JPH05240862A - β−グルカン類検出用試薬及びβ−グルカン類の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 調製法が簡単で、かつ高感度のβ−グルカン
類検出用試薬及びそれを用いたβ−グルカン類の検出方
法の提供。 【構成】 カブトガニ血球抽出物中にカブトガニ血球由
来エンドトキシン中和ペプチドと発色基質とを含むこと
を特徴とするβ−グルカン類検出用試薬、並びにかかる
β−グルカン類検出用試薬を用いて、検体中のβ−グル
カン類を検出することを特徴とするβ−グルカン類の検
出方法。 【効果】 調製法が簡単で、かつ高感度のβ−グルカン
類検出用試薬及びそれを用いたβ−グルカン類の検出方
法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、真菌症の診断薬等とし
て医薬分野に利用されるβ−グルカン類検出用試薬、及
びそれを用いたβ−グルカン類の検出方法に関するもの
である。

【０００２】

【従来の技術】真菌類は、その菌体成分としてβ−グル
カンを含むので、現在、血中β−グルカン濃度を測定す
ることにより、真菌症を早期に発見する試みがなされて
いる（大阪大学医学部雑誌第41巻第３号第133〜142
頁）。このため、β−グルカンを特異的に検出する試薬
は、真菌症診断薬として医療分野において有用である。

【０００３】β−グルカン類は、カブトガニ由来の血球
抽出物を凝固させることが知られており、これを利用し
てβ−グルカン類を定量することができる。しかしカブ
トガニ由来の血球抽出物は、β−グルカン類の他エンド
トキシンによっても凝固する。これは、カブトガニ血球
抽出物中にβ−グルカン性凝固酵素前駆体活性因子を取
り除いたり、不活性化することによりβ−グルカン類に
特異的に反応する試薬に関する発明を完成し、特許出願
をおこなった（特開平2-138193、同2-207098）。

【０００４】特開平2-138193は、スルホプロピル基を吸
着担体とするイオン交換クロマトグラフィーにより血球
抽出物を分画して得られるβ−グルカン類に特異的な血
球抽出物に関するものである。また特開平2-207098は、
通常のゲル化法リムラス試薬にエンドトキシン中和ペプ
チドを加えたβ−グルカン類に特異的な血球抽出物に関
するものである。すなわちアメリカ産カブトガニ血球よ
り、12mMMgCl₂ を含む20mMTris-HCl緩衝液（pH8.0）で
抽出した血球抽出物に、この抽出残渣より20mMHClで抽
出した逆相HPLCで精製したポリヘムシンを添加してなる
β−グルカン類に特異的なカブトガニ血球抽出物に関す
るものである。これは、0.1n／mlのカルボキシメチルカ
ードランを検出することが可能で、かつ100ng／mlの日
本薬局方標準エンドトキシンに対して感受性を示さな
い。

【０００５】しかしながら、前述の特開平2-138193は、
高度な技術を必要とするエンドトキシンフリーの状態で
のクロマトグラフィーを行う必要があり、試薬を調製す
る操作が煩雑になるという問題がある。また特開平2-20
7098も、その調製法は簡便ではあるが、ゲル化法リムラ
ス試薬自体が定量には不向きであり検出感度も0.1ng／m
l低いという問題がある。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は上記の
従来技術に存する問題を解決するべく、その調製法が簡
単で、かつ高感度のβ−グルカン類検出用試薬及びそれ
を用いたβ−グルカン類の検出方法を提供することにあ
る。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者は上記課題の解
決のために、調製法が簡単でありかつ高感度のβ−グル
カン類検出用試薬について鋭意検討した。そしてその結
果、通常のエンドトキシン検出用試薬にカブトガニ血球
由来エンドトキシン中和ペプチドと発色基質を包含させ
るという簡単な方法で高感度のβ−グルカン類検出用試
薬を調製できることを見出し、本発明を完成した。

【０００８】すなわち、本願は以下に掲げる発明をその
要旨とするものである。 (1) カブトガニ血球抽出物中にカブトガニ血球由来エン
ドトキシン中和ペプチドと発色基質とを含むことを特徴
とするβ−グルカン類検出用試薬。 (2) カブトガニ血球由来エンドトキシン中和ペプチドが
タキプレシン−I 、タキプレシン−II、タキプレシン−
III、ポリヘムシン−I 、又はポリヘムシン−IIである
前記(1)記載のβ−グルカン類検出用試薬。 (3) 発色基質がBoc-Leu-Gly-Arg-pNa、Boc-Leu-Gly-Arg
-McA（式中、Boc はtert−ブチルオキシカルボニル基
を、pNa はp-ニトロアリニドを、McA はメチルクマリン
であることを示す。）、配列番号１に示す構造を有する
ペプチド、配列番号２に示す構造を有するペプチド、又
は配列番号３に示す構造を有するペプチドである前記
(1)記載のβ−グルカン類検出用試薬。 (4) 前記(1)〜(3)のいずれか一つに記載のβ−グルカン
類検出用試薬を用いて、検体中のβ−グルカン類を検出
することを特徴とするβ−グルカン類の検出方法。

