CN1030610C - 制备结晶的鬼臼乙叉甙4’-磷酸酯二乙醇化物的新方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了温度稳定的结晶的鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯二乙醇溶剂化物及其制备方法。

Description

本发明涉及结晶的鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯二乙醇溶剂化物。

鬼臼乙叉甙是目前美国批准的抗癌药物，用于治疗小细胞肺癌和顽固性睾丸肿瘤。由于鬼臼乙叉甙只微溶于水，因此制备其溶液需要有机溶剂或有机溶剂混合物。目前市售的非肠道给药的鬼臼乙叉甙产品是溶于多溶剂系统中的。

鬼臼乙叉甙4′磷酸酯(I)及其二钠盐(II)由美国专利4,904,768号作为鬼臼乙叉甙的前体形式公开，而且在体内的抗癌测定中，其活性与鬼臼乙叉甙相同。

        I：  R＝H

        II： R＝Na

鬼臼乙叉甙在水中的溶解度是约0.1mg/ml，而鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯及其二钠盐在水中的溶解度为≥100mg/ml，因此这允许用少量或不用有机溶剂制备药物制剂。以前公开的鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯及其二钠盐是绒毛状非晶形物质，它们难于处理，且储存时有分解倾向。因此，本发明目的之一是提供一种形式的鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯，该形式的鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯比其以前的形式更具优点地用于制药目的。本发明涉及新的结晶的鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯乙醇溶剂化物，它与鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯的已知形式相较，更易于处理并且有意想不到的稳定性。

本发明提供了式(III)的稳定的结晶鬼臼叉甙4′-磷酸酯二乙醇溶剂化物，下文称为鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯二乙醇化物。

(III)

另一方面，本发明提供了制备结晶鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯二乙醇化物的方法，它包括在含溶剂系统的乙醇中形成鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯的饱和溶液。

图1表示鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯二乙醇化物的X射线粉末衍射图。

图2表示鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯二乙醇化物的质子NMR光谱图(D₂O，200MHz)。

I．鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯二乙醇化物的制备

按下法可制得结晶鬼臼乙叉甙4-磷酸酯二乙醇化物：在含有溶剂系统的乙醇中形成鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯的饱和溶液；让结晶形成；和收集所述结晶。按美国专利4,904,768号公开的方法可制备原料鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯，所述方法包括：将鬼臼乙叉甙与氯磷酸二苯酯反应，得到的产物再催化氢化。此法得到的产物是非晶形物质，它可被转变成本发明的结晶鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯二乙醇化物。

混合鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯、乙醇和共溶剂，可制得鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯的饱和乙醇溶液。所述的共溶剂可以是：例如水或甲醇。必要时，该混合物可加热得到完全的溶液。当溶液在一个适合于结晶形成的温度下静置时，使形成了鬼臼乙叉甙4-磷酸酯二乙醇化物的结晶；所述温度并不特别限制，可在例如，约0-65℃范围，但最好在室温下，即约15-25℃进行结晶。期望的产物的结晶一般非常慢，通常在收集结晶之前，将该溶液搅拌约18-72小时。此外，也可向溶液中加入少量预先形成的鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯二乙醇化物结晶作为晶种。按常规方法(如过滤)收集结晶，用无水乙醇洗，然后干燥，得鬼臼叉甙4′-磷酸酯二乙醇化物，无色结晶固体。干燥最好在20-25℃下真空干燥。

在一典型方法中，将鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯与无水乙醇混合，最好是1g鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯用15ml乙醇；然后加热回流。向混合物中加入足够量的水以得到完全的溶液，一般每克鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯需要约0.3-0.6ml水。必要时趁热过滤该溶液，除去不溶的杂质，然后搅拌下让滤液冷却至室温，即约15-25℃。滤液保持在有助于结晶形成的温度，直至足够的结晶形成。虽然可在约55-65℃发生，但最好将溶液保持在室温。于是，搅拌溶液约18-72小时，得期望的产物，无色结晶固体。通过下述实施例更充分地解释上述方法。

实施例1

由鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯制备鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯二乙醇化物。

向非晶形鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯(18.0g)中加入无水乙醇(270ml，加热回流，加入去离子水(约需5-10ml)直至得到一完全的溶液。趁热过滤，滤液冷却至约20℃，搅拌18小时。过滤收集产物，用无水乙醇(2×20ml)洗，于20℃真空干燥18小时，得鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯二乙醇化物，无色结晶固体，15.4g(91％回收率)。

