CN102965353B - 一种麦芽糖底物特异性提高的环糊精糖基转移酶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种麦芽糖底物特异性提高的环糊精糖基转移酶及其制备方法，属于遗传工程和酶工程领域。本发明通过对P.macerans strain JFB05-01(CCTCC NO:M208063)的CGTase的47位的赖氨酸（Lys）分别替换为苯丙氨酸（Phe）、酪氨酸（Tyr）和脯氨酸（Pro），使AA-2G产量分别提高了17.1%，22.1%和32.9%。这些突变株比野生型CGTase更利于利用麦芽糖为糖基供体生产AA-2G，具有重要的工业应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种环糊精糖基转移酶及制备方法，特别是一种麦芽糖底物特异性提高的环糊精糖基转移酶及其制备方法。
背景技术
L-抗坏血酸（L-AA，维生素C）是水溶性维生素，参与很多体内的生理活动，在保持和促进人体健康中起到重要的作用，是人体无法自身合成的必需的营养元素。但L-AA极不稳定，在空气中易被氧化为脱氢抗坏血酸，破坏分子中的共轭体系，发生不可逆裂解反应，特别是在空气、光线、热和金属离子的存在下，反应更迅速，使L-AA的生理活性减弱甚至消失，这使得它在应用上受到很大的限制。因此，如何增强L-AA的稳定性是目前国内外学术界和产业界所关注的焦点问题。
2-O-α-D-吡喃型葡萄糖基-L-抗坏血酸（AA-2G）是L-AA的糖基衍生物，是将一个糖基以α-1,4-糖苷键连接于L-AA的C2位上。由于L-AA的C2位上有糖基掩蔽，不易发生氧化反应，所以在水溶液中特别稳定，并且AA-2G没有直接还原性，有效地保护了L-AA的生物活性。所以AA-2G是迄今发现的稳定性和性能最佳的L-AA替代品。
目前，AA-2G主要通过糖基转移酶生物催化生成，其中环糊精葡萄糖基转移酶（CGTase）是最常用的催化酶。通常以α-环糊精或β-环糊精为糖基供体，将葡萄糖基催化转移到受体L-AA上。然而，若以α-环糊精为糖基供体，成本太高；若以β-环糊精为糖基供体，由于它的溶解度较低，酶促反应效率受到较大限制。因此，选择一种既便宜又易溶的糖基供体（如麦芽糖）将会大大减少AA-2G的生产成本，提高其利润。但是，由于目前环糊精葡萄糖基转移酶（CGTase）对麦芽糖的底物特异性（转化率）较低，因此，通过分子改造CGTase技术提高其对麦芽糖的底物特异性，将推动与L-AA糖基衍生物相关行业的快速发展。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种麦芽糖底物特异性提高的环糊精糖基转移酶，以GenbankAF047363.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶为出发序列，第47位的赖氨酸突变成苯丙氨酸K47F、酪氨酸K47Y或脯氨酸K47P。其中优选突变为脯氨酸。
所述环糊精葡萄糖基转移酶来源于软化类芽孢杆菌(Peanibacillus macerans)。
所述环糊精葡萄糖基转移酶的获得方法为以Genbank AF047363.1公布的基因为出发基因,将第47位的赖氨酸突变成苯丙氨酸K47F、酪氨酸K47Y或脯氨酸K47P。
产所述环糊精葡萄糖基转移酶的基因工程菌或转基因细胞系也为本发明要求保护的范围。
本发明要解决的另一个技术问题是提供一种产环糊精葡萄糖基转移酶基因工程菌的构建方法，具体步骤如下：
1）采用化学全合成或PCR方法克隆编码所述环糊精葡萄糖基转移酶基因；
2）将步骤1）获得的环糊精葡萄糖基转移酶基因连接到大肠杆菌表达载体，得到重组表达载体；
3）将步骤2）获得的重组表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）得到基因工程菌。
本发明要解决的另一个技术问题是提供一种应用所述基因工程菌发酵生产环糊精葡萄糖基转移酶的方法，以产环糊精葡萄糖基转移酶突变体的基因工程菌为生产菌株，活化后按4%接种量将种子发酵液接到含100μg/mL氨苄青霉素的TB液体培养基；大肠杆菌在30℃摇床培养至OD600=0.6，加入0.01mM终浓度的IPTG诱导胞外表达，并在25℃摇床继续培养发酵90h后，将发酵液于4℃、10000rpm离心20min除菌体，收集富含环糊精葡萄糖基转移酶的上清液。
