CN102958534A

CN102958534A - Notch1结合剂及其使用方法

Info

Publication number: CN102958534A
Application number: CN2011800094573A
Authority: CN
Inventors: 爱德华·特恩·图恩·范德霍斯特
Original assignee: Oncomed Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Oncomed Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2010-01-13
Filing date: 2011-01-13
Publication date: 2013-03-06
Anticipated expiration: 2031-01-13
Also published as: ES2561102T3; CN102958534B; EP2523682A4; EP2523682A2; WO2011088215A3; MX2012008085A; WO2011088215A2; EP2523682B1; US8834875B2; US20120213786A1; HK1181316A1; AU2011205316B2; AU2011205316A1

Abstract

本发明涉及Notch1结合剂和使用该剂用于治疗疾病诸如血液癌症的方法。本发明提供特异性结合人Notch1的胞外域的非配体结合近膜区的抗体。本发明还提供使用抑制Notch1活性的剂用于治疗癌症的方法。还描述治疗血液癌症的方法，包括向患有血液癌症诸如T细胞淋巴母细胞性白血病的受治疗者施用治疗有效量的本发明的结合剂或抗体。

Description

Notch1结合剂及其使用方法

相关申请的交叉参考

本申请要求2010年1月13日提交的美国临时申请No.61/294,762和2010年11月5日提交的美国临时申请No.61/410,651的优先权权益，其每一篇通过引用全文并入本文。

发明领域

本发明的领域一般涉及结合人Notch1的抗体和其它剂，以及涉及使用该抗体和其它剂用于治疗血液疾病、尤其是Notch途径相关的疾病的方法。

发明背景

Notch信号传导途径是普遍地保守的信号转导系统。其牵涉在发育期间的细胞命运确定中，包括胚胎模式形成和胚后组织维持。另外，Notch信号传导已被鉴定为维持造血干细胞的关键因子。

哺乳动物Notch受体家族包括4个成员：Notch1、Notch2、Notch3和Notch4。Notch受体是大的单跨膜I型跨膜蛋白，具有多个保守的结构基序。胞外域包含牵涉在配体结合中的可变数目的表皮生长因子（EGF）-样重复和牵涉在Notch异二聚化中的三个富含半胱氨酸的LIN-12/Notch重复（LNR）。胞内域包含牵涉在结合Notch下游信号传导蛋白中的RAM23基序、也牵涉在介导下游信号传导中的7cdc10/锚蛋白重复、和牵涉在Notch蛋白降解中的PEST结构域。

哺乳动物Notch配体包括Δ-样1（DLL1）、Δ-样3（DLL3）、Δ-样4（DLL4）、Jagged1和Jagged2。类似于Notch受体，Notch配体是具有多个保守结构基序的I型跨膜蛋白。所有Notch配体共同的胞外基序包括牵涉在受体结合中的单个Δ/Serrate/Lag-2（DSL）结构域、以及可能牵涉在稳定受体结合中的可变数目的EGF-样重复。Jagged蛋白的胞外域包含富含半胱氨酸的区域，其与von Willebrand因子C型结构域具有部分同源性，并可能牵涉在配体二聚化中。这一基序在DLL家族成员中不存在。（Leong等,2006, Blood，107:2223-2233）。

Notch受体的胞外域与通常位于相邻细胞上的Notch配体的胞外域相互作用，导致Notch受体的2个蛋白水解切割。一个胞外切割由ADAM（A Disintegrin And Metallopeptidase，解整合素-金属肽酶）蛋白酶介导，跨膜域内的第二切割由γ分泌酶复合物介导。后一切割产生Notch胞内域（ICD），该Notch胞内域移位进入细胞核，在细胞核中其激活CBF1，Suppressor of Hairless，Lag-2（CSL）家族的转录因子，上述家族的转录因子作为主要下游效应子增加Hairy/Split增强子（HES）家族的细胞核碱性螺旋-环-螺旋转录因子的转录。（Artavanis等,1999,Science,284:770；Brennan和Brown,2003,Breast Cancer Res.,5:69；Iso等,2003,Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.,23:543）。

Notch途径已经与血液和实体的肿瘤和癌症二者的发病关联。与肿瘤发生相关的许多细胞功能和微环境信号已经显示为被Notch途径信号传导调节，包括细胞增殖、凋亡、粘附和血管发生。（Leong等,2006,Blood，107:2223-2233）。另外，Notch受体和/或Notch配体已经显示为在多种人癌症中起到潜在的致癌作用，所述人癌症包括急性骨髓性白血病、B细胞慢性淋巴细胞性白血病、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、T细胞急性淋巴母细胞性白血病、脑癌、乳癌、宫颈癌、结肠癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌和皮肤癌。（Leong等,2006,Blood，107:2223-2233）。

人中的Notch1基因首先在T细胞急性淋巴母细胞性白血病的亚型中鉴定为导致Notch途径激活的移位的基因座（Ellisen等,1991,Cell，66:649-61）。最近已显示，多于50%的人T细胞急性淋巴母细胞性白血病具有牵涉Notch1的胞外异二聚结构域和/或C末端PEST结构域的激活突变（Weng等,2004,Science,306:269-271；Pear & Aster,2004,Curr.Opin.Hematol.,11:416-33）。小鼠模型中T细胞内的Notch1信号传导的组成型激活类似地产生T细胞淋巴瘤，表明了发病原因（Robey等,1996,Cell，87:483-92；Pear等,1996,J.Exp.Med.,183:2283-91；Yan等,2001,Blood，98:3793-9；Bellavia等,2000,EMBO J.,19:3337-48）。逆转录病毒激活的Notch2已经牵涉在由猫白血病病毒引起的胸腺淋巴瘤中（Rohn等,1996,J.Virology,70:8071-8080）。人T细胞急性淋巴母细胞性白血病样品已经显示表达Notch3和其靶基因HES-1，其在正常外周T细胞或非T细胞白血病中都不表达（Bellavia等,2002,PNAS，99:3788-3793）。如此，Notch途径已经被鉴定为用于多种血液癌症中治疗性介入的可能的靶。

已经报道了抗-Notch抗体及其作为抗癌治疗剂的可能应用。参见例如美国专利申请公布第2008/0131434和2009/0081238号，通过引用将其每一篇整体并入本文。还参见国际公布No.WO2008/057144、WO2008/076960、WO2008/150525、WO2010/005566和WO2010/005567；通过引用将其每一篇整体并入本文。

发明概要

本发明提供特异性结合Notch1受体的胞外域的非配体结合近膜区的结合剂（例如抗体），和包含所述剂的组合物，例如药物组合物。本发明还提供使用该结合剂用于治疗血液癌症的方法，通过向需要其的受治疗者施用该剂。在一些实施方案中，该方法包括抑制癌细胞的生长。在一些实施方案中，该癌症是血液癌症，诸如白血病或淋巴瘤。在一些实施方案中，该血液癌症是急性骨髓性白血病、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤或T细胞急性淋巴母细胞性白血病。在一些实施方案中，该血液癌症是T细胞急性淋巴母细胞性白血病。在一些实施方案中，该治疗血液癌症的方法包括抑制Notch1信号传导。在一些实施方案中，该治疗血液癌症的方法包括抑制Notch1激活。在一些实施方案中，该治疗癌症或抑制癌细胞生长的方法包括用该结合剂靶向癌干细胞。在一些实施方案中，该癌干细胞包括白血病起源细胞（leukemia initiating cell）。在一些实施方案中，该方法包括减少受治疗者中癌干细胞的频率，减少受治疗者中癌干细胞的数量，减少癌症的致瘤性，和/或通过减少受治疗者中癌干细胞的数量或频率来减少癌症的致瘤性。

在一方面，本发明提供治疗受治疗者中血液癌症的方法，包括向所述受治疗者施用治疗有效量的特异性结合人Notch1的胞外域的非配体结合近膜区的结合剂。在一些实施方案中，该血液癌症是急性骨髓性白血病、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤或T细胞急性淋巴母细胞性白血病。在一些实施方案中，该血液癌症是T细胞急性淋巴母细胞性白血病。在一些实施方案中，该结合剂是抗体。在一些实施方案中，该结合剂是包括以下的抗体：(a)包含RGYWIE（SEQ ID NO:15）的重链CDR1、包含QILPGTGRTNYNEKFKG（SEQ ID NO:16）的重链CDR2、和包含FDGNYGYYAMDY（SEQ ID NO:17）的重链CDR3；和/或(b)包含RSSTGAVTTSNYAN（SEQ ID NO:18）的轻链CDR1、包含GTNNRAP（SEQ ID NO:19）的轻链CDR2、和包含ALWYSNHWVFGGGTKL（SEQ ID NO:20）的轻链CDR3。

在某些实施方案中，本发明提供治疗受治疗者中血液癌症的方法，包括向所述受治疗者施用治疗有效量的特异性结合人Notch1的胞外域的非配体结合近膜区的结合剂（例如抗体），其中该结合剂包括：(a)包含RGYWIE（SEQ ID NO:15）、或包含1、2、3或4个氨基酸取代的其变体的重链CDR1；(b)包含QILPGTGRTNYNEKFKG（SEQ ID NO:16）、或包含1、2、3或4个氨基酸取代的其变体的重链CDR2；和/或(c)包含FDGNYGYYAMDY（SEQ ID NO:17）、或包含1、2、3或4个氨基酸取代的其变体的重链CDR3。在某些实施方案中，该结合剂（例如抗体）包括（或还包括）(a)包含RSSTGAVTTSNYAN（SEQ ID NO:18）、或包含1、2、3或4个氨基酸取代的其变体的轻链CDR1；(b)包含GTNNRAP（SEQ ID NO:19）、或包含1、2、3或4个氨基酸取代的其变体的轻链CDR2；和/或(c)包含ALWYSNHWVFGGGTKL（SEQID NO:20）、或包含1、2、3或4个氨基酸取代的其变体的轻链CDR3。在一些实施方案中，该氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，该血液癌症是急性骨髓性白血病、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤或T细胞急性淋巴母细胞性白血病。在一些实施方案中，该血液癌症是T细胞急性淋巴母细胞性白血病。

在某些实施方案中，本发明提供治疗受治疗者中血液癌症的方法，包括向所述受治疗者施用治疗有效量的特异性结合人Notch1的胞外域的非配体结合近膜区的结合剂（例如抗体），其中该结合剂包括：(a)与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:24具有至少约90%、至少约95%、至少约98%或100%序列同一性的重链可变区；和/或(b)与SEQID NO:8、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:32具有至少约90%、至少约95%、至少约98%或100%序列同一性的轻链可变区。在一些实施方案中，该结合剂（例如抗体）包括包含SEQ ID NO:14的重链可变区和包含SEQ ID NO:8的轻链可变区。在一些实施方案中，该结合剂（例如抗体）包括包含SEQ ID NO:24的重链可变区和包含SEQ IDNO:28的轻链可变区。在一些实施方案中，该结合剂（例如抗体）包括包含SEQ IDNO:24的重链可变区和包含SEQ ID NO:32的轻链可变区。在一些实施方案中，该Notch1结合剂是抗体52M51。在一些实施方案中，该Notch1结合剂是抗体52M51的人源化形式。

在某些实施方案中，该Notch1结合剂包括52M51抗体的重链和轻链（带有或不带有信号/前导序列）。在某些实施方案中，该Notch1结合剂是52M51抗体。在一些实施方案中，该Notch1是抗体52M51的人源化形式。按照布达佩斯条约的规定，产生52M51抗体的杂交瘤细胞系在2008年8月7日保藏在美国典型培养物保藏中心（ATCC）,10801 University Boulevard,Manassas,VA,USA，分配的指定编号是PTA-9405。在一些实施方案中，该抗体是由按照布达佩斯条约的规定，在2008年10月15日保藏在ATCC，分配的指定编号是PTA-9549的多核苷酸编码的抗体52M51的人源化形式52M51H4L3。

在上述方面或实施方案、以及本文别处描述的其它方面和/或实施方案的每一个的某些实施方案中，该结合剂（例如抗体）特异性结合Notch1受体的胞外域的非配体结合近膜区，其中Notch1受体的非配体结合近膜区包括人Notch1受体的约氨基酸1427至约氨基酸1732。在一些实施方案中，Notch1受体的近膜区包括SEQ ID NO:2的至少一部分。在一些实施方案中，Notch1受体的近膜区包括SEQ ID NO:2。在某些实施方案中，该结合剂（例如抗体）特异性结合至少一种另外Notch受体的胞外域的非配体结合近膜区。

在一些实施方案中，本发明提供特异性结合与抗体52M51结合的表位相同或重叠的Notch1表位的抗体。

在另一方面，本发明提供治疗受治疗者中血液癌症的方法，包括向所述受治疗者施用治疗有效量的特异性结合人Notch1的胞外域的非配体结合近膜区的结合剂（例如抗体），其中该结合剂结合所述近膜区中的与由以ATCC专利保藏号PTA-9405保藏的杂交瘤细胞系产生的抗体52M51结合的表位相同的表位。在一些实施方案中，该结合剂与抗体52M51竞争对Notch1近膜区的特异性结合。在一些实施方案中，该结合剂与抗体52M51竞争对包含SEQ ID NO:2的至少一部分的Notch1的非配体结合近膜区的特异性结合。在一些实施方案中，该结合剂与抗体52M51竞争对包含SEQ ID NO:2的Notch1的非配体结合近膜区中的表位的特异性结合。在一些实施方案中，该血液癌症是急性骨髓性白血病、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤或T细胞急性淋巴母细胞性白血病。在一些实施方案中，该血液癌症是T细胞急性淋巴母细胞性白血病。

在另一方面，本发明提供抑制血液癌症生长的方法，包括将所述癌细胞与有效量的特异性结合人Notch1受体的胞外域的非配体结合近膜区的结合剂（例如抗体）接触，其中该抗体包括：(a)包含RGYWIE（SEQ ID NO:15）的重链CDR1、包含QILPGTGRTNYNEKFKG（SEQ ID NO:16）的重链CDR2、和包含FDGNYGYYAMDY（SEQ ID NO:17）的重链CDR3；和/或(b)包含RSSTGAVTTSNYAN（SEQ ID NO:18）的轻链CDR1、包含GTNNRAP（SEQ ID NO:19）的轻链CDR2、和包含ALWYSNHWVFGGGTKL（SEQ ID NO:20）的轻链CDR3。在一些实施方案中，该血液癌症是急性骨髓性白血病、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤或T细胞急性淋巴母细胞性白血病。在一些实施方案中，该血液癌症是T细胞急性淋巴母细胞性白血病。

