DE69211973T2

DE69211973T2 - Reagenzien und Verfahren zur Bestimmung von Beta-Glucanen

Info

Publication number: DE69211973T2
Application number: DE69211973T
Authority: DE
Inventors: Junko Cho; Hiroshi Nakajima; Hisashi Yamamoto
Original assignee: Maruha Corp
Current assignee: Maruha Nichiro Corp
Priority date: 1991-12-25
Filing date: 1992-09-24
Publication date: 1996-12-19
Anticipated expiration: 2012-09-25
Also published as: DE69211973D1; US5571683A; EP0549102A1; EP0549102B1; JPH05240862A

Description

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft β-Glucan-Nachweisreagenzien, die als Diagnostika für Nosomykose auf dem Gebiet der Pharmazie verwendet werden, und Verfahren zur Bestimmung von β-Glucanen unter Verwendung der Reagenzien.
Gegenwärtig wird versucht, Nosomykose in einem frühen Stadium durch die Bestimmung der Konzentration von β-Glucanen im Blut nachzuweisen, da Pilze β-Glucane in ihren Bestandteilen enthalten (Zeitschrift herausgegeben von der Ohsaka University, School of Medicine 41(3), 133-142). Reagenzien, die für β-Glucane spezifisch sind. sind deshalb zum Nachweis von Nosomykose nützlich und können als Diagnostika auf dem Gebiet der Pharmazie verwendet werden.
Es ist bekannt, daß β-Glucane das Hämocytenlysat von Pfeilschwanzkrebsen koagulieren; diese Erkenntnis kann zur quantitativen Bestimmung der β-Glucan-Mengen im Blut genützt werden. Jedoch koagulieren Endotoxine ebenfalls das Hämocytenlysat der Pfeilschwanzkrebse. Der Grund dafür ist, daß das Hämocytenlysat der Pfeilschwanzkrebse sowohl einen Aktivator des Vorläufers eines β-Glucan-koagulierenden Enzyms als auch einen Aktivator des Vorläufers eines Endotoxin-koagulierenden Enzyms enthält.
Die hier genannten Erfinder haben erfolgreich Reagenzien hergestellt, welche spezifisch mit β-Glucanen allein durch die Entfernung oder Inaktivierung eines Äktivators des Vorläufers eines Endotoxin-koagulierenden Enzyms im Limulus-Hämocytenlysat reagieren, und haben diese Erfindung eingereicht (Japanische Patentanmeldung KOKAI Nrn. 138193/1990 und 207098/1990).
Die in der Japanischen Patentanmeldung KOKAI Nr. 138193/1990 offenbarte Erfindung betrifft das für β-Glucane spezifische Hämocytenlysat, welches durch Fraktionierung des Hämocytenlysats durch eine Ionenaustauscherchromatographie mit Sulfopropyl als Adsorbens gewonnen wurde.
Die in der Japanischen Patentanmeldung KOKAI Nr. 207098/1990 offenbarte Erfindung betrifft das für β-Glucane spezifische Hämocytenlysat, welches ein Endotoxin neutralisierendes Peptid plus ein beim üblichen Gelierungsverfahren verwendetes Limulus-Reagens umfaßt.
Die vorliegende Erfindung betrifft das für β-Glucane spezifische Hämocytenlysat welches durch die Extraktion der Hämocyten der Amerikanischen Pfeilschwanzkrebse mit 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) mit 12 mM MgCl&sub2; und dem Zusatz von Polyphemusin zu dem Hämocytenlysat gewonnen wurde. Das Polyphemusin wird durch die Extraktion des Präzipitats des Hämocytenlysats mit 20 mM HCl und die Reinigung des resultierenden Extrakts durch eine Umkehrphasen-HPLC gewonnen.
Das für β-Glucane spezifische Hämocytenlysat kann so wenig wie 0,1 ng/ml Carboxymethylcurdlan nachweisen, jedoch reagiert es nicht mit so wenig wie 100 ng/ml des Nippon Pharmacopoeia Standard-Endotoxins.
Das Verfahren der in der Japanischen Patentanmeldung KOKAI Nr.138193 offenbarten Erfindung erfordert eine Chromatographie von Endotoxin-freien Proben durchzuführen, was die Herstellungsverfahren von Reagenzien kompliziert. Ergänzend hierzu, während das in der Japanischen Patentanmeldung KOKAI Nr. 138193/1990 offenbarte Herstellungsverfahren von Reagenzien einfach ist, ist ein Limulus-Reagens allein, welches beim Gelierungsverfahren verwendet wird, für die quantitative Analyse nicht geeignet und seine Empfindlichkeit beträgt so wenig wie 0,1 ng/ml.
Ein erfindungsgemäßes Ziel ist die Bereitstellung eines β-Glucan-Nachweisreagens, welches einfach hergestellt werden kann und sehr empfindlich ist, und eines Verfahrens zur Bestimmung von β-Glucanen unter Verwendung des Reagens.
Die hier genannten Erfinder haben ein Reagens zum Nachweis von β-Glucanen untersucht, ein Reagens, welches einfach hergestellt werden kann und sehr empfindlich ist, und fanden ein einfaches Verfahren für die Herstellung eines β-Glucan-Nachweisreagens durch die Kombination üblicher Endotoxin-Nachweisreagenzien mit von Limulus- Hämocyten abgeleiteten, Endotoxin neutralisierenden Peptiden und chromogenen Substraten.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein β-Glucan-Nachweisreagens, welches Limulus- Hämocytenlysate mit von Limulus-Hämocyten abgeleiteten, Endotoxin neutralisierenden Peptiden und chromogene Substrate umfaßt. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Bestimmung von β-Glucanen unter Verwendung des vorstehend beschriebenen β-Glucan-Nachweisreagens.
Das erfindungsgemäße β-Glucan-Nachweisreagens kann leicht hergestellt werden ist sehr empfindlich und in der Medizin als Diagnostikum für Pilzerkrankungen nützlich.

