoliksi on monimutkainen prosessi, johon sisältyy useita vaiheita (esikäsittely, ... 30 kiintoaineiden mahdollinen erottaminen, selluloosan hydrolyysi, etanolin tuotto * · ·* selluloosasta ja hemiselluloosasta ja etanolin tislaaminen). Raaka-aineesta riippuen • · · tarvitaan eri tyyppisiä esikäsittelytekniikoita. Esikäsittelyvaihe on yleensä tarpeen • * *** selluloosaosan hydrolysoitavuuden parantamiseksi. Esikäsittelyn tarkoituksena on tehdä biomassan materiaalit alttiimmiksi kemialliselle tai entsymaattiselle hydrolyysille sokerien i 118012 2 tuottamiseksi tehokkaasti selluloosasta ja hemisclluloosasta. Esikäsittelyn päämääränä on poistaa ja erottaa hemiselluloosa selluloosasta, hajottaa ja poistaa ligniinivaippa, vähentää selluloosan kiteisyyttä, lisätä selluloosaan avointa pinta-alaa ja lisätä selluloosan huokoskokoa hydrolysoivien aineiden läpäisyn helpottamiseksi.

5

Yksityiskohtaisia kuvauksia erilaisista esikäsittelytekniikoista on saatavilla. Erilaisista esikäsittelyvaihtoehdoista höyryräjäytys (rikkihappokyllästyksen ja rikkidioksidin kanssa) on eräs laajimmin tutkituista menetelmistä.

10 Selluloosan maksimihajotettavuus osuu yleensä yhteen hemiselluloosan täydellisen poiston kanssa. Siksi tehokkaissa esikäsittelymenetelmissä suurin osa hemiselluloosasta liukenee ja muodostaa liukoisen fraktion, joka sisältää pääasiassa hemiselluloosaperäisiä sokereita (kutsutaan “hemiselluloosasuodokseksi”). Puhdistamaton hemiselluloosasuodos esikäsittelystä sisältää tavallisesti erilaisia lignoselluloosan hajoamistuotteita. Nämä voivat 15 olla ligniinin ja sokerin hajoamistuotteita, mukaan luettuina furfuraali, hydroksimetyylifurfuraali ja muurahais- ja etikkahappo. Näistä komponenteista useimmat ovat myrkyllisiä entsyymeille ja mikrobeille, myöhempää hydrolyysi-ja fermentaatioprosessia hidastaen. Useita erilaisia detoksifiointimenetelmiä on tutkittu. Neutralointi kalkilla, aktiivihii 1 ikäsittely ja erilaiset adsorptiohartsit ovat tutkittujen ' 20 menetelmien joukossa. Hemiselluloosasuodoksessa olevien inhibiittoreiden on osoitettu • * · t · · * voimakkaasti alentavan sekä hydrolyysi-että fermentaationopeuksia.

* * I

* * * • * • · • · Φ

Selluloosaosanhydrolyysimenetelmät voivat perustua joko happoon tai entsyymeihin.

• · "" Entsymaattisen hydrol yysin tärkeimpiä haittoja ovat se, että menetelmä on varsin hidas ja 25 entsyymikustannukset ovat silti liian korkeat. Hydrolyysisaannot ovat yleensä riippuvaisia • · substraatin tyypistä ja esikäsittelystä, entsyymin tyypistä ja annoksesta ja hydrolyysiajasta.

, , Useimmat kokeet on suoritettu raaka-aineiden alhaisilla sakeuksilla esikäsittelyvaiheesta • · · • · · . * * ·. peräisin olevassa substraatissa olevien estävien yhdisteiden määrän johdosta.

* * * ... 30 On olemassa olennaisesti kaksi erilaista menetelmien tyyppiä, joita voidaan käyttää * * *" selluloosan (ja hemiselluloosan) muuntamiseksi etanoliksi. Nämä ovat erillinen hydrolyysi • · · •<#;* ja fermentaatio (SHF) ja samanaikainen sokeriksi muuttaminen ja fermentaatio (SSF). | *'**’ Jälkimmäinen menetelmä on myös laajennettu samanaikaisen sokeriksi muuttamisen ja hemiselluloosan fermentaation sisältäväksi (SSHF), ja sitä kutsutaan myös samanaikaiseksi 118012 3 sokeriksi muuttamiseksi ja kofermentaatioksi (SSCF). Erilaisten selluloosan biokonversiojäijestelmien joukossa SSF näyttää olevan lupaavin lähestymistapa selluloosan muuntamiseksi etanoliksi biokemiallisesti. Teollinen etanolin tuottaminen suoritetaan perinteisesti hiivalla, joka on tunnettu vahva eliö. Uusia kantoja (joko hiivoja 5 tai bakteereita) on muokattu käyttämään kaikkia lignoselluloosaraaka-aineesta peräisin olevia sokereita tehokkaasti. Kaikkien sokerien käyttö, hemiselluloosasta peräisin olevat pentoosit ja kaikki heksoosit mukaan lukien, on olennaista etanolin taloudelliselle tuotannolle.

10 Entsyymien optimiolosuhteet (useimmiten sienisellulaaseja, joilla on maksimiaktiivisuus 50 °C:ssa ja alueella 4 - 5 olevassa pHrssa) määräävät erillisen hydrolyysin menetelmässä (SHF) käytettävät hydrolyysiolosuhteet. Erillisen hydrolyysivaiheen pääetu on se, että hydrolyysi toteutetaan entsyymien optimilämpötilassa, ja erillinen fermentaatio hiivan optimissa, noin 30 °C:ssa. Tärkein haitta on se, että hydrolyysissä vapautuvat sokerit 15 estävät sellulaasiaktiivisuutta hydrolyysin aikana voimakkaasti. Tämä voidaan ainakin osittain voittaa kasvattamalla beeta-glukosidaasiaktiivisuutta käytettävässä valmisteessa (lisäämällä erillistä entsyymiä tai käyttämällä ylituottavaa kantaa). Sellulaasikuormitukset vaihtelevat yleensä välillä 10-20 FPU/g substraattia (tai selluloosaa), ja beeta-glukosidaasia lisätään. Tuotetut sokeripitoisuudet ovat yleensä varsin matalia johtuen 20 kuiva-aineen alhaisesta määrästä hydrolyysissä. Saannot (sokereista) ovat yleensä • · : korkeampia laimeammissa jäijestelmissä, joissa lopputuoteinhibitio on minimoitu. Pitkät i *** reaktioajat myös tekevät korkeamman etanolisaannon ja pitoisuuden mahdolliseksi.