在上述方面或实施方案、以及本文别处描述的其它方面和/或实施方案的每一个的某些实施方案中，该结合剂是抗体。在一些实施方案中，该抗体是重组抗体。在一些实施方案中，该抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，该抗体是嵌合抗体。在一些实施方案中，该抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，该抗体是人抗体。在某些实施方案中，该抗体是抗体片段。在某些实施方案中，该抗体或抗体片段是单价、单特异性、二价、双特异性或多特异性的。在某些实施方案中，该抗体与细胞毒性部分共轭。在某些实施方案中，该抗体是分离的。在又另外的实施方案中，该抗体是大体上纯的。

还提供包含用在本文所述的治疗血液癌症的方法中的、特异性结合人Notch1受体的胞外域的非配体结合近膜区的结合剂（例如抗体）的药物组合物。在某些实施方案中，该药物组合物还包括药学上可接受的载体。

在上述方面或实施方案、以及本文别处描述的其它方面和/或实施方案的每一个的某些实施方案中，该结合剂（例如抗体）是Notch1拮抗剂。在一些实施方案中，该结合剂抑制Notch1信号传导。在一些实施方案中，该结合剂抑制Notch1激活。在一些实施方案中，该结合剂抑制Notch1的活性。在一些实施方案中，该结合剂抑制组成型激活的Notch1的活性。在一些实施方案中，该结合剂抑制近膜区中的裂解。在某些实施方案中，该结合剂抑制Notch1的裂解（例如，在S2位点被金属蛋白酶裂解）和/或抑制Notch1被配体结合的激活。在一些实施方案中，该结合剂抑制Notch1的胞内域（ICD）的释放或形成。在某些实施方案中，该结合剂抑制血液癌症细胞的生长。在一些实施方案中，该结合剂抑制T细胞急性淋巴母细胞性白血病细胞的生长。

在进一步的方面，本发明提供抑制血液癌症细胞中Notch1的活性的方法，包括将该癌症细胞与有效量的上述方面和实施方案、以及本文别处描述的其它方面/实施方案中描述的任一种抗体或多肽接触。在某些实施方案中，该血液癌症细胞是T细胞急性淋巴母细胞性白血病细胞。

在另一方面，本发明提供在受治疗者中抑制血液癌症生长的方法，该方法包括向所述受治疗者施用治疗有效量的上述方面和实施方案、以及本文别处描述的其它方面/实施方案中描述的任一种抗体或多肽。在一些实施方案中，该血液癌症包括癌干细胞。在一些实施方案中，该血液癌症包括白血病起源细胞。在一些实施方案中，该方法包括用本文所述的结合剂和抗体靶向该癌干细胞。在某些实施方案中，该方法包括减少血液癌症中癌干细胞的频率，减少血液癌症中白血病起源细胞的数量，减少血液癌症中癌干细胞的数量，减少血液癌症的致瘤性，和/或通过减少血液癌症中癌干细胞的数量或频率来减少血液癌症的致瘤性。在一些实施方案中，该方法包括抑制Notch1的活性和/或抑制血液癌症的生长。在某些实施方案中，该血液癌症是急性骨髓性白血病、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤或T细胞急性淋巴母细胞性白血病。在某些实施方案中，该血液癌症细胞是T细胞急性淋巴母细胞性白血病细胞。

在另外的方面中，本发明提供在受治疗者中抑制血液癌症生长的方法，该方法包括向所述受治疗者施用治疗有效量的特异性结合人Notch1的胞外域的非配体结合近膜区的抗体，其中该结合抑制Notch1的活性。在一些实施方案中，该方法包括抑制组成型激活的Notch1的活性。

在进一步的方面，本发明提供通过减少包含癌干细胞的血液癌症中癌干细胞的频率或数量来减少血液癌症的致瘤性的方法，该方法包括将该癌细胞与有效量的本文所述的抑制Notch1活性的结合剂或抗体接触。

在上述方面和/或实施方案、以及本文描述的其它方面或实施方案的每一个的某些实施方案中，该方法还包括向所述受治疗者施用至少一种另外的治疗剂。在上述方面或实施方案、以及本文别处描述的其它方面和/或实施方案的每一个的某些实施方案中，该抗体或多肽联合用于血液癌症的另外的治疗施用于受治疗者。在某些实施方案中，用于血液癌症的另外的治疗包括放射治疗、化疗和/或另外的治疗抗体。

本发明还提供治疗人中血液癌症的方法，其中包含癌干细胞的血液癌症不以该癌干细胞过表达一种或多种Notch受体为特征，该方法包括向人施用治疗有效量的结合Notch1的胞外域的近膜区并阻断Notch1的配体激活的结合剂或抗体。在一些实施方案中，施用本文所述的结合剂或抗体以治疗血液癌症，其中该血液癌症以组成型激活的Notch1为特征。

本发明还提供治疗人中血液癌症的方法，包括向人施用治疗有效量的(a)结合Notch1并抑制过表达Notch1的癌干细胞生长的第一抗体；和(b)结合Notch受体并阻断Notch受体的配体激活的第二抗体。在一些实施方案中，该方法包括向人施用治疗有效量的(a)结合Notch1并抑制过表达Notch1的癌干细胞生长的第一抗体；和(b)结合VEGF的第二抗体。

在进一步的实施方案中，本发明提供用于（除了其它以外）以上方法中的制品。例如，本发明提供包含容器和其中包含的组合物的制品，其中该组合物包含结合Notch的抗体，且该制品还包括指示该组合物可用于治疗包含癌干细胞的癌症的包装说明书。在一些实施方案中，本发明提供包含容器和其中包含的组合物的制品，其中该组合物包含结合Notch的抗体，且该制品还包括指示该组合物可用于治疗包含表达一种或多种Notch受体的癌干细胞的癌症的包装说明书。

在某些实施方案中，本发明另外涉及包含容器和其中包含的组合物的制品，其中该组合物包含结合Notch受体并阻断Notch受体的配体激活的抗体，且该制品还包括指示该组合物可用于治疗癌症的包装说明书，其中该癌症包含不以过表达Notch受体为特征的癌干细胞。

在某些实施方案中，提供制品，其包括：(a)第一容器和其中包含的组合物，其中该组合物包含结合Notch受体并抑制包含过表达Notch的癌干细胞的癌细胞生长的第一抗体；和(b)第二容器和其中包含的组合物，其中该组合物包含结合Notch并阻断Notch受体的配体激活的第二抗体。

在一些实施方案中，提供另外的制品，其包括容器和其中包含的组合物，其中该组合物包含结合Notch并阻断Notch受体的配体激活的抗体，且该制品还包括指示该组合物可用于治疗选自以下组成的组的癌症的包装说明书：急性骨髓性白血病、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤和T细胞急性淋巴母细胞性白血病。

本发明另外提供：结合Notch并阻断Notch受体的配体激活的抗体（例如，人抗体或人源化抗体）；包含该抗体和药学上可接受的载体的组合物；和包含与细胞毒性剂共轭的该抗体的免疫共轭物。

在一方面，本发明提供编码上述方面或实施方案、以及本文别处描述的其它方面和/或实施方案的任一种抗体或多肽的分离的多核苷酸。在一些实施方案中，本发明提供包含该多核苷酸的载体。在一些实施方案中，宿主细胞包括该多核苷酸或该载体。在其它实施方案中，产生该抗体的方法包括培养包含该多核苷酸的宿主细胞从而表达该多核苷酸，和任选地还包括从宿主细胞培养物（例如，从宿主细胞培养基）回收该抗体。

而且，本发明提供编码如上述实施方案或方面所述、以及本文别处描述的人源化或人抗体的分离的多核苷酸；包含该多核苷酸的载体；包含该多核苷酸或该载体的宿主细胞；以及包括培养包含该多核苷酸的宿主细胞从而表达该多核苷酸，和任选地还包括从宿主细胞培养物（例如，从宿主细胞培养基）回收该抗体的产生该抗体的方法。

本发明还涉及包含与一种或多种加利车霉素分子共轭的结合Notch的抗体的免疫共轭物，和这种共轭物用于治疗表达Notch的癌症，例如，其中癌干细胞过表达Notch的癌症的用途。

在根据马库什组或可选择要素的其它分组，包括但不限于以“和/或”或“或”分开的可选择要素的分组描述了本发明的方面或实施方案的情况下，本发明不仅包括作为整体列出的整个组，还个别地包括该组的各成员和主要组的所有可能亚组，以及还包括缺少一个或多个组成员的主要组。本发明还预见到明确排除要求保护的发明中任何组成员中的一个或多个。例如，措辞诸如“X和/或Y”涵盖单独的“X”、单独的“Y”、以及“X”与“Y”一起。

附图简述

图1：抑制Notch信号传导的靶向Notch的近膜区的抗体的鉴定。(A)Notch受体和52M抗原区的图示。该52M抗原包括Notch1受体在受体成熟期间经受弗林蛋白酶切割和在配体结合后经受ADAM（A Disintegrin And Metallopeptidase，解整合素-金属肽酶）蛋白酶切割的区域。随后通过γ-分泌酶进行的加工引起在细胞核中激活基因转录的Notch的胞内域（ICD）的释放。(B)在可溶性Notch配体（hDLL4-Fc）和Notch1受体抗体存在下培养的Notch1-HeLa细胞生成的荧光素酶水平（y轴）。来自带有或不带有hDLL4-Fc的未转染（NT）细胞的结果示于x轴的最左边。52M Notch1抗体沿着x轴显示，并且与DBZ（一种Notch γ-分泌酶抑制剂）和21M18（一种抗-DLL4抗体）比较。荧光素酶活性下降表明，Notch1抗体52M51、52M63、52M74和52M80都显著地抑制Notch信号传导。(C)在可溶性Notch配体（hDLL4-Fc）和Notch1受体抗体存在下培养的Notch1-HeLa细胞生成的荧光素酶水平（y轴）。来自带有或不带有hDLL4-Fc的未转染（NT）细胞的结果示于x轴的最左边。52M51鼠杂交瘤产生的抗体和人源化变体52M51H4L3以所示的各种浓度沿着x轴显示。荧光素酶活性下降表明，亲本鼠抗体52M51和人源化变体显著地抑制Notch信号传导。(D)对表达Notch1的HeLa细胞进行配体介导的刺激后的ICD形成的蛋白质印迹分析。在不存在DLL4配体（-DLL4）时产生最小ICD，但是DLL4的存在刺激形成。虽然存在DLL4，但是抗体52M51、52M63、52M74和52M80将ICD形成减少至背景水平。

图2：在白血病异种移植模型中对抗Notch1抗体的评价。在辐射后以10×10⁶个骨髓单核细胞预处理NOD/SCID小鼠。7天后，对小鼠注射5×10⁶个原代T细胞急性淋巴母细胞性白血病细胞。注射T细胞急性淋巴母细胞性白血病细胞5周后，处死小鼠并通过流式细胞术分析从脾分离的细胞的T-ALL移入。流式细胞术分析使用针对人CD45和CD34的特异性单克隆抗体进行。使用Tree Star FlowJo软件确定抗体染色阳性的细胞比例。使用GraphPad Prism软件通过Student t检验计算显著性。指出小鼠脾中人CD45+和CD34+细胞的百分比。***代表与对照抗体LZ-1相比p<0.001的显著性。

图3：HPB-ALL细胞中Notch1抑制的体外评价。将HPB-ALL细胞铺板在96孔板中并用抗Notch1抗体52M51（-■-）、对照抗体或二苯并吖庚因（dibenzazepine，DBZ）（-●-）处理。数据显示为相对光单位（RLU）。

图4：Notch1对HPB-ALL细胞增殖的抑制的体外评价。在12μM DBZ、100μg.ml抗Notch1抗体52M51或100μg/ml对照抗体存在下培养HPB-ALL细胞。通过流式细胞术分析细胞的K167蛋白。

图5：Notch1对ICD形成的抑制的体外评价。在12μM DBZ、100μg.ml抗Notch1抗体52M51或100μg/ml对照抗体存在下培养HPB-ALL细胞。通过SDS-PAGE分离全细胞蛋白提取物，并使用Notch1ICD特异性抗体通过蛋白质印迹分析评价。

图6：抗Notch1抗体对HPB-ALL肿瘤体内生长的抑制。将HPB-ALL细胞皮下注射到NOD/SCID小鼠中。用对照抗体（-■-）或抗Notch1抗体52M51

处理小鼠。数据显示为随着处理后天数的肿瘤体积（mm³）。抗体以15mg/kg每周一次施用。

图7：在弥散性白血病异种移植模型中对抗Notch1抗体的评价。将HPB-ALL细胞注射到NOD/SCID小鼠的尾静脉中。注射后1天，用对照抗体或抗Notch1抗体52M51处理动物。大约5周后，使小鼠安乐死，分析脾、外周血和骨髓中HPB-ALL细胞的存在。

发明详述

本发明提供结合一种或多种人Notch受体、尤其是Notch1的新型试剂，包括但不限于多肽，诸如抗体。该Notch结合剂包括人Notch1的拮抗剂。还提供相关的多肽和多核苷酸、包含该Notch结合剂的组合物、以及制备该Notch结合剂的方法。还提供使用该新型Notch结合剂的方法，例如抑制血液癌症生长和/或治疗血液癌症的方法。

本发明还鉴定特异性结合人Notch1的胞外域的非配体结合近膜区并抑制肿瘤体内生长的分子（例如抗体）。已经将对于配体结合必需和足够的Notch的配体结合区鉴定为EGF重复11和12，表明Notch受体的该区在Notch信号传导和肿瘤发生中是重要的（Rebay等,1991,Cell，67:687；Lei等,2003,Dev.,130:6411；Hambleton等,2004,Structure,12:2173）。预料之外的是，已经发现在人Notch受体的胞外域的配体结合域外部结合的抗体抑制肿瘤细胞体内生长（参见美国专利公布第2008/0131434号和国际公布WO2010/005567，通过引用将其每一篇整体并入本文）。因此，在一种或多种人Notch受体-Notch1、Notch2、Notch3和Notch4-的胞外域的配体结合域外部结合的抗体具有作为潜在的癌治疗剂的价值。

现在已经鉴定出特异性结合Notch1的胞外域的近膜区的单克隆抗体，包括单克隆抗体52M51（实施例1）。已经产生了人源化52M51抗体（实施例2）。包括52M51和52M51的人源化变体在内的几种抗体，虽然与Notch1在配体结合区外的区域中结合，但是抑制配体诱导的Notch1信号传导（实施例3和图1B和图1C）。已经表明几种抗体抑制Notch胞内域（ICD）形成的能力（实施例3和7；图1D和5）。52M51显示抑制HPB-ALL细胞的实体瘤生长（实施例8和图6）。52M51显示减少人白血病细胞的体外细胞存活力和增殖（实施例5和6；图3和4）。已经发现52M51在两种异种移植物模型中抑制白血病细胞体内移入（实施例4和9；图2和7）。

I.定义

为了便于理解本发明，在以下定义多个术语和短语。

本文使用的术语“拮抗剂”是指部分或全部阻断、抑制或中和Notch途径的生物学活性的任何分子。本文使用的术语“拮抗剂”包括部分或全部阻断、抑制或中和Notch受体的表达的任何分子。合适的拮抗剂分子特别包括拮抗性抗体或抗体片段。

