CN101503680B - 具有高产β-环糊精能力的环糊精葡萄糖基转移酶的突变体及突变方法 - Google Patents
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Abstract
具有高产β-环糊精能力的环糊精葡萄糖基转移酶的突变体及突变方法，属于基因工程和酶工程领域。本发明利用蛋白质工程的定点突变方法提高一种环糊精葡萄糖基转移酶(简称CGT酶)产β-环糊精能力，提供了提高来源于Peanibacillus macerans JFB05-01(CCTCC NO：M 208063)的CGT酶产β-环糊精能力的突变方案，将CGT酶的47位的Lys分别替换成Arg，His及Thr，获得的三种突变体酶K47R，K47H，K47T，它们的β-环糊精生产能力较野生型CGT酶有所提高；其中，突变体酶K47T尤为显著。这些突变体酶比野生型CGT酶更利于β-环糊精的工业化生产。
Description
技术领域
具有高产β-环糊精能力的环糊精葡萄糖基转移酶的突变体及突变方法，本发明属于基因工程和酶工程领域。具体地说本发明是利用蛋白质工程的定点突变方法改善环糊精葡萄糖基转移酶(CGT酶)的产物特异性的技术。
背景技术
环糊精是由六个以上葡萄糖连结而成的具有环状疏水圆锥形结构的低聚糖非还原性化合物系列，其中最常用的是α-、β-、γ-环糊精，它们分别由6、7、8个葡萄糖单元构成。目前，环糊精的工业化生产均采用酶法合成，即在CGT酶催化作用下，通过环化反应转化淀粉及相关基质合成环糊精。由于环糊精能与许多客体分子形成包合物，从而改变客体分子的物理和化学性质如溶解度、稳定性等，因此在食品、医药、农业、纺织、环保、化妆品、生物技术和分析化学等领域具有广泛的应用。
CGT酶是一个多功能型的酶，它能催化四种不同的反应：三种转糖基化反应(歧化反应、环化反应和偶合反应)和水解反应。CGT酶通过环化反应能利用淀粉生产环糊精，这是其工业应用的基础。用CGT酶生产环糊精一个主要的不利条件是所有已知的野生型CGT酶生产的是α-、β-、γ-环糊精的混合物。这不仅给产物的分离纯化带来很大不便，而且提高了成本。
本发明主要是对来源于软化类芽孢杆菌Peanibacillus macerans JFB05-01(CCTCC NO：M 208063)的CGT酶进行了产物特异性的定点突变改造。
发明内容
本发明的目的是提供提高P.macerans JFB 05-01 CGT酶产β-环糊精能力的突变方案。
本发明的再一个目的是提出具有更高β-环糊精生产能力的突变体酶K47R，K47H，K47T，及其构建方法。
本发明的技术方案：来源于软化类芽孢杆菌(Peanibacillus macerans)JFB05-01的环糊精葡萄糖基转移酶，简称CGT酶，的三种突变体酶K47R，K47H及K47T，将CGT酶基因中第47位的赖氨酸Lys分别变成了精氨酸Arg，组氨酸His或苏氨酸Thr，分别命名为K47R，K47H及K47T，它们相比于野生型CGT酶具有更高的产β-环糊精能力。
软化类芽孢杆菌(Peanibacillus macerans)JFB 05-01(CCTCC NO：M208063)，已在中国专利CN101294149A公开，公开日2008年10月29日。
所述的三种突变体酶K47R，K47H及K47T的制备方法，根据P.maceransJFB 05-01 CGT酶基因序列，分别设计并合成引入Arg47，His47，Thr47密码子的定点突变引物，对基因进行定点突变，测定DNA序列，分别鉴别出Lys47密码子变成Arg47密码子，His47密码子及Thr47密码子的突变体，并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。
(1)定点突变
利用快速PCR技术，以表达载体cgt/pET-20b(+)为模板进行定点突变，
引入Arg47密码子的定点突变引物为：
正向引物：5’-CGATCCAATTTGCGGCTCTATTTCGG-3’(下划线为突变碱基)，
反向引物：5’-CCGAAATAGAGCCGCAAATTGGATCG-3’(下划线为突变碱基)，
引入His47密码子的定点突变引物为：
正向引物：5’-CGATCCAATTTGCACCTCTATTTCGG-3’(下划线为突变碱基)，
反向引物：5’-CCGAAATAGAGGTGCAAATTGGATCG-3’(下划线为突变碱基)，
引入Thr47密码子的定点突变引物为：
正向引物：5’-CGATCCAATTTGACGCTCTATTTCGG-3’(下划线为突变碱基)，
反向引物：5’-CCGAAATAGAGCGTCAAATTGGATCG-3’(下划线为突变碱基)，
PCR反应体系均为：10×Ex Taq buffer 5μL，dNTPs(2.5mM)5μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板DNA 1μL，Ex Taq HS(5U/μL)0.25μL，加入双蒸水至50μL。
PCR扩增条件均为：94℃预变性4min；随后进行35个循环(94℃30s，55℃30s，72℃6min)；最后72℃保温10min。