• · • · • · · * * * • * *···* Samanaikaisen sokeriksi muuttamisen ja fermentaation menetelmässä (SSF) selluloosan • * · ···· 25 muuttaminen glukoosiksi sellulaaseilla ja sitä seuraava glukoosin (ja pentoosien) • · ’*··* fermentaatio etanoliksi tapahtuvat samoissa reaktoreissa. Esillä olevien prosessikaavioiden mukaisesti kaikki reagoivat aineet (selluloosa, entsyymit ja fermentoiva eliö) on lisätty * * • ·« *... samana ajankohtana. Eräs SSF-menetelmän tärkeimmistä vaatimuksista on sokeriksi * · • · *" muuttamis-ja fermentaatiojärjestelmien yhteensopivuus lämpötilan (alle 37 °C), pH:n ja • # * * # *. " 30 substraattipitoisuuden osalta. SSF:n tarjoamiin pääetuihin sisältyvät selluloosan • · · • · *···* hydrolyysin kohonnut nopeus johtuen sellulaasiaktiivisuutta estävien sokereiden otosta :.·#ϊ (hiivan toimesta) ja aseptisten olosuhteiden vähentyneestä tarpeesta. Haittoja ovat erot • « optimaalisissa olosuhteissa hydrolyysille ja fermentaatiolle.

4 118012

Keksinnön yhteenveto

Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on parantaa tunnetun alan taloudellisuutta ja tehokkuutta (raaka-aineen käytön suhteen) ja saada aikaan uusi menetelmä i 5 lignoselluloosamateriaalien muuntamiseksi etanoliksi. Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on erityisesti kohottaa fermentaatioprosessin lopullista etanolipitoisuutta ja parantaa tuotantonopeutta ja saantoa.

Keksintö perustuu ajatukseen suorittaa hydrolyysi ja fermentaatio korkeassa 10 substraattipitoisuudessajahemiselluloosasuodokseninhibitorisia vaikutuksia välttämällä vähentää tarvittavien entsyymien määrää ja lopulta alentaa etanolintuoton kokonaiskustannuksia. Harvat julkaistut prosessikonfiguraatiot (kuten NREL-prosessi) I eivät ole saavuttaneet näitä päämääriä.

15 Esillä oleva keksintö perustuu kolmen pääasiallisen menetelmävaiheen yhdistelmään, nimittäin ensimmäiseen vaiheeseen, jossa esikäsitelty lignoselluloosamateriaali, jolla on etanoliksi fermentoitumaan kykenevän selluloosa- tai lignoselluloosamateriaalin kohonnut pitoisuus, saatetaan alttiiksi esihydrolyysivaiheelle korkeassa sakeudessa. Sitten hydrolyysiä jatketaan keksinnön toisen vaiheen aikana samanaikaisesti fermentaation , , 20 kanssa. Ja lopulta raaka-aineen esikäsittelyn aikana erotetut liuenneet hemiselluloosat - • · · • · · "* * mahdollisesti fermentaation inhibiittoreiden poistamisen jälkeen-lisätään • · m ·* fermentaatioseokseen ja yhdistettyjen substraattien fermentaatiota jatketaan tuotteen • · · kohonneen saannon aikaansaamiseksi.

* * • * *«* * · · 25 Tarkemmin sanoen keksinnölle on pääasiassa tunnusomaista se, mitä todetaan • · patenttivaatimuksen 1 tunnusmerkkiosassa.

• · * • · » • · * .*··. Esillä oleva, parannetun hydrolyysi- ja fermentaatiotekniikan olennaiset piirteet sisältävä * * * ’ . keksintö saa aikaan seuraavat edut: !..* 30 • · • · *" Suuri hydrolyysinopeus ja korkea pitoisuus saadaan aikaan aloittamalla hydrolyysi • · · j • ·* korkeassa raaka-aineen sakeudessa esihydrolysoiville entsyymeille optimaalisissa • · *···* olosuhteissa.

^ I

118012 5 -

Lopputuoteinhibitio vältetään jatkamalla päähydrolyysivaihetta samanaikaisesti etanolintuoton kanssa hydrolysoiduista sokereista hiivalla, joka kuluttaa entsyymien lopputuotcinhibitiota mahdollisesti aiheuttavat sokerit.

5 Tarvittava entsyymien määrä vähenee johtuen vähentyneestä lopputuoteinhibitiosta ja vähäisemmästä beeta-glukosidaasin tarpeesta. Hemiselluloosafraktion pitoisuus ja valinnainen detoksiflointi parantaa etanolintuoton nopeutta ja johtaa korkeaan lopulliseen etanolipitoisuuteen. Hemiselluloosafraktion lisääminen myöhemmässä vaiheessa vähentää entsyymien ja eliöiden inhiboitumista mahdollisten inhibitoristen yhdisteiden 10 vaikutuksesta. Inhibitoristen vaikutusten minimointi ja raaka-aineen (hiilihydraatin) sakeuden lisääminen johtavat suurempiin fermentaationopeuksiin, korkeampiin lopullisiin etanolipitoisuuksiin ja alempiin etanolintuotannon kustannuksiin. i

Keksintöä kuvataan seuraavaksi yksityiskohtaisemmin viitaten oheiseen piirrokseen. i 15

Piirustuksen lvhvt kuvaus

Kuvio 1 esittää kaavamaisella tavalla keksinnön mukaisen uuden kolmivaiheisen menetelmän suunnitelman lignoselluloosan muuntamiseksi etanoliksi.

20 λ • · * · · : Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus • · • * • ·· " ·· f* *· i ♦ ♦ ; • Kokonaismenetelmä etanolin tuottamiseksi kuitumaisesta lignoselluloosaraaka-aineesta ♦ · *···* sisältää yleensä seuraavat vaiheet: ; • · · •"ί 25 - entsymaahinen esihydrolyysi korkeassa sakeudessa, tyypillisesti 10 % d.w. tai * · • · ’** enemmän, entsyymien optimilämpötilassa. Entsyymikoostumus voidaan suunnitella .. nimenomaisesti esihydrolyysiä varten tai se voi olla esihydrolyysin aikana sama > · "... kuin päähydrolyysivaiheessa; ! • · # - sekundaarinen samanaikainen entsymaattinen päähydrolyysi ja heksoosisokereiden * * · 30 fermentaatio fermentoivalle eliölle sopivassa lämpötilassa; ja • * · t • » T - väkevöidyn ja valinnaisesti detoksifioidun hemiselluloosafraktion lisääminen sen • · · t jälkeen, kun suurin osa heksoosisokereista on fermentoitu; tämä menettely voi * · * · · *· " myös mahdollistaa detoksifioimattoman hemiselluloosasuodoksen käytön.