本文使用的术语“抗体”是指通过至少一个位于免疫球蛋白分子的可变区内的抗原识别位点，识别和特异性结合诸如蛋白、多肽、肽、糖类、多核苷酸、脂质或上述物质的组合等靶的免疫球蛋白分子。如本文所用，该术语包括完整的多克隆抗体、完整的单克隆抗体、抗体片段（例如Fab、Fab'、F(ab')2、和Fv片段）、单链Fv（scFv）抗体、由至少两个完整抗体产生的诸如双特异性抗体等多特异性抗体、单特异性抗体、单价抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的抗原决定部分的融合蛋白、和任何其它包含抗原识别位点的经修饰免疫球蛋白分子，只要该抗体显示所需的生物活性。基于分别称为α、δ、ε、γ和μ的抗体重链恒定域的身份，抗体可以是五个主要种类免疫球蛋白中的任一种：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，或其亚类（同种型）（例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2）。不同种类的免疫球蛋白具有不同的众所周知的亚基结构和三维构造。抗体可以是裸的或与包括但不限于毒素和放射性同位素的其它分子共轭。

术语“抗体片段”表示完整抗体的一部分，和表示完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、线性抗体、单链抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。

术语抗体的“可变区”是指单独的或组合的抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区。重链和轻链的可变区各由通过三个还称为“高变区”的互补决定区（CDR）连接的四个框架区（FR）组成。各链中的CDR通过框架区邻近保持在一起，并且与来自另一链的CDR一起帮助形成抗体的抗原结合位点。至少有两种用于确定CDR的技术：(1)基于跨物种序列变异性的方法（即，Kabat等，1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版，National Institutes of Health,Bethesda Md.），和(2)基于抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法（Al-Lazikani等，1997,J.Molec.Biol.,273:927-948）。另外，本领域有时使用这两种方法的组合来确定CDR。

本文所用的术语“单克隆抗体”是指参与高度特异性识别和结合单抗原决定簇或表位的同源性抗体群。这与通常包括针对不同抗原决定簇的不同抗体的混合物的多克隆抗体不同。术语“单克隆抗体”涵盖完整的全长单克隆抗体以及抗体片段（例如，Fab、Fab'、F(ab')2、Fv）、单链（scFv）抗体、包含抗体部分的融合蛋白、和任何其它包含抗原识别位点的经修饰免疫球蛋白分子。另外，“单克隆抗体”是指通过包括但不限于杂交瘤产生、噬菌体选择、重组表达和转基因动物的任何多种方式制得的此类抗体。

本文所用的术语“人源化抗体”是指非人（例如鼠）抗体的形式，其为含有最小非人序列的特异性免疫球蛋白链、嵌合免疫球蛋白或其片段。

本文使用的术语“人抗体”是指由人产生的抗体或通过使用本领域已知的任何技术制备的具有与由人产生的抗体相应的氨基酸序列的抗体。人抗体的该定义包括完整或全长抗体、其片段、和/或包含至少一个人重链和/或轻链多肽的抗体，例如，包含鼠轻链和人重链多肽的抗体。

本文使用的术语“嵌合抗体”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列源自两个或以上物种的抗体。通常而言，轻链和重链的可变区对应于源自一个哺乳动物物种（例如，小鼠、大鼠、兔等）的具有所需特异性、亲和性和/或能力的抗体的可变区，而恒定区与源自另一物种（通常是人）的抗体中的序列同源，从而避免在该物种中引发免疫应答。

术语“表位”和“抗原决定簇”在本文中可互换地使用，是指抗原的能够被特定抗体识别和特异性结合的部分。当抗原是多肽时，表位可由连续的氨基酸形成和由通过蛋白的三级折叠而并置的不连续氨基酸形成。当蛋白变性时通常会保留由连续的氨基酸形成的表位（还称为线性表位），而当蛋白变性时通常会丧失通过三级折叠形成的表位（还称为构象性表位）。表位通常包括至少3个，或更经常至少5个或8-10个呈单独空间构象的氨基酸。

术语“选择性结合”或“特异性结合”是指结合剂或抗体与表位、蛋白或靶分子的反应或结合比与其它物质(包括不相关蛋白)的反应或结合更频繁、更迅速、持久性更大、亲和性更大或上述情况的某些组合。在某些实施方案中，“特异性结合”是指例如，抗体与蛋白结合的K_D为约0.1mM或更小，但更经常为小于约1μM。在某些实施方案中，“特异性结合”是指抗体与靶结合的K_D有时为至少约0.1μM或更小或有时为至少约0.01μM或更小。由于不同物种中同源性蛋白之间的序列同一性，特异性结合可以包括识别多于一个物种中蛋白（例如Notch受体）的抗体。类似地，由于不同蛋白的多肽序列某些区域内的同源性，特异性结合可以包括识别多于一种蛋白（例如人Notch1和人Notch2）的抗体（或其它多肽或结合剂）。应该理解，在某些实施方案中，与第一靶特异性结合的抗体或结合部分可以与第二靶特异性结合或不与第二靶特异性结合。这样，“特异性结合”不必然地要求（尽管其可以包括）专一性结合，即，与单个靶的结合。如此，在某些实施方案中，抗体可特异性结合多于一种靶（例如人 Notch1、人Notch2、人Notch3、和/或小鼠Notch）。在某些实施方案中，多个靶可被抗体上同一抗原结合位点结合。例如，在某些情况中，抗体可包括两个相同的抗原结合位点，其每一个特异性结合两种或多种蛋白（例如Notch1和Notch2）上的相同表位。在某些替代性实施方案中，抗体可以是双特异性的，包括具有不同特异性的至少两个抗原结合位点。通过非限制性实例，双特异性抗体可包括识别一种蛋白（例如人Notch1）上的表位的一个抗原结合位点，还包括识别第二蛋白（例如人Notch2）上的不同表位的第二、不同抗原结合位点。通常但不一定提及结合是指特异性结合。

术语“多肽”和“肽”和“蛋白”在本文中可互换地使用，是指任何长度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是线性或分支的，其可包括修饰的氨基酸，且其可被非氨基酸中断。这些术语还涵盖已被天然修饰或通过介入修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰，诸如与标记组分共轭。该定义中还包括，例如，包含氨基酸的一种或多种类似物（包括例如，非天然氨基酸）、以及本领域已知的其它修饰的多肽。应理解的是，由于本发明的多肽是基于抗体的，在某些实施方案中，该多肽可作为单链或缔合的链存在。

术语“多核苷酸”和“核酸”在本文可互换地使用，是指任何长度的核苷酸聚合物，并包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基、和/或其类似物、或可被DNA或RNA聚合酶掺入聚合物中的任何底物。

“高严格性条件”可鉴定为以下条件：(1)洗涤采用低离子强度和高温，例如在50℃以0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1%十二烷基硫酸钠；(2)杂交期间在42℃采用变性剂诸如甲酰胺，例如，50%（v/v）甲酰胺加0.1%牛血清白蛋白/0.1%Ficoll/0.1%聚乙烯吡咯烷酮/pH 6.5的50mM磷酸钠缓冲剂加750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠；或(3)在42℃采用50%甲酰胺、5×SSC（0.75MNaCl、0.075M柠檬酸钠）、50mM磷酸钠（pH6.8）、0.1%焦磷酸钠、5×Denhardt溶液、超声化的鲑精DNA（50μg/ml）、0.1%SDS、和10%硫酸葡聚糖，在42℃以0.2×SSC（氯化钠/柠檬酸钠）和在55℃以50%甲酰胺洗涤，随后是包含EDTA的0.1×SSC在55℃的高严格性洗涤。

在两种或多种核酸或多肽的上下文中，术语“相同”或“同一性”百分比是指为了最大对应性比较和比对（如果需要则引入缺口）时，相同或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基的两种或多种序列或亚序列，不考虑任何保守性氨基酸取代作为序列同一性的部分。同一性百分比可使用序列比较软件或算法或通过目视检查来测量。可用来获得氨基酸或核苷酸序列的比对的多种算法和软件是本领域公知的。这些包括但不限于BLAST、ALIGN、Megalign、BestFit、GCG Wisconsin软件包等。在一些实施方案中，本发明的两种核酸或多肽是大体上相同的，表示它们为了最大对应性比较和比对时具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%，和在一些实施方案中至少95%、96%、97%、98%、99%的核苷酸或氨基酸残基同一性，如使用序列比较软件或通过目视检查测量的。在一些实施方案中，跨至少约10个、至少约20、至少约40-60残基长度或其间的任何整数值的序列区域存在同一性。在一些实施方案中，跨多于60-80个残基，诸如至少约90-100个残基的较长区域存在同一性，且在一些实施方案中，序列跨被比较的序列（诸如核苷酸序列的编码区）全长是大体上相同的。

“保守性氨基酸取代”是其中一个氨基酸残基被具有相似侧链的另一个氨基酸残基代替的氨基酸取代。具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域中已定义，包括碱性侧链（例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸）、酸性侧链（例如，天冬氨酸、谷氨酸）、不带电荷的极性侧链（例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸）、非极性侧链（例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸）、β-分支侧链（例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸）和芳香族侧链（例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）。例如，苯丙氨酸对酪氨酸的取代是保守性取代。优选地，本发明的多肽和抗体的序列中的保守性取代不消除包含该氨基酸序列的多肽或抗体对抗原的结合，该抗原即，该多肽或抗体结合的一种或多种Notch蛋白。鉴定不消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守性取代的方法是本领域公知的。

本文使用的术语“载体”是指能够在宿主细胞中递送和通常表达一种或多种目标基因或序列的构建体。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、阳离子缩合剂伴随的DNA或RNA表达载体、和脂质体中包裹的DNA或RNA表达载体。

“分离的”多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是呈自然中不存在的形式的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。分离的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物包括已被纯化到不再呈其于天然中存在的形式的程度的那些。在一些实施方案中，分离的抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是大体上纯的。

本文所用的术语“大体上纯的”是指至少50%纯（即，不含污染物）、至少90%纯、至少95%纯、至少98%纯、或至少99%纯的材料。

如本文所用，术语“癌症（cancer）”和“癌性的（cancerous）”是指或描述其中一群细胞的特征在于失调的细胞生长的哺乳动物中的生理状况。癌症的实例包括但不限于癌、母细胞瘤、肉瘤、和血液癌症诸如淋巴瘤和白血病。

本文所用的术语“肿瘤”和“赘生物”是指任何由过度的细胞生长或增殖导致的组织的团块，其可以是良性的（非癌的）或恶性的（癌的），包括癌前病变。

术语“增殖性障碍”和“增殖性疾病”是指与异常细胞增殖有关的障碍，如癌。

本文所用的术语“转移”是指癌从原始位置扩散或转移到身体的其它区域的过程，并且伴随着位于新位置处的类似的癌性病变的发生。“转移”或“转移性”细胞是失去与相邻细胞的粘附接触并且经由血流或淋巴从疾病的原发位置迁移从而侵袭邻近的身体结构的细胞。

术语“癌干细胞”和“CSC”和“肿瘤干细胞”在本文中可互换地使用，并且指来自具有以下性质的癌症的细胞：(1)具有广泛的增殖能力；(2)能够进行不对称细胞分裂从而产生增殖或发育潜能降低的一种或多种分化子代；和(3)能够进行对称细胞分裂以用于自我更新或自我维持。当连续移植到免疫受损宿主（例如小鼠）时，与不能形成肿瘤的大多数肿瘤细胞相比，这些性质赋予癌干细胞以形成或建立肿瘤或癌症的能力。癌干细胞以无序方式进行自我更新与分化，从而形成具有异常细胞类型的肿瘤，当发生突变时所述异常细胞类型可以随时间而改变。本文使用的“癌干细胞”可包括白血病起源细胞。

术语“癌细胞”和“肿瘤细胞”是指源自癌症或肿瘤或癌前病变的全部细胞群体，包括占癌细胞群大部分的非致瘤性细胞和致瘤性干细胞（癌干细胞）。当仅指缺乏更新和分化能力的那些肿瘤细胞时，本文所用的术语“癌细胞”或“肿瘤细胞”将被术语“非致瘤性”修饰，以将那些肿瘤细胞与癌干细胞区分。

本文所用的术语“致瘤性的”是指癌干细胞的功能特征，包括自我更新（产生另外的致瘤性癌干细胞）的性质和增殖以产生所有其它肿瘤细胞（产生分化的因而非致瘤性的肿瘤细胞）的性质。

本文所用的术语肿瘤的“致瘤性”是指当连续移植到免疫受损宿主（例如小鼠）时，来自肿瘤的细胞的随机样品形成可察觉的肿瘤的能力。

术语“受治疗者”是指任何动物（例如哺乳动物），包括但不限于人、非人灵长类动物、犬、猫、啮齿类动物等，其是特定治疗的接受者。通常而言，对于人受治疗者，术语“受治疗者”和“患者”在本文中可互换地使用。

术语“药学上可接受的”是指由美国联邦或州政府的管理机构已批准或可批准的，或在美国药典或其它公知的药典中列出的，以用于包括人的动物。

术语“药学上可接受的赋形剂、载体或佐剂”或“可接受的药物载体”是指可以与本文公开的至少一种结合剂（例如抗体）一起对受治疗者施用的赋性剂、载体或佐剂，并且其不破坏结合剂的药理学活性，并且当以足以递送治疗效果的剂量施用时是无毒的。

术语“有效量”或“治疗有效量”或“治疗效果”是指对于“治疗”受治疗者或哺乳动物中的疾病或障碍有效的结合剂、抗体、多肽、多核苷酸、小有机分子或其它药物的量。在癌症的情况下，治疗有效量的药物（例如抗体）具有治疗效果并因此可以减少癌细胞的数量；降低致瘤性、致瘤频率或致瘤能力；减少癌干细胞的数量或频率；减少肿瘤尺寸；减少癌细胞群体；抑制或停止癌细胞向周围器官的浸润（包括例如癌向软组织和骨的扩散）；抑制和停止肿瘤或癌细胞转移；抑制和停止肿瘤或癌细胞生长；某种程度上减轻与癌有关的一种或多种症状；减少发病率和死亡率；改进生活质量；或所述效应的组合。在诸如抗体等试剂阻止生长和/或杀死现有的癌细胞的情况下，可将其称为细胞抑制性和/或细胞毒性。

