CN103060349A

CN103060349A - 凝固酶原以及使用所述酶检测内毒素或(1→3)-β-D-葡聚糖的方法

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Publication number: CN103060349A
Application number: CN2012102727312A
Authority: CN
Inventors: 田村弘志; 高桥昭治
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 2006-07-07
Filing date: 2007-07-06
Publication date: 2013-04-24
Also published as: JP2014207912A; US20130309701A1; EP3190185A1; EP2495321A1; EP2050820A1; EP2050820A4; JP2017060486A; JPWO2008004674A1; WO2008004674A1; US20090208995A1; US9040254B2; CN101454448A; EP2495322A1

Abstract

本发明提供可稳定、廉价、大量制备具有一定品质的用于测定(1→3)-β-D-葡聚糖和内毒素的试剂的编码鲎来源的凝固酶原的DNA，含有所述DNA的病毒，携带所述病毒的细胞和使用所述细胞制备凝固酶原的方法，以及使用所述酶测定(1→3)-β-D-葡聚糖和内毒素的方法。本发明中选择编码包含例如序列号4所示的氨基酸序列的蛋白质的DNA等作为编码鲎来源的凝固酶原的核酸，基于所述DNA得到了重组体形式的所述凝固酶原。通过使用所得到的酶，并利用鲎的溶解物的级联系统元件，可得到对(1→3)-β-D-葡聚糖和内毒素的灵敏的检测方法和检测试剂盒。

Description

凝固酶原以及使用所述酶检测内毒素或(1→3)-β-D-葡聚糖的方法

本申请为申请号为200780019590.0、申请日为2007年7月6日的同名申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及编码鲎来源的凝固酶原的核酸，含有所述核酸的病毒、携带所述病毒的细胞及使用所述细胞的制备凝固酶原的方法，还涉及使用由此获得的凝固酶原检测Et或BG的方法和检测试剂盒。

背景技术

已知有使用鲎的变形细胞溶解物（鲎血球提取液，以下仅称为“溶解物”）测定Et或BG的方法。所述方法基于溶解物由Et或BG而凝固。所述凝固反应是因若干凝固因子被逐级活化而引起的（专利文献1、非专利文献1）。

例如，BG与溶解物接触，则将存在于溶解物中的G因子活化为活性G因子。所述活性G因子又将存在于溶解物中的Pro-CE活化为CE。所述CE限制性水解存在于溶解物中的凝固蛋白原分子的特定位点，由此生成凝固蛋白凝胶，从而凝固溶解物。CE也作用于合成底物（例如、叔丁氧羰基-亮氨酰-甘氨酰-精氨酸-pNA（Boc-Leu-Gly-Arg-pNA）），水解其酰胺键，从而释放pNA。因此，可通过测定生成的显色物质（pNA）的吸光度来定量BG（专利文献1）。

Pro-CE已被克隆（非专利文献2），但是难以使用所述核酸表达保持活性的蛋白质（Pro-CE）。

也就是说，Pro-CE已经被克隆，但是本文献公开的技术方案仅是用于获得编码目的蛋白的cDNA的靶克隆的标准方法。即仅仅是使用抗CE抗体从λgt11 cDNA文库（150万个克隆）中筛选出23个克隆，亚克隆到pUC118/119载体中后，测定碱基序列。事实上，仅是这些操作，其所需工作量也非常大，因此没有进行丝氨酸蛋白酶前体proCE的酶活性（CE的蛋白酶（酰胺酶）活性）的表现和由活性B因子的ProCE的活化，或在活性C因子和B因子的共存下的酶活性的定量再现实验（重构）。测定特定蛋白质碱基序列的工作和获得所述蛋白质的重组体，并用其构建特定的测试系统的工作是需要全新水平的高技术创造性的课题。

专利文献1：特开平08-122334号公报

专利文献2：特开2006-271384号公报

非专利文献1：J.Protein Chem.,5,p255-268(1986)

非专利文献2：J.Biol.Chem.,265(36).P22426-22433(1990)

发明内容

发明拟解决的问题

本发明旨在提供可稳定、廉价、大量制备具有一定品质的Et或BG的测定试剂的编码鲎来源的Pro-CE的核酸，含有所述核酸的病毒，携带所述病毒的细胞和使用所述细胞制备Pro-CE的方法，通过使用所述制备方法获得的使用Pro-CE检测Et或BG的方法和检测试剂盒。

用于解决问题的方法

发明人在为解决上述问题而进行研究的过程中发现，通过使用携带含有编码Pro-CE的DNA的病毒的细胞，可制备具有Pro-CE活性的蛋白质，并发现可由此稳定、廉价、大量制备具有一定品质的Et和BG的检测试剂，从而完成本发明。

包括上述背景技术部分在内，本申请文件通篇使用的缩写如下。

Pro-CE：凝固酶原（pro-clotting enzyme）

CE：凝固酶（clotting enzyme）

AcNPV：苜蓿银纹夜蛾（Autographa californica）核型多角体病毒

BG：(1→3)-β-D-葡聚糖

Et：内毒素（也称为“脂多糖”）

HEPES：2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪]乙磺酸（2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid）

HRP：辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase）

MOI：感染复数（multiplicity of infection）

NPV：核型多角体病毒（nuclear polyhedrosis virus）

PBS：磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline）

PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）

pNA：对硝基苯胺

PVDF：聚偏氟乙烯（polyvinylidene difluoride）

SDS：十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）

SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳

LAL：鲎变形细胞溶解物

即本发明提供编码鲎来源的Pro-CE的核酸（以下称为“本发明的核酸”）。

这里所谓鲎选自中国鲎（Tachypleus tridentatus）、美洲鲎（Limulus Polyphemus）、马来鲎（Tachypleus gigas）和圆尾鲎（Tachypleus rotundicauda）（也称为东南亚鲎（Carcinoscorpiusrotundicauda））这4种中的任一种。

且其中所谓“编码鲎来源的Pro-CE的核酸”更优选为选自下述（A）～（C）中的核酸。

（A）编码含有序列号4所示氨基酸序列的蛋白质的DNA、

（B）编码“含有序列号4所示氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、取代、插入或移位了的氨基酸序列且具有鲎来源的凝固酶原活性的蛋白质”的DNA、

（C）由上述（A）或（B）的DNA转录得到的RNA。

且其中所谓“编码鲎来源的Pro-CE的核酸”优选选自下述（a）～（d）中的核酸。

（a）含有序列号3的碱基序列1～1143所示的碱基序列的DNA、

（b）具有下述特征的DNA：在含有序列号3的碱基序列1～1143所示的碱基序列的碱基序列上，具有由所述碱基序列编码的蛋白质的氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、取代、插入或移位的碱基变异，且表达的蛋白质具有鲎来源的凝固酶原活性，

（c）由上述（a）或（b）的DNA转录得到的RNA。

本发明还提供含有本发明的核酸的病毒（以下称为“本发明的病毒”）。

这里所谓“病毒”优选为杆状病毒。在杆状病毒中也优选为NPV，更优选为AcNPV。

本发明还提供携带本发明的病毒的细胞（以下称为“本发明的细胞”）。

对这里所谓“细胞”无特定限制，可考虑是否与上述本发明的病毒相符等自由选择。即如大肠杆菌源、细菌源、酵母源、昆虫源的细胞等。如上所述，合适的本发明的病毒为杆状病毒，若选择所述病毒，则优选昆虫源的细胞。

本发明还提供至少包括使本发明的细胞生长，并从其生长物中回收鲎来源的Pro-CE的步骤的制备鲎来源的Pro-CE的方法（以下称为“本发明的制备方法”）。

本发明还提供通过本发明的制备方法制备的Pro-CE（以下称为“本发明的酶”）。

本发明还提供E t的检测方法（以下称为“本发明的方法1”），其特征在于：使待检测内毒素的被检样品与本发明的酶和“表现出通过与E t接触使Pro-CE转化为CE的活性的丝氨酸蛋白酶前体”共存，以伴随本发明的酶转化为CE的酶活性作为指标，对所述样品中的E t进行检测。

本发明的方法1中，“表现出通过与Et接触使Pro-CE转化为CE的活性的丝氨酸蛋白酶前体”是“表现出通过与活性C因子接触使Pro-CE转化为CE的活性的丝氨酸蛋白酶前体”和鲎来源的C因子和/或重组C因子。

且其中所述“表现出通过与活性C因子接触使Pro-CE转化为CE的活性的丝氨酸蛋白酶前体”是鲎来源的B因子和/或重组B因子。

上述C因子和B因子优选均为重组型，本发明的方法1的最优选形式之一为例如，使待检Et的被检样品与C因子和B因子同本发明的酶一起共存，且所述C因子和B因子均为重组型。若立足于检测灵敏度等方法的有效性，则优选使用鲎来源的天然型C因子和B因子实施本发明的方法1，但欲回收作为天然的C因子和B因子的原料的鲎体液，则需捕获鲎，并回收不对其持续生长产生障碍的限度的体液。在所述捕获和回收体液时，难免对鲎造成某种程度的压力，而且还有人指责由于环境破坏等原因鲎的个体数量在减少。因此如果将实施本发明的方法1中使用的所有级联反应蛋白质均改为重组型，则尤其从保护珍贵生物资源的观点来看意义深远，对生物保护、动物代替的贡献也无以估量。