PCR产物经Dpn I(购自加拿大Fermentas公司)消化，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，感受态细胞在LB固体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)培养过夜后，挑单克隆于LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中培养，后提取质粒，将突变质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，所有突变质粒均测序正确。
(2)突变体的表达与纯化：
挑取转入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)的单克隆于LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)生长8～10h，按4％接种量将种子发酵液接到TB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)；大肠杆菌在30℃摇床培养至OD600＝0.6，加入0.01mM终浓度的IPTG诱导胞外表达，并在25℃摇床继续培养发酵90小时后，将发酵液于4℃、10000rpm离心20min除菌体，收集上清液并纯化，分别得到突变体酶K47R，K47H和K47T制品。
本发明的有益效果：本发明构建了三个有意义的突变体，均实现了β-环糊精产物特异性的提高，比野生型CGT酶更利于β-环糊精的工业化生产。
附图说明
图1野生型和突变型CGT酶的三种环糊精产量。A、野生型CGT酶；B、突变体酶K47R；C、突变体酶K47H；D、突变体酶K47T。其中◆表示α-环糊精；■表示β-环糊精；▲表示γ-环糊精。
具体实施方式
实施例1：本实施例说明突变体酶K47R，K47H及K47T的制备。
1)定点突变
利用快速PCR技术，以表达载体cgt/pET-20b(+)为模板进行定点突变，
引入Arg47密码子的定点突变引物为：
正向引物：5’-CGATCCAATTTGCGGCTCTATTTCGG-3’(下划线为突变碱基)，
反向引物：5’-CCGAAATAGAGCCGCAAATTGGATCG-3’(下划线为突变碱基)，
引入His47密码子的定点突变引物为：
正向引物：5’-CGATCCAATTTGCACCTCTATTTCGG-3’(下划线为突变碱基)，
反向引物：5’-CCGAAATAGAGGTGCAAATTGGATCG-3’(下划线为突变碱基)，
引入Thr47密码子的定点突变引物为：
正向引物：5’-CGATCCAATTTGACGCTCTATTTCGG-3’(下划线为突变碱基)，
反向引物：5’-CCGAAATAGAGCGTCAAATTGGATCG-3’(下划线为突变碱基)，
PCR反应体系均为：10×Ex Taq buffer 5μL，dNTPs(2.5mM)5μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板DNA 1μL，Ex Taq HS(5U/μL)0.25μL，加入双蒸水至50μL。
PCR扩增条件均为：94℃预变性4min；随后进行35个循环(94℃30s，55℃30s，72℃6min)；最后72℃保温10min。
三种PCR产物分别经Dpn I(购自加拿大Fermentas公司)消化，转化大肠杆菌JM 109感受态细胞，感受态细胞在LB固体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)培养过夜后，挑单克隆于LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中培养，后提取质粒，将突变质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，所有突变质粒均测序正确。
2)突变体的表达与纯化：
挑取转入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)的单克隆于LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)生长8～10h，按4％接种量将种子发酵液接到TB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)。大肠杆菌在30℃摇床培养至OD600＝0.6，加入0.01mM终浓度的IPTG诱导胞外表达，并在25℃摇床继续培养发酵90小时后，将发酵液于4℃、10000rpm离心20min除菌体，分别收集上清液。
上清液中加入70％固体硫酸铵盐析过夜，4℃、10000rpm离心20min，取沉淀物用适量含20mM磷酸钠、0.5M氯化钠和20mM咪唑、pH 7.4的缓冲液A溶解，并在缓冲液A中透析过夜后，通过0.22μm膜过滤后制成上样样品；Ni亲和柱用缓冲液A平衡后，将上样样品吸入Ni柱，使之完全吸附后，分别用缓冲液A、含20-480mM咪唑的缓冲液A、含480mM咪唑的缓冲液A洗脱，流速1mL/min，检测波长为280nm，分部收集含CGT酶酶活的洗脱液；活力组分在50mM磷酸钠缓冲液(pH＝6)中透析过夜后，分别得到纯化突变体酶K47R，K47H及K47T。
实施例2：本实施例说明酶活分析。
1)酶活测定方法