术语“治疗”或“处理”或“要治疗”或“缓解”或“要缓解”是指1)治愈、减慢、减轻诊断的病理性状况或障碍的症状、和/或使诊断的病理性状况或障碍的进展停止的治疗措施；和2)防止或减缓所靶向的病理性状况或障碍的发展的预防性或防备性措施。因此，需要治疗的受治疗者包括已经患有疾病的受治疗者；有倾向患疾病的受治疗者和要预防疾病的受治疗者。在一些实施方案中，如果患者显示出以下情况的一种或多种，则根据本发明的方法成功地“治疗”了受治疗者：癌细胞的数量减少或完全不存在；肿瘤尺寸减少；对癌细胞向周围器官的浸润（包括癌细胞向软组织和骨的扩散）的抑制或不存在；肿瘤或癌细胞转移的抑制或不存在；肿瘤生长的抑制或不存在；减轻一种或多种与特定癌相关的症状；发病率和致死率降低；生活质量改进；致瘤性降低；癌干细胞的数量或频率减少；或上述效应的某些组合。

如本说明书和权利要求书所用，单数形式的“a”、“an”和“the”包括复数形式，除非上下文明确指出。

应该理解每当在本文用措辞“包含”来描述实施方案时，还提供以“组成”和/或“基本上由组成”描述的其它类似实施方案。

本文在短语中使用的术语“和/或”诸如“A和/或B”意为包括：A和B二者；A或B；A（单独）；和B（单独）。类似地，在短语中使用的术语“和/或”诸如“A、B和/或C”意为涵盖以下实施方案的每一种：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A（单独）；B（单独）；和C（单独）。

II.Notch1结合剂

本发明提供特异性结合人Notch1的胞外域的非配体结合近膜区的剂、包含那些结合剂的组合物、和使用那些结合剂用于治疗血液癌症的方法。尤其是，在某些实施方案中，本发明提供结合Notch1的剂，包括拮抗剂，和在人患者中使用该剂或拮抗剂抑制癌症生长和治疗癌症或其它疾病的方法。在某些实施方案中，该拮抗剂是特异性结合人Notch1的胞外域的非配体结合区的抗体。

在一方面，本发明提供特异性结合人Notch1的胞外域的非配体结合近膜区的结合剂。在一些实施方案中，该结合剂是抗体。在一些实施方案中，该结合剂或抗体结合人Notch1的包含约氨基酸1427至约氨基酸1732的区域。在一些实施方案中，该结合剂或抗体结合包含SEQ ID NO:2的区域。在一些实施方案中，该结合剂或抗体特异性结合SEQ ID NO:2中的区域。在一些实施方案中，该结合剂或抗体特异性结合包含SEQ ID NO:2的区域中的表位。在某些实施方案中，结合Notch1的结合剂或抗体还特异性结合至少一种另外Notch受体的胞外域的非配体结合近膜区。在一些实施方案中，该至少一种另外Notch受体是Notch2。在一些实施方案中，该至少一种另外Notch受体是Notch3。在一些实施方案中，该至少一种另外Notch受体是Notch4。

在某些实施方案中，该Notch1结合剂是多肽。在某些实施方案中，该Notch1结合剂或多肽是抗体。在某些实施方案中，该抗体是IgG抗体。在一些实施方案中，该抗体是IgG1抗体。在一些实施方案中，该抗体是IgG2抗体。在某些实施方案中，该抗体是单克隆抗体。在某些实施方案中，该抗体是人源化抗体。在某些实施方案中，该抗体是人抗体。在某些实施方案中，该抗体是抗体片段。

在某些实施方案中，该Notch1结合剂（例如抗体）以约1μM或更小、约100nM或更小、约40nM或更小、约20nM或更小、约10nM或更小、或约1nM或更小的解离常数（K_D）结合人Notch1的胞外域的非配体结合近膜区。在某些实施方案中，该Notch1结合剂或抗体以约40nM或更小、约20nM或更小、约10nM或更小、或约1nM或更小的K_D结合人Notch1。在一些实施方案中，该剂或抗体对Notch1的解离常数是使用固定在Biacore 芯片上的包含Notch1胞外域的近膜区的Notch1融合蛋白确定的解离常数。

可以通过本领域已知的任何方法检测本发明的Notch1结合剂（例如抗体）的特异性结合。可以使用的免疫检验包括但不限于使用下述技术的竞争性和非竞争性检验系统：如Biacore分析、FACS分析、免疫荧光、免疫细胞化学、蛋白质印迹分析、放射免疫检验、ELISA、“夹心”免疫检验、免疫沉淀检验、沉淀反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散检验、凝集检验、补体固定检验、免疫放射度检验、荧光免疫检验和蛋白A免疫检验。所述检验在本领域中是常规的并且是众所周知的（参见，例如Ausubel等编,1994,Current Protocols in Molecular Biology，Vol.1,John Wiley & Sons,Inc.,New York）。

在一些实施方案中，可使用ELISA确定Notch1结合剂（例如抗体）对人Notch1的特异性结合。在一些实施方案中，ELISA检验包括：制备Notch1抗原，用抗原包被96孔微量滴定板的孔，向所述孔中添加与诸如酶促底物（例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）等可检测化合物共轭的Notch1结合剂或抗体，温育一段时间，并且检测所述结合剂或抗体的存在。在一些实施方案中，Notch1结合剂或抗体不与可检测化合物共轭，而是向所述孔中添加识别Notch1结合剂或抗体的第二共轭抗体。在一些实施方案中，代替用Notch1抗原包被所述孔的是，可以用Notch1结合剂或抗体包被所述孔，并且在向经包被的孔中添加抗原后添加与可检测化合物共轭的第二抗体。本领域技术人员已知可经改编和/或优化而增加检出信号的参数，以及可使用的ELISA的其它变化形式（参见例如Ausubel等编，1994,Current Protocols in Molecular Biology，Vol.1,John Wiley & Sons,Inc.,New York at 11.2.1）。

可以通过竞争结合检验确定抗体或其它结合剂对Notch1的结合亲和力和抗体抗原相互作用的结合解离率（on-oFF rate）。在一些实施方案中，一种竞争结合检验是放射免疫检验，所述放射免疫检验包括在增加量的未标记抗原的存在下使经标记抗原（例如³H或¹²⁵I标记的抗原）或其片段或变体与目的抗体一起温育，然后检测与经标记抗原结合的抗体。可以从根据斯卡恰特作图分析获得的数据确定抗体对抗原的亲和力和结合解离率。在一些实施方案中，使用Biacore动力学分析来确定抗体或剂结合Notch（例如，人Notch1、人Notch2、人Notch3、人Notch4或小鼠Notch）的结合亲和力和结合解离率。Biacore动力学分析包括分析抗体与固定在Biacore芯片表面上的抗原（例如Notch1蛋白）的结合和解离。在一些实施方案中，可使用Biacore动力学分析来研究定性表位竞争结合检验中不同抗体的结合。

在某些实施方案中，本发明提供特异性结合人Notch1的胞外域的非配体结合近膜区的抗体，其中该抗体包括抗体52M51的CDR（参见表1）的一个、两个、三个、四个、五个和/或六个。在一些实施方案中，该抗体包括52M51的CDR的一个或多个、52M51的CDR的两个或更多个、52M51的CDR的三个或更多个、52M51的CDR的四个或更多个、52M51的CDR的五个或更多个、或52M51的CDR的所有六个。在一些实施方案中，该抗体包括具有每CDR多达四个（即，0、1、2、3或4个）氨基酸取代的CDR。在某些实施方案中，重链CDR被包含在重链可变区中。在某些实施方案中，轻链CDR被包含在轻链可变区中。

表1

在某些实施方案中，该结合剂是包括以下的抗体：(a)包含RGYWIE（SEQ ID NO:15）的重链CDR1、包含QILPGTGRTNYNEKFKG（SEQ IDNO:16）的重链CDR2、和包含FDGNYGYYAMDY（SEQ ID NO:17）的重链CDR3；和/或(b)包含RSSTGAVTTSNYAN（SEQ ID NO:18）的轻链CDR1、包含GTNNRAP（SEQ ID NO:19）的轻链CDR2、和包含ALWYSNHWVFGGGTKL（SEQ ID NO:20）的轻链CDR3。在一些实施方案中，该抗体包括包含以下的重链可变区：(a)包含RGYWIE（SEQ ID NO:15）、或包含1、2、3或4个氨基酸取代的其变体的重链CDR1；(b)包含QILPGTGRTNYNEKFKG（SEQ ID NO:16）、或包含1、2、3或4个氨基酸取代的其变体的重链CDR2；和/或(c)包含FDGNYGYYAMDY（SEQ ID NO:17）、或包含1、2、3或4个氨基酸取代的其变体的重链CDR3。在其它实施方案中，该抗体包括（或还包括）包含以下的轻链可变区：(a)包含RSSTGAVTTSNYAN（SEQ ID NO:18）、或包含1、2、3或4个氨基酸取代的其变体的轻链CDR1；(b)包含GTNNRAP（SEQ ID NO:19）、或包含1、2、3或4个氨基酸取代的其变体的轻链CDR2；和/或(c)包含ALWYSNHWVFGGGTKL（SEQ ID NO:20）、或包含1、2、3或4个氨基酸取代的其变体的轻链CDR3。在一些实施方案中，该氨基酸取代是保守性氨基酸取代。

在一些实施方案中，该Notch1结合剂是特异性结合人Notch1的胞外域的非配体结合近膜区的抗体。在一些实施方案中，该抗体包括与SEQ ID NO:14具有至少约90%序列同一性的重链可变区、和/或与SEQ ID NO:8具有至少约90%序列同一性的轻链可变区。在一些实施方案中，该抗体包括与SEQ ID NO:14具有至少约95%、至少约97%或至少约99%序列同一性的重链可变区、和/或与SEQ ID NO:8具有至少约95%、至少约97%或至少约99%序列同一性的轻链可变区。在一些实施方案中，该抗体包括与SEQ ID NO:14具有至少约95%序列同一性的重链可变区、和/或与SEQ ID NO:8具有至少约95%序列同一性的轻链可变区。在一些实施方案中，该抗体包括包含SEQID NO:14的重链可变区、和/或包含SEQ ID NO:8的轻链可变区。在一些实施方案中，该抗体包括包含SEQ ID NO:14的重链可变区、和SEQ ID NO:8的轻链可变区。在一些实施方案中，该抗体是单克隆抗体或抗体片段。

在一些实施方案中，该Notch1结合剂是特异性结合人Notch1的胞外域的非配体结合近膜区的抗体。在一些实施方案中，该抗体包括与SEQ ID NO:24具有至少约90%序列同一性的重链可变区、和/或与SEQ ID NO:28具有至少约90%序列同一性的轻链可变区。在一些实施方案中，该抗体包括与SEQ ID NO:24具有至少约95%、至少约97%或至少约99%序列同一性的重链可变区、和/或与SEQ ID NO:28具有至少约95%、至少约97%或至少约99%序列同一性的轻链可变区。在一些实施方案中，该抗体包括与SEQ ID NO:24具有至少约95%序列同一性的重链可变区、和/或与SEQ ID NO:28具有至少约95%序列同一性的轻链可变区。在一些实施方案中，该抗体包括包含SEQ ID NO:24的重链可变区、和/或包含SEQ ID NO:28的轻链可变区。在一些实施方案中，该抗体包括包含SEQ ID NO:24的重链可变区、和包含SEQ ID NO:28的轻链可变区。在一些实施方案中，该抗体是单克隆抗体或抗体片段。

在一些实施方案中，该Notch1结合剂是特异性结合人Notch1的胞外域的非配体结合近膜区的抗体。在一些实施方案中，该抗体包括与SEQ ID NO:24具有至少约90%序列同一性的重链可变区、和/或与SEQ ID NO:32具有至少约90%序列同一性的轻链可变区。在一些实施方案中，该抗体包括与SEQ ID NO:24具有至少约95%、至少约97%或至少约99%序列同一性的重链可变区、和/或与SEQ ID NO:32具有至少约95%、至少约97%或至少约99%序列同一性的轻链可变区。在一些实施方案中，该抗体包括与SEQ ID NO:24具有至少约95%序列同一性的重链可变区、和/或与SEQ ID NO:32具有至少约95%序列同一性的轻链可变区。在一些实施方案中，该抗体包括包含SEQID NO:24的重链可变区、和/或包含SEQ ID NO:32的轻链可变区。在一些实施方案中，该抗体包括包含SEQ ID NO:24的重链可变区、和包含SEQ ID NO:32的轻链可变区。在一些实施方案中，该抗体是单克隆抗体或抗体片段。

在一些实施方案中，该Notch1结合剂是抗体52M51，由按照布达佩斯条约的规定，于2008年8月7日保藏在ATCC，并给予保藏号PTA-9405的杂交瘤细胞系产生。在一些实施方案中，该抗体是52M51的人源化形式。在一些实施方案中，该抗体是52M51的人源化形式“52M51H4L3”，由按照布达佩斯条约的规定，于2008年10月15日保藏在ATCC，并给予保藏号PTA-9549的DNA编码。在一些实施方案中，该抗体是52M51的人源化形式“52M51H4L4”。在一些实施方案中，本发明提供结合抗体52M51结合的表位的相同表位的抗体。在其它实施方案中，本发明提供与以上实施方案和/或方面、以及本文别处描述的其它方面/实施方案中所述的任何抗体竞争对人Notch1的胞外域的非配体结合近膜区的特异性结合的抗体。

本发明提供多种多肽，包括但不限于抗体和抗体片段。在某些实施方案中，该多肽是分离的。在某些替代性实施方案中，该多肽是大体上纯的。

在某些实施方案中，本发明的多肽可以是包含SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:32的序列的重组多肽、天然多肽、或合成多肽（带有或不带有信号/前导序列）。在一些实施方案中，该多肽包括分别在SEQ ID NO:10和/或SEQ ID NO:4中提供的重链和/或轻链（带有或不带有信号/前导序列）。在某些实施方案中，该多肽是抗体。在某些实施方案中，该多肽特异性结合人Notch1的胞外域的非配体结合近膜区。在某些实施方案中，该多肽包括包含SEQ ID NO:8的可变轻链序列和包含SEQ ID NO:14的可变重链序列。在某些实施方案中，该多肽包括包含SEQ ID NO:28的可变轻链序列和包含SEQ ID NO:24的可变重链序列。在某些实施方案中，该多肽包括包含SEQ ID NO:32的可变轻链序列和包含SEQ IDNO:24的可变重链序列。在某些实施方案中，该多肽是抗体。在某些实施方案中，该多肽特异性结合人Notch1的胞外域的非配体结合近膜区。

本发明的多肽包括SEQ ID NO:14的多肽、以及与SEQ ID NO:14的多肽具有至少90%序列同一性的多肽、和与SEQ ID NO:14的多肽具有至少95%序列同一性的多肽、且在又其它实施方案中，与SEQ ID NO:14的多肽具有至少96%、97%、98%或99%序列同一性的多肽。本发明的多肽包括SEQ ID NO:8的多肽、以及与SEQ ID NO:8的多肽具有至少90%序列同一性的多肽、和与SEQ ID NO:8的多肽具有至少95%序列同一性的多肽、且在又其它实施方案中，与SEQ ID NO:8的多肽具有至少96%、97%、98%或99%序列同一性的多肽。