Beschreibung der Figuren

Figur 1 zeigt die Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen β-Glucan-Nachweisreagens gegenüber Endotoxin.
Figur 2 zeigt die Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen β-Glucan-Nachweisreagens gegenüber β-Glucanen.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Geeignete Limulus-Arten für das erfindungsgemäße Limulus-Lysat umfassen Tachypleus tridentatus, Tachypleus gigas, Limulus polyphemus und ähnliche.
Die Erfindung verwendet jedes beliebige von Limulus-Arten abgeleitete, Endotoxin neutralisierende Peptid, wie Tachyplesin-I, Tachyplesin-II, Tachyplesin-III, Polyphemusin-I oder Polyphemusin-II. Diese Peptide werden in den Japanischen Patentanmeldungen KOKAI Nrn. 53799/1990 (Polyphemusin-I), 152978/1990 (Polyphemusin-II), 27089/1990 (Tachyplesin-III) oder in der Veröffentlichung der Japanischen Übersetzung der PCT-Anmeldung Nr.500194/1990 (Tachyplesin-I) oder in J. Biochem. 106 (1989), 663-668 (Tachyplesin-II), ausführlich beschrieben. Eines der Verfahren für die Herstellung dieser Peptide wird nachstehend kurz beschrieben.

Polyphemusin-I

Tris-HCl-Puffer mit Natriumchlorid und Benzamidinhydrochlorid wird den Hämocyten des Nordamerikanischen Pfeilschwanzkrebses (Limulus polyphenus) zugegeben. Die Hämocyten werden aufgebrochen und anschließend zentrifugiert. Eine HCl-Lösung wird dem Präzipitat zugegeben, welches aufgebrochen und zentrifugiert wird. Der Überstand wird auf eine Sephadex G-50-Säule geladen, der anschließend eine HCl-Lösung zugegeben wird. Fraktionen bei einer Extinktion von 280 nm werden gewonnen und auf eine Cosmosil 5C18-Säule geladen. Eine Trifluoressigsäurelösung, worin die Konzentration von Acetonitril verändert wird, wird dann auf die Säule geladen, wobei Polyphemusin-I erhalten wird.

Polyphemusin-II

Polyphemusin-II wird ebenfalls aus dem Nordamerikanischen Pfeilschwanzkrebs auf eine ähnliche Weise gewonnen, wie bei Polyphemusin-I beschrieben. Polyphemusin-II wird aufgrund des Unterschieds in der Elutionsdauer abgetrennt.

Tachyplesin-I und Tachyplesin-II

Diese werden aus den Asiatischen Pfeilschwanzkrebsen (Tachypleus tridentatus, Trachypleus gigas) auf eine ähnliche Weise gewonnen, wie bei Polyphemusin-I und -II beschrieben: die unlöslichen Fraktionen der Asiatischen Pfeilschwanzkrebs-Extrakte werden mit einer HCl-Lösung extrahiert und der Extrakt wird durch eine Sephadex G-50-Säule und Umkehrphasen-HPLC gereinigt.