在另一变异方法中，在美国专利4,904,768号公开的制备鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯的方法中最后加一结晶步骤，也可制得结晶的鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯二乙醇化物。由鬼臼乙叉甙为原料制备结晶鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯二乙醇化物的通用方法描述如下。通过美国专利4,904,768号公开方法的改良方法制备鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯。

实施例2

由鬼臼乙叉甙制备鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯二乙醇化物

A．鬼臼乙叉甙4′-二苄基磷酸酯的制备

向亚磷酸二苄酯(446.5g，1.70mol，2N)的二氯甲烷(3.5L)溶液中，于20℃和搅拌下一次加入N-氯琥珀酰亚胺(227.5g，1.70mol，2N)，反应混合物于30℃搅拌3小时，冷却至0℃，在0℃保持12-72小时，然后过滤。在搅拌和惰性气体环境下，用1至1.5小时，将上述制备的一部分氯代磷酸二苄酯溶液(62.5％，1.25N)加入冷却到-15℃至-20℃的鬼臼乙叉甙(500g，0.85mol)、4-二甲氨基吡啶(10.5g，0.86mol，0.1N)、N，N-二异丙基乙胺(311.5ml，1.79mol，2.1N)和无水乙腈(5L)的混合物中，在-15℃至-20℃搅拌该反应混合物，再加入少量氯代磷酸二苄酯溶液(0.1至0.25N)，直至HPLC表明至少98％的鬼臼叉甙已被消耗为止。向反应混合物中加入0.5M KH₂PO₄(5L)，升温至室温，分出有机相，用10％NaCl(2L)洗两次，用NaSO₄干燥，真空蒸发溶剂，得到的固体粗品经硅胶色谱纯化，先用20％Et OAc/CH₂Cl₂，40％EtOAc/CH₂Cl₂，然后用乙酸乙酯洗脱，合并含期望产物的馏份，真空蒸发至2L，在良好的搅拌下将其慢慢加入庚烷(5L)中，于20℃搅拌1-3小时，过滤，于40℃真空干燥18小时，得标题化合物(505g，70％产率)。

B.结晶的鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯二乙醇化物的制备

将鬼臼乙叉甙4′-二苄基磷酸酯(500g，0.59mol)的甲醇(2L)溶液加入10％Pd/C(50g)的甲醇(1L)混悬液中，加热至约37℃，向其中慢慢加入1-甲基-1，4-环己二烯(555g，660ml，5.89mol，10N)甲醇(1L)溶液，于40-45℃搅拌该混合物，直至TLC表明反应完全为止。过滤，浓缩或加入甲醇将滤液调至约1L体积，将其加入无水乙醇(4L)中。该溶液接种标准的鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯，并浓缩至约2.5L，加入无水乙醇(3.5L)，在约20℃搅拌18-72小时，过滤收集固体，用无水乙醇(2×250ml)洗，于约25℃真空干燥18小时，得300-350g产物(80-90％产率)。

II.结晶的鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯二乙醇化物的物理-化学性质

m.p：141-150℃(失去溶剂)；

     160-720(熔化)。

乙醇残留：11.8％(NMR分析)；

          13.2％(热重量分析)；

按C₂₉H₃₃O₁₆P·2C₂H₆O计算为12.1％。

水份含量：0.22％(用Karl Fischer方法)。

NMR：见图2

用装有垂直测角计(θ/2θ)的Philips APD3720型粉末衍射系统得到图1所示的X射线粉末衍射图。X射线发生器(Philips XRG3100型)在45KV和40mA条件下操作，用1.544056的铜Ka线作为放射源。每个样品在2至32deg.2θ间扫描，所用步长为0.04deg.2θ，扫描速度为0.04deg.2θ/sec，用philips APD软件4.00进行所有数据的收集和分析。

III.所用材料

a.上述制备的结晶鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯二乙醇化物。

b.按下述方法制备结晶的鬼臼乙叉甙4′磷酸酯(未溶剂化)。搅拌下将鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯(300mg)的乙醇(175ml)溶液于70℃加热，得到澄清溶液，过滤，滤液于70℃加热至体积减至约34ml为止，将部分溶液(约17ml)放于小瓶中，加入少量以前得到的针状鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯结晶作晶种，于-12℃冰箱中放四天，收集生成的针状结晶，白色绒毛状物质。NMR分析表明该物质的乙醇含量为约1.6％W/W。

C.按美国专利4,904,768号描述方法制备非晶形鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯二钠盐。

d.将结晶的鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯二乙醇化物(125mg)溶于甲醇(50ml)中，用旋转蒸发器蒸发至干，残余物在25℃真空干燥1小时，得到非晶形鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯。