本发明的多肽包括SEQ ID NO:24的多肽、以及与SEQ ID NO:24的多肽具有至少90%序列同一性的多肽、和与SEQ ID NO:24的多肽具有至少95%序列同一性的多肽、且在又其它实施方案中，与SEQ ID NO:24的多肽具有至少96%、97%、98%或99%序列同一性的多肽。本发明的多肽包括SEQ ID NO:28的多肽、以及与SEQ ID NO:28的多肽具有至少90%序列同一性的多肽、和与SEQ ID NO:28的多肽具有至少95%序列同一性的多肽、且在又其它实施方案中，与SEQ ID NO:28的多肽具有至少96%、97%、98%或99%序列同一性的多肽。本发明的多肽包括SEQ ID NO:32的多肽、以及与SEQ ID NO:32的多肽具有至少90%序列同一性的多肽、和与SEQ IDNO:32的多肽具有至少95%序列同一性的多肽、且在又其它实施方案中，与SEQ IDNO:32的多肽具有至少96%、97%、98%或99%序列同一性的多肽。

在某些实施方案中，该Notch1结合剂（例如抗体）结合Notch1并调节Notch1活性。在一些实施方案中，该Notch1结合剂是拮抗剂并调节Notch1活性。

在某些实施方案中，该Notch1结合剂（例如抗体）是Notch1拮抗剂并抑制Notch1活性。在某些实施方案中，该Notch1结合剂抑制所结合的人Notch1活性的至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约50%、至少约75%、至少约90%或约100%。在一些实施方案中，该Notch1结合剂抑制组成型激活的Notch1的活性。在一些实施方案中，该组成型激活的Notch1在血液癌症中表达。在某些实施方案中，该组成型激活的Notch1在T细胞急性淋巴母细胞性白血病中表达。

在某些实施方案中，该Notch1结合剂（例如抗体）抑制Notch信号传导。应理解的是，在某些实施方案中，抑制Notch信号传导的Notch1结合剂可抑制通过一种或多种Notch的信号传导，但不必抑制通过所有Notch的信号传导。在某些替代性实施方案中，可抑制通过所有人Notch的信号传导。在某些实施方案中，通过选自以下组成的组的一种或多种Notch的信号传导被抑制：Notch1、Notch2、Notch3和Notch4。在某些实施方案中，Notch1结合剂对Notch信号传导的抑制是Notch1信号传导水平减少至少约10%、至少约25%、至少约50%、至少约75%、至少约90%或至少约95%。

在某些实施方案中，该Notch1结合剂（例如抗体）抑制Notch激活。应理解的是，在某些实施方案中，抑制Notch激活的Notch1结合剂可抑制一种或多种Notch的激活，但不必抑制所有Notch的激活。在某些替代性实施方案中，可抑制所有人Notch的激活。在某些实施方案中，选自以下组成的组的一种或多种Notch的激活被抑制：Notch1、Notch2、Notch3和Notch4。在某些实施方案中，Notch1结合剂对Notch激活的抑制是Notch1激活水平减少至少约10%、至少约25%、至少约50%、至少约75%、至少约90%或至少约95%。

用于确定Notch1结合剂（或候选Notch1结合剂）是否抑制Notch激活的体内和体外检验是本领域已知的。在一些实施方案中，基于细胞的、利用在萤火虫荧光素酶报告基因上游包含多个拷贝的TCF-结合结构域的TCF/Luc报告基因载体的荧光素酶报告基因检验可用于体外测量Notch信号传导水平。在其它实施方案中，可使用基于细胞的、利用在萤火虫荧光素酶报告基因上游包含多个拷贝的CBF-结合结构域的CBF/Luc报告基因载体的荧光素酶报告基因检验。将在Notch1结合剂存在下由Notch配体引起的Notch激活水平与Notch1结合剂不存在下由Notch配体引起的Notch激活水平比较。这种荧光素酶报告基因检验评价对Notch激活的抑制的用途的非限制性具体实例在实施例3和图1B和1C中提供。

在某些实施方案中，该Notch1结合剂（例如抗体）具有一种或多种以下作用：抑制癌细胞增殖，抑制癌细胞生长，阻止或减少癌细胞的转移，减少肿瘤或癌症中癌干细胞的频率，触发癌细胞的细胞死亡（例如，通过凋亡），通过减少癌细胞群中癌干细胞的频率来减少癌细胞的致瘤性，分化致瘤性细胞为非致瘤性状态，或增加患者的存活。

在某些实施方案中，该Notch1结合剂（例如抗体）能够抑制癌细胞生长。在某些实施方案中，该Notch1结合剂能够体外抑制癌细胞生长（例如，将癌细胞与抗体体外接触）。在某些实施方案中，该Notch1结合剂能够体内抑制癌症生长（例如，在异种移植小鼠模型中和/或在患有癌症的人中）。

在某些实施方案中，该Notch1结合剂（例如抗体）能够减少血液癌症的致瘤性。在某些实施方案中，该Notch1结合剂或抗体能够在动物模型，诸如小鼠异种移植模型中减少包含癌干细胞的血液癌症的致瘤性。在某些实施方案中，该Notch1结合剂或抗体能够在动物模型，诸如小鼠异种移植模型中减少包含白血病起源细胞的血液癌症的致瘤性。在一些实施方案中，该Notch1结合剂能够通过减少血液癌症中癌干细胞的频率来减少血液癌症的致瘤性。在某些实施方案中，癌症中癌干细胞的数量或频率被减少至少约2倍、约3倍、约5倍、约10倍、约50倍、约100倍、或约1000倍。在某些实施方案中，癌干细胞的频率的减少通过利用动物模型的有限稀释检验（LDA）确定。关于使用有限稀释检验来确定肿瘤中癌干细胞的数量或频率减少的实例和指导可见于，例如，国际公布No.WO2008/042236、美国专利公布No.2008/0064049和2008/0178305。

在某些实施方案中，Notch1结合剂或抗体经由抗体依赖性细胞毒性（ADCC）介导表达Notch1的细胞的细胞死亡。ADCC包括通过识别抗体的Fc部分的效应细胞的细胞裂解。例如，许多淋巴细胞、单核细胞、组织巨噬细胞、粒细胞和嗜酸粒细胞具有Fc受体并能够介导细胞溶解（Dillman,1994,J.Clin.Oncol.,12:1497）。

在一些实施方案中，Notch1结合剂或抗体通过激活补体依赖性细胞毒性（CDC）来触发表达Notch1受体的细胞的细胞死亡。CDC包括血清补体与抗体的Fc部分结合，随后激活补体蛋白级联，导致细胞膜破坏和最终细胞死亡。已知抗体的生物活性在很大程度上是由抗体分子的恒定结构域或Fc区决定的（Uananue和Benacerraf，1984,Textbook of Immunology，2nd Edition,Williams & Wilkins,p.218）。不同类和亚类的抗体在这方面不同，相同亚类但来自不同物种的抗体也如此。在人抗体中，IgM是最有效地结合补体的抗体种类，随后是IgG1、IgG3和IgG2，而IgG4在激活补体级联方面表现相当不足（Dillman,1994,J.Clin.Oncol.12:1497；Jefferis等,1998,Immunol.Rev. 163:59-76）。根据本发明，可制备具有期望生物活性的那些种类的抗体。

可检验任何具体Notch1结合剂或抗体介导通过CDC和/或ADCC溶解靶细胞的能力。在一些实施方案中，生长目标细胞并体外标记（靶细胞），向该细胞培养物加入抗体连同可被该抗原抗体复合物激活的血清补体或免疫细胞。例如，通过标记从溶解细胞的释放来检测靶细胞的细胞溶解。在一些实施方案中，可使用患者自身的血清作为补体和/或免疫细胞源来筛选抗体。然后，在体外检验中能够激活补体或介导ADCC的抗体能够在该特定患者中治疗地使用。

在某些实施方案中，该Notch1结合剂（例如抗体）具有在受治疗者或哺乳动物（如，小鼠、大鼠、猕猴或人）中至少约5小时、至少约10小时、至少约24小时、至少约3天、至少约1周、或至少约2周的循环半衰期。在某些实施方案中，该Notch1结合剂是具有在受治疗者或哺乳动物（如，小鼠、大鼠、猕猴或人）中至少约5小时、至少约10小时、至少约24小时、至少约3天、至少约1周、或至少约2周的循环半衰期的IgG（例如，IgG1或IgG2）抗体。增加剂诸如多肽和抗体的半衰期的方法是本领域已知的。在一些实施方案中，增加IgG抗体的循环半衰期的已知方法包括在Fc区中引入突变，这增加pH 6.0时抗体对新生Fc受体（FcRn）的pH依赖性结合（参见例如，美国专利公布No.2005/0276799；2007/0148164；和2007/0122403）。增加缺少Fc区的抗体片段的循环半衰期的已知方法包括但不限于诸如聚乙二醇化的技术。

在一些实施方案中，该Notch1结合剂是多克隆抗体。多克隆抗体可通过任何已知方法制备。在一些实施方案中，通过多次皮下注射或腹膜内注射相关抗原（例如，纯化的肽片段、全长重组蛋白或融合蛋白）来免疫动物（例如，兔、大鼠、小鼠、山羊、驴）从而产生多克隆抗体。该抗原可任选地与载体诸如匙孔血蓝蛋白（KLH）或血清白蛋白共轭。在无菌盐水中稀释该抗原（带有或不带有载体蛋白）并通常与佐剂（例如完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂）联合以形成稳定的乳液。在足够时间段后，从经免疫的动物的血液和腹水等中回收多克隆抗体。可以根据本领域的标准方法，包括但不限于亲和层析、离子交换色谱、凝胶电泳和透析从血清或腹水中纯化多克隆抗体。

在一些实施方案中，该Notch1结合剂是单克隆抗体。可采用本领域技术人员已知的杂交瘤方法制备单克隆抗体（参见例如，Kohler和Milstein,1975,Nature256:495-497）。在一些实施方案中，采用杂交瘤法，按照如上所述对小鼠、仓鼠或其它适当的宿主动物进行免疫以引发从淋巴细胞生成特异性结合免疫性抗原的抗体。在一些实施方案中，可以在体外免疫淋巴细胞。在一些实施方案中，免疫性抗原可以是人蛋白或其部分。在一些实施方案中，免疫性抗原可以是小鼠蛋白或其部分。

免疫后，分离淋巴细胞，并使用例如聚乙二醇将其与适当骨髓瘤细胞系融合，从而形成随后可以从未融合的淋巴细胞和骨髓瘤细胞中选出的杂交瘤细胞。可通过多种方法，包括但不限于免疫沉淀、免疫印迹或体外结合检验（例如流式细胞术、酶联免疫吸附检验（ELISA）和放射性免疫检验（RIA））来鉴定产生特异性抗所选抗原的单克隆抗体的杂交瘤。可使用标准方法（Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press,1986）在培养物中体外繁殖或以动物腹水肿瘤体内繁殖所述杂交瘤。根据本领域的标准方法，包括但不限于亲和层析、离子交换色谱、凝胶电泳和透析可从培养基或腹水中纯化单克隆抗体。

在某些实施方案中，可以使用本领域技术人员已知的重组DNA技术来制备单克隆抗体（参见例如，美国专利No.4,816,567）。使用能够特异性扩增编码单克隆抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸引物，通过例如RT-PCR从成熟B细胞或杂交瘤细胞分离出编码所述单克隆抗体的多核苷酸，并使用常规技术确定其序列。然后将所分离的编码重链和轻链的多核苷酸克隆到适当的表达载体中，当将该表达载体转染到诸如大肠杆菌（E.coli）、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢（CHO）细胞或骨髓瘤细胞等本身不生成免疫球蛋白的宿主细胞中时，由该宿主细胞产生单克隆抗体。在其它实施方案中，可以从表达所需物种的CDR的噬菌体展示文库中分离出重组单克隆抗体或其片段（参见例如，McCafferty等,1990,Nature,348:552-554；Clackson等,1991,Nature,352:624-628；和Marks等,1991,J.Mol.Biol.,222:581-597）。

可以使用重组DNA技术，进一步修饰编码单克隆抗体的多核苷酸，以产生替代性抗体。在一些实施方案中，可以将例如小鼠单克隆抗体的轻链和重链的恒定区取代为1)例如人抗体的恒定区，以产生嵌合抗体或2)非免疫球蛋白多肽，以产生融合抗体。在其它实施方案中，截短或去除所述恒定区以产生单克隆抗体的所需抗体片段。可以使用可变区的定点诱变或高密度诱变来优化单克隆抗体的特异性、亲和力、和/或其它生物特征。在一些实施方案中，可以使用CDR的定点诱变来优化单克隆抗体的特异性、亲和力、和/或其它生物特征。

在一些实施方案中，该Notch1结合剂是人源化抗体。通常，人源化抗体是其中利用本领域技术人员已知的方法，将来自CDR的残基被非人物种（例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠等）的具有所需特异性、亲和性和/或能力的CDR的残基置换的人免疫球蛋白。在一些实施方案中，人免疫球蛋白的Fv框架区残基被来自非人物种的具有所需特异性、亲和性和/或能力的抗体中的相应残基置换。在一些实施方案中，该人源化抗体可通过取代Fv框架区中和/或置换的非人残基中的另外的残基来进一步修饰，以精炼和优化抗体特异性、亲和性、和/或能力。一般，人源化抗体会包含基本上所有的至少一个、通常两个或三个可变域，所述可变域含有所有、或基本上所有的与非人免疫球蛋白对应的CDR区，而所有、或基本上所有的框架区是人免疫球蛋白共有序列的框架区。在一些实施方案中，人源化抗体还可以包含免疫球蛋白（通常为人免疫球蛋白）恒定区或域（Fc）的至少一部分。在某些实施方案中，在治疗上使用这样的人源化抗体，因为它们当施用于人受治疗者时可降低抗原性和HAMA（人抗小鼠抗体）应答。按照已知技术，本领域技术人员将能够获得具有降低的免疫原性的功能性人源化抗体（参见例如，美国专利No.5,225,539；5,585,089；5,693,761和5,693,762）。