作为Et检测系统的元件使用的C因子或B因子为重组型因子时，对于用于整合编码所述因子的基因的载体和用于转入所述载体的宿主的选择可无特定限制，但也与前述重组型Pro-CE一样，作为载体的病毒优选杆状病毒，在杆状病毒中也优选NPV，更优选AcNPV。因此，宿主虽可例举大肠杆菌源、细菌源、酵母源、昆虫源的细胞等，但本发明的病毒适选杆状病毒，在选择所述病毒时，适选昆虫源的细胞。

另外，所谓“将伴随本发明的酶向CE转化的酶活性作为指标”是指，定量或定性检测由本发明的酶Pro-CE向CE转化而诱导的酶活性，并将其作为被检样品中Et的存在量或存在指示。有关“出现伴随Pro-CE向CE转化的酶活性的现象”，可例举由于CE的存在，伴随凝固蛋白凝胶生成的溶解物的凝固（可根据凝胶化或浑浊程度的变化等进行检测），通过合成显色底物的酰胺键的水解而分离的显色色素的显色等。尤其是，通过使用合成显色底物，可构建高灵敏度的再现性好的测定系统。而且，也无需使用鲎来源的溶解物，从保护珍贵生物资源的角度也是十分有益的。

有关合成显色底物，可例举例如、X-A-Y（式中、X为保护基、Y为显色色素、A为三肽）所示的物质。由于CE的存在而切断A-Y键，显色色素Y显色，形成Et的存在的定量或定性指示。这里，保护基X可例举，肽的公知保护基，例如、叔丁氧羰基、苯甲酰基等；作为显色色素Y，可例举例如、pNA、MCA（7-甲氧基香豆素-4-醋酸）、DNP（2,4-二硝基苯胺）、丹磺酰（Dansyl）色素等。有关三肽，可例示例如，Leu-Gly-Arg（LGR：单字母表示）、和Ile-Glu-Gly-Arg（IEGR：单字母表示）、Val-Pro-Arg（VPR：单字母表示）等。

在定量实施本发明的方法1时，可预先使用Et的标准品，制作显示E t量和指示强度（显色色素Y产生的显色的强度或由于溶解物的凝固导致的混浊程度等）之间关系的相关数据（典型的是标准曲线），以其为基准，以检测出的指示强度作为基础，检测被检样品中的Et。

对上述被检样品无特定限制，除了注射用水、药品、输液、血液制剂、医疗仪器（医疗用具）、医药部外品、化妆品等之外，还可列举食品，饮用水，空气、江河、土壤等环境样品，天然蛋白质或基因重组蛋白质，核酸，酶，糖，电解质和血液、体液、组织等生物体成分等。

本发明还提供用于实施本发明的方法1的Et检测试剂盒（以下、称为“本发明的试剂盒1”），其特征在于：其组分至少含有本发明的酶和“表现出通过与Et接触使Pro-CE转化为CE的活性的丝氨酸蛋白酶前体”。

而且本发明的试剂盒1优选为“表现出通过与内毒素接触使凝固酶原转化为凝固酶的活性的丝氨酸蛋白酶前体”是“表现出通过与活性C因子接触使凝固酶原转化为凝固酶的活性的丝氨酸蛋白酶前体”和”鲎来源的C因子和/或重组C因子”。

而且，所述“表现出通过与活性C因子接触使凝固酶原转化为凝固酶的活性的丝氨酸蛋白酶前体”优选是鲎来源的B因子和/或重组B因子。

另外，在本发明的试剂盒1中，上述C因子和B因子均为重组型是合适的，有关本发明的试剂盒1的最适形式之一，可例举作为其构成含有的C因子和B因子均为重组型的形式。也就是说，有关本发明的试剂盒1中所含的级联反应蛋白质，更优选仅是本发明的酶、重组C因子和重组B因子。

本发明的试剂盒1中，可根据用本发明的试剂盒1实施的本发明的方法1的形式而选择用于实施本发明的方法1而使用的试剂等，例如上述合成显色底物（X-A-Y）、缓冲液、稀释液、盐、鲎的溶解物等，并包含于试剂盒的组成中。

本发明还提供一种BG检测方法（以下称为“本发明的方法2”），其特征在于：使待检BG的被检样品与本发明的酶和“表现出通过与BG接触使Pro-CE转化为CE的活性的丝氨酸蛋白酶前体”共存，以伴随凝固酶原转化为凝固酶的酶活性作为指标，对所述样品中的BG进行检测。

本发明的方法2中，“表现出通过与BG接触使Pro-CE转化为CE的活性的丝氨酸蛋白酶前体”优选为鲎来源的G因子和/或重组G因子。

上述G因子适选重组型，有关本发明的方法2的最适形式之一，可例举使待检BG的被检样品与本发明的酶同G因子一起共存，且所述G因子全部为重组型。

而且，在本发明的方法2中使用的G因子是重组型的合适理由与本发明的方法1中C因子和B因子适选重组型的理由相同。而且，有关可获得重组型G因子时的载体的病毒，适选杆状病毒，在杆状病毒中也优选NPV，更优选AcNPV，这与上述C因子和B因子相同。而且，有关宿主，可例举大肠杆菌源、细菌源、酵母源、昆虫源的细胞等，合适的本发明的病毒为杆状病毒，在选择所述病毒时，适选昆虫源的细胞，理由同上。

而且，所谓“以伴随由本发明的酶向CE转化的酶活性作为指标”是指定量或定性检测出现本发明的酶Pro-CE向CE转化的现象，并以其作为被检样品中的BG的存在量或存在的指示，这与本发明的方法1相同，有关“出现本发明的酶Pro-CE向CE转化的现象”的内容也与本发明的方法1公开的相同。本发明的方法2中也可适用合成显色底物X-A-Y。

在定量实施本发明的方法2时，可预先使用BG的标准品，制作表示BG量和指示强度（显色色素Y产生的显色的强度或由于溶解物的凝固导致的混浊程度等）之间关系的相关数据（典型的是校正曲线），以其为基准，以检测出的指示强度作为基础，检测被检样品中的BG。

而且本发明还提供用于实施本发明的方法2的BG检测试剂盒（以下、称为“本发明的试剂盒2”），其特征在于：其组分至少含有本发明的酶和“表现出通过与BG接触使Pro-CE转化为CE的活性的丝氨酸蛋白酶前体”。

本发明的试剂盒2，其中的“表现出通过与BG接触使Pro-CE转化为CE的活性的丝氨酸蛋白酶前体”优选为鲎来源的G因子和/或重组G因子。

而且本发明的试剂盒2中，上述G因子适选为重组型，本发明的试剂盒2的最适形式之一可例举：作为其构成含有的G因子（α、β亚单位）均为重组型的形式。也就是说，有关本发明的试剂盒2所含的级联反应蛋白质，更优选仅是本发明的酶、重组G因子。

本发明的试剂盒2中，可根据用本发明的试剂盒2实施的本发明的方法2的形式而选择用于实施本发明的方法2而使用的试剂等，例如上述合成显色底物（X-A-Y）、缓冲液、稀释液、盐、鲎的溶解物等，并包含于试剂盒的组成中。

发明的效果

由于通过使用本发明的核酸可提供对稳定，有效，大量且廉价制备具有一定品质的Pro-CE有用的本发明的病毒，因此本发明的核酸极为有用。而且，通过使用本发明的病毒可提供对稳定，有效，大量且廉价制备具有一定品质的Pro-CE有用的本发明的细胞，因此本发明的病毒极为有用。而且，通过使用本发明的细胞可稳定，有效，大量且廉价制备具有Pro-CE的活性的一定品质的蛋白质，而且由此可提供本发明的方法和本发明的试剂盒，因此极为有用。进而，通过本发明的方法和本发明的试剂盒，不用从珍贵生物资源鲎中制备溶解物，就可进行E t和BG的检测、测定，提供了对生物保护、动物代替、成本、精度、再现性等方面极为有用的方法。

附图的简要说明

图1表示Pro-CE重组病毒的目的序列N末端、C末端区域的测序分析结果。

图2表示Pro-CE表达产物的蛋白质印记结果。

图3表示在BG浓度为1ng/mL时上清部分的反应性。

图4表示在BG浓度为10ng/mL时上清部分的反应性。

图5表示由于使用DS-3GII成分的BG的反应性。

图6表示在Et浓度为10ng/mL时上清部分的反应性

图7表示在Et浓度为100ng/mL时上清部分的反应性。

图8表示在使用重组G因子（5倍稀释）时的BG的反应性。

图9表示在Et反应中需使用的重组B因子的研究结果。

图10表示在Et反应中所使用的各样品中所述反应的结果。

图11表示对在高浓度的Et存在下各因子对Boc-LGR-pNA底物的水解特性进行研究的结果。

图12表示在0～100mM之间研究硫酸镁浓度对完全重构体系的Et反应的影响的结果。

图13表示在0～10mM之间研究硫酸镁浓度对完全重构体系的Et反应的影响的结果。

图14表示在0～5mM之间研究氯化钙浓度对完全重构体系的Et反应的影响的结果。

图15表示在0～2.5mM之间研究氯化钠浓度对完全重构体系的Et反应的影响的结果。

图16表示对使用Boc-LGR-pNA和Boc-VPR-pNA作为底物时的完全重构体系的Et反应的差异进行研究的结果。

发明的最佳实施形式

以下通过本发明的最佳实施形式对本发明进行说明。

1.本发明的核酸

本发明的核酸为编码鲎来源的Pro-CE的核酸。本发明的核酸中“编码鲎来源的Pro-CE的核酸”只要是编码鲎来源的Pro-CE的核酸，则无特定限制。例如，可例示由序列号1记载的碱基序列构成的核酸（序列号2仅表示基于所述碱基序列的氨基酸序列），但如果是本领域技术人员就容易理解的是，具有由于遗传密码的简并性而导致差异的碱基序列的碱基序列所构成的核酸也包含于本发明的核酸中。