软化类芽孢杆菌（Peanibacillus macerans）JFB05-01（CCTCC NO：M208063），已在中国专利CN101294149公开，公开日2008年10月29日。
来源于软化类芽孢杆菌(Peanibacillus macerans)JFB05-01的环糊精葡萄糖基转移酶(简称CGTase)的三种突变体酶：K47F，K47Y及K47P，它们相比于野生型CGTase利用麦芽糖为糖基供体生产AA-2G时，产量分别提高17.1%，22.1%和32.9%。
本发明的有益效果：本发明构建了3个有意义的突变体，均实现了环糊精糖基转移酶对麦芽糖的底物特异性的提高，以此为糖基供体所产AA-2G产量均高于野生型CGTase，更利于AA-2G工业化生产。
附图说明：
图1不同反应时间下野生型CGTase和突变型酶生成AA-2G的产量。
■：野生型CGTase；●：K47F；▲：K47Y；◆:K47P。
具体实施方式
实施例1：底物特异性提高的环糊精葡萄糖基转移酶
本发明的环糊精糖基转移酶是在GenBank AF047363.1公布的基因序列基础上，将其47位点的赖氨酸突变成苯丙氨酸、酪氨酸或脯氨酸，分别为K47F、K47Y和K47P。
可以通过化学全合成或定点突变的方式将其成熟区的47位点进行氨基酸的取代。
实施例2：底物特异性提高的环糊精葡萄糖基转移酶的制备方法
本例以PCR方法为例进行说明，但被发明的保护并不限于仅通过PCR方法获得突变的方法。突变体酶K47F、K47Y和K47P的制备方法如下：
1）定点突变
单突变体酶K47F、K47Y和K47P的定点突变，利用快速突变试剂盒MutanBEST kit，以表达载体cgt/pET-20b(+)1为模板，
引入K47F密码子的顶点突变引物为：
正向引物：5'-CCAATTTGTTCCTCTATTTCGGGGG-3'，下划线为突变碱基；
反向引物：5'-ATCGGTCGCCGCTGAACGCA-3'；
引入K47Y密码子的顶点突变引物为：
正向引物：5'-CCAATTTGTACCTCTATTTCGGGGG-3'，下划线为突变碱基；
反向引物：5'-ATCGGTCGCCGCTGAACGCA-3'；
引入K47P密码子的顶点突变引物为：
正向引物：5'-CCAATTTGCCGCTCTATTTCGGGGG-3'，下划线为突变碱基；
反向引物：5'-ATCGGTCGCCGCTGAACGCA-3'。
PCR反应体系均为：5×PrimeSTAR Buffer(Mg2+Plus)10μL，2.5mM dNTPs4μL,10μM正向引物1μL，10μM反向引物1μL，模板DNA1μL，2.5U/μLPrimeSTAR Taq HS0.5μL，加入双蒸水至50μL；
PCR产物扩增条件均为：98℃预变性3min；随后进行98℃10s,62℃15s，72℃6min30个循环；最后72℃保温10min；
PCR产物经MutanBEST kit处理，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，感受态细胞在含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基培养过夜后，挑单克隆于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，后提取质粒，将突变质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，所有质粒均测序正确；
2）突变体表达与纯化：
挑取转入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)的单克隆于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养生长8~10h，按4%接种量将种子发酵液接到含100μg/mL氨苄青霉素的TB液体培养基；大肠杆菌在30℃摇床培养至OD600=0.6，加入0.01mM终浓度的IPTG诱导胞外表达，并在25℃摇床继续培养发酵90h后，将发酵液于4℃、10000rpm离心20min除菌体，收集上清液。