. _ j 118012 6

Erityisesti menetelmä sisältää a) raaka-aineen muuntamisen (esim. esikäsittelyllä ja myöhemmällä kiinteä-neste -erotusvaiheella) kiinteäksi lignoselluloosafraktioksi, jonka selluloosapitoisuus on kasvanut, ja nestefraktioksi, joka sisältää pääasiassa liuenneita hemiselluloosia; 5 b) kuitumaisen lignoselluloosamateriaalin hydrolysoinnin selluloosaentsyymillä korkeassa sakeudessa modifioidun lignoselluloosamateriaalin aikaansaamiseksi, jolla on kasvanut virtaavuus (joka merkitsee esim. parannettuja sekoitus- ja pumppausominaisuuksia), c) modifioidun lignoselluloosamateriaalin saattamisen samanaikaisesti alttiiksi 10 jatketulle hydrolyysille jollain sellulaasilla ja etanolifermentaatiolle fermentaatioseoksessa, i d) fermentaation jatkamisen tarjolla olevien hiilihydraattien olennaisen osuuden muuntamiseksi etanoliksi, > e) liuenneet hemiselluloosat sisältävän nestefraktion lisäämisen fermentaatioseokseen 15 ja fermentaation jatkamisen, ja f) etanolin talteenoton fermentaatioseoksesta.

Esillä olevassa menetelmässä raaka-aineena etanolifermentaatiota varten voidaan käyttää mitä tahansa lignoselluloosa-, tavallisesti kuitumaista lignoselluloosamateriaalia, joka 20 sisältää olennaisia määriä selluloosaa ja hemiselluloosaa, joka on altista » · · : hiilivetymateriaalin hydrolyysille monomeerisiksi sokereiksi, heksooseiksi ja pentooseiksi.

• * • e· • · • ·

Raaka-aine valitaan tyypillisesti havupuu-ja kovapuutähteistä, tähän käyttöön varatuista • · *··* sadoista, maatalousjätteestä, jätepaperista tai metsäteollisuuden sivuvirrasta.

• · "*: 25 *** • · • · ”* Kääntyen nyt piirroksen puoleen voidaan havaita, että seuraavia viitenumerolta käytetään . eri menetelmävaiheiden osoittamiseen: ! • i · * % · 1. Esikäsittely • · ·* 2. Suodatus ja pesu ·♦**· [ / 30 3. Esihydrolyysi * · **;* 4. Hydrolyysija heksoosien fermentaatio 1 «· · ; *.· 5. Väkevöinti * · « • * 6. Detoksifiointi 7. Hydrolyysi ja hemiselluloosan fermentaatio ·' · j „ ! , , j 7 118012

8. Tislaus ; I

' ί i ' ·ϊ i · * » « • 1 · • · » · • · : .

• · * 2 • · * · • ·· • · · • « * · *** • · · * * 1 1 1 * 1 * · • · 1 . ^ . : 'vf • · · Φ · · *·· • Φ · ’ 1 1 | ·1· * *** • · · • 1 • · • · 1 * · • · 2 * 1 1 8 118012 Näitä vaiheita tarkastellaan jäljempänä: 1. Raaka-aineen esikäsittely 5 Raaka-aine esikäsitellään jollain esikäsittelymenetelmällä, kuten höyryräjäytys, tarkoituksena vapauttaa hemiselluloosat kuitumaisesta lignoselluloosamatriisista.

Tekniikkana höyry räjäytystä kuvaavat yksityiskohtaisemmin esim. Saddler et ai. (1993) ja laitteiston ja menetelmän esikäsittelyä varten kuvaavat Palmqvist et ai. (1996).

10 (Saddler, J, Ramos, L ja Breuil, C (1993) Steam pre-treatment of lignocellulosic residues.

Teoksessa: Bioconversion of Forest and Agricultural plant Residues. Saddler, J.N. (toim.) CAB International, Wallingford, UK, luku 3, 73-92; Palmqvist, E, Hahn-Hägerdal, B,

Galbe, M, Larsson, M, Stenberg, K, Szengyel, Z, Tengborg, C and Zacchi, G. 1996 Design and operation of a bench-scale process development unit for the production of ethanol 3 15 from lignocellulosics. Bioresource Technology 58:171-179) 2. Suodatus ia pesu

Seuraavassa vaiheessa lietteelle tehdään suodatus ja pesu. Näin saadulla kuitumaisella 20 materiaalilla on kohonnut selluloosapitoisuus raaka-aineeseen verrattuna, koska Φ · : huomattava osa hemiselluloosista (noin 5 paino-% - 30 paino-% kokonaisraaka-aineesta) • ·

• I

ί '* on liuotettu nestefaasiin (vesifaasiin). Esikäsittely-ja suodatus/pesuvaiheiden tarkoituksena • t • · • ** on erottaa huomattava osa, vähintään 40 paino-%, erityisesti vähintään 50 paino-% raaka- *·· # * ‘ · · · * aineessa olevista hemiselluloosista ja lisätä ne nestefaasiin pääasiallisesti monomeerisessä • · · *”j 25 tai oligomeerisessä muodossa. Hemiselluloosien/sakkaridien määrä nestefraktiossa on * *"·* tyypillisesti vähintään 2 kertaa suurempi, edullisesti 2,5 - 15 kertaa suurempi (painon

perusteella laskettuna) kuin kuitumaisessa materiaalissa. I

• · ··· • « -.--1 • · *Γ Suodattaminen toteutetaan käyttämällä esim. suodatinpuristimia tai muita tavanomaisia * * • · * *· " 30 erotusmenetelmiä pääasiassa selluloosan sisältävän kiintoainefraktion erottamiseen ja • · · • · *·;·* pesemiseen. Erottaminen johtaa suodatinkakkuun (korkeassa lämpötilassa), jolla on korkea kiintoainepitoisuus ja nestefraktioon, joka sisältää liuenneet hemiselluloosat mutta myös • * ·.*·· inhibitoriset yhdisteet.