甲基橙法测定α-环化活力的方法：取适当稀释的酶液0.1mL，加入装有0.9mL预先用50mM磷酸缓冲液(pH6.5)配制的3％(w/v)可溶性淀粉溶液中，在40℃下反应10min后，加入1.0mL 1.0N的盐酸停止反应，再加入1.0mL用50mM磷酸缓冲液配制的0.1mM甲基橙，在16℃下保温20min，在505nm下测定吸光度。一个酶活单位定义为在上述条件下每分钟生成1μmol α-环糊精所需的酶量。
酚酞法测定β-环化活力的方法：取适当稀释的酶液0.1mL，加入装有0.9mL预先用50mM磷酸缓冲液(pH6.5)配制的3％(w/v)可溶性淀粉溶液的试管中，在40℃下反应10min后，加入3.5mL 30mM NaOH和0.5mL由5mM Na2CO3溶液配制的0.02％(w/v)酚酞停止反应，在室温下保温20min，在550nm下测定吸光度。一个酶活单位定义为在上述条件下每分钟生成1μmol β-环糊精所需的酶量。
溴甲酚氯法测定γ-环化活力的方法：取适当稀释的酶液0.1mL，加入装有0.9mL预先用50mM磷酸缓冲液(pH6.5)配制的3％(w/v)可溶性淀粉溶液的试管中，在40℃下反应10min后，加入50μL 1.0N的盐酸停止反应，再加入2mL0.2M柠檬酸缓冲液(pH 4.2)和100μL 5mM溴甲酚氯溶液，在室温下保温20min，在630nm下测定吸光度。一个酶活单位定义为在上述条件下每分钟生成1μmol γ-环糊精所需的酶量。
2)酶活比较
实验结果列于表1。野生型CGT酶有更高的α-环化活力，与野生型相比，突变体酶K47R的α-环化活力降低了13％，β-环化活力增加至1.5倍；突变体酶K47H的α-环化活力降低了34％，β-环化活力增加至2.2倍；K47T的β-环化活力显著升高，β-环化活力高于α-环化活力。突变体酶K47R，K47H，K47T的总环化活力有所下降。而且，突变体酶K47R，K47H，K47T的β-环化活力占总环化活力的比例高于野生型酶。
表1
实施例3：本实施例说明HPLC方法分析环糊精生成量。
配制5％(湿基，含水量8％，w/v)可溶性淀粉溶液作为底物，5g淀粉溶解在90mL磷酸钠缓冲液(pH6.0)中，定容至100mL，在沸水中煮沸30min。分别加入一定量的野生CGT酶、突变酶K47R、K47H、或K47T使反应体系中酶活为0.2U/mL，置于40℃下反应40h，隔时间取样600μL，12000rpm离心10min，取上清500μL，加5μL糖化酶(70U/mL)，在30℃糖化1h，10min煮沸灭活，12000rpm离心30min，取上清经0.45μm超滤膜过滤后取20μL上HPLC分析。
反应液中α-，β-，和γ-环糊精的浓度采用HPLC测定，采用HPLC进行产物分析的色谱条件是：Waters 600HPLC色谱仪，Waters自动进样器，色谱柱Lichrosorb NH2(4.6mm×150mm)，Waters2410示差检测器；流动相(V/V)为65％乙腈水溶液，流速1mL min-1；柱温30℃。
实验结果列于图1，将上述突变体表达获得的突变体纯酶制品与野生型纯酶制品相比，可以发现，突变体K47R，K47H，K47T实现了β-环糊精生产能力的提高。表2可以看出，通过40h培养后，与野生型相比，这三个突变体的β-环糊精产量分别增加了4％，8％及13％，而α-环糊精产量降低了11％，21％及34％。
表2
序列表
<210>SEQ ID NO：1
正向引物：5’-CGATCCAATTTGCGGCTCTATTTCGG-3’，
反向引物：5’-CCGAAATAGAGCCGCAAATTGGATCG-3’，
<210>SEQ ID NO：2
正向引物：5’-CGATCCAATTTGCACCTCTATTTCGG-3’，
反向引物：5’-CCGAAATAGAGGTGCAAATTGGATCG-3’，
<210>SEQ ID NO：3
正向引物：5’-CGATCCAATTTGACGCTCTATTTCGG-3’，
反向引物：5’-CCGAAATAGAGCGTCAAATTGGATCG-3’。
Claims (3)
1.来源于软化类芽孢杆菌(Peanibacillus macerans)JFB 05-01的环糊精葡萄糖基转移酶的突变体酶K47R的制备方法，其特征在于：
(1)定点突变
利用快速PCR技术，以表达载体cgt/pET-20b(+)为模板进行定点突变，引入Arg47密码子的定点突变引物为：
正向引物：5’-CGATCCAATTTGCGGCTCTATTTCGG-3’，下划线为突变碱基，
反向引物：5’-CCGAAATAGAGCCGCAAATTGGATCG-3’，下划线为突变碱基，
PCR反应体系均为：10×Ex Taq buffer5μL，2.5mM dNTPs 5μL，10μM正向引物1μL，10μM反向引物1μL，模板DNA 1μL，5U/μL Ex Taq HS 0.25μL，加入双蒸水至50μL；
PCR扩增条件均为：94℃预变性4min；随后94℃30s，55℃30s，72℃6min进行35个循环；最后72℃保温10min；
PCR产物经Dpn I消化，转化大肠杆菌JM 109感受态细胞，感受态细胞在含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基培养过夜后，挑单克隆于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，后提取质粒，将突变质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，突变质粒测序正确；