这里使用的“核酸”可以是DNA，也可以是RNA，本领域技术人员可根据其用途进行选择。例如，在更为重视稳定性时，可选择DNA。

有关这种核酸，可例示编码源于如下鲎的Pro-CE的核酸：

中国鲎（Tachypleus tridentatus），美洲鲎（LimulusPolyphemus），马来鲎（Tachypleus gigas）和圆尾鲎（Tachypleusrotundicauda）。

这其中优选编码源于中国鲎（Tachypleus tridentatus）或美洲鲎（Limulus Polyphemus）的Pro-CE的核酸，更优选编码源于中国鲎（Tachypleus tridentatus）的Pro-CE的核酸。

本发明的核酸也可化学合成，也可通过基因工程方法制备。在通过基因工程方法制备时，可按照常规方法从例如美洲鲎（LimulusPolyphemus），中国鲎（Tachypleus tridentatus），马来鲎（Tachypleusgigas）和圆尾鲎（Tachypleus rotundicauda）等鲎的血球（变形细胞）中制备出cDNA文库，使用所述文库以及例如5号序列或6中记载的人工制备的碱基序列的引物，通过PCR法，使目的DNA扩增进行制备。可通过使用凝胶电泳等基于分子量的分离方法，容易地分离PCR产物。

而且这里所谓“编码鲎来源的Pro-CE的核酸”更优选为下述（A）～（C）的核酸。

（A）编码含有序列号4所示氨基酸序列的蛋白质的DNA、

（C）由上述（A）或（B）的DNA转录得到的RNA。

这里所谓“编码含有序列号4所示氨基酸序列的蛋白质的DNA”是编码源于中国鲎（Tachypleus tridentatus）的Pro-CE的DNA。

而且在天然存在的蛋白质中，由于编码其的DNA的多态性或变异可导致氨基酸序列中发生氨基酸的取代，缺失，插入或移位等变异，此外由于生成后的蛋白质在细胞内和纯化中的修饰反应等可发生氨基酸的磷酸化，糖基化，脂质添加，脯氨酸的羟化等翻译后修饰，尽管如此，但也存在与没有变异的蛋白质呈现基本等同的生理、生物学活性的变异蛋白质。这样，即使对于“由（A）的DNA编码的蛋白质”存在若干差异，却没有发现其功能有大的差异的“由（B）的DNA编码的蛋白质”可认为与“由（A）的DNA编码的蛋白质”基本上相同。即使在人为地在蛋白质的氨基酸序列中导入如上所述变异时也是一样，此时还可制备出各种各样的变异体。例如，已知将人白细胞介素2（IL-2）的氨基酸序列中的某个半胱氨酸残基取代为丝氨酸的多肽仍然保持白细胞介素2的活性（Science,224,1431（1984））。这种“具有变异的蛋白质”可通过“位点特异性突变”等公知方法制成。而且，已知某些种类的蛋白质具有对于活性非必需的肽区域。例如，存在于被分泌到细胞外的蛋白质中的信号肽或可在蛋白酶的前体等中发现的前序列等与其相当，大部分这些区域在翻译后或向活性蛋白质转换时被除去。这种蛋白质是以在一级结构上不同的形态存在，但最终具有与“由（A）的DNA编码的蛋白质”基本等同功能的蛋白质。上述“由（B）的DNA编码的蛋白质”就是为了定义这类蛋白质。

而且，本申请文件中所谓“多个氨基酸”表示在不丧失所述蛋白质的活性的范围内可发生变异的氨基酸的数目，例如，为含有600个氨基酸残基的蛋白质时，表示2～30个左右，优选2～15，更优选2～8个。

由（B）的DNA编码的蛋白质具有鲎来源的Pro-CE的活性。Pro-CE的活性，可通过使所述Pro-CE、合成底物（例如叔丁氧羰基-亮氨酰-甘氨酰-精氨酸-pNA（Boc-Leu-Gly-Arg-pNA））、Et、C因子和B因子共存来研究其反应性，从而进行确认。具体而言，如果所述Pro-CE具有活性，由于通过使所述Pro-CE、合成底物、Et、C因子共存，pNA逐渐游离，因此通过对所述pNA的生成量进行吸光度测定可检测了解。具体的方法请参照实施例2。

这里使用的所谓“共存”只要是所共存物质达到相互接触的状态，则无特定限制。具体是指使之与这些所述Pro-CE，合成底物，Et，C因子和B因子相接触，或达到与所述Pro-CE，合成底物，BG和G因子相互接触的状态。

而且这里所用的“反应”是指：通过使所述Pro-CE与合成底物共存，所述Pro-CE转化为CE，作用于合成底物，通过水解所述酰胺键游离pNA的反应。

而且，有关前述（A）的编码“含有序列号4所示氨基酸序列的蛋白质”的DNA，可例示由序列号3中1～1143号碱基所示的碱基序列定义的DNA。而且还可使用登录于GenBank的登录号为No.D161657的DNA。

而且，有关前述（B）的编码“含有序列号4所示氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、取代、插入或移位了的氨基酸序列且具有鲎来源的凝固酶原活性的蛋白质”的DNA，可例示例如前述（A）的DNA或与所述DNA互补的DNA或与这些DNA在严紧条件下杂交的DNA。

这里所谓“严紧条件”是指所谓形成特异性杂交体，不形成非特异性的杂交体的条件（Sambrook,J.et al.,Molecular Cloning ALaboratory Manual,second Edition,Cold Spring HarborLaboratory Press（1989）等参照）。有关“严紧条件”，具体可例举在含有50%甲酰胺、4×SSC、50mM HEPES（pH7.0）、10×Denhardt'ssolution、100μg/ml鲑鱼精子DNA的溶液中，于42℃下使之杂交，然后在室温下用2×SSC、0.1%SDS溶液、50℃下用0.1×SSC、0.1%SDS溶液进行清洗的条件。

有关本发明的核酸，还优选再与编码标记肽等的DNA相连。作为标记肽，可例举例如蛋白质A、胰岛素信号序列、Hi s-标签、FLAG、CBP（钙调蛋白（calmodulin）结合蛋白）、GST（谷胱甘肽-S-转移酶）等。而且，本发明的核酸中还包括由上述（A）或（B）的DNA转录得到的RNA。

本发明的核酸可在例如后述“本发明的病毒”的制备中使用，进而还可在本发明的细胞等的制备中利用。

2.本发明的病毒

本发明的病毒为含有本发明的核酸的病毒。

对本发明的核酸的说明如前所述。

本发明的病毒中的所谓“含有核酸”，只要含有所述核酸即可，再含有其它碱基或核酸也无妨。因此，不仅可含有例如所述核酸，还可再含有编码标记肽等的核酸等。

例如，本发明的病毒还包含含有与“上述本发明的核酸中的（A）或（B）的DNA”和“编码标记肽等的DNA”相连接的DNA的载体。所含有的核酸若设计成这样，则存在着其可作为与标记肽等的融合蛋白表达，可容易地进行所述表达蛋白质的纯化，检测和分析等这样的优点。有关标记肽，可例举例如蛋白质A、胰岛素信号序列、His-标签、FLAG、CBP（钙调蛋白结合蛋白）、GST（谷胱甘肽-S-转移酶）等。例如，与蛋白质A的融合蛋白可通过使用结合了IgG的固定相的亲合层析简便地进行纯化。同样，就与His标签的融合蛋白来说，可使用结合了磁性镍的固定相，就与FLAG的融合蛋白来说，可使用结合了抗FLAG抗体的固定相。另外，与胰岛素信号的融合蛋白由于被分泌到细胞外（培养基等），因此无需进行细胞破碎等提取操作。

对本发明的病毒的制备方法无特定限制。制备本发明的病毒的方法的其中一例如下所示。更具体的方法请参照实施例。

首先，制备编码鲎来源的Pro-CE的核酸。所述核酸为前述（A）的DNA时，首先制备编码“含有序列号4所示氨基酸序列的蛋白质”的DNA。而在使用前述（B）的DNA时，首先制备编码“含有序列号4所示氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、取代、插入或移位了的氨基酸序列且具有鲎来源的凝固酶原活性的蛋白质”的DNA。所述DNA只要是编码各个指定蛋白质的DNA，则无特定限制。有关这些DNA，由于遗传密码简并而存在各种不同的碱基序列，可使用含有其中任一种碱基序列的DNA。