在某些实施方案中，该Notch1结合剂是人抗体。可以使用本领域已知的各种技术来直接制备人抗体。在一些实施方案中，可以产生经体外免疫的永生化人B淋巴细胞或从能够生成针对靶抗原的抗体的经免疫个体中分离得到的永生化人B淋巴细胞（参见，例如，Cole等,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss,p.77(1985)；Boemer等,1991,J.Immunol.,147(1):86-95；美国专利No.5,750,373；5,567,610和5,229,275）。在一些实施方案中，可以从其中表达人抗体的噬菌体文库中选择人抗体（Vaughan等,1996,Nature Biotechnology,14:309-314；Sheets等,1998,PNAS，95:6157-6162；Hoogenboom和Winter,1991,J.Mol.Biol.,227:381；Marks等,1991,J.Mol.Biol.,222:581）。可选地，可使用噬菌体展示技术来从来自未免疫的供体的免疫球蛋白可变（V）结构域基因库体外产生人抗体和抗体片段。用于抗体噬菌体文库的产生和使用的技术还描述在美国专利No.5,969,108；6,172,197；5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915；6,593,081；6,300,064；6,653,068；6,706,484；和7,264,963；和Rothe等,2008,J.Mol.Bio.,376:1182-1200。诸如链改组（Marks等,1992,Bio/Technology,10:779-783）的亲和性突变策略是本领域已知的，可用于产生高亲和性人抗体。

在一些实施方案中，可以在含有人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠中制得人抗体，所述人免疫球蛋白基因座能够在没有内源性免疫球蛋白生成的情况下经免疫生成人抗体的全套抗体库。该方法描述在美国专利No.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425和5,661,016中。

在一些实施方案中，该Notch1结合剂是双特异性抗体。双特异性抗体能够特异性识别并结合至少两种不同表位。所述不同表位可以处在同一分子中或者处在不同的分子上。在一些实施方案中，该双特异性抗体是单克隆的人或人源化抗体。在一些实施方案中，该抗体可特异性识别和结合第一抗原靶（例如Notch1）以及第二抗原靶，诸如白细胞上的效应分子（例如，CD2、CD3、CD28或B7）或Fc受体（例如，CD64、CD32或CD16），从而将细胞防御机制集中于表达第一抗原靶的细胞。在一些实施方案中，可以使用抗体来将细胞毒剂导至表达特定靶抗原诸如Notch1的细胞。这些抗体具有抗原结合臂和结合细胞毒剂或放射性核素螯合剂如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA的臂。在某些实施方案中，该双特异性抗体特异性结合Notch1、以及选自以下组成的组的至少一种另外的Notch受体：Notch2、Notch3和Notch4、或选自以下组成的组的Notch配体：Jagged1、Jagged2、DLL1、DLL3和DLL4。

用于制造双特异性抗体的技术是本领域技术人员已知的，参见例如，Millstein等,1983,Nature,305:537-539；Brennan等,1985,Science,229:81；Suresh等,1986,Methodsin Enzymol.,121:120；Traunecker等,1991,EMBO J.,10:3655-3659；Shalaby等,1992,J.Exp.Med.,175:217-225；Kostelny等,1992,J.Immunol.,148:1547-1553；Gruber等,1994,J.Immunol.,152:5368；和美国专利No.5,731,168）。双特异性抗体可以是完整的抗体或抗体片段。还设想有多于两价的抗体。例如，可以制备三特异性抗体（Tutt等,1991,J.Immunol.,147:60）。如此，在某些实施方案中，Notch1抗体是多特异性的。

在某些实施方案中，本文所述的Notch1结合剂或抗体可以是单特异性的。例如，在某些实施方案中，抗体包含的一个或多个抗原结合位点的每一个能够结合（或结合于）Notch1上的同源表位。在某些实施方案中，本文描述的单特异性抗体的抗原结合位点能够结合（或结合于）Notch1和第二Notch诸如Notch2、Notch3或Notch4（即，相同表位见于Notch1上和例如见于Notch2上）。

在某些实施方案中，该Notch1结合剂是抗体片段。抗体片段可具有与完整抗体不同的功能或能力；例如，抗体片段可具有增加的肿瘤渗透。用于产生抗体片段的多种技术是已知的，包括但不限于完整抗体的蛋白水解性消化。在一些实施方案中，抗体片段包括由胃蛋白酶消化抗体分子产生的F(ab')2片段。在一些实施方案中，抗体片段包括通过还原F(ab')2片段的二硫键桥产生的Fab片段。在其它实施方案中，抗体片段包括以木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子产生的Fab片段。在某些实施方案中，抗体片段是重组地产生的。在一些实施方案中，抗体片段包括Fv或单链Fv（scFv）片段。Fab、Fv和scFv抗体片段可在大肠杆菌或其它宿主细胞中表达和从其分泌，允许产生大量的这些片段。在一些实施方案中，抗体片段从本文讨论的抗体噬菌体文库分离。例如，可使用方法来构建Fab表达文库（Huse等,1989,Science,246:1275-1281）以允许快速和有效地鉴定对Notch1蛋白或其衍生物、片段、类似物或同源物具有期望特异性的单克隆Fab片段。在一些实施方案中，抗体片段是线性抗体片段，如美国专利No.5,641,870中描述。在某些实施方案中，抗体片段是单特异性或双特异性。在某些实施方案中，该Notch1结合剂是scFv。多种技术可用于产生对Notch1特异性的单链抗体（参见例如，美国专利No.4,946,778）。

更理想的是，特别是在抗体片段的情况中，对抗体进行修饰以延长其血清半衰期。这可以通过例如以下方法来实现：通过抗体片段中适当区域的突变而将补救受体结合表位引入到抗体片段中，或者将所述表位引入到肽标签中，然后将肽标签融合到抗体片段的任一端或抗体片段的中间（例如通过DNA或肽合成）。

出于本发明的目的，应当理解的是经修饰的抗体或其片段可以包含使该抗体和Notch1的胞外域的近膜区相关联的任何类型的可变区。在这方面，该可变区可以来自于任何种类的哺乳动物，所述哺乳动物可以被诱导而加强体液应答和产生抗所需的抗原（如Notch1）的免疫球蛋白。这样，经修饰抗体的可变区可以例如来源于人、鼠、非人灵长动物（例如食蟹猴、猕猴等）或狼。在一些实施方案中，经修饰的免疫球蛋白的可变区和恒定区均是人的。在其它实施方案中，相容性抗体（一般来自于非人来源）的可变区可以经工程改造或特异性修改以改善该分子的结合性能或降低该分子的免疫原性。在这方面，可以通过包含引入的氨基酸序列而使对本发明有用的可变区人源化或以其它方式使该其改变。

在一些实施方案中，通过一个或多个CDR的至少部分置换可以改变重链和轻链中的可变域，并且如果需要，可以通过部分框架区置换和序列修饰来进行所述改变。尽管CDR可以来自于与从中获得框架区的抗体的类别或者甚至是亚类相同的抗体，但是设想到，CDR可以来自于不同类别的抗体，优选来自于不同物种的抗体。可能不需要用来自供体可变区的所有CDR来置换所有的CDR以将一个可变域的抗原结合能力转移到另一个可变域。而是，可以只需要转移对维持抗原结合位点活性所必需的那些残基。

虽然改变了可变区，但是本领域技术人员应当意识到，本发明的经修饰的抗体可包含这样的抗体（例如，全长抗体或其抗原结合片段），其中，当与具有近似相同免疫原性、包含天然或未改变的恒定区的抗体相比时，所述抗体中的一个或多个恒定区域的至少一部分已被缺失或以其它方式改变从而提供所需的生物化学特性，如增强的癌细胞定位、增加的肿瘤渗透、减少的血清半衰期或增加的血清半衰期。在一些实施方案中，经修饰的抗体的恒定区包含人恒定区。对恒定区所进行的修饰包括在一个或多个域中一个或多个氨基酸的添加、缺失或取代。本文所公开的经修饰的抗体可以包含对三个重链恒定域（CH1、CH2或CH3）的一个或多个和/或对轻链恒定域（CL）进行的改变或修饰。在一些实施方案中，从经修饰的抗体的恒定区中部分缺失或完全缺失一个或多个结构域。在其它实施方案中，去除了整个CH2域（ΔCH2构建体）。在一些实施方案中，所省掉的恒定区域被能够提供通常由缺失恒定区赋予的某些分子柔性的短氨基酸间隔子（例如10个氨基酸残基）置换。

在一些实施方案中，改造经修饰的抗体而将CH3域直接融合到抗体的铰链区。在其它实施方案中，在铰链区和经修饰的CH2和/或CH3域之间插入肽间隔子。例如，可以表达构建体，其中CH2域已经缺失，并且余下的CH3域（修饰或未修饰的）通过5-20个氨基酸间隔子而被连接到铰链区上。可以添加这样的间隔子以确保恒定域的调控元件保持自由且是可接近的或者使铰链区保持柔性。然而，应当注意的是，在某些情况中，可能证实氨基酸间隔子具有免疫原性并诱发抗所述构建体的不需要的免疫应答。因此，在某些实施方案中，加到所述构建体的任何间隔子应当相对无免疫原性，从而保持经修饰的抗体的所需生物化学性质。

在一些实施方案中，经修饰的抗体可仅具有恒定结构域的部分缺失或数个或甚至单个氨基酸的取代。例如，CH2域的所选区域中的单氨基酸突变可能足以显著降低Fc结合并由此加强癌细胞的定位和/或肿瘤渗透。类似地，可能希望简单地缺失一个或多个恒定区域的控制待调节的特定效应子功能（例如补体C1q结合）的那部分。恒定区的这种部分缺失可以改善抗体的所选特性（血清半衰期）同时保留与该恒定区域关联的其它所需功能完整。而且，如上文暗示的，可以通过能够改善所得构建体特性的一个或多个氨基酸的突变或取代来修饰所公开的抗体的恒定区。在这方面，有可能可以破坏由保守的结合位点提供的活性（例如Fc结合），同时基本保持经修饰的抗体的构型和免疫原性特性。在某些实施方案中，经修饰的抗体包含向恒定区添加的一个或多个氨基酸，以增强所需特性如减少或增加效应子功能，或者提供更多的细胞毒素或碳水化合物粘附。

本领域已知的是，恒定区介导数种效应子功能。例如，补体的C1组分与IgG或IgM抗体（结合于抗原）的Fc区的结合活化补体体系。补体活化对细胞病原体的调理和裂解是重要的。补体活化还刺激炎性应答，并且还能够参与自身免疫超敏性。另外，抗体的Fc区可结合表达Fc受体（FcR）的细胞。有大量的对不同类别抗体，包括IgG（γ受体）、IgE（ε受体）、IgA（α受体）和IgM（μ受体）具有特异性的Fc受体。抗体与细胞表面上的Fc受体的结合会触发许多重要而多样的生物学应答，包括抗体包被颗粒的吞噬和破坏、免疫复合物的清除、杀伤细胞对抗体包被靶细胞的裂解（ADCC）、炎性介质的释放、胎盘转移和免疫球蛋白生成的控制。

在一些实施方案中，该Notch1结合剂或抗体提供改变了的效应子功能，这反过来又影响了所施用抗体的生物学特性。例如，在一些实施方案中，恒定区域的缺失或失活（通过点突变或其它方式）可以减少循环中的经修饰的抗体（例如Notch1抗体）与Fc受体的结合，由此加强癌细胞的定位和/或肿瘤渗透。在其它实施方案中，恒定区修饰增加或减少抗体的血清半衰期。在一些实施方案中，修饰恒定区来消除二硫键或寡糖部分，允许加强癌细胞的定位。

在某些实施方案中，Notch1结合剂或抗体不具有一种或多种效应子功能。在一些实施方案中，该抗体不具有ADCC活性，和/或不具有CDC活性。在某些实施方案中，该抗体不结合Fc受体和/或补体因子。在某些实施方案中，该抗体不具有效应子功能。

本发明还包括与本文提出的嵌合抗体、人源化抗体和/或人抗体或它们的抗体片段基本同源的变体和等效物。这些变体或等效物可以含有例如保守性取代突变，即一个或多个氨基酸被相似的氨基酸取代。

如此，本发明提供用于产生结合Notch1的抗体的方法。在一些实施方案中，用于产生结合Notch1的抗体的方法包括使用杂交瘤技术。在一些实施方案中，该方法包括使用人或小鼠Notch1的胞外域作为免疫性抗原。在一些实施方案中，产生结合 Notch1的抗体的方法包括筛选人噬菌体文库。本发明还提供鉴定结合Notch1的抗体的方法。在一些实施方案中，通过以流式细胞术（FACS）筛选对Notch1的结合来鉴定抗体。在一些实施方案中，通过筛选Notch1激活的抑制或阻断来鉴定抗体。在一些实施方案中，通过筛选Notch1信号传导的抑制或阻断来鉴定抗体。

在某些实施方案中，本文所述的抗体是分离的。在某些实施方案中，本文所述的抗体是大体上纯的。

在本发明的一些实施方案中，该Notch1结合剂是多肽。该多肽可以是结合人Notch1的胞外域的非配体结合近膜区的重组多肽、天然多肽、或合成多肽。在一些实施方案中，该多肽包括结合人Notch1的胞外域的非配体结合近膜区的抗体或其片段。本领域技术人员承认可以对多肽的某些氨基酸序列进行变化而不会显著影响蛋白的结构或功能。因此，Notch1结合多肽还包括显示与人Notch1的胞外域的近膜区的基本结合活性的多肽的改变。在一些实施方案中，Notch1结合多肽的氨基酸序列改变包括缺失、插入、倒置、重复和/或类型取代。

可以对该多肽和其变体进一步进行修饰以含有正常情况下不是该多肽部分的其它化学基团。衍生的基团可以改善多肽的溶解度、生物半衰期和/或吸附。该基团还可以减少或消除该多肽和变体的任何不期望的副作用。可以在Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版，University of the Sciences,Philadelphia 2005中发现关于化学基团的综述。

可以通过本领域已知的任何合适的方法生产本文所述的多肽。所述方法从直接蛋白合成方法，到构建编码多肽序列的DNA序列并在合适的宿主中表达这些序列。在一些实施方案中，使用重组技术通过分离或合成编码野生型目的蛋白的DNA序列来构建DNA序列。任选地，可以通过位点特异性诱变来对该序列进行诱变从而提供其功能类似物。（参见，例如Zoeller等,1984,PNAS，81:5662-5066和美国专利No.4,588,585。）

在一些实施方案中，编码目的多肽的DNA序列可通过使用寡核苷酸合成仪的化学合成来构建。可以基于所需多肽的氨基酸序列和通过选择在会产生重组目的多肽的宿主细胞中偏好的那些密码子来设计寡核苷酸。可以应用标准方法来合成编码目的多肽的多核苷酸序列。例如，可以使用完整氨基酸序列来构建反译（back-translated）基因。另外，可以合成含有编码特定分离的多肽的核苷酸序列的DNA寡聚物。例如，可以合成几种编码所需多肽的一部分的小寡核苷酸并然后连接。各寡核苷酸通常含有5’或3’悬垂以用于互补组装。

一旦进行组装（通过合成、重组DNA技术、定点诱变或另一方法）后，则可将编码特定的目的多肽的多核苷酸序列插入表达载体并可操作地连接至适合在所需宿主中表达所述多肽的表达控制序列。可以通过核苷酸测序、限制酶切作图和/或在合适宿主中表达生物活性多肽来确认合适的组装。如本领域众所周知的，为了在宿主中获得转染基因的高表达水平，必须将该基因可操作地连接至在所选表达宿主中具有功能的转录和翻译表达控制序列。