Tachyplesin-III

Tachyplesin-III wird aus dem Malayischen Pfeilschwanzkrebs (Tachypleus gigas) auf eine ähnliche Weise gewonnen, wie bei Polyphemusin-I beschrieben.
Als Alternative zu dem vorstehend beschriebenen Verfahren können dieses Peptide durch ein Festphasen-Verfahren gewonnen werden. Bei der Anwendung des Festphasen-Verfahrens sollte eine α-Aminogruppe einer beliebigen Aminosäure mit einer tert.-Butyloxycarbonylgruppe (Boc-Gruppe) geschützt werden und eine an eine Aminosäure gebundene Gruppe wird vorzugsweise durch die Umwandlung der Aminosäure wie folgt geschützt:
Arginin wird in Tosylarginin umgewandelt, um die Guanidinogruppe zu schützen;
Lysin wird in 2-Chlorbenzyloxycarbonyllysin umgewandelt, um die &epsi;-Aminogruppe zu schützen;
Cystein wird in 4-Methylbenzylcystein umgewandelt, um die Thiolgruppe zu schützen;
Tyrosin wird in Benzyltyrosin umgewandelt, um die Hydroxylgruppe zu schützen; und Tryptophan wird in Formyltryptophan umgewandelt, um den Indolring zu schützen.
Die geschützte Argininform (Argininderivat), eine C-terminale Aminosäure, wird in ein Phenylacetamidomethyl-Harz eingeführt und die Polypeptidkette wird nach und nach verlängert, wobei ein geschütztes Peptidharz hergestellt wird. Das auf diese Weise synthetisierte geschützte Peptidharz wird mit Fluorwasserstoff behandelt, um das geschützte Peptid von dem Harz zu trennen. Gleichzeitig werden die Schutzgruppen von dem geschützten Peptid entfernt und das Peptid wird reduziert, wobei eine synthetisches Peptid durch das auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren hergestellt wird. Das auf diese Weise gewonnene, rohe, synthetische Peptid wird durch ein auf dem Fachgebiet bekanntes Verfahren gereinigt, wie Gelfiltration, Umkehrphasen-HPLC und ähnliches. Das für die Synthese des Peptids angewendete Festphasen-Verfahren wird gemäß dem in Biochemistry Experiment (I), Nippon Biochemistry Meeting (Hrsg.), Protein Chemistry 4 (1977), 208-495, Tokyo Kagaku Dojin Press; und "Merrifield et al. Method" in Peptide Synthesis von Izumiya N., Maruzen K.K. Press (1975), beschriebenen Verfahren ausgeführt.
Die chemische Strukturen dieser Peptide sind nachstehend aufgeführt. Tachyplesin-I Tachyplesin-II Tachyplesin-III Polyphemusin-I Polyphemusin-II
(worin ein Paar von 1 und 2 oder ein Paar von 3 und 4 jeweils direkt gebunden ist und Arg-NH&sub2; bedeutet, daß eine Carboxylgruppe von Arginin eine Amidgruppe ist).
Erfindungsgemäße chromogene Substrate umfassen Boc-Leu-Gly-Arg-pNa, Boc-Leu- Gly-Arg-MCA, Boc-Ile-Glu-Gly-Arg-pNa, Boc-Val-Leu-Gly-Arg-pNa und Bz-Ile-Glu- Gly-Arg-pNa (worin pNa p-Nitroanilin und McA Methylcumarin bedeuten).
Die Menge der Endotoxin neutralisierenden Peptide in dem erfindungsgemäßen β-Glucan-Nachweisreagens beträgt vorzugsweise 0,5 bis 2 mg pro Fläschehen für 20 Tests.
Die Konzentration der β-Glucane in Proben kann wie folgt bestimmt werden. Ein chromogenes Substrat, zum Beispiel Boc-Leu-Gly-Arg-pNa, wird verwendet und das β-Glucan-Nachweisreagens wird zu einer Probe zugegeben. Das Reaktionsgemiseh wird bei 37ºC während 30 Minuten inkubiert. Nach der Inkubation wird 0,4 N Essigsäure dem Reaktionsgemisch zugegeben, um die Umsetzung zu beenden. Die Extinktion (bei 405 nm) des Reaktionsprodukts wird gemessen, und die Konzentration von β-Glucan in der Probe wird mit Bezug auf die aus bekannten β-Glucan-Konzentrationen erstellte Kalibrierungskurve bestimmt.
Die vorliegende Erfindung wird durch Beispiele weiterhin beschrieben, welche den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung nicht begrenzen.

Beispiele

1. Herstellung von Hämocytenlysaten aus Limulus-Arten

100 ml 20 mM Tris-HCl (pH 7,2) mit 150 mM Natriumchlorid wurden zu 10 g Hämocyten des Chinesischen Tachypleus tridentatus zugegeben. Die Hämocyten wurden aufgebrochen und bei 3500 Upm während 30 Minuten zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde als Limulus-Hämocytenlysat verwendet.