通过将这种核酸导入病毒，可制备本发明的病毒。

导入这种核酸的病毒只要是可在基因转染中使用的病毒，则无特定限制。尤其优选杆状病毒。其中也优选NPV。NPV只要是被分类为NPV的病毒，则无特定限制，例如可使用AcNPV、蚕NPV（Bombyx moriNPV、BmNPV）等。尤其优选AcNPV。

向病毒导入核酸可通过使用转移载体的同源重组进行。对转移载体的种类无特定限制，可例示例如pPSC8（プロテインサイエンス社）、pFastBac（インビトロジェン社）、pVL1393（ファーミンジェン社）等，其中优选pPSC8。这些转移载体还可使用市售品。

对使用转移载体的同源重组方法无特定限制。其具体一例请参照实施例。

含有前述（A）或（B）的DNA的病毒是否被制备出来，可通过例如分析制备出的病毒的碱基序列，研究是否含有编码鲎来源的Pro-CE的DNA，由所制备的病毒表达的蛋白质是否具有鲎来源的Pro-CE的氨基酸序列，由所制备的病毒表达的蛋白质是否具有Pro-CE的活性等进行确认。

本发明的病毒在可在例如后述“本发明的细胞”的制备中使用，进而还可在本发明的方法等中利用。

3.本发明的细胞

本发明的细胞是携带本发明的病毒的细胞。

对“本发明的病毒”的说明如前所述。

这里所用的“细胞”只要是本发明的病毒可感染且可表达本发明的病毒所含有的鲎来源的Pro-CE的细胞即可。有关其中一例，可例举源于昆虫的细胞。而且，有关源于昆虫的细胞，可例示Sf9细胞。

对使细胞携带本发明的病毒的方法并无特定限制，例如在使用NPV作为病毒时，仅使本发明的病毒与细胞相接触，即可使本发明的病毒感染所述细胞，从而使所述细胞携带本发明的病毒。其具体方法的其中一例请参照后述实施例。

本发明的细胞由于具有制备鲎来源的Pro-CE的能力，因此以这些性质作为指标，选择本发明的细胞。

本发明的细胞可利用于例如后述本发明的制备方法等中。

4.本发明的制备方法

本发明的制备方法是鲎来源的Pro-CE的制备方法，其至少包括使本发明的细胞生长，并从其生长物中回收鲎来源的Pro-CE的步骤。

“本发明的细胞”如前所述。

本申请文件中所谓“生长”是包括转化细胞的增殖、嵌合了转化细胞的动物、昆虫等的生长的概念。而且，这里所谓“生长产物”是包括使转化细胞生长后的培养基（培养液上清），经培养的细胞自身，来自嵌合了细胞的动物、昆虫等中的分泌物、排出物等的概念。

生长条件（培养基和培养条件等）只要是可使本发明的细胞生长，使鲎来源的Pro-CE得以制备的条件，则无特定限制，可根据所使用的载体和细胞等进行适当选择。例如，有关培养温度，可例示20～40℃左右。

本发明的细胞的生长时间，还可根据所使用的本发明的细胞的量，所希望的Pro-CE的产量，其它的生长条件等适当调节。

从生长物中回收鲎来源的Pro-CE的方法可由本领域技术人员，根据生长物的种类，从一般的方法中适当选择并使用。

例如、Pro-CE以被分泌于培养基（培养液上清）中的可溶性形态产生时，可回收培养基，直接使用。而且，当Pro-CE以被分泌到细胞质中的可溶性形态或不溶性（膜结合性）形态产生时，通过使用氮气蚀装置的方法、均质化、玻璃珠粉碎法、声波处理、渗透压休克法、冻融法等通过细胞破碎进行的提取、表面活性剂提取、或它们的组合等处理操作，可提取这些Pro-CE，其提取物可直接作为Pro-CE使用。

本发明的制备方法只要至少含有“使本发明的细胞生长，并从其生长物中回收鲎来源的Pro-CE的步骤”即可，但也可再含有其它步骤。例如，还可包括对所回收的Pro-CE再进行纯化的步骤。纯化可以是不完全纯化（部分纯化），也可是完全纯化，可根据Pro-CE的使用目的等适当选择。

有关纯化方法，可具体例举例如通过使用硫酸铵或硫酸钠等进行的盐析、离心分离、透析、超滤法、吸附层析、离子交换层析、疏水性层析、逆相层析、凝胶过滤法、凝胶浸透层析、亲合层析、电泳法等，或它们的组合等处理操作。

所制备的蛋白质是否由Pro-CE构成，是否保持鲎来源的Pro-CE的活性等，通过分析所回收的蛋白质的氨基酸序列，分子量，电泳结果，使用与Pro-CE特异性反应的抗体的蛋白质印记等可确认。

如果根据本发明的方法，可极为有效地制备保持Pro-CE活性的蛋白质。

5.本发明的酶

本发明的酶是通过本发明的制备方法制备的Pro-CE。

“本发明的制备方法”如前所述。

本发明的酶可在后述本发明的方法1等中使用。

6.本发明的方法1

本发明的方法1是一种灵敏的Et检测方法，其特征在于：使待检Et的被检样品与本发明的酶和“表现出通过与Et接触而使Pro-CE转化为CE的活性的丝氨酸蛋白酶前体”共存，以伴随本发明的酶转化为CE的酶活性作为指标，对所述样品中的Et进行检测。

“本发明的酶”如前所述。

这里所用的所谓“共存”只要是所共存物质达到相互接触的状态，则无特定限制。

例如，只要可使这些本发明的酶、待检Et的被检样品和“表现出通过与Et接触而使Pro-CE转化为CE的活性的丝氨酸蛋白酶前体”达到相互接触的状态，则无特定限制，可使之共存于溶液中，使Pro-CE或表现出通过与Et接触使Pro-CE转化为CE的活性的丝氨酸蛋白酶前体附着于适当的固定相上，使之与前述“表现出通过与Et接触而使Pro-CE转化为CE的活性的丝氨酸蛋白酶前体”或Pro-CE接触。

而且，本发明的方法1中，“表现出通过与E t接触而使Pro-CE转化为CE的活性的丝氨酸蛋白酶前体”优选为“表现出通过与活性C因子接触而使Pro-CE转化为CE的活性的丝氨酸蛋白酶前体”和“鲎来源的C因子和/或重组C因子”。

所述“表现出通过与活性C因子接触而使Pro-CE转化为CE的活性的丝氨酸蛋白酶前体”还优选为鲎来源的B因子和/或重组B因子。

可在本发明的方法1中使用的“C因子”和“B因子”只要保持其功能，则无特定限制。例如，可使用通过层析等纯化源于中国鲎（Tachypleus tridentatus）、美洲鲎（Limulus Polyphemus）、马来鲎（Tachypleus gigas）和圆尾鲎（Tachypleus rotundicauda）这4种鲎中的任一种的溶解物而获得的天然的C因子成分、B因子成分，也可使用重组C因子、B因子。天然的C因子、B因子，可用结合了硫酸葡聚糖、硫代丙基等的载体或特异性吸附载体等处理溶解物，从而获得C因子、B因子的成分。而且，就重组体而言，由于例如中国鲎（Tachypleus tridentatus）和圆尾鲎（Tachypleusrotundicauda）源的天然C因子的氨基酸序列是公知的，因此可适于基于这些序列制备。对所述方法无特定限制，例如可用如下方法获得。可合成在C末端添加了His-标签的C因子的目的碱基序列，导入转移载体（例如pPSC8、タカラバイオ社制造）中，将获得的表达载体（Factor C/pPSC8）DNA与杆状病毒（AcNPV）DNA共转染到Sf9细胞中，对从培养上清获得的病毒液进行纯化，再通过扩增制备。B因子也可用同样的方法获得。C因子和B因子，它们的氨基酸序列和其编码基因都是已知的（C因子有市售，在后述实施例中公开了所述市售品。序列号15表示B因子基因的碱基序列。B因子的氨基酸序列示于序列号16），这些因子的重组体可基于这些序列信息，用与上述本发明的酶基本相同的步骤制备。而且，只要是本领域技术人员就容易理解具有由于遗传密码的简并而导致的公知的C因子的碱基序列与序列号15不同的碱基序列的碱基序列，在基于其制备的蛋白质具有C因子或B因子原来的作用的范围内，其可以是本发明中可使用的C因子和B因子。

有关使重构体系运作的条件，可例举无需经过昆虫细胞（作为反应的场所提供），而在无细胞的体系中，为了至少顺利地推进级联反应的起动、丝氨酸蛋白酶前体的逐级活化和CE的反应，优选进行一定加热，和以碱土类金属（钙、锶、钡、铍、镁等）、碱金属（锂、钠、钾等）为代表的金属离子共存等。