【０００９】以下、本発明について詳細に説明する。本
発明に用いられるエンドトキシン中和ペプチドの由来の
カブトガニの種類は調製を企図するエンドトキシン中和
ペプチドの種類に応じて用いることができる。具体的に
はカブトガニ（Tachypleus tridentatus）、ミナミカブ
トガニ（Tachypleus gigas）、アメリカカブトガニ（Li
mulus polyphemus）の３属を挙げることができる。な
お、他の属のカブトガニとして知られているマルオカブ
トガニ（Carcinoscorpius rotundicauda）は本発明にお
いて用いられる抽出物の出所としては好ましくないこと
が確かめられている。

【００１０】また、本発明に用いられるカブトガニ血球
由来エンドトキシン中和ペプチドの種類は特に限定され
ない。例えば、タキプレシン−I、タキプレシン−II、
タキプレシン−III、ポリヘムシン−I、又はポリヘムシ
ン−II等を代表的なエンドトキシン中和ペプチドとして
挙げることができる。これらのエンドトキシン中和ペプ
チドは、微量でエンドトキシンを中和することができる
点で特に好ましい。

【００１１】以下にこれらの中和ペプチドについて説明
するが、その詳細についてはそれぞれ特表平2-500194
（タキプレシン−I）、"J.Biochem, 106, 663〜668(198
9)"（タキプレシン−II）、特開平2-270897（タキプレ
シン−III）特開平2-53799（ポリヘムシン−I）、特開
平2-152987（ポリヘムシン−II）に記載されている。ま
た、それぞれの当該中和ペプチドの化学的構造は以下の
通りである。

【００１２】a) タキプレシン−I

【００１３】

【化１】

【００１４】b) タキプレシン−II

【００１５】

【化２】

【００１６】c) タキプレシン−III

【００１７】

【化３】

【００１８】d) ポリヘムシン−I

【００１９】

【化４】

【００２０】e) ポリヘムシン−II

【００２１】

【化５】

【００２２】（式中、と、とは、それぞれ直接
に結合している。Arg-NH₂ は、アルギニンのカルボキシ
ル基がアミドであることを表す。）ポリヘムシン−I及
びポリヘムシン−IIは、一般的にアメリカカブトガニ
（Limulus polyphemus）の血球から調製することができ
る。すなわち、当該血球を塩化ナトリウムとベンズアミ
ジン塩酸塩を含むトリス塩酸緩衝液等の中性緩衝液を加
え粉砕し、かかる粉砕物を遠心後その沈澱物を得る。さ
らに当該沈澱物に塩酸溶液を加えてこれを粉砕し、遠心
後にその上清を得る。これをゲルろ過して、塩酸等の強
酸溶液で抽出する。当該溶出溶液の280nmにおける吸光
度を測定して集めた溶出区分をさらに分配吸着クロマト
グラフィーカラムに添加し、アセトニトリルの濃度を変
化させたトリフルオロ酢酸溶液で溶出することにより得
られる。

【００２３】なお、所望するポリヘムシン−I及びポリ
ヘムシン−IIは上記分配吸着クロマトグラフィーにおい
て溶出する異なるピークをそれぞれ特定して単離するこ
とにより得ることができる。タキプレシン−I及びタキ
プレシン−IIは、上記ポリヘムシン類と同様な方法でカ
ブトガニ（Tachypleus tridentatus）の血球抽出物の不
溶性画分を塩酸等の強酸溶液で抽出し、それをゲルろ過
と分配吸着クロマトグラフィーカラムで分離・精製する
ことによって得られる。タキプレシン−Iとタキプレシ
ン−IIは分配吸着クロマトグラフィーにおいて溶出する
異なるピークをそれぞれ特定して単離することにより得
られる。