2. Herstellung des Endotoxin neutralisierenden Peptids (Tachyplesin-III)

500 ml 20 mM Tris-HCl (pH 7,2) mit 50 mM Natriumchlorid und 2 mM Benzamidinhydrochlorid wurden zu 50 g Hämocyten des Malayischen Tachypleus gigas zugegeben. Die Hämocyten wurden aufgebrochen und bei 3500 Upm während 30 Minuten zentrifügiert. 500 ml einer 20 mM Salzsäurelösung wurden dem erhaltenen Niederschlag zugegeben. Die Mischung wurde dann erneut aufgebrochen und zentrifügiert. Die Aufbrech- und Zentrifugationsverfahren wurden noch dreimal wiederholt und der Überstand wurde jedesmal gepoolt. Der Überstand wurde gefriergetroclmet. Nach dem Gefriertrocknen wurde die gefriergetrocknete Probe in einer kleinen Menge einer 20 mM Salzsäurelösung gelöst. Die Mischung wurde auf eine Sephadex G-50-Säule geladen, der eine 20 mM Salzsäurelösung zugegeben wurde. Das Eluat wurde auf eine Extinktion bei 280 nm getestet. Die letzte Hälfte des Anteils nach der maximalen Extinktion wurde gewonnen und gefriergetrocknet.
Die gefriergetrocknete Probe wurde in einer kleinen Menge einer 20 mM Salzsäurelösung gelöst. Die Mischung wurde auf eine Cosmosil 5C18-Säule geladen. Trifluoressigsäurelösung, worin die Konzentration von Acetonitril verändert wurde, wurde zu der Säule zugegeben, um Tachyplesin-III zu eluieren.

3. Herstellung von β-Glucan spezifischen Reagenzien

Tachyplesin-III wurde in einer 4%igen Mannitollösung bis zu einer Endkonzentration von 2 mg/ml gelöst. 0,5 ml der resultierenden Lösung wurden mit 0,5 ml eines Limulus- Hämocytenlysats vereinigt. Der Mischung wurden 0,2 ml einer 5 mM Boc-Leu-Gly-Arg- pNa-Lösung zugegeben. Die resultierende Mischung wurde gefriergetrocknet, wobei das gewunschte Reagens hergestellt wird.

4. Empfindlichkeitstest von β-Glucan-Nachweisreagenzien auf β-Glucan und Endotoxine

Die Empfindlichkeit der erfindungsgemäßen β-Glucan-Nachweisreagenzien gegenüber von Endotoxin (Nippon Pharmacopeia Standard Products) und β-Glucan wurde wie folgt getestet.
Das β-Glucan-Reagens wurde in 2,1 ml 40 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,2) gelöst und die Lösung wurde in einer Menge von je 0,1 ml in sterilisierte Röhrchen verteilt. 0,1 ml einer Lösung mit erhöhten Konzentrationen der Endotoxine und β-Glucane wurden einem jeden Röhrchen zugegeben. Jedes Röhrchen wurde mit Hilfe eines Vortexgeräts gemischt und bei 37 ± 1ºC während 30 ± 1 Minuten inkubiert. Nach der Inkubation wurden 0,4 ml 0,4 N Essigsäure jedem Röhrchen zugegeben, um die Reaktion zu beenden. Die Extinktion (bei 405 nm) des Reaktionsprodukts wurde bestimmt.
Figur 1 zeigt eine Kalibrierungskurve von Endotoxin. Figur 2 zeigt eine Kalibrierungskurve von β-Glucan.

Claims

1. β-Glucan-Nachweisreagens, umfassend ein Limulus-Hämocytenlysat, ein von Limulus-Hämocyten abgeleitetes, Endotoxin neutralisierendes Peptid und ein chromogenes Substrat.

2. Reagens nach Anspruch 1, worin das Endotoxin neutralisierende Peptid zumindest eines von Tachyplesin-I Tachyplesin-II, Tachyplesin-IIII, Polyphemusin-I und Polyphemusin-II ist.

3. Reagens nach Anspruch 1 oder 2, worin das chromogene Substrat Boc-Leu-Gly- Arg-pNa, Boc-Leu-Gly-Arg-McA oder Boc-Ile-Glu-Gly-Arg-pNa (worin Boc tert.- Butyloxycarbonyl, pNa p-Nitroanilin und McA Methylcumarin bedeuten) umfaßt.

4. Verwendung eines β-Glucan-Nachweisreagens nach Anspruch 1, 2 oder 3 zur Bestimmung von β-Glucan in einer Probe.