本发明的方法1中，有关级联反应蛋白质，更优选仅使本发明的酶、重组C因子和重组B因子共存。

本说明书中使用的所谓“级联反应”是指以下反应“1.”和/或“2.”；

1.在溶解物中加入Et，存在于溶解物中的C因子（Et感受性因子、分子量123，000）被活化，生成的活性C因子通过对B因子（分子量64，000）的特定位点限制性水解从而生成活性B因子，活性B因子通过使Pro-CE（分子量54，000）活化而转化为CE，CE通过对凝固蛋白原（凝固蛋白、分子量19，723）的由二硫键桥连的环内的特定位点，即…Arg¹⁸-Thr¹⁹…之间和…Arg⁴⁶-Gly⁴⁷…之间进行限制性水解，将H-Thr¹⁹…Arg⁴⁶-OH所示的肽C（氨基酸28残基）游离，同时将其余部分转化为凝固蛋白凝胶的一系列反应。

2.若在溶解物中加入BG，存在于溶解物中的G因子（BG感受性因子）被活化，活性G因子使Pro-CE得以活化，从而转化为CE，对凝固蛋白原的由二硫键桥连的环内的特定位点进行限制性水解，从而生成凝固蛋白凝胶的一系列反应。

而且所谓“级联反应蛋白质”是指构成“级联反应”的蛋白质。是指丝氨酸蛋白酶前体（C因子、B因子、G因子和Pro-CE），具体在上述级联反应“1.”中是指C因子、B因子和Pro-CE，在“2.”中是指G因子和Pro-CE。

而且根据后述实施例可知，可在本发明的方法1中使用的通过基因工程方法获得的各凝固因子其来源可不同。例如，还可通过包括使本发明的酶、圆尾鲎（Tachypleus rotundicauda）源的C因子和美洲鲎（Limulus Polyphemus）源的B因子共存的步骤来检测Et。

本发明的方法1可通过使用后述本发明的试剂盒1简便地实施。

7.本发明的试剂盒1

而且，本发明的试剂盒1是用于实施本发明的方法1的Et检测试剂盒，其特征在于：其组分至少含有本发明的酶和“表现出通过与Et接触而使Pro-CE转化为CE的活性的丝氨酸蛋白酶前体”。

“本发明的酶”如前所述。

而且，所述“表现出通过与活性C因子接触而使Pro-CE转化为CE的活性的丝氨酸蛋白酶前体”优选为鲎来源的B因子和/或重组B因子。

而且本发明的试剂盒1优选仅由作为级联反应蛋白质的本发明的酶，重组C因子和重组B因子构成。

本领域技术人员也可基于本发明的方法1适当利用本发明的试剂盒1。

在本发明的试剂盒1中使用的“C因子”，“B因子”和“级联反应”等用语的意思等与本发明的方法1中所使用的相同。并且如前所述，为了实施本发明的方法1所使用的试剂等，例如上述合成显色底物（X-A-Y）、缓冲液、稀释液、盐、鲎的溶解物等，可根据通过本发明的试剂盒1实施的本发明的方法1的形式进行选择，并包含于试剂盒的组成中。

8.本发明的方法2

而且本发明的方法2是BG检测方法，其特征在于：使待检BG的被检样品与本发明的酶和“表现出通过与BG接触使Pro-CE转化为CE的活性的丝氨酸蛋白酶前体”共存，以伴随本发明的酶转化为凝固酶的酶活性作为指标，对所述样品中的BG进行检测。

“本发明的酶”如前所述。

本发明的方法2的“表现出通过与BG接触使Pro-CE转化为CE的活性的丝氨酸蛋白酶前体”优选为鲎来源的G因子和/或重组G因子。

可在本发明的方法2中使用的“G因子”只要保持着其功能，则无特定限制。例如，还可使用通过层析等对源于4种鲎的任一种的溶解物进行纯化而获得的天然G因子成分，还可使用重组G因子。而且，就重组体G因子而言，G因子是由α亚单位和β亚单位构成的蛋白质，可按下述流程制备。

首先制备编码鲎来源的G因子的α亚单位的DNA。有关所述DNA，可例示例如登录于GenBank的登录号为No.16622的DNA（17号序列，氨基酸序列为18号序列）。用BamHI/HindIII处理所述DNA，回收含有目的基因序列的DNA片段。对所述样品进行平滑末端化处理后，与用NruI处理的pPSC8（转移载体）相混合，进行连接反应。然后用连接产物转化大肠杆菌（E.coli）JM109，获得转化细胞。纯化确认了目的大小片段的质粒。用筛选出的表达载体（G因子-α/pPSC8）DNA和杆状病毒（AcNPV）DNA共转染Sf9细胞。然后，从所述培养液上清中纯化获得的病毒液，再进行扩增。使所述病毒液感染expres SF+细胞，通过对培养液离心分离，获得上清部分和沉淀部分。可从这些成分中获得G因子的α亚单位。而且，对于β亚单位而言，可通过在获得α亚单位的方法中，将使用的DNA取代为编码鲎来源的G因子的β单位的DNA来获得。而且，有关编码β单位的DNA，还可使用例如登录于GenBank的登录号为No.16623（19号序列）的碱基序列或其氨基酸序列（20号序列）。而且，如果是本领域技术人员则容易理解的是具有由于遗传密码的简并而导致的与序列号16和17不同的碱基序列的碱基序列，在基于其制备的蛋白质具有G因子原来的作用的范围内，可以是本发明中可使用的G因子。

有关使重构体系运作的条件，可例举无需经过昆虫细胞（作为反应的场所提供），在无细胞的体系中，为了至少顺利地推进级联反应的起动、丝氨酸蛋白酶前体的逐级活化和CE的反应，优选进行一定加热，和碱土类、碱金属等金属离子共存等。

而且本发明的方法2更优选仅使作为级联反应蛋白质的本发明的酶和重组G因子共存。而且，与本发明的方法1一样，可使用来源相同的本发明的酶和重组G因子，也可组合不同来源的酶。

本发明的方法2中使用的“共存”、“级联反应”、“级联反应蛋白质”等用语的意思与本发明的方法1中所使用的相同。

本发明的方法2可在后述本发明的试剂盒2中利用。

9.本发明的试剂盒2

而且本发明的试剂盒2是用于实施本发明的方法2的BG检测试剂盒，其特征在于：其组分至少含有本发明的酶和“表现出通过与BG接触使Pro-CE转化为CE的活性的丝氨酸蛋白酶前体”。

“本发明的酶”如前所述。

本发明的试剂盒2中的“表现出通过与BG接触使Pro-CE转化为CE的活性的丝氨酸蛋白酶”优选为鲎来源的G因子和/或重组G因子。

所述G因子为重组型更合适，有关本发明的试剂盒2的最适形式之一，可例示作为其构成而含有的G因子均为重组型的形式。即，有关包含于本发明的试剂盒2中的级联反应蛋白质，更优选仅是本发明的酶、重组G因子。

本领域技术人员也可基于本发明的方法2适当利用本发明的试剂盒2。

本发明的试剂盒2中使用的“G因子”与本发明的方法2中所使用的含义相同。而且，“级联反应”“级联反应蛋白质”与本发明的方法1中所使用的含义相同。而且，如前所述，为了实施本发明的方法2所使用的试剂等，例如上述合成显色底物（X-A-Y）、缓冲液、稀释液、盐、鲎的溶解物等，可根据通过本发明的试剂盒2实施的本发明的方法2的形式进行选择，并包含于试剂盒的组成中。

实施例

以下通过实施例更具体说明本发明。

实施例1.使用昆虫细胞的Pro-CE的表达

在转移载体（pPSC8）中导入序列号3所示的cDNA（在序列号3的1～1125所示的碱基序列的C末端上添加了His-标签序列）（由九州大学大学院医学研究院分子细胞生化学领域（现在，东北大学大学院生命科学研究科）的牟田達史博士赠与。所述cDNA是按前述非专利文献2中记载的方法制备的），筛选具有指定碱基序列的克隆。用筛选出的表达载体（PC/pPSC8）DNA和杆状病毒（AcNPV）DNA共转染Sf9细胞。从所述培养液上清中纯化获得的病毒液，再进行扩增。从感染了杆状病毒的细胞中提取病毒DNA，再进行测序分析。使获得的病毒液感染昆虫细胞expresSF＋（注册商标；プロテイン·サイエンス（Protein Science）社制造），使用蛋白质印记分析表达产物。以下，对这些步骤进行详细说明。

1.表达载体的构建

向0.2mL的离心管中加入PC/pUC118（20ng/μg）1μL，2.5mM dNTP12μL、KOD缓冲液#15μL，25mM氯化镁溶液2μL，PC-F、PC-R（4pmol/μL）各2.5μL，KOD DNA聚合酶（東洋紡社制造）1μL和24μL灭菌的纯水，并搅拌，进行PCR。在确认含有目的基因后，用TE缓冲液使总量达到16μL。在获得的PCR产物中加入100mM ATP 1μL、10×Buffer 1μL和T4多核苷酸激酶（タカラバイオ株式会社制造），于37℃温育30分钟。纯化PCR产物后，与经Sma I处理的pPSC12相混合，进行连接反应。用连接产物转化大肠杆菌（E.coli）JM109，获得了转化细胞（PC/pPSC12）。用XbaI/BglII消化PC/pPSC12，回收含有目的基因的片段。将获得的片段与用相同的酶处理的pPSC8相混合，进行连接反应。用连接产物转化大肠杆菌（E.coli）JM109，获得了转化细胞。对确认了目的大小片段的质粒进行纯化，确认其序列。在序列分析时，使用以下引物和ABI Prism Big Dye Terminator CycleSequencing Kit Ver.3（Applied Biosystems社），在分析时使用自动测序仪ABI Prism 310 Genetic Analyzer（Applied Biosystems社）。引物序列示于序列表的5～10号序列。