【００２４】また、タキプレシン−IIIは、ミナミカブ
トガニ（Tachypleus gigas）について、上記ポリヘムシ
ン類と同様の操作を施すことによって調製することがで
きる。さらに、これらの中和ペプチドは上記の化学的構
造に基づいて化学合成、例えば固相法によって調製する
ことができる。例えば、この固相法を本発明に適用する
場合には、α−アミノ基はいずれのアミノ酸についても
tert−ブチルオキシカルボニル基（Boc 基）で保護し、
さらにアルギニンのグアニジノ基、リシンのε−アミノ
基、システインのチオール基、チロシンの水酸基、トリ
プトファンのインドール環については、アルギニン、リ
シン、システイン、チロシン、トリプトファンをそれぞ
れトシルアルギニン（tosylarginin）、2-クロロベンジ
ルオキシカルボニルリシン（2-chlorobenzyloxycarbony
llysine）、4-メチルベンジルシステイン（4-methylben
zylcysteine）、ベンジルチロシン（benzyltyrosin
e）、ホルミルトリプトファン（formyltryptophan）と
いう形にすることにより保護するのが好適である。

【００２５】その後、Ｃ末端アミノ酸のアルギニンの保
護誘導体をフェニルアセトアミドメチル樹脂（phenylac
etamidmethyl resin）に導入し、以後順次アミノ酸鎖の
延長、保護ペプチド樹脂の合成、フッ化水素処理という
工程を経ることにより、上記保護ペプチドを樹脂から切
断して脱保護し、これを還元し、以下常法に従って所望
の合成中和ペプチドを調製することができる。このよう
にして得られた粗合成ペプチドは、ゲルろ過、逆相HPLC
等のペプチドの精製工程において常用される手段によっ
て精製することができる。なお、かかるペプチド合成に
おいて常用される固相法については、例えば“日本生化
学会編「生化学実験講座(1)」”、“「蛋白質の化学」
４巻、208〜495頁、（株）東京化学同人発行（197
7）”、及び“泉屋信夫他著「ペプチド合成」、丸善
（株）発行（1975）" に記載されているメリフィールド
（Merrifield）等の方法に準じて行うことができる。

【００２６】また本発明において用いられる発色基質と
しては、例えばBoc-Leu-Gly-Arg-pNa、Boc-Leu-Gly-Arg
-McA（式中、Boc はtert−ブチルオキシカルボニル基
を、pNa はp-ニトロアリニドを、McA はメチルクマリン
であることを示す。）、配列番号１に示す構造を有する
ペプチド、配列番号２に示す構造を有するペプチド、配
列番号３に示す構造を有するペプチド等を挙げることが
できる。なお、これらの発色基質は本発明において用い
るに際して、カブトガニ血球凝固系の凝固酵素の基質と
して特異性が高いという点で好ましい。なお、当該発色
基質はそれぞれSigma 社から入手して用いることができ
る。

【００２７】本発明のβ−グルカン類検出用試薬におけ
るエンドトキシン中和ペプチドの使用量としては、通常
20テスト１バイアル中に当該中和ペプチドを0.5〜２mg
含有させるのが好ましい。さらに当該試薬中に添加する
上記発色基質の添加量は、前記バイアル中に0.05〜0.20
μmol、好ましくは0.10μmol程度である。このようにし
て調製したβ−グルカン類検出用試薬は通常は凍結乾燥
処理を施して保存する。また、当該調製済試薬は冷蔵し
て保存するのが好ましい。

【００２８】本発明のβ−グルカン類検出用試薬を用い
て試料中のβ−グルカン濃度を測定するには、試薬とし
て用いるエンドトキシン中和ペプチドと発色基質の種類
に応じた方法をとることができる。例えば、発色基質と
してBoc-Leu-Gly-Arg-pNaを用いる場合には、測定試料
中に本発明試薬を添加し、37℃で30分反応後、0.4N酢酸
で反応を停止させた後、405nmにおける吸光度を測定
し、既知濃度のβ−グルカンにより予め作製された検量
線により試料中のβ−グルカン類の濃度を求める方法を
採ることが好ましい。