在某些实施方案中，使用重组表达载体来扩增和表达编码Notch1结合剂诸如多肽或抗体或其片段的DNA。例如，重组表达载体可以是可复制的DNA构建体，其具有编码Notch1结合剂或抗体或其片段的多肽链的合成或cDNA来源的DNA片段，所述DNA片段与源自哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因的合适的转录或翻译调节元件可操作地连接。转录单元通常包括以下组件的组装体：(1)在基因表达中具有调节作用的遗传元件，例如，转录启动子或增强子，(2)转录为mRNA并且翻译成蛋白的结构或编码序列，和(3)合适的转录和翻译起始和终止序列。调节元件可以包括用于控制转录的操作子序列。在宿主中复制的能力通常由复制原点赋予，并且可以另外引入便于识别转化体的选择基因。当DNA区域相互功能上相关时，称为它们“可操作地连接”。例如，如果信号肽（分泌前导序列）的DNA表达为参与多肽分泌的前体，则信号肽（分泌前导序列）的DNA与多肽的DNA可操作地连接；如果启动子控制编码序列的转录，则启动子与编码序列可操作地连接；或如果核糖体结合位点经定位而允许翻译，则核糖体结合位点与编码序列可操作地连接。在一些实施方案中，旨在在酵母表达系统中使用的结构元件包括能够使宿主细胞将翻译蛋白分泌到胞外的前导序列。在其它实施方案中，当表达不具有前导序列或转运序列的重组蛋白时，其可以包括N末端甲硫氨酸残基。任选地，可以随后从表达的重组蛋白中切割下该残基以提供最终产物。

表达控制序列和表达载体的选择取决于宿主的选择。可以使用各种表达宿主/载体组合。对于真核宿主有用的表达载体包括，例如，包含来自SV40、牛乳头状瘤病毒、腺病毒和巨细胞病毒的表达控制序列的载体。对于细菌宿主有用的表达载体包括已知的细菌质粒，例如包括pCR1、pBR322、pMB9和其衍生物等在内的来自大肠杆菌的质粒，以及诸如M13和其它丝状单链DNA噬菌体等广宿主范围质粒。

用于表达Notch1结合剂或抗体（或将用作抗原的Notch1多肽）的合适的宿主细胞包括处于适当启动子控制下的原核生物、酵母、昆虫或高级真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性生物体或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌或杆菌。高级真核细胞包括如下所述哺乳动物来源的已建立细胞系。还可以使用无细胞翻译系统。

使用各种哺乳动物或昆虫细胞培养系统来表达重组多肽。在哺乳动物细胞中表达重组蛋白可以是优选的，因为所述蛋白通常正确地折叠、合适地修饰和具有完全功能。合适的哺乳动物宿主细胞系的实例包括COS-7（来源于猴肾）、L-929（来源于鼠成纤维细胞）、C127（来源于鼠乳瘤）、3T3（来源于鼠成纤维细胞）、CHO（来源于中国仓鼠卵巢）、HeLa（来源于人宫颈癌）和BHK（来源于仓鼠肾成纤维细胞）细胞系。哺乳动物表达载体可以包含与待表达基因连接的诸如复制原点、合适的启动子和增强子等非转录元件和其它5’或3’侧翼非转录序列，以及诸如必需的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点以及转录终止序列等5’或3’非翻译序列。用于在昆虫细胞中产生异源性蛋白的杆状病毒系统是本领域技术人员公知的（参见例如Luckow和Summers,1988,Bio/Technology,6:47）。

可以根据任何合适的方法对由经转化宿主产生的蛋白进行纯化。所述标准方法包括色谱（例如离子交换色谱、亲和色谱和尺寸排阻柱色谱）、离心、差别溶解度或通过用于蛋白纯化的任何其它标准技术。诸如六聚组氨酸、麦芽糖结合域、流感病毒外壳序列和谷胱甘肽-S-转移酶的亲和标签可以与蛋白连接，从而允许通过合适的亲和柱容易地进行纯化。还可使用诸如蛋白水解、高效液相色谱（HPLC）、核磁共振和x射线晶体学对分离的蛋白进行物理表征。

在一些实施方案中，可以首先使用商购的蛋白浓缩过滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤装置浓缩来自将重组蛋白分泌到培养基中的表达系统的上清液。浓缩步骤后，可将浓缩物施加到合适的纯化基质。在其它实施方案中，可以使用阴离子交换树脂，例如具有悬垂二乙氨基乙基（DEAE）基团的基质或基底。所述基质可以是丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、纤维素或蛋白纯化中常用的其它种类。在一些实施方案中，可以使用阳离子交换步骤。合适的阳离子交换器包括各种含有磺丙基或羧甲基的不溶性基质。在一些实施方案中，可以使用羟磷灰石（CHT）介质，包括但不限于陶瓷羟磷灰石。在一些实施方案中，可以使用一种或多种反相HPLC步骤来进一步纯化重组蛋白，所述反相HPLC步骤采用诸如具有悬垂甲基或其它脂肪族基团的硅胶等疏水性RP-HPLC介质。还可以以各种组合使用上述纯化步骤中的一些或全部，从而提供均一性的重组蛋白。

在一些实施方案中，细菌培养物中产生的重组蛋白可例如通过起始提取从细胞团块中分离，然后是一次或多次浓缩、盐析、水性离子交换或尺寸排阻色谱步骤。对于最后的纯化步骤可以使用HPLC。可以通过任何常规方法破坏重组蛋白表达中所用的微生物细胞，包括冻融循环、超声处理、机械破坏或使用细胞裂解剂。

本领域已知用于纯化抗体和其它蛋白的方法还包括，例如，美国专利公布No.2008/0312425、2008/0177048和2009/0187005中描述的那些。

在某些实施方案中，该Notch1结合剂是非抗体的多肽。用于鉴定和产生以高亲和性结合蛋白靶的非抗体多肽的多种方法是本领域已知的。参见例如，Skerra,2007,Curr.Opin.Biotechnol.,18:295-304；Hosse等,2006,Protein Science,15:14-27；Gill等,2006,Curr.Opin.Biotechnol.,17:653-658；Nygren,2008,FEBS J.,275:2668-76；和Skerra,2008,FEBS J.,275:2677-83。在某些实施方案中，可使用噬菌体展示技术来产生和/或鉴定Notch1结合多肽。在某些实施方案中，该Notch1结合多肽包括选自以下组成的组的类型的蛋白支架：蛋白A、蛋白G、脂笼蛋白、纤连蛋白结构域、锚蛋白共有重复结构域和硫氧还蛋白。

在某些实施方案中，该Notch1结合剂或抗体能够以多种共轭（即免疫共轭物或放射共轭物）或未共轭形式的任何一种使用。在某些实施方案中，该抗体可以未共轭形式使用来利用受治疗者的包括补体依赖性细胞毒性和抗体依赖性细胞毒性的自然防御机制消除恶性细胞或癌细胞。

在一些实施方案中，该Notch1结合剂（例如抗体或多肽）与细胞毒剂共轭。在一些实施方案中，该细胞毒剂是包括但不限于以下的化学治疗剂：氨甲喋呤、阿霉素、多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其它嵌入剂。在一些实施方案中，细胞毒剂是细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素、或其片段，包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、莫迪素A链、α-帚曲菌素(a-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒蛋白、丝裂蛋白(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素、和单端孢霉烯族化合物(tricothecene)。在一些实施方案中，细胞毒剂是产生放射共轭物或放射共轭的抗体的放射性同位素。用于产生放射共轭的抗体的多种放射性核素是可获得，包括但不限于⁹⁰Y、¹²⁵I、¹³¹I、¹²³I、¹¹¹In、¹³¹In、¹⁰⁵Rh、¹⁵³Sm、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、¹⁶⁶Ho、¹⁷⁷Lu、 ¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re和²¹²Bi。还可使用抗体与一种或多种小分子毒素，诸如加利车霉素、美登醇(maytansinoid)、单端胞菌毒素(trichothene)和CC1065以及这些毒素的具有毒素活性的衍生物的轭合物。使用诸如以下的多种双官能蛋白偶联剂制造抗体与细胞毒剂的轭合物：N-琥珀酰亚胺基-3-2-(吡啶二硫醇)丙酸酯(SPDP)、亚氨基四氢噻吩(iminothiolane,IT)、亚胺酯的双官能衍生物(如二亚胺代己二酸二甲酯HCL)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、双叠氮化合物(如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双-二氮鎓衍生物(如双-(对二氮鎓苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。

异源共轭抗体也在本发明的范围之内。异源共轭抗体由两个共价连接的抗体构成。已经提出例如利用这样的抗体将免疫细胞靶向到有害细胞上(美国专利No.4,676,980)。还设想到，可以使用合成蛋白化学中已知的方法，包括涉及交联剂的方法体外制备所述抗体。

在某些实施方案中，本发明涵盖包含编码特异性结合Notch1的多肽或这种多肽的片段的多核苷酸的多核苷酸。术语“编码多肽的多核苷酸”涵盖仅包括多肽的编码序列的多核苷酸、以及包括另外的编码和/或非编码序列的多核苷酸。例如，本发明提供包含编码针对人Notch1的抗体或编码这种抗体的片段的核酸序列的多核苷酸。本发明的多核苷酸可以为RNA形式或DNA形式。DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA；并且可以是双链或单链，如果是单链，其可以是编码链或非编码链（反义链）。

在某些实施方案中，提供包含编码包含选自以下组成的组的序列的多肽的多核苷酸的多核苷酸：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:28和SEQID NO:32。在一些实施方案中，提供编码包含选自以下组成的组的序列的多肽（带有或不带有信号序列）的多核苷酸序列：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:30。

在一些实施方案中，提供包含选自以下组成的组的核苷酸序列（带有或不带有信号序列）的多核苷酸：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:29。

在某些实施方案中，提供包含具有与包含选自以下组成的组的序列的多核苷酸至少80%相同、至少85%相同、至少90%相同、至少95%相同，且在一些实施方案中，至少96%、97%、98%或99%相同的核苷酸序列的多核苷酸（带有或不带有信号序列）的多核苷酸：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:29。在一些实施方案中，该多核苷酸具有与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:13至少90%相同的核苷酸序列。

还提供包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:29、和/或与编码具有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32的序列的多肽的多核苷酸杂交的多核苷酸的多核苷酸。在某些实施方案中，该杂交是在高严格性条件下。

在某些实施方案中，多核苷酸包含成熟多肽的编码序列，该编码序列在同一阅读框中融合于有助于例如在宿主细胞中表达和分泌多肽的多核苷酸（例如用作控制多肽从细胞中转运的分泌序列的前导序列）。具有前导序列的多肽是一种前体蛋白，所具有的前导序列可被宿主细胞切除以产生成熟形式的多肽。多核苷酸还可以编码这样的前体蛋白，该前体蛋白是成熟蛋白加上额外的5'氨基酸残基。具有前体序列的成熟蛋白是一种前体蛋白，并且是该蛋白的非活性形式。切除前体序列后，留下的即是具有活性的成熟蛋白。

在某些实施方案中，多核苷酸包含成熟多肽的编码序列，该编码序列在同一阅读框中融合于允许例如纯化和/或鉴定所编码多肽的标志序列。例如，在细菌宿主的情况中，该标志序列可以是由pQE-9载体提供的六组氨酸标签以纯化与该标志物融合的成熟多肽，或者，当使用哺乳动物宿主（例如COS-7细胞）时，标志序列可以是源自于流感血凝素蛋白的血凝素（HA）标签。在一些实施方案中，标志序列是可联合其它亲和性标签使用的FLAG标签，即序列DYKDDDK的肽（SEQ ID NO:33）。

本发明还涉及上述多核苷酸的变体，其编码例如，片段、类似物、和/或衍生物。

在某些实施方案中，本发明提供多核苷酸，该多核苷酸包含具有与编码包含本文所述的针对人Notch1的抗体或其片段的多肽的多核苷酸至少80%相同、至少85%相同、至少90%相同、至少95%相同，且在一些实施方案中，至少96%、97%、98%或99%相同的核苷酸序列的多核苷酸。

本文所用的短语具有与对照核苷酸序列至少例如95%“同一性”的核苷酸序列的多核苷酸是指，除了该多核苷酸序列可包含至多5个点突变/参考核苷酸序列的100个核苷酸之外，该多核苷酸的核苷酸序列与参考序列是相同的。换言之，为了获得具有与参考核苷酸序列至少95%同一性的核苷酸序列的多核苷酸，参考序列中至多有5%的核苷酸可以被缺失或被另一核苷酸取代，或者占参考序列中总核苷酸的至多5%的数量的核苷酸可以插入到参考序列中。参考序列的这些突变可以发生在参考核苷酸序列的5'末端位置或3'末端位置，或者这些末端位置之间的任意位置，或者单独地散布在参考序列的核苷酸之中，或者以一个或多个相邻的组存在在参考序列中。

多核苷酸变体可以在编码区、非编码区或二者中含有变化。在一些实施方案中，多核苷酸变体含有产生沉默取代、添加或缺失但不改变所编码多肽的性质或活性的变化。在一些实施方案中，由于遗传密码子的简并性，多核苷酸变体包含“沉默”取代。可以为了各种理由，例如优化用于特定宿主的密码子表达（例如，将人mRNA中的密码子改变为细菌宿主如大肠杆菌偏好的密码子）来产生多核苷酸变体。

在一些实施方案中，多核苷酸可包括修饰的核苷酸，诸如甲基化的核苷酸和其类似物。如果存在对核苷酸结构的修饰，可以在组装聚合物之前或之后给予。核苷酸的序列可被非核苷酸组分中断。多核苷酸可在聚合后被进一步修饰，诸如通过共轭标记组分。其它类型的修饰包括，例如，“加帽”；以类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸；核苷酸间修饰诸如，不带电荷的键（例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酸酰胺酯、和氨基甲酸酯）和带电荷的键（例如，硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯）；悬垂部分诸如蛋白（例如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽和聚-L-赖氨酸）；嵌入剂（例如，吖啶和补骨脂素）；螯合剂（例如，金属、放射性金属、硼和氧化性金属）；烷化剂（alkylator）；修饰的键（例如，α异头碳核酸）；以及未修饰形式的多核苷酸。另外，糖中通常存在的任何羟基可被例如膦酸酯基团、磷酸酯基团代替，被标准保护基保护，或被活化以准备与另外核苷酸另外成键，或可被共轭于固体支撑物。5'和3'末端OH可被磷酸化或被胺或1至20个碳原子的有机加帽基团部分取代。其它羟基也可被衍生为标准保护基。多核苷酸还可包含本领域中一般已知的核糖或脱氧核糖糖的类似形式，包括例如，2'-O-甲基-、'-O-烯丙基、2'-氟-或2'-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、α-异头碳糖、差向异构糖诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、庚酮糖、无环类似物、和无碱基核苷类似物诸如甲基核糖苷。一个或多个磷酸二酯键可被替代性的连接基团代替。这些替代性的连接基团包括但不限于其中磷酸酯被以下代替的实施方案：P(O)S（"硫代物"）、P(S)S（"二硫代物"）、"(O)NR₂（"酰胺酯"）、P(O)R、P(O)OR′、CO或CH₂（"甲缩醛"），其中每个R或R'独立地是H或取代的或未取代的烷基（1-20C），任选地包含醚（--O--）键、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基。多核苷酸中的所有键不必是相同的。