序列号5：PC-F

序列号6：PC-R

序列号7：PSC2

序列号8：PSC4

序列号9：PC 453/472-F

序列号10：PC 683/664-R

将确认插入了目的基因的克隆接种于含有50μg/mL氨苄青霉素的100mL的LB培养基中，于30℃过夜培养。回收增殖的菌体，按照Plasmid Midi Kit（QIAGEN社制造）的操作手册纯化质粒。

2.共转染

在接种于25cm²烧瓶中的1.0×10⁶个Sf9细胞中加入2.3μg含有编码Pro-CE的cDNA的表达载体，85ng线性AcNPV DNA和含有5μLLIPOFECTIN Reagent（Invitrogen社制造）的无血清Sf-900II培养基（Invitrogen社制造）200μL。于28℃静置6小时后，加入无血清Sf-900II培养基使得培养液量达到5mL。再于28℃培养5天后，回收培养上清，并作为共转染溶液。

3.重组病毒的纯化

重组病毒的纯化用溶菌斑测试法进行。具体的方法如下。

将2.0×10⁶个Sf9细胞接种于直径为60mM的平皿中，于28℃静置1小时，使细胞附着于底面上。用无血清Sf-900II培养基将前述共转染溶液稀释至10⁴、10⁵、10⁶和10⁷倍，将1mL等份的这些溶液加入细胞，于室温下平稳振荡1小时。然后，除去平皿上清（病毒液），灌入含有0.5% SeaKemGTG琼脂糖（BMA社制造）的无血清Sf-900II培养基4mL，于28℃静置培养8天。在每个培养基中挑取6个不存在多角体（Polyhedra）的感染的昆虫细胞的溶菌斑，各悬浮于1mL的无血清Sf-900II培养基中，作为病毒原液。

4.重组病毒的增殖

然后，进行重组病毒的增殖（重组病毒液的制作）。具体方法如下。

在接种于25cm²烧瓶中的2.0×10⁶个Sf9细胞中等份加入0.5mL上述病毒原液，于28℃静置培养1小时。加入无血清Sf-900II培养基使得培养液量达到5mL，静置培养3天，作为第1代病毒液。

在接种于75cm²烧瓶中的6.0×10⁶个Sf9细胞中全量加入第1代病毒液，于28℃静置培养1小时。然后，加入10mL无血清Sf-900II培养基，再培养3天。培养后，回收培养上清，于3，000×g、4℃离心15分钟，分成上清和沉淀两部分。回收所述培养上清，作为第2代病毒液。

5.重组病毒液的制作

用无血清Sf-900II培养基将处于对数生长期的培养中的昆虫细胞expresSF＋稀释成1.5×10⁶个/mL的50mL于125mL的三角烧瓶中。在其中加入0.5mL上述第2代病毒液，于130rpm，于28℃振荡培养3天。培养后，于10，000×g、4℃下将培养液离心30分钟，分成上清和沉淀两部分。回收所述培养上清，作为第3代病毒液。

6.基因插入确认

然后，确认DNA插入细胞。具体方法如下。

将如上所述回收的第3代病毒液0.7mL加入1.5mL离心管中，加入等量的20%聚乙二醇，1M氯化钠溶液，充分混合，静置1小时。然后，于10，000×g离心分离10分钟，分成上清和沉淀两部分。回收所述沉淀，按照QIAamp DNA Miki Kit（QIAGEN社制造）的操作手册溶解于180μL Buffer ALT中，提取病毒DNA。以提取的病毒DNA作为模板，用以下的引物，如下述进行PCR。

序列号11：PSC N3F

序列号12：PSC N3R

在0.2mL的离心管中加入1μL上述病毒DNA，5μL KOD Plus的10×PCR缓冲液，5μL 2mM dNTPs，2μL 25mM硫酸镁溶液，PSCN3F和PSCN3R引物（4pmol/mL）各3.75μL，1μL KOD-Plus-DNA聚合酶（东洋纺社制造）和19.5μL灭菌的纯水，充分搅拌。用所述溶液，通过重复进行30个“于94℃下1分钟，于58℃下1分钟，于72℃下4分钟”这样的循环，进行PCR。

用琼脂糖凝胶对10μL的PCR产物进行电泳，确认了扩增片段的长度。对获得了目的长度片段的PCR产物进行纯化，确定N末端侧和C末端侧的序列。使用与前述“1.”相同的试剂和仪器进行测序分析，使用如下引物。引物序列示于序列表的13号和14序列。

序列号13：PSCNF2

序列号14：PSC3

7.滴度测定

将2.0×10⁶个Sf9细胞接种于直径为60mM的平皿中，于28℃静置1小时，使细胞附着于底面上后，除去培养液。用无血清Sf-900II培养基将第3代病毒液稀释至10⁵、10⁶、10⁷和10⁸倍，在平皿中等份加入1mL这些溶液，于室温下平稳振荡1小时。然后，去掉平皿上清（病毒液），灌入4mL含有0.5%SeaKemGTG琼脂糖（BMA社制造）的无血清Sf-900II培养基，于28℃静置培养7天。对每个培养基中所观察到的溶菌斑进行计数，得出滴度。

8.表达实验

用无血清Sf-900II培养基将昆虫细胞expresSF＋稀释成1.5×10⁶个/mL，以每瓶100mL分装到9个250mL的三角烧瓶中。向其中加入第3代病毒液使得分别达到MOI=0.2、1、5（各3瓶）于130rpm，28℃下分别振荡培养48、72、96小时。培养后，将培养液于3，000×g、4℃下离心20分钟，分成沉淀和上清两部分。

9.表达产物的确定

对前述“8.”中回收的样品，按照常规方法进行SDS-PAGE。通过半干印记法将蛋白质转到杂交膜上，在以下条件下进行蛋白质印记。而且，整合到病毒中的“编码Pro-CE的DNA”被设计成以结合了His-标签的形式表达。

样品的处理：对于上清，加入Laemmli样品缓冲液（BIO-RAD社制造），于99℃热处理3分钟。对于沉淀，在相当于200μL的沉淀中加入400μL的PBS悬浮后，加入Laemmli样品缓冲液，于99℃热处理3分钟。

样品用量：20μL/泳道。

SDS-PAGE凝胶浓度：使用10～20%凝胶（BIO-RAD社制造）。

SDS-PAGE凝胶通电150V、CV。

杂交膜：使用PVDF。

杂交通电：15V、CV、30分钟。

一级抗体：使用五组氨酸抗体（Penta、His Antibody）（QIAGEN社制造）。

二级抗体：使用山羊抗小鼠IgG（H+L)-HRP缀合物（BIO-RAD社制造）。

检测：使用免疫印迹荧光素HRP底物（Milipore社制造）。

10.结果

重组病毒的目的序列的测序分析结果示于图1。上半部分表示分析结果，下半部分表示Pro-CE的序列。由此清楚了重组病毒中Pro-CE的N末端，C末端的序列一致。由此确认了重组病毒中存在编码Pro-CE的DNA的碱基序列。

而且，滴度测定的结果为0.7×10⁸pfu/mL。

前述“9.”的结果是，在目的位置（约40kDa附近）确认了与抗His-标签抗体反应的条带（图2）。图2的M为分子量标记，48，72，96分别表示48小时感染区、72小时感染区、96小时感染区，S表示未感染病毒区，A表示野生型病毒感染区。由此确认了Pro-CE的表达。

实施例2.重组Pro-CE的活性确定

用无血清Sf-900II培养基将昆虫细胞expresSF＋稀释成1.5×10⁶个/mL，以每瓶100mL分装到9个250mL的三角烧瓶中。向其中加入第3代病毒液使得分别达到MOI=0.2、1、5（各3瓶），于130rpm、28℃下分别振荡培养48、72、96小时。培养后，于3，000×g、4℃下将培养液离心20分钟，分成沉淀和上清两部分。将上清冷冻保存。

样品1：MOI=0.2，48小时

样品2：MOI=0.2，72小时

样品3：MOI=0.2，96小时

样品4：MOI=1，48小时

样品5：MOI=1，72小时

样品6：MOI=1，96小时

样品7：MOI=5，48小时

样品8：MOI=5，72小时

样品9：MOI=5，96小时

样品10：未感染病毒细胞

样品11：野生型病毒感染细胞

（试剂）

DS-3GII成分：源于鲎血球提取液的G因子（通过硫酸葡聚糖Sepharose CL-6B（以下DS-Sepharose）获得的成分纯化产物）

DS-10AII成分：源于鲎血球提取液的Pro-CE（DS-Sepharose纯化产物）

BG：用蒸馏水1.495mL溶解CSBG（1495ng/vial）后，进行10倍连续稀释。

1.使用上清部分和G因子的BG浓度为1～100ng/mL下的反应性

首先，对上述9个样品的上清，研究所表达的蛋白质是否保持着Pro-CE的活性。

用含有150mM NaCl的50mL Tris-HCl缓冲液（pH7.5）将培养后的上清部分各稀释10倍。在所述稀释物（各25μL）中加入DS-3GII成分（25μL）、葡聚糖（终浓度2.4%），Tris-HCl缓冲液（pH8.0）（终浓度80mM），MgSO₄（终浓度64mM），CaCl₂（终浓度0.4mM），Na₂SO₄（终浓度8mM），注射用蒸馏水（15μL），Boc-Leu-Gly-Arg-pNA底物（参照前述专利文献1）（终浓度0.24mM）和25μL BG溶液（0、1、10、100ng/mL），总容量达到125μL，然后移至Wellreader SK603中，于37℃下使之反应2小时后，自动测定405nm波长（对照波长492nm）下的吸光度。而且，作为阳性对照，使用DS-10AII成分。做两次平行实验，计算出吸光度的平均值。其结果示于图3，4和表1中。