【００２９】次に、本発明を実施例により具体的に説明
するが、本発明の技術的範囲が当該実施例によって限定
されるものではない。

【００３０】

【実施例】

(1) カブトガニ血球抽出物の調製 カブトガニ（Tachypleus tridentatus）の血球10gに150
mM塩化ナトリウムを含む20mMトリス塩酸緩衝液（pH7.
2）を100ml加えて粉砕し、3500rpmで30分間遠心分離し
てその上清を得た。そして、かかる上清をカブトガニ血
球抽出物とした。 (2) エンドトキシン中和ペプチド（タキプレシンIII）
の調製 ミナミカブトガニ（Tachypleus gigas）の血球50gに、5
0mM塩化ナトリウム及び２mMベンズアミジン塩酸塩を含
む20mMトリス緩衝液500mlを加え粉砕し、3500rpmで30分
間遠心した。これにより得られた沈澱物に20mM塩酸溶液
500mlを加え、再度粉砕しその上清を得た。そしてさら
に、同様の操作を３回繰り返してその上清を集めた。次
にかかる上清を凍結乾燥処理に付した。当該凍結乾燥品
を、再度少量の20mM塩酸溶液で溶解し、これをSephadex
G-50 カラム（ファルマシア社製）に添加して、20mM塩
酸溶液で溶出した。そしてかかる溶出物の280nmにおけ
る吸光度を測定し、最後のピークの後半部分を再び凍結
乾燥処理に付した。

【００３１】さらに、当該凍結乾燥品を再度少量の20mM
塩酸溶液で溶解し、コスモシール5C18カラム（ナカライ
テスク社製）に添加した。次にこれをアセトニトリルの
濃度を変化させたトリフルオロ酢酸溶液で溶出を行い、
所望のタキプレシンIIIを調製した。 (3) β−グルカン特異試薬の調製 タキプレシンIIIを４％マンニトール溶液で２mg／mlの
濃度に溶解し、その0.5mlをカブトガニ血球抽出物0.5ml
と混合した。さらにBoc-Leu-Gly-Arg-pNa（Sigma 社
製）溶液0.2mlを加え凍結乾燥処理を施し目的とする検
出試薬を得た。 (4) β−グルカンおよびエンドトキシンに対する感受性
の検定 本発明検出試薬のエンドトキシン（日本薬局方標準品）
及びβ−グルカン（カードラン）に対する感受性は以下
のように検定した。

【００３２】すなわち、上記(3)において調製した本発
明検出試薬を2.1mlの40mMトリス塩酸緩衝液（pH7.2）に
溶解し、滅菌した試験管に0.1mlずつ分注した。そこ
に、種々の濃度に調製したエンドトキシン及びβ−グル
カン0.1mlを加え、攪拌後37±１℃で30±１分間保温し
た。これに0.4N酢酸0.4mlを加え反応を停止させ、405nm
における吸光度を測定した。

【００３３】エンドトキシンに対する検量線を図１に、
β−グルカンに対する検量線を図２に示す。

【００３４】

【発明の効果】本発明により、調製法が簡単で、かつ高
感度のβ−グルカン類検出用試薬及びそれを用いたβ−
グルカン類の検出方法が提供される。

【００３５】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴：Ｎ末端にtert−ブチルオキシカルボニル基
が付加され、Ｃ末端にはp-ニトロアリニドが付加されて
いる。 配列： Ile Glu Gly Arg 配列番号：２ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴：Ｎ末端にtert−ブチルオキシカルボニル基
が付加され、Ｃ末端にはp-ニトロアリニドが付加されて
いる。 配列： Val Leu Gly Arg 配列番号：３ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴：Ｎ末端にベンジル基が付加され、Ｃ末端に
はp-ニトロアリニドが付加されている。 配列： Ile Glu Gly Arg

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明のβ−グルカン類検出用試薬のエンド
トキシンに対する感受性を示す図。

【図２】 本発明のβ−グルカン類検出用試薬のβ−グ
ルカンに対する感受性を示す図。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 カブトガニ血球抽出物中にカブトガニ血
   球由来エンドトキシン中和ペプチドと発色基質とを含む
   ことを特徴とするβ−グルカン類検出用試薬。
2. 【請求項２】 カブトガニ血球由来エンドトキシン中和
   ペプチドがタキプレシン−I、タキプレシン−II、タキ
   プレシン−III、ポリヘムシン−I、又はポリヘムシン−
   IIである請求項１記載のβ−グルカン類検出用試薬。
3. 【請求項３】 発色基質がBoc-Leu-Gly-Arg-pNa、Boc-L
   eu-Gly-Arg-McA（式中、Boc はtert−ブチルオキシカル
   ボニル基を、pNa はp-ニトロアリニドを、McA はメチル
   クマリンであることを示す。）、配列番号１に示す構造
   を有するペプチド、配列番号２に示す構造を有するペプ
   チド、又は配列番号３に示す構造を有するペプチドであ
   る請求項１記載のβ−グルカン類検出用試薬。
4. 【請求項４】 請求項１〜請求項３のいずれか１項に記
   載のβ−グルカン類検出用試薬を用いて、検体中のβ−
   グルカン類を検出することを特徴とするβ−グルカン類
   の検出方法。