118012 9 3. Esihvdrolwsi (edellä mainittu vaihe tri

Modifioidun lignoselluloosamateriaalin hydrolysointi vaiheessa b toteutetaan 30 - 90 °C:n tai 40 - 90 °C:n lämpötilassa 0,5 - 24 tunnin ajan, tyypillisesti noin 1-12 tuntia. Sakeus on 5 korkea, yleensä noin 5 - 40 % kuivapainoa, edullisesti noin 10 - 25 % d.w. Hydrolyysi toteutetaan lievästi happamissa olosuhteissa, edullisesti välillä 4-6 olevalla pH-alueella.

i

Kuten jäljempänä tullaan yksityiskohtaisemmin pohtimaan, toteutetaan vaiheen b hydrolyysi ensimmäisellä sellulaasipreparaatilla ja vaiheen e hydrolyysi (kuvion 1 10 viitenumero 5) toteutetaan toisella selluloosapreparaatilla, sellulaasien ollessa joko samat tai edullisesti erilaiset. Käyttämällä erilaisia sellulaaseja on mahdollista käyttää Jr: entsyymejä, jotka ovat erilaisiin tehtäviinsä optimoituja. Näin ollen ensimmäinen entsyymi voidaan spesifisesti optimoida käsiteltävyyden (kuten sekoituksen ja pumppaamisen -yleisesti “virtaavuuden”) parantamiseksi korkeassa sakeudessa, viskositeetin 15 alentamiseksi, fermentoituvien sokereiden tuottamiseksi ja olemaan aktiivisia 30 — 90 °C:n lämpötiloissa vaiheessa b. Esihydrolyysin aikana ainakin osa selluloosasta ja muista hiilihydraateista hydrolysoituu sokereiksi (monosakkarideiksi). Tyypillisesti vähintään 5 %, edullisesti 10 % - 90 %, erityisesti noin 20 - 80 % hiilihydraateista hydrolysoidaan tässä vaiheessa fermentoituvien monosakkaridien tuottamiseksi. Jäljempänä mainituissa , , 20 esimerkeissä hydrolyysiaste on ollut noin 20 - 70 %.

• · ♦ # · · • · · · • * • * • · · I. Vaiheessa b käytettävällä entsyymillä on edullisesti laaja sellulaasien kirjo. Entsyymillä on • · · etenkin vähintään kaksi aktiivisuutta valittuna ryhmästä, johon kuuluvat • · "!. sellobiohydrolaasiaktiivisuudet, endoglukanaasiaktiivisuudet, beeta- ,···, 25 glukosidaasiaktiivisuudet ja hemisellulaasiaktiivisuudet (ks. jäljempänä olevaa entsyymien • · • · · yksityiskohtaisempaa selitystä). . , • · ♦ • V • · · .*··. 4. Hydrolyysi ia heksoosien fermentaatio • · · * ] ····· • · ...t 30 Samanaikaisen hydrolyysin ja fermentaation (vaihe c) vaiheet toteutetaan edullisesti • · lämpötilassa, joka on 30 - 70 °C:n alueella. (Vaiheen b hydrolyysi toteutetaan edullisesti | • · i korkeammassa lämpötilassa kuin vaiheen c hydrolyysi ja fermentaatio). Hydrolyysiä • · jatketaan toisella entsyymillä, joka on aktiivinen tässä lämpötilassa 6 - 96 turmin reaktioajan.

10 118012 ί

Vaiheessa c käytettävällä entsyymillä on laaja sellulaasien kiijo ja se on aktiivinen 30 - 90 °C:n lämpötiloissa. Entsyymillä on edullisesti vähintään kaksi aktiivisuutta valittuna ryhmästä, johon kuuluvat sellobiohydrolaasiaktiivisuudet, endoglukanaasiaktiivisuudet, 5 beeta-glukosidaasiaktiivisuudetjahemisellulaasiaktiivisuudet. Jäljellä olevan lignoselluloosamateriaalin hydrolyysin toteuttaminen optimoidaan spesifisesti vaiheissa c - 1! e.

Nämä kaksi entsyymiä ovat edullisesti samaa alkuperää ja suunniteltu 10 lignoselluloosamateriaalin hydrolysoimiseksi tehokkaasti koko prosessissa, joka koostuu vaiheista b - e.

Täydellisempi kuvaus entsyymeistä esitetään jäljempänä.

15 Hydrolyysin aikana jäljellä oleva selluloosa ja muut selluloosa-ja lignoselluloosamateriaalin hiilihydraattiosat muunnetaan sokereiksi.

Fermentaatiovaihe toteutetaan jonkin fermentoivan eliön läsnä ollessa, joka kykenee fermentoimaan tärkeimpiä lignoselluloosasta peräisin olevia hiilihydraatteja (sokereita), ; 20 siis monosakkarideja, kuten heksooseja ja pentooseja. Fermentoiva eliö kykenee * · · * »i » » » · ;·, tuottamaan etanolia tärkeimmistä lignoselluloosasta peräisin olevista sokereista 30 - 70 • ·· Φ °C:n lämpötiloissa.

• * * '1.' t • · * • * • · • · *

Esimerkkejä sopivista eliöistä ovat seuraavat: * · · · .**·. 25

Hiivoja: : Saccharomyces cerevisiae, sisältäen geneettisesti muunnetut eliöt (GMO), kuten VTT- !*.: kanta B-03339 *··.* 30 Pichia stipitis

Candida shehatae [ ’ Hansenula polymorpha ϊ.,.ϊ Pachysolen tannophilus

Brettanomyces naardenensis : *.* 35 Pichia segobiensis •’"j P.guillennondii P. naganishii Candida tenuis Π 118012 C. albicans C. tropicalis C. maltosa C. torresii 5 Metschnikowia bicuspidata M. zobellii

Sporopachydermia quercuum

Wingea robertsii ; ? 10 Bakteereita:

Zymomonas mobilis E.coli (GMO-kanta/kantoja)

Klebsiella oxytoca (GMO -kanta) 15

Sieniä:

Fusarium oxysporum Candida guillermondii 20 C. millerii C. tropicalis C. parapsilosis Petromyces albertensis Debaromyces hansenii 25 Cellulomonas cellulans Corynebacterium sp.

Serratia marcescens • · • · · ! 30 Fermentoiva eliö on erityisesti hiiva, joka kykenee tuottamaan etanolia tärkeimmistä • · * * • ** lignoselluloosaperäisistä sokereista.