表1

如表1所示，样品1～9的病毒感染细胞的培养上清中存在几乎相同量的所述酶，在所有的成分中确认了Pro-CE的表达。尤其是，样品2呈现强活性。

而且，表2和图5比较了上述样品2的重组Pro-CE和DS-10AII成分的活性。

表2

根据这些结果，确认了所述重组Pro-CE具有与鲎血球提取液来源的Pro-CE几乎等同的活性。

2.使用了上清部分和B和C因子的Et浓度为1～100ng/mL下的反应性

向在上述“1.”中获得的稀释物中加入所述重组Pro-CE和Pro-CE的洗脱成分DS10-AII成分（阳性对照），以及代替B和C因子的B和C因子的洗脱成分DS-12BCI成分（25μL）和Et。加入的Et浓度分别为0、1、10、100ng/mL。就其它的反应混合物而言，加入相同的浓度和量，总容量为125μL，转移到Wellreader SK603内，于37℃下反应30分钟后，自动测定了405nm波长（对照波长492nm）下的吸光度。做两次平行实验，计算出吸光度的平均值。其结果示于图6、7和表3。

表3

端点测定端点测定

如表3所示，在所有的样品的病毒感染细胞的培养上清中可确认存在所述Pro-CE。尤其是，样品2呈现出强活性。

实施例3.由重组Pro-CE和重组G因子构成的完全重构体系的活性表达的确认

（试剂）

（1）重组G因子（α亚单位：β亚单位=2:1的培养上清）

（2）重组Pro-CE（实施例2的样品2的培养上清）

（3）用1.495mL蒸馏水溶解BG:CSBG（1495ng/vial）后，进行10倍连续稀释。

用含有150mM NaCl的50mL Tris-HCl缓冲液（pH7.5）将按照特开2006－271384号公报（专利文献2）中公开的方法制备的（1）和（2）的培养上清各稀释5倍。在这里使用2序列号1所示序列的DNA作为编码G因子的α亚单位的DNA。向经稀释的重组G因子（25μL）中加入重组Pro-CE（25μL）、Tris-HCl缓冲液（pH8.0）（终浓度80mM）、MgSO4（终浓度64mM）、CaCl₂（终浓度0.4mM）、Na₂SO₄（终浓度8mM）、注射用蒸馏水（15μL）、葡聚糖（终浓度2.4%）、Boc-Leu-Gly-Arg-pNA底物（终浓度0.24mM）和25μL BG溶液（0、1、10ng/mL），总容量达到125μL，转移到Wellreader SK603内，通过常规方法使之反应后，自动测定了405nm波长（对照波长492nm）下的吸光度。做两次平行实验，计算出吸光度的平均值。其结果示于表4和图8。

表4

端点测定

根据这些结果，通过组合重组G因子和重组Pro-CE，确认了与溶解物中的各因子（天然LAL因子）一样通过BG进行的反应以浓度依赖性进行，与天然的LAL因子一样活性表达。

实施例4.通过使用由重组Pro-CE、重组B因子和重组C因子构成的完全重构体系进行的Et反应的确认

合成在B因子的C末端侧添加了His-标签序列的B因子的表达目的碱基序列，导入转移载体（pPSC8）。用获得的表达载体（B因子/pPSC8）DNA和杆状病毒（AcNPV）DNA共转染Sf9细胞，从其培养液上清纯化获得的病毒液，并进行扩增。从病毒液中提取病毒DNA，进行碱基序列的分析，确认了整合基因的N末端和C末端，及其各序列。使获得的重组病毒以MOI=0.02、0.1和0.5感染相当于100mL培养液的expresSF＋细胞，在48、72和96小时后，回收培养上清和沉淀。对回收的表达产物，通过使用抗His-标签抗体的蛋白质印记确认表达。进而，在本因子和重组C因子（PyroGene、ケンブレックス社制造）以及重组ProCE的共存下，加入Et（0、0.01，0.1，1，10，100μg/ml），使之于37℃反应1小时，根据pro-CE的合成底物（Boc-Leu-Gly-Arg-pNA）的水解能确认ProCE的活化（CE的生成）。

进行与实施例1相同的实验，确认重组B因子的活性后，对Et反应性进行研究时，MOI=0.1、96小时的条件下Et反应性最高，因此在C体系的级联的重构时使用了所述条件（表5，图9）。

而且，为了确认组合不同鲎来源的各因子时是否促进级联反应，使用市售的PyroGene（ケンブレックス社制造）的组合物形式的重组C因子（圆尾鲎来源的）作为重组C因子。

（试剂）

（1）重组B因子（MOI=0.1、96小时的培养上清）

（2）重组Pro-CE（实施例2的样品2的培养上清）

（3）重组C因子（商品名PyroGene，原液使用）

（4）用蒸馏水将Et:大肠杆菌（E.coli）O111:B4源（シグマ社制造）配制成1mg/mL后，进行10倍连续稀释。

而且，为了确认实验结果为获得了重构级联的结果，制成如下组合的样品，进行验证。

样品A：重组Pro-CE、重组B因子和重组C因子

样品B：重组Pro-CE、重组B因子和蒸馏水

样品C：重组Pro-CE、重组C因子和蒸馏水

样品D：重组B因子、重组C因子和蒸馏水

样品E：重组Pro-CE和蒸馏水

样品F：重组B因子和蒸馏水

样品G：重组C因子和蒸馏水

而且，在各样品中，使用经含有150mM NaCl的冰冷的50mLTris-HCl缓冲液（pH7.5）将上述（1）和（2）的培养上清分别稀释5倍的稀释液将总液量调到60μL。

在各样品中加入Tris-HCl缓冲液（pH8.0）（终浓度80mM）、MgSO₄（终浓度64mM）、CaCl₂（终浓度0.4mM）、Na₂SO₄（终浓度8mM）、葡聚糖（终浓度2.4%）、注射用蒸馏水（15μL）、Boc-Leu-Gly-Arg-pNA底物（终浓度0.24mM）和25μL Et溶液（0、100ng/mL），总容量达到125μL，转移到Wellreader SK603内，于37℃使之反应10小时后，自动测定了405nm波长（对照波长492nm）下的吸光度。做两次平行实验，计算出吸光度的平均值。其结果示于表6和图10。

而且，对在高浓度的Et存在下各因子（样品A、B和E～G）对Boc-Leu-Gly-Arg-pNA底物的水解特性进行了研究。在重组Pro-CE和重组B因子单独或共存的样品中，并没有发现由于高浓度的Et的活化。而另一方面，在重组C因子单独的样品以及由重组C因子，重组B因子和重组Pro-CE构成的完全重构体系中发现了显著的水解活性。但是，在由重组Pro-CE，重组B因子和重组C因子构成的完全重构体系中的水解活性与在重组C因子单独中的水解活性相比，诱导了显著的活化（约3个数量级的差异）（图11）。

这些结果表明，通过组合重组C因子、重组B因子和重组Pro-CE可与天然的各因子（天然的LAL因子）一样促进依赖于Et的浓度的级联反应。而且确认了，重构所述级联反应时，即使使用不同鲎种类的凝固因子，也可与天然的LAL因子一样表现活性。

实施例5.对金属盐对完全重构体系的Et反应的活性的影响的研究

对变化向在实施例4中所示的完全重构体系（样品A）的Et反应中加入的金属盐的量时的Et反应的活性变化进行了研究。

（A）硫酸镁的影响（未加入氯化钙和氯化钠）

（a）0～100mM的浓度范围下的研究

在实施例4的完全重构体系的E t反应中，使所述实施例中64mM的硫酸镁的浓度在0～100mM之间变化，观察反应活性的变化（反应时）。其结果示于表7和图12中。而且，本反应中，Et溶液在0ng/mL（对照）和100ng/mL这2种的体系中进行。

根据表7和图12中所示的结果，在本发明的方法1的完全重构体系中，伴随在本测定系中所加入的硫酸镁的浓度上升，活性值显著减少。

（b）在0～10mM的浓度范围内研究

上述本实施例的（a）的反应系中（Et浓度为0ng/mL（对照）和20ng/mL），在反应时使硫酸镁的浓度在0～10mM变化，观察重构后的活性变化。其结果示于表8和图13。