B.方法

精确称重试验样品，并装于1型燧石玻璃瓶中，用涂过特氟隆(Teflon)的塞子和铝盖密封。将小瓶放于50℃储存。分别在2、4和8周用HPLC测定这些样品的含量。在4℃干燥储存的样品作为对照(假定其含量为100％)。

C.HPLC测定条件

柱：Jones Apex十八烷基，5μ，150×4.6mm

流速：1ml/min

流动相A：0.02M磷酸铵(一碱基)的Milli-Q

水(pH～4.5)/乙腈(85∶15)溶液

流动相B：乙腈

梯度：0-3分，等浓度0％B；

      3-18分，线性梯度0-30％B；

      18-23分，等浓度30％B；

      23-25分，线性梯度30-0％B；

      25-30分，100％A重新平衡(即0％B)

波长：235nm

样品浓度：0.1mg/ml

样品稀释液：流动相A

进样量：20μl

保留时间：鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯-5.4分；

          木酚素P-11.5分；

          鬼臼乙叉甙-17.5分。

在0.05-0.20mg/ml浓度范围内，鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯的峰面积与浓度线性相关(相关系数＝0.9999)。

D.结果

上述稳定性试验的结果列于下表中，其中“EP”表示鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯。

试验物质	％EP残留
				2WK	4WK	8WK
	结晶EP 2EtOH
试验1试验2				100100	98.4100	97.599.3
	结晶    EP	93.3	87.9				85.1
非晶型EP				65.8	54.1	46.7
	非晶型EP2Na	85.5	69.3				61.6

在50℃的稳定性试验结果表明：结晶的鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯二乙醇化物在8周期间的含量降低极小，这清楚地证明结晶的鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯二乙醇化物比其它形式的鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯的稳定性更好。

本发明的结晶鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯二乙醇化物可直接用于药物制备中。例如，它可以与隋性的药学上可接受的赋形剂(例如：乳糖，甘露糖醇，右旋糖酐，或其它适宜填充剂；调pH的柠檬酸钠)混合而制剂。固体混合物可装入小瓶中，在给药前用常用的生理学上可接受的稀释剂(如右旋糖溶液或生理盐水)稀释成注射溶液。固体混合物也可填入适合于鬼臼叉甙4′-磷酸酯口服给药的明胶胶囊中。

此外，结晶的鬼臼乙叉苷4′-磷酸酯二乙醇化物可用于制备鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯的冻干制剂。于是，将结晶的鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯二乙醇化物溶于注射用水中，加入药学上接受的碱(例如氢氧化钠或柠檬酸钠)调溶液pH至约4-5范围；溶液中也可含有其它制药赋形剂，例如填充剂(如乳糖或右旋糖酐)。向每一玻璃瓶中装1ml溶液，并冻干。给予病人前，冻干物用生理学上可接受的稀释剂再配制。

值得注意的是：结晶鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯二乙醇化物不管是作为药物制剂，还是以填充药物形式，都应该保持在相对湿度低的环境中，优选低于33％的相对湿度，最好在干燥剂存在下或在密封容器中保存，以避免不希期的暴露于湿气中。

上述的描述和非限定的解释性实施例使专业人员能够最充分地实施和应用本发明。专业人员用适当的实验很容易实现本发明范围内的任何变化和改良。

Claims (3)

1.制备结晶的鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯二乙醇化物的方法，它包括在含有乙醇的溶剂系统中形成鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯的饱和溶液，其中所述溶剂系统包括水和乙醇以及甲醇和乙醇；使所得的溶液于0-65℃下静置或加入晶种后，搅拌该溶液约18-72小时；过滤收集结晶，用无水乙醇洗涤，然后干燥所得的产品。

2.根据权利要求1的制备结晶的鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯二乙醇化物的方法，该方法包括以下步骤：

(1)加热乙醇和无定形的鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯的混合物至回流；

(2)将水加入步骤(1)所得产物中使形成溶液；

(3)过滤步骤(2)所得的溶液，在搅拌下冷却滤液；和

(4)回收所得的二乙醇化物产品。

3.根据权利要求1的制备结晶的鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯二乙醇化物的方法，该方法包括以下步骤：

(1)制取鬼臼乙叉甙4′-磷酸酯的甲醇溶液(1∶1)；

(2)将步骤(1)所得的溶液加到无水乙醇中使成为4∶1的溶液；

(3)将另外的结晶的鬼臼乙叉甙作为晶种加入步骤(2)所得的溶液中，然后将溶液浓缩至2.5∶1；

(4)将无水乙醇加到步骤(3)的溶液中；

(5)在20℃下，搅拌该溶液约18-72小时；和

(6)收集所得的二乙醇化物固体结晶。

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