上清液中加入70%固体硫酸铵盐析过夜，4℃、10000rpm离心20min，取沉淀物用适量含20mM磷酸钠、0.5M氯化钠、20mM咪唑、pH7.4的缓冲液A溶解，并在缓冲液A中透析过夜后，通过0.22μm膜过滤后制成上样样品；Ni亲和柱用缓冲液A平衡后，将上样样品吸入Ni柱，使之完全吸附后，分别用含20-480mM咪唑的缓冲液A、含480mM咪唑的缓冲液A的洗脱，流速1mL/min，检测波长为280nm，分部收集含CGTase酶活的洗脱液；活力组分在50mM磷酸钠缓冲液（pH=6）中透析过夜后，分别得到纯化突变体酶K47F、K47Y和K47P。
实施例3：本实施例说明酶活分析及AA-2G的合成及检测。
1）酶活测定方法：
甲基橙法测定α-环化活力的方法:取适当稀释的酶液0.1mL，加入装有0.9mL预先用50mM磷酸缓冲液（pH6.5）配制的3%可溶性淀粉溶液中，在40℃下反应10min后，加入1.0mL1.0M的盐酸停止反应，再加入1.0mL用50mM磷酸缓冲液配制的0.1mM甲基橙，在16℃下保温20min，在505nm下测定吸光度。一个酶活单位定义在该条件下每分钟生成1μmolα-环糊精所需酶量。
淀粉水解活力测定方法：将适量的酶液加入到含1%可溶性淀粉的50mM磷酸缓冲液中（pH6.5），50℃反应10min，然后用DNS法测定还原糖浓度。一个酶活单位定义在该条件下每分钟生成1μmol还原糖所需酶量。
歧化反应活力测定方法：将含有6mM供体底物4-硝基苯基-α-D-麦芽庚糖-4-6-O-亚乙基（EPS）和10mM受体底物麦芽糖的10mM柠檬酸缓冲液（pH6.0）在50℃保温10min中，然后加入适当稀释的酶液0.1mL反应，每0.5min取100μL反应样品加入20μL1.2MHCl(4℃)，然后在60℃保温10min使CGTase失活。随后，加入20μL1.2M NaOH中和，将样品加到磷酸缓冲液（pH7.0），并加入60μL（1U）α-糖苷酶于37℃反应60min。加入1mL1M碳酸钠使样品pH升至8以上，在401nm波长下侧吸光值（ε401=18.4mM-1）。1单位酶活定义为每分钟转化1μmol的酶的量。
AA-2G的合成及检测方法：将适量酶液加入含有麦芽糖和L-AA（终浓度为5%）的醋酸-醋酸钠缓冲液中（pH5.5），于避光避氧条件下37℃反应24h，然后加入10U/mL糖化酶在65℃，pH5.5条件下反应24h，通过HPLC方法检测AA-2G产量。
HPLC检测AA-2G产量方法：酶反应样品通过0.22μm滤膜过滤，使用Amethyst C18-H柱(4.6×250mm,Sepax,America)检测。检测波长：238nm；流动相：0.05M KH2PO4/H3PO4
(pH2.0)；流速：0.6mL/min。在此条件下，在大约10min时会出现AA-2G的流出峰。AA-2G浓度通过峰面积计算而得。
2）酶活比较：实验结果见下表，将上述突变体表达获得的突变体纯酶制品与野生菌纯酶制品相比，可以发现：
与野生型CGTase相比：
突变体酶K47F、K47Y和K47Pα-环化活力分别降低44.9%、52.5%和2.6%；
突变体酶K47F略微提高6.5%，K47Y和K47P淀粉水解活力分别降低了62.2%和68.7%；
突变体酶K47F、K47Y和K47P歧化活力分别提高了：12.5%，18.1%和30.2%；
突变体酶K47F、K47Y和K47P以麦芽糖为糖基供体生成AA-2G产量分别提高了：17.1%，21.1%和32.8%。
3）不同反应时间下野生型CGTase和突变型酶生成AA-2G产量的比较：结果列于图1，可以发现，突变型K47F酶在反应16h时AA-2G达到最高产量;野生型，突变型K47Y和K47P在反应20h时AA-2G达到最高产量。
Claims (2)
1.一种应用环糊精糖基转移酶以麦芽糖为底物制备2-O-α-D-吡喃型葡萄糖基-L-抗坏血酸的方法，其特征在于，所述环糊精糖基转移酶是以Genbank AF047363.1所示的基因序列编码的环糊精葡萄糖基转移酶为出发序列，将成熟酶第47位的赖氨酸突变为酪氨酸或脯氨酸。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于，将成熟酶第47位的赖氨酸突变脯氨酸。
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