(2)突变体的表达与纯化：
挑取转入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)的单克隆于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基生长8～10h，按4％接种量将种子发酵液接到含100μg/mL氨苄青霉素的TB液体培养基；大肠杆菌在30℃摇床培养至OD600＝0.6，加入0.01mM终浓度的IPTG诱导胞外表达，并在25℃摇床继续培养发酵90小时后，将发酵液于4℃、10000rpm离心20min除菌体，收集上清液并纯化，得到突变体酶K47R制品。
2.来源于软化类芽孢杆菌(Peanibacillus macerans)JFB 05-01的环糊精葡萄糖基转移酶的突变体酶K47H的制备方法，其特征在于：
(1)定点突变
利用快速PCR技术，以表达载体cgt/pET-20b(+)为模板进行定点突变，引入His47密码子的定点突变引物为：
正向引物：5’-CGATCCAATTTGCACCTCTATTTCGG-3’，下划线为突变碱基，
反向引物：5’-CCGAAATAGAGGTGCAAATTGGATCG-3’，下划线为突变碱基，
PCR反应体系均为：10×Ex Taq buffer5μL，2.5mM dNTPs 5μL，10μM正向引物1μL，10μM反向引物1μL，模板DNA 1μL，5U/μL Ex Taq HS 0.25μL，加入双蒸水至50μL；
PCR扩增条件均为：94℃预变性4min；随后94℃30s，55℃30s，72℃6min进行35个循环；最后72℃保温10min；
PCR产物经Dpn I消化，转化大肠杆菌JM 109感受态细胞，感受态细胞在含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基培养过夜后，挑单克隆于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，后提取质粒，将突变质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，突变质粒测序正确；
(2)突变体的表达与纯化：
挑取转入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)的单克隆于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基生长8～10h，按4％接种量将种子发酵液接到含100μg/mL氨苄青霉素的TB液体培养基；大肠杆菌在30℃摇床培养至OD600＝0.6，加入0.01mM终浓度的IPTG诱导胞外表达，并在25℃摇床继续培养发酵90小时后，将发酵液于4℃、10000rpm离心20min除菌体，收集上清液并纯化，得到突变体酶K47H制品。
3.来源于软化类芽孢杆菌(Peanibacillus macerans)JFB 05-01的环糊精葡萄糖基转移酶的突变体酶K47T的制备方法，其特征在于：
(1)定点突变
利用快速PCR技术，以表达载体cgt/pET-20b(+)为模板进行定点突变，引入Thr47密码子的定点突变引物为：
正向引物：5’-CGATCCAATTTGACGCTCTATTTCGG-3’，下划线为突变碱基，
反向引物：5’-CCGAAATAGAGCGTCAAATTGGATCG-3’，下划线为突变碱基，
PCR反应体系均为：10×Ex Taq buffer5μL，2.5mM dNTPs 5μL，10μM正向引物1μL，10μM反向引物1μL，模板DNA 1μL，5U/μL Ex Taq HS 0.25μL，加入双蒸水至50μL；
PCR扩增条件均为：94℃预变性4min；随后94℃30s，55℃30s，72℃6min进行35个循环；最后72℃保温10min；
PCR产物经Dpn I消化，转化大肠杆菌JM 109感受态细胞，感受态细胞在含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基培养过夜后，挑单克隆于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，后提取质粒，将突变质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，突变质粒测序正确；
(2)突变体的表达与纯化：
挑取转入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)的单克隆于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基生长8～10h，按4％接种量将种子发酵液接到含100μg/mL氨苄青霉素的TB液体培养基；大肠杆菌在30℃摇床培养至OD600＝0.6，加入0.01mM终浓度的IPTG诱导胞外表达，并在25℃摇床继续培养发酵90小时后，将发酵液于4℃、10000rpm离心20min除菌体，收集上清液并纯化，得到突变体酶K47T制品。
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