• * • * · • •m • * *···* 5. Väkevöinti • ”·^“ • · · * · · · t*· 1 ' ' g * · * · *** 35 Suodatusvaiheesta saadun nestefraktion pitoisuutta kohotetaan ennen nesteen lisäämistä . fermentaatioseokseen. Näin ollen on edullista kohottaa hemiselluloosafraktion pitoisuutta • · · • · · !!! 5 - 60 %:n kuivapainopitoisuuteen.

• · ··· * * Väkevöinti voidaan toteuttaa haihduttamalla ja erilaisin kalvotekniikoin. Haihduttamalla * · *;·' 40 tehtävän väkevöinnin aikana joitakin fermentoiville eliöille inhibitorisia yhdisteitä voidaan * · · : myös poistaa hemiselluloosasuodoksesta.

* * · • · ♦ · • ♦ ♦ 6. Detoksifiointi ' ' ' i 12 118012

Nestefraktion voidaan - esikäsittelyn olosuhteista riippuen, saattaa alttiiksi detoksifiointitoimenpiteelle hemiselluloosafraktion vapauttamiseksi aineista, jotka saattavat inhiboida fermentaatiota. Inhibiittorit voidaan poistaa esim. erottamalla, i i 5 haihduttamalla, ioniekskluusiolla, hartsilla tai aktiivihiilikäsittelymenetelmällä.

7. Hvdrolvvsi ia hemiselluloosan fermentaatio

Nestefraktio lisätään, kun olennainen osa fermcntaatiolle vaiheessa e tarjolla olevasta 10 hiilihydraattisubstraatista on fermentoitu etanoliksi. Edullisesti vähintään 20 paino-%, edullisemmin vähintään 40 paino-%, etenkin vähintään 50 paino-%, tarjolla olevista hydrolyysin aikana muodostuneista monosakkarideista, etenkin heksooseista ja pentooseista, fermentoidaan etanoliksi ennen nestefraktion lisäämistä. Väkevöity hemiselluloosafraktio lisätään sitten 10 minuutin - 48 tunnin, edullisesti noin 15 min - 24 15 tunnin ajanjakson aikana, jonka ajan jälkeen fermentaatiota jatketaan vielä 6 - 72 tunnin, edullisesti 8 - 48 tunnin ajan 30 - 70 °C:n lämpötilassa ja pH:ssa 4 - 6.

Edellä mainitun menetelmän tuloksena saadaan fermentaatioseos, joka sisältää painosta yleensä noin 0,5 - 10 %, etenkin noin 2 - 8 % etanolia. Saanto (laskettuna tarjolla olevista . , 20 hiilihydraateista) on 80 paino-% tai enemmän, etenkin 85 paino-% tai enemmän, mikä on * * * korkea käytetyt raaka-aineet huomioon ottaen.

: I .

• · 1 • · · · *··· 8. Etanolin tislaus • · ^-— • · * · · • · * * * · · .···. 25 Etanolin tislaaminen ja vedenpoisto toteutetaan sinänsä tunnetuin menetelmin. ; • · • · · . Sellulolvvttiset entsyymit • · · ♦ · · • · • · • ·

Edellä mainitut entsymaattiset hydrolyysivaiheet voidaan toteuttaa sellulaasientsyymien • Φ .*·». 30 seoksilla. Seokset koostuvat etenkin entsyymien kolmesta päätyypistä: sellobiohydrolaasit • * • · · (CBH't), endoglukanaasit (EG't) ja a-glukosidaasit. Lisäksi seokset voivat sisältää muita • ♦ * • · *..! hydrolyyttisiä entsyymejä, kuten hemisellulaaseja. Entsyymiseosten koostumus • · optimoidaan hiilihydraattien, etenkin selluloosan tehokkaaksi hydrolysoimiseksi monomeerisiksi sokereiksi. Tätä varten sellobiohydrolaaseja tarvitaan selluloosan kiteiseen

,3 118012 I

osaan vaikuttamiseksi, endoglukanaaseja pääasiassa selluloosan amorfiseen osaan, ja beeta-glukosidaaseja sellobioosin poistamiseksi hydrolyysiseoksista, koska sellobioosi inhiboi CBH-entsyymien vaikutusta lopputuoteinhibitiosta johtuen. Hydrolyysin mekanismit ovat tunnettuja ja niitä kuvaa yksityiskohtaisemmin esim. Teeri (1997).

5 Nykyiset kaupalliset sellulaasientsyymivalmisteet ovat pääasiassa peräisin sienistä (esim. Trichoderma, Aspergillus). Seosten ominaisuuksia voidaan parantaa tai tehdä sopiviksi spesifisille olosuhteille käyttäen bioteknisiä menetelmiä. Seokset voidaan modifioida sellaisiksi, että ne sisältävät muista eliöistä johdettuja uusia sellulaasiproteiineja geneettisen muokkauksen menetelmiä käyttäen, tai nykyisten sellulaasiproteiinien 10 ominaisuuksia voidaan parantaa proteiinimuokkauksella.

(Teeri, T. (1997) Crystalline cellulose degradation: new insight into the function of cellobiohydrolases. TIBTECH 15 (toukokuu 1997), s. 161-167.) 15 : ;

Seuraavat epärajoittavat esimerkit kuvaavat keksintöä lisää: >

Esimerkki 1

Esikäsitellyn havupuun esihydrolyysi . . 20 • Φ m • · * ] ' [ Havupuuta esikäsiteltiin höyryllä ja jaettiin kahteen fraktioon; kiinteään fraktioon, joka # • ·· ··, sisälsi pääasiassa selluloosaa ja liukoiseen fraktioon, joka sisälsi pääasiassa * · * .···. hemiselluloosan sokerit ja inhibitoriset yhdisteet. Kiinteä fraktio suodatettiin, pestiin ja * a ·*· suspendoitiin kuitususpension muodostamiseksi, jonka kuiva-ainepitoisuus oli 14,4 %.

• * · · 25 Kuitu esihydrolysoitiin käyttämällä kaupallisia entsyymivalmisteita (Celluclast 1,5 L FG, t · ψ 20 FPU/g d.w. ja Novozym 188, beeta-glukosidaasin annos 200 nkat/g d.w) 50 °C:ssa 2 - • j*j 20 tunnin ajan.