根据表8和图13中所示的结果显示，在本发明的方法1的完全重构体系中，硫酸镁的浓度即使在10mM以下，也以依赖于浓度的方式抑制Et反应。

这些结果表明，在通过本测定体系进行的Et反应中，即使不加入硫酸镁，各因子在重构后的活性也被良好地检测出及维持。

（B）氯化钙的影响（未加入硫酸镁和氯化钠）

在实施例4的完全重构体系的Et反应中（Et为不加入（对照）和20ng/mL），使反应时加入的氯化钙的浓度达到0～5mM，观察重构后的活性变化。且结果示于表9和图14。

表9

（在CaCl₂的浓度为1～5mM时轻微白色浑浊）

表9和图14的结果表明，在完全重构体系的Et反应中，即使不加入氯化钙，也与镁一样，各因子的活性也可被良好地检测出及维持。

（C）氯化钠的影响（未加入硫酸镁和氯化钙）

在本实验的体系中，反应缓冲液（Tris-Cl、pH=8.0）中的Cl^-在反应时以80mM存在，但在本实验体系中，不使Na⁺共存，不把氯化钠浓度计算在内。

实施例4的完全重构体系的Et反应中（Et为未加入（对照）和20ng/mL），使在所述实施例中加入了150mM的氯化钙浓度在0、0.078、0.156、0.313、0.625、1.25、2.5（M）和0～2.5M之间变化，观察反应值的变化（反应时）。其结果示于表10和图15。

表10和图15的结果表明，发现氯化钠在反应时的浓度在0～50mM之间时，对重构后的活性几乎没有影响，浓度在这之上时发现了显著的反应抑制（200mM下约降低30%）。

实施例6.对在完全重构体系中Et反应的底物特异性的研究

将使用了包含于以重组C因子作为组分的Et检测试剂（PyroGene：Cambrex社）中的荧光合成底物、与Boc-Val-Pro-Arg-MCA类似的显色合成底物，Boc-Val-Pro-Arg-pNA（Boc-VPR-pNA）（醋酸盐）（以下也称为底物1）的实施例4的完全重构体系中的Et反应与在通常的LAL反应中最适的Boc-Leu-Gly-Arg-pNA（Boc-LGR-pNA）（以下，也称为底物2）进行比较。

将E t反应时的底物浓度设定为底物1，底物2共0.3mM。

其结果示于表11和图16。

表11和图16所示的结果表明，对于由完全重构体系构成的本体系的Et活性而言，Boc-Leu-Gly-Arg-pNA（底物2）与Boc-Val-Pro-Arg-pNA（底物1）相比，反应值高约200倍。

而且，有关其它的实验，在进行仅有重组型C因子的体系（通过将底物浓度设定为底物1，底物2共0.3mM进行）的Et反应的研究时，与使用底物2时的反应值相比，使用底物1时，反应值高约1.6倍。

由此表明，与重组型C因子单独时相比，由完全重构体系构成的内毒素活性呈现显著高的反应值。而且，即使在(1→3)-β-D-葡聚糖中也显示出相同的倾向。也就是说，通过本发明确知即使微量也可进行高灵敏度且再现性好的内毒素和(1→3)-β-D-葡聚糖的检测和定量。

产业上利用的可能性

本发明提供了使鲎来源的Pro-CE基因大量表达，用于有效且高再现性地检测并测定微生物源的菌体成分的体外工具和方法。而且，通过本发明获得的Pro-CE，还作为与其它的与LAL反应相关的重组因子一起作为构成反应体系的主要的因子被提供。所述方法，有关通过Et和BG的检测和定量进行的药品、医疗用具等的安全性评价，败血症、真菌感染症等的血清诊断，环境、食品卫生领域中微生物污染的检测工具，或作为研究用试剂等，可期待长久且大范围地利用。

Claims

1.编码鲎来源的凝固酶原的核酸。

2.权利要求1所述的核酸，其中所述鲎选自中国鲎（Tachypleustridentatus）、美洲鲎（Limulus Polyphemus）、马来鲎（Tachypleusgigas）和圆尾鲎（Tachypleus rotundicauda）。

3.权利要求1所述的核酸，其中所述编码鲎来源的凝固酶原的核酸选自以下（A）～（C）：

（A）编码含有序列号4所示氨基酸序列的蛋白质的DNA、

（C）由上述（A）或（B）的DNA转录得到的RNA。

4.权利要求1所述的核酸，其中所述编码鲎来源的凝固酶原的核酸选自以下（a）～（c）：

（a）含有序列号3的碱基序列1～1143所示的碱基序列的DNA、

（b）具有下述特征的DNA：在含有序列号3的碱基序列1～1143所示的碱基序列的碱基序列上，具有使由所述碱基序列编码的蛋白质的氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、取代、插入或移位的碱基变异，且所表达的蛋白质具有鲎来源的凝固酶原活性，

（c）由上述（a）或（b）的DNA转录得到的RNA。

5.带有权利要求1～4中任一项所述的核酸的病毒。

6.权利要求5所述的病毒，其中所述病毒为杆状病毒。

7.权利要求6所述的病毒，其中所述杆状病毒为核型多角体病毒。

8.携带权利要求5～7中任一项所述的病毒的细胞。

9.权利要求8的细胞，其中所述细胞为昆虫来源的细胞。

10.制备鲎来源的凝固酶原的方法，其至少包括使权利要求8或9所述的细胞生长，并从其生长物中回收鲎来源的凝固酶原的步骤。

11.根据权利要求10的方法制备的凝固酶原。

12.内毒素检测方法，其特征在于：使待检测内毒素的被检样品与权利要求11所述的凝固酶原和“表现出通过与内毒素接触使凝固酶原转化为凝固酶的活性的丝氨酸蛋白酶前体”共存，以伴随凝固酶原转化为凝固酶的酶活性作为指标，对所述样品中的内毒素进行检测。

13.权利要求12所述的内毒素检测方法，其特征在于：“表现出通过与内毒素接触使凝固酶原转化为凝固酶的活性的丝氨酸蛋白酶前体”是“表现出通过与活性C因子接触使凝固酶原转化为凝固酶的活性的丝氨酸蛋白酶前体”和鲎来源的C因子和/或重组C因子。

14.权利要求13所述的内毒素检测方法，其特征在于：“表现出通过与活性C因子接触使凝固酶原转化为凝固酶的活性的丝氨酸蛋白酶前体”是鲎来源的B因子和/或重组B因子。

15.权利要求12～14中任一项所述的内毒素检测方法，其特征在于：仅使作为级联反应蛋白质的权利要求11所述的凝固酶原、重组C因子和重组B因子共存。

16.用于实施权利要求12所述的检测方法的内毒素检测试剂盒，其特征在于：其组分至少含有权利要求11的凝固酶原和“表现出通过与内毒素接触使凝固酶原转化为凝固酶的活性的丝氨酸蛋白酶前体”。

17.权利要求16所述的内毒素检测试剂盒，其特征在于：“表现出通过与内毒素接触使凝固酶原转化为凝固酶的活性的丝氨酸蛋白酶前体”是“表现出通过与活性C因子接触使凝固酶原转化为凝固酶的活性的丝氨酸蛋白酶前体”和鲎来源的C因子和/或重组C因子。

18.权利要求17所述的内毒素检测试剂盒，其特征在于：“表现出通过与活性C因子接触使凝固酶原转化为凝固酶的活性的丝氨酸蛋白酶前体”是鲎来源的B因子和/或重组B因子。

19.权利要求16～18中任一项所述的内毒素检测试剂盒，其特征在于：其组分仅含有作为级联反应蛋白质的权利要求11所述的凝固酶原、重组C因子和重组B因子。

20.(1→3)-β-D-葡聚糖检测方法，其特征在于：使待检测(1→3)-β-D-葡聚糖的被检样品与权利要求11的凝固酶原和“表现出通过与(1→3)-β-D-葡聚糖接触使凝固酶原转化为凝固酶的活性的丝氨酸蛋白酶前体”共存，以伴随凝固酶原转化为凝固酶的酶活性作为指标，对所述样品中的(1→3)-β-D-葡聚糖进行检测。

21.权利要求20所述的(1→3)-β-D-葡聚糖检测方法，其特征在于：“表现出通过与(1→3)-β-D-葡聚糖接触使凝固酶原转化为凝固酶的活性的丝氨酸蛋白酶前体”是鲎来源的G因子和/或重组G因子。

22.权利要求20或21的(1→3)-β-D-葡聚糖检测方法，其特征在于：仅使作为级联反应蛋白质的权利要求11所述的凝固酶原和重组G因子共存。

23.用于实施权利要求20所述的检测方法的(1→3)-β-D-葡聚糖检测试剂盒，其特征在于：其组分至少含有权利要求11所述的凝固酶原和“表现出通过与(1→3)-β-D-葡聚糖接触使凝固酶原转化为凝固酶的活性的丝氨酸蛋白酶前体”。

24.权利要求23所述的(1→3)-β-D-葡聚糖检测试剂盒，其特征在于：“表现出通过与(1→3)-β-D-葡聚糖接触使凝固酶原转化为凝固酶的活性的丝氨酸蛋白酶前体”是鲎来源的G因子和/或重组G因子。

25.权利要求23或24所述的(1→3)-β-D-葡聚糖检测试剂盒，其特征在于：其组分仅含有作为级联反应蛋白质的权利要求11所述的凝固酶原和重组G因子。