在某些实施方案中，本文所述的多核苷酸是分离的。在某些实施方案中，本文所述的多核苷酸是大体上纯的。

还提供包含本文所述多核苷酸的载体和细胞。在一些实施方案中，表达载体包括多核苷酸分子。在一些实施方案中，宿主细胞包括包含该多核苷酸分子的表达载体。在一些实施方案中，宿主细胞包括多核苷酸分子。

III.使用方法和药物组合物

本发明的Notch1结合剂（例如，多肽和/或抗体）可用于多种应用，包括但不限于治疗性治疗方法，诸如血液癌症的治疗。在某些实施方案中，该剂可用于调节Notch1的活性，抑制Notch1活性，抑制或阻断Notch1/Notch配体相互作用，抑制Notch1信号传导，和/或抑制Notch1激活。在一些实施方案中，该Notch1结合剂可用于阻断Notch1的裂解，抑制近膜区的裂解，抑制近膜区中S2位点处的裂解，抑制Notch1的胞内域释放。在一些实施方案中，该Notch1结合剂可用于抑制癌细胞生长，减少癌细胞体积，减少癌细胞群，减少血液癌症的致瘤性，减少血液癌症中癌干细胞的频率，减少血液癌症中白血病起源细胞的频率，诱导癌细胞死亡，和/或诱导分化。使用方法可以是体外、离体或体内方法。在某些实施方案中，该Notch1结合剂（例如，多肽和/或抗体）是Notch1的拮抗剂。在某些实施方案中，该Notch1结合剂是Notch信号传导途径的拮抗剂。在一些实施方案中，该Notch1结合剂是Notch1激活的拮抗剂。

在某些实施方案中，本文所述的Notch1结合剂用于治疗与Notch信号传导和激活相关的疾病。在特定实施方案中，该疾病是与Notch信号传导途径相关的疾病。在特定实施方案中，该疾病是与组成型激活的Notch1相关的疾病。在一些实施方案中，癌细胞生长与Notch信号传导途径相关。在一些实施方案中，癌细胞生长与Notch1激活相关。在一些实施方案中，该疾病是血液癌症。在某些实施方案中，该血液癌症是急性骨髓性白血病、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤或T细胞急性淋巴母细胞性白血病。在一些实施方案中，该疾病是T细胞急性淋巴母细胞性白血病。

本发明还提供使用本文所述Notch1结合剂抑制血液癌症生长的方法。在某些实施方案中，抑制血液癌症生长的方法包括在体外将肿瘤细胞与Notch1结合剂（例如抗体）接触。例如，将在细胞表面上表达Notch1的永生化细胞系或癌症细胞系培养在添加了抑制癌细胞生长的抗体或其它剂的培养基中。在一些实施方案中，从患者样品分离癌细胞，所述患者样品诸如例如，组织活检样品、胸膜积液或血液样品，并培养在添加了抑制癌细胞生长的Notch1结合剂的培养基中。

在一些实施方案中，抑制血液癌症生长的方法包括在体内将癌细胞与Notch1结合剂（例如抗体）接触。在某些实施方案中，将癌细胞与Notch1结合剂接触是在动物模型中进行。例如，在白血病的一种动物模型中，将免疫受损小鼠（例如NOD/SCID小鼠）亚致死地辐射，然后在24小时内静脉内注射原代人白血病细胞。已经显示人白血病细胞能够移入小鼠的造血组织。在替代性模型中，将免疫受损小鼠（例如NOD/SCID小鼠）静脉内注射原代人白血病细胞而无此前的辐射。在白血病的不同动物模型中，将免疫受损小鼠（例如NOD/SCID小鼠）亚致死地辐射，然后用人脐带血或骨髓单核细胞“预处理”。一段时间后（例如5-7天），对这些小鼠注射来自患有血液癌症诸如T细胞急性淋巴母细胞性白血病的患者的细胞。白血病细胞已经显示移入这些预处理的小鼠。（参见例如，Dialynas等,2001,Stem Cells 19:443-452，Dialynas等,2001,Blood 97:3218-3225，和美国专利6,930,222和7,186,880）。

在一些实施方案中，Notch1结合剂（例如抗体）在注射血液癌症细胞后立即施用，以研究该Notch1结合剂对癌细胞移入的作用。在一些实施方案中，Notch1结合剂在注射血液癌症细胞（例如白血病细胞）之前施用。在一些实施方案中，Notch1结合剂在血液癌症细胞已经移入小鼠中后施用，以研究该Notch1结合剂对已建立的血液癌症的作用。在一些实施方案中，Notch1结合剂在血液癌症细胞已经移入预处理小鼠后施用，以研究该Notch1结合剂对已建立的血液癌症的作用。在一些实施方案中，在注射血液癌症细胞（例如白血病细胞）到小鼠1天、2天、3天、4天、5 天等之前，向小鼠施用该Notch1结合剂。在一些实施方案中，在血液癌症细胞移入1周、2周、3周、4周、5周、6周等之后，向小鼠施用该Notch1结合剂。施用该Notch1结合剂后，观察小鼠的癌细胞移入的抑制和/或癌细胞生长的抑制。在一些实施方案中，从患者样品诸如例如，组织活检、胸膜积液或血液样品分离癌干细胞并注入免疫受损小鼠，然后施用Notch1结合剂以抑制癌细胞生长。在一些实施方案中，从患者样品诸如例如，组织活检、胸膜积液或血液样品分离癌干细胞并注入辐射的、预处理的免疫受损小鼠，然后施用Notch1结合剂以抑制癌细胞生长。在一些实施方案中，在向动物引入癌细胞的同时或短时间后施用该Notch1结合剂以阻止癌细胞生长。在一些实施方案中，在已经移入癌细胞并建立血液癌症后施用该Notch1结合剂作为治疗剂。在一些实施方案中，该血液癌症细胞包括癌干细胞。在一些实施方案中，该血液癌症细胞包括白血病起源细胞。

本发明提供在受治疗者中抑制血液癌症生长的方法，该方法包括向所述受治疗者施用治疗有效量的特异性结合人Notch1的胞外域的非配体结合近膜区的抗体。在一些实施方案中，该血液癌症包括癌干细胞。在一些实施方案中，该血液癌症包括白血病起源细胞。在一些实施方案中，该方法包括以本文所述的Notch1抗体靶向该癌干细胞或白血病起源细胞。在某些实施方案中，抑制血液癌症生长的方法包括施用治疗有效量的本文所述的Notch1抗体。

在某些实施方案中，抑制血液癌症生长的方法包括减少该癌症中癌干细胞的频率，减少该癌症中癌干细胞的数量，减少该癌症的致瘤性，和/或通过减少该癌症中癌干细胞的数量或频率来减少该癌症的致瘤性。在一些实施方案中，抑制血液癌症生长的方法包括抑制Notch1受体的活性。在某些实施方案中，该血液癌症包括但不限于急性骨髓性白血病、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤或T细胞急性淋巴母细胞性白血病。在一些实施方案中，该血液癌症是T细胞急性淋巴母细胞性白血病。

在某些实施方案中，治疗血液癌症的方法包括施用治疗有效量的与特异性结合人Notch1受体的胞外域的非配体结合近膜区并抑制癌症生长的细胞毒性部分共轭的抗体。在某些实施方案中，治疗血液癌症的方法包括联合放射治疗施用治疗有效量的本文所述的任何方面和/或实施方案、以及其它方面和/或实施方案的抗体。在某些实施方案中，治疗血液癌症的方法包括联合化疗施用治疗有效量的本文所述的任何方面和/或实施方案、以及其它方面和/或实施方案的抗体。在某些实施方案中，治疗血液癌症的方法包括施用治疗有效量的特异性结合人Notch1受体的胞外域的非配体结合近膜区并抑制癌症生长的抗体，其中该血液癌症包括但不限于急性骨髓性白血病、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤或T细胞急性淋巴母细胞性白血病。

在另一方面，本发明提供在需要其的受治疗者治疗血液癌症的方法，包括向所述受治疗者施用治疗有效量的特异性结合人Notch1受体蛋白的胞外域的非配体结合近膜区并抑制受治疗者中癌症生长的抗体。在某些实施方案中，治疗血液癌症的方法包括施用治疗有效量的单克隆抗体。在某些实施方案中，治疗血液癌症的方法包括施用治疗有效量的嵌合抗体。在某些实施方案中，治疗血液癌症的方法包括施用治疗有效量的人源化抗体。在某些实施方案中，治疗血液癌症的方法包括施用治疗有效量的人抗体。

在某些实施方案中，抑制血液癌症生长的方法包括向所述受治疗者施用治疗有效量的Notch1结合剂。在某些实施方案中，该受治疗者是人。在某些实施方案中，该受治疗者患有血液癌症。在某些实施方案中，该受治疗者已经去除了癌细胞。在一些实施方案中，该Notch1结合剂是抗体。在一些实施方案中，该Notch1结合剂是抗体52M51。在一些实施方案中，该Notch1结合剂是52M51的人源化形式。

在某些实施方案中，该血液癌症细胞表达该Notch1结合剂或抗体结合的Notch1。在某些实施方案中，该肿瘤过表达人Notch1。在一些实施方案中，该Notch1结合剂结合Notch1并抑制或减少血液癌症生长。在一些实施方案中，该Notch1结合剂结合Notch1，干扰Notch1/Notch配体相互作用并抑制或减少血液癌症生长。在一些实施方案中，该Notch1结合剂结合Notch1，抑制Notch激活并抑制或减少血液癌症生长。在一些实施方案中，该Notch1结合剂结合Notch1，并减少血液癌症中癌干细胞的频率。在一些实施方案中，该Notch1结合剂结合组成型激活的Notch1并抑制Notch1活性。

在某些实施方案中，该血液癌症是急性骨髓性白血病、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤或T细胞急性淋巴母细胞性白血病。在某些实施方案中，该血液癌症是急性骨髓性白血病。在某些实施方案中，该血液癌症是霍奇金淋巴瘤。在某些实施方案中，该血液癌症是多发性骨髓瘤。在某些实施方案中，该血液癌症是T细胞急性淋巴母细胞性白血病。在某些实施方案中，该受治疗者是人。

本发明还提供使用本文所述Notch1结合剂治疗血液癌症的方法。在某些实施方案中，该血液癌症以表达该Notch1结合剂（例如抗体）结合的Notch1的细胞为特征。在某些实施方案中，该血液癌症过表达人Notch1。在某些实施方案中，该血液癌症以表达Notch1的细胞为特征，其中该Notch1剂（例如抗体）干扰Notch配体引起的Notch信号传导和/或激活。在一些实施方案中，该Notch1结合剂结合Notch1并抑制或减少血液癌症生长。在一些实施方案中，该Notch1结合剂结合Notch1，干扰Notch1/Notch配体相互作用并抑制或减少血液癌症生长。在一些实施方案中，该Notch1结合剂结合Notch1，抑制Notch1激活并抑制或减少血液癌症生长。在一些实施方案中，该Notch结合剂结合Notch，并减少血液癌症中癌干细胞的频率。

本发明提供治疗血液癌症的方法，包括向受治疗者（例如需要治疗的受治疗者）施用治疗有效量的Notch1结合剂。在某些实施方案中，该受治疗者是人。在某些实施方案中，该受治疗者患有血液癌症。在某些实施方案中，该受治疗者已经去除了癌细胞。在一些实施方案中，该Notch1结合剂是抗体。在一些实施方案中，该Notch1结合剂是抗体52M51。在一些实施方案中，该Notch1结合剂是52M51的人源化形式。

在某些实施方案中，该血液癌症是选自以下组成的组的癌症：急性骨髓性白血病、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤和T细胞急性淋巴母细胞性白血病。在某些实施方案中，该血液癌症是急性骨髓性白血病。在某些实施方案中，该血液癌症是霍奇金淋巴瘤。在某些实施方案中，该血液癌症是多发性骨髓瘤。在某些实施方案中，该血液癌症是T细胞急性淋巴母细胞性白血病。在某些实施方案中，该受治疗者是人。

本发明还提供抑制细胞中Notch信号传导或Notch激活的方法，包括将该细胞与有效量的Notch1结合剂接触。在某些实施方案中，该细胞是血液癌症细胞。在某些实施方案中，该方法是体内方法，其中将该癌细胞与该Notch1结合剂接触的步骤包括向所述受治疗者施用治疗有效量的该Notch1结合剂。在一些实施方案中，该方法是体外或离体方法。在某些实施方案中，该Notch1结合剂抑制Notch信号传导。在一些实施方案中，该Notch1结合剂抑制Notch激活。在某些实施方案中，该Notch1结合剂干扰Notch1/Notch配体相互作用。在某些实施方案中，该Notch1结合剂抑制选自以下组成的组的至少一种另外Notch受体的Notch激活：Notch2、Notch3和Notch4。在一些实施方案中，该Notch1结合剂是抗体。在一些实施方案中，该Notch1结合剂是抗体52M51。在一些实施方案中，该Notch1结合剂是52M51的人源化形式。

另外，本发明提供在受治疗者中减少血液癌症的致瘤性的方法，包括向所述受治疗者施用治疗有效量的Notch1结合剂。在某些实施方案中，该血液癌症包括癌干细胞。在某些实施方案中，该血液癌症包括白血病起源细胞。在某些实施方案中，血液癌症中癌干细胞的频率通过施用该Notch1结合剂而减少。本发明还提供减少血液癌症中癌干细胞的频率的方法，包括将该癌细胞与有效量的Notch1结合剂接触。在一些实施方案中，该Notch1结合剂是抗体52M51。在一些实施方案中，该Notch1结合剂是52M51的人源化形式。

本发明还提供在受治疗者中治疗疾病或障碍的方法，其中该疾病或障碍以癌干细胞、白血病起源细胞和/或祖先细胞水平升高为特征。在一些实施方案中，该治疗方法包括向所述受治疗者施用治疗有效量的该Notch1结合剂、多肽或抗体。

本发明还提供包含本文所述的Notch1结合剂、抗体或多肽的药物组合物。这些药物组合物可用于在人患者中抑制癌细胞生长、抑制血液癌症生长、和治疗血液癌症。

通过将本发明的经纯化拮抗剂（例如抗体