• φ * • * · • * * · ··*

Hydrolyysin aikana 74 % kuidun selluloosasta hydrolysoitui glukoosiksi, jota oli läsnä * · ,·*·. 30 nesteffaktiossa pitoisuutena 46 g/1. Lisäksi nestemäinen osa sisälsi pieniä määriä muita * · 4 fermentoituvia sokereita: 0,1 g/1 mannoosia, 0,03 g/1 galaktoosia ja 0,04 g/1 ksyloosia.

• * · * ·

Kiinteän fraktion viskositeetti aleni nopeasti hydrolyysin aikana ja sekoitusominaisuudet • · paranivat selvästi jo 2 ensimmäisen hydrolyysitunnin aikana, luoden kuitususpension edullisemmat prosessointiominaisuudet.

14 118 012 Höyryllä esikäsiteltyä havupuuta käsiteltiin myös suoraan entsyymeillä samalla tavalla kuin aiemmin kuvattiin, mutta ilman hemiselluloosasokerifraktion erottamista ja ilman pesua. Tässä tapauksessa hydrolyysinopeus oli vain 11 % pestyllä kuidulla saadusta (8 % 5 kuidun selluloosasta hydrolysoitui), mikä osoittaa, että esihydrolyysivaihe on selvästi tehokkaampaa tapauksessa, jossa hemiselluloosafraktio erotetaan kuidusta ennen esihydrolyysiä. !

Kun vastaava hydrolyysikoe toteutettiin alemmalla kuitupitoisuudella (2 %:n kuiva-aine), 10 oli hydrolyysinopeus pesemättömällä kuidulla parempi: 66 % hydrolyysinopeudesta pestyllä kuidulla. Tämä osoittaa, että hemiselluloosasuodoksen aiheuttaman entsyymien inhibitio tulee selvästi vakavammaksi, kun kuidun pitoisuutta kasvatetaan. Näin ollen i hemiselluloosasuodoksen erottaminen kuidusta on hyvin tärkeätä tehokkaalle hydrolyysille esihydrolyysivaiheessa korkean sakeuden prosessissa.

15

Esimerkki 2

Etanolin tuotto esihydrolysoidusta havupuusta

Havupuuta esikäsiteltiin höyryllä ja jaettiin kahteen fraktioon; kiinteään fraktioon, joka . 20 sisälsi pääasiassa selluloosaa ja liukoiseen fraktioon, joka sisälsi pääasiassa • * · • * « · ", hemiselluloosan sokerit. Kiinteä fraktio suodatettiin, pestiin ja suspendoitiin • * · kuitususpension muodostamiseksi, jonka kuiva-ainepitoisuus oli 14,5 %. Kuitu * ·· .···, esihydrolysoitiin käyttämällä kaupallisia entsyymivalmisteita 50 °C:ssa.

• · -Il ···

Hydrolyysiolosuhteet olivat: 13,3 % kiinteitä aineita d.w. asetaattipuskurissa, pH 5, ·* « « j .*··. 25 käytetyt entsyymivalmisteet olivat Celluclast 1,5 L FG, 20 FPU/g d.w. ja Novozym 188, • · · beeta-glukosidaasin annoksen ollessa 200 nkat/g d.w. 20 tunnin kuluttua esihydrolysaatti : j*· temperoitiin 30 °C:seen ja ympättiin hiivalla (kanta VTT-B-03339), joka oli ennen ··· :***: siirrostusta suspendoitu ravinteiden kanssa 10 til.-%:na (esihydrolysaatista) veteen.

• ♦ ·

Vertailukäsittely toteutettiin samoissa olosuhteissa, mutta hiiva siirrostettiin prosessin • · .···, 30 alussa välittömästi entsyymien lisäämisen jälkeen.

• · *· · ·*

« · · . i I

• ·

Koe esihydrolyysin kanssa ja vertailukäsittely johtivat molemmat 25 g/l:n * · etanolipitoisuuteen, mikä vastaa 81 %:n etanolisaantoa teoreettisesta. Esihydrolyysi oli näin ollen yhtä hyvä kuin erillinen hydrolyysi prosessissa tapahtuvan etanolintuoton 118012 15 suhteen ,ja johti lisäksi parempiin sekoittumisominaisuuksiin alhaisemmalla energiantarpeella. !

Esimerkki 3 5 Etanolin tuotto esitaydrolysoidusta havupuusta hemiselluloosafraktion kanssa ja

ilman I

Havupuuta esikäsiteltiin höyryllä ja jaettiin kahteen fraktioon; kiinteään fraktioon, joka sisälsi pääasiassa selluloosaa ja liukoiseen fraktioon, joka sisälsi pääasiassa 10 hemiselluloosan sokerit. Kiinteä fraktio suodatettiin, pestiin ja suspendoitiin kuitususpension muodostamiseksi, jonka kuiva-ainepitoisuus oli 18 %. Kuitu esihydrolysoitiin käyttämällä kaupallisia entsyymivalmisteita 50 °C:ssa.

Hydrolyysiolosuhteet olivat: 16,2 % kiinteitä aineita d.w. asetaattipuskurissa, pH 5, käytetyt entsyymivalmisteet olivat Celluclast 1,5 L FG, 20 FPU/g d.w. ja Novozym 188, 15 beeta-glukosidaasin annoksen ollessa 200 nkat/g d.w. Esihydrolyysin jälkeen noin 58 % kuitufraktiossa olevasta selluloosasta oli hydrolysoitunut glukoosiksi.

i · 20 tunnin kuluttua esihydrolysaatti temperoitiin 30 °C:seen ja ympättiin hiivalla (kanta ! · VTT-B-03339), joka oli ennen siirrostusta suspendoitu ravinteiden kanssa 10 til.-%:na | ; 20 (esihydrolysaatista) veteen.

«·· *·· * ♦ · • « ♦ ··

Hiivalle inhibitorisia ja toksisia yhdisteitä sisältävä hemiselluloosasuodos lisättiin joko: ! • ·· .···. A) hydrolyysin alussa (johtaen 13,3 %:iin kiintoaineita d.w. hydrolyysissä).

• · B) fermentaation alussa samana ajankohtana kuin hiiva, tai ; ' • * * · .**. 25 C) kahdella peräkkäisellä lisäyksellä fermentaation alkamisen jälkeen.

• · » : ;*j Vertailutarkoituksia varten suoritettiin käsittely käyttäen hemiselluloosafraktion sisältävää * · :***: pesemätöntä, höyryllä esikäsiteltyä materiaalia, joka sisälsi siis materiaalin ilman ·*· hemiselluloosafraktion erottamista, ja ilman mitään pesua.

· 30 Φ t k · ·

Hiivafermentaatiossa tuotetut etanolipitoisuudet olivat eri tapauksissa: A) 0,2 %, B) 2,6 % ♦ · · • · \.I ja C) 3,2 %. Vertailevassa tutkimuksessa käsittely tuotti vain 0,15 % etanolia. Sokerit **·** t lisätystä suodoksesta käytettiin vain osittain tapauksessa B), kun taas niiden suurin osa i kulutettiin tapauksessa C). Tulokset osoittavat, että toksisen suodoksen asteittainen - ‘ ’ 1 j 16 118012 ! lisääminen fermentaation myöhemmässä vaiheessa paransi saantoja ja tuottonopeuksia,

Suodoksen toksisuuden johdosta sekä hydrolyysin että fermentaation nopeudet alenivat.

Esimerkki 4. Inhibiittoreiden poistaminen hemiselluloosasuodoksesta haihdutuksella.

5

Hemiselluloosasuodos erotettiin höyryllä esikäsitellystä kuusikuidusta ja väkevöitiin 4,8-kertaisesti tyhjöhaihdutuksella 60-65 °C:ssa. Ennen ja jälkeen väkevöinnin suodos analysoitiin HPLCdla monosakkaridien ja useiden inhibitoristen yhdisteiden osalta: etikkahappo, fiirfuraali ja 5-hydroksimetyylifurfuraali (5-HMF).

10

Haihdutuksen aikana furfuraali poistui suodoksesta (määrän ollessa alle HPLC:n detektiorajan suodoksessa). Haihduttamalla tehdyssä väkevöinnissä etikkahapon määrä aleni 67 %:lla ja 5-HMF:n määrä aleni 12 %:lla. Näin ollen useiden inhibitoristen yhdisteiden määrää voidaan vähentää tai ne voidaan poistaa hemiselluloosasuodoksesta 15 haihdutuksella, joka toteutetaan hemiselluloosasuodoksen väkevöimiseksi ennen sen lisäämistä fermentaatioprosessiin.

Esimerkki 5 : ^

Etanolin tuotto esikäsitellystä havupuusta kolmivaiheisessa prosessissa : .·. ' 20 e * · • * · ·

Koko prosessia testattiin korkeassa kiinteän aineen kuivapainon sakeuden (13 paino-% * " i*. esihydrolyysivaiheessa) olosuhteissa lisäämällä väkevöityä hemiselluloosafraktiota • " ·***. (sokeripitoisuus 27 %) myöhemmän SSF-vaiheen aikana. Koe suoritettiin ·· · ··· laboratoriofermentorissa pH-ja lämpötilakontrollin kanssa ja sekoittamalla lietettä ·« · · 25 tehokkaasti. Koe aloitettiin 13 %:n sakeudella esihydrolyysivaiheen kanssa 50 °C:ssa * * * (entsyymin lisääminen kuten kuvattiin esimerkissä 2) ja jatkettiin 24 tunnin ajan.

: Esihydrolyysin jälkeen 60 % selluloosasta kuitufraktiossa oli hydrolysoitunut glukoosiksi.

* · · • m Φ · ··* ...

Fermentorin lämpötila laskettiin sitten 30 °C:seen, riittävästi ravinteita lisättiin ja .***. 30 fermentori ympättiin pentooseja fermentoivalla hiivalla (kanta VTT-B-03339).

* * *

Hydrolyysissä tuotetut sokerit kulutettiin nopeasti ja samanaikainen hydrolyysi ja • t ··· fermentaatio jatkuivat. 24 tunnin kuluttua hiivan siirrostuksesta aloitettiin detoksifioidun ja • · "! # « * haihduttamalla väkevöidyn (noin 20 %:in alkuperäisestä tilavuudesta) väkevöidyn hemiselluloosafraktion lisääminen ja sitä jatkettiin noin 25 tunnin ajan.

. 17 118 012

Kun fermentaatio oli päättynyt, etanolipitoisuus oli 4,5 %, vastaten n. 90 %:n teoreettista saantoa raaka-aineessa olevista hiilihydraateista. Pääosa suodoksessa olevista sokereista käytettiin myös: esim. mannoosin ja glukoosin kokonaiskäyttö oli vastaavasti 92 % ja 95 % 5 kaikesta raaka-aineissa läsnä olevasta mannoosista tai glukoosista. Prosessi tuotti näin ollen etanolin korkean pitoisuuden ja saannon, ja helpotti hemiselluloosafraktion ! sokereiden käyttöä.

i • m • « · • · 1 ··· « ·· ♦ · • · · ·· • 1 ' • · 1 ♦ «·· • · « « • · · ·♦· ···♦ ··· • · • · • · · • · ·

• ♦ · J

♦ · · • · • · • · · • » ··· • · • · • 1 · • '.· i • · · • · · • 1 i 9 · · • · ·

Claims (24)

1. Menetelmä etanolin tuottamiseksi hiilihydraatteja sisältävästä kuitumaisesta lignoselluloosaraaka-aineesta, sisältäen 5 a) raaka-aineen muuntamisen kiinteäksi lignoselluloosafraktioksi, jonka selluloosapitoisuus on kohonnut, ja nestemäiseksi fraktioksi, joka sisältää pääasiassa liuenneita hemiselluloosia; b) kuitumaisen lignoselluloosamateriaalin hydrolysoinnin 10 - 40 %:n d.w. sakeudessa sellulaasientsyymillä hiilihydraateista noin 20 - 80 %:n hydrolysoimiseksi 10 heksooseja japentooseja sisältävän modifioidun lignoselluloosamateriaalin aikaansaamiseksi, ja mainitulla materiaalilla on parempi virtaavuus, c) modifioidun lignoselluloosamateriaalin saattamisen samanaikaisesti alttiiksi jatketulle hydrolyysille jollain sellulaasilla ja heksoosien ja pentoosien etanolifermentaatiolle fermentaatioseoksessa,

7 I 15 d) fermentaation jatkamisen saatavilla olevien hiilihydraattien muuntamiseksi * etanoliksi, e) liuenneet hemiselluloosat sisältävän nestemäisen fraktion lisäämisen fermentaatioseokseen, kun vähintään 50 paino-% saatavilla olevista heksooseista ja pentooseista on fermentoitu etanoliksi ja fermentaation jatkamisen, ja 20 f) etanolin talteenoton fermentaatioseoksesta. • · * mmm • · · * · · · ' mm mm m m m *. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa raakamateriaalille tehdään m m • mm *... höyryräjäytys vaiheessa a. • · • · ··· « ♦ · « “!! 25 3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, jossa vaiheen b hydrolyysi toteutetaan · 40 - 90 °C:n lämpötilassa 0,5 - 24 tunnin ajan. mmm • · • * · . · · ·. 4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, jossa vaiheen b hydrolyysi toteutetaan 10 - mm· m * · * . 25 %:n d.w. sakeudessa. ***** !..* 30 • · " * * *" 5. Patenttivaatimuksen 3 tai 4 mukainen menetelmä, jossa vaiheen b hydrolyysi toteutetaan # ♦** • ·* alueella 4 - 6 olevassa pH:ssa. • · • · mmm 19 118012

6. Jonkin patenttivaatimuksen 3-5 mukainen menetelmä, jossa vaiheen b hydrolyysi toteutetaan ensimmäisellä sellulaasivalmisteella ja vaiheen c hydrolyysi toteutetaan toisella selhiloosavalmisteella, mainittujen ensimmäisten ja toisten sellulaasien ollessa erilaisia.

7. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, jossa vaiheessa b käytettävällä entsyymillä on laaja sellulaasien kirjo ja se on aktiivinen alueella 30 - 90 °C olevissa lämpötiloissa.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, jossa entsyymillä on vähintään kaksi 10 aktiivisuutta valittuna ryhmästä, johon kuuluvat sellobiohydrolaasiaktiivisuudet, endogl ukanaasiaktii visuudet, beeta-glukosidaasiaktiivisuudet ja hemisellulaasiaktiivisuudet.

9. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, jossa vaiheen b hydrolyysi 15 toteutetaan korkeammassa lämpötilassa kuin vaiheen c hydrolyysi ja fermentaatio.

10. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 9 mukainen menetelmä, jossa vaihe c toteutetaan alueella 30 - 70 °C olevassa lämpötilassa. 1 ” '

11. Jonkin edellisen patentti vaatimuksen mukainen menetelmä, jossa vaiheessa c • · · * käytettävällä entsyymillä on laaja sellulaasien kirjo ja se on aktiivinen 30 - 90 °C:n • * [, lämpötiloissa. • · -· • · · I • · • · **! 12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, jossa entsyymillä on vähintään kaksi j * ‘1’.'. 25 aktiivisuutta valittuna ryhmästä, johon kuuluvat sellobiohydrolaasiaktiivisuudet, • * endogl ukanaasiaktiivisuudet, beeta-glukosidaasiaktiivisuudet ja . · hemisellulaasiaktiivisuudet. * # · -t *·· • · • « * · * ' ·. 13. Patenttivaatimuksen 11 tai 12 mukainen menetelmä, jossa vaiheessa e käytettävä ····· • · ... 30 entsyymi kykenee hydrolysoimaan vaiheissa c - e läsnä olevaan • » • * I *Γ lignoselluloosamateriaalin. • · a • · · ' • · * * * · · • * • · • * · . ' 1 ! 20 1 1 8 0 1 2

14. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, jossa fermentaatiovaihe toteutetaan fermentoivan eliön läsnä ollessa, joka kykenee fermentoimaan tärkeimpiä lignoselluloosasta peräisin olevia sokereita, siis heksooseja ja pentooseja.

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, jossa fermentoiva eliö kykenee tuottamaan etanolia tärkeimmistä lignoselluloosasta peräisin olevista sokereista 30 - 70 °C:n lämpötilassa.

16. Patenttivaatimusten 14 tai 15 mukainen menetelmä, jossa fermentoiva eliö on hiiva, 10 joka kykenee tuottamaan etanolia tärkeimmistä lignoselluloosasta peräisin olevista sokereista. . 1

17. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, jossa fermentaatio toteutetaan 30-70 °C:n lämpötilassa ja hydrolyysiä jatketaan toisella entsyymillä, joka on 15 aktiivinen tässä lämpötilassa 6 - 96 tunnin reaktioajan.

18. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa nestemäisen fraktion pitoisuutta kohotetaan vaiheen a jälkeen ja ennen vaihetta d. . . 20 19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, jossa hemiselluloosaffaktio lisätään 5 - • * · • · Φ ·* ;*' * 60 %:n kuivapainopitoisuudessa. : , • * • * · * * • « ···.-

20. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, jossa nestemäinen fraktio * * " ^ saatetaan alttiiksi dctoksifiointitoimenpiteelle hemiseJluloosaffaktion vapauttamiseksi 25 aineista, jotka voivat inhiboida fermentaatiota. • « • · ♦ . 21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen menetelmä, jossa inhibiittorit poistetaan erottamalla, ♦ · · .·**. haihduttamalla, ioniekskluusiolla, hartsilla tai aktiivihiilikäsittelymenetelmällä. • · · * • · · « * • · ...φ 30 22. Jonkin patenttivaatimuksen 1-21 mukainen menetelmä, jossa väkevöity ] hemiselluloosaffaktio lisätään 10 minuutin - 48 tunnin ajanjakson aikana, minkä ajan • · · *..·* jälkeen fermentaatiota jatketaan vielä 6 - 72 tuntia 30 - 70 °C:n lämpötilassa ja pH:ssa 4 - • · • · 6. 2i 118012 !

23. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, jossa ensimmäiset ja toiset entsyymit ovat samaa alkuperää ja suunniteltu Hgnoselluloosamateriaalin hydrolysoimiseksi tehokkaasti koko prosessissa, joka koostuu vaiheista b - e.

24. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, jossa lignoselluloosaraaka- aine on peräisin havupuusta, kovapuusta, tähän käyttöön varatuista sadoista, maatalousjätteistä, jätepaperista tai metsäteollisuuden sivuvirrasta. | • ♦ * · 1 * · · *♦1· • · • 1 • · · * * « • · * «· *** • · • 1 .... | • ; ( • 1 φ • l *»·· **· • « * · · i . _ \ • 1 · ·1·. ··· • · * · • · · • I »··1· • 1 Iti • Φ * 1 • ··1 • · · * · • · i 1 1 'I • · I • · • · · 22 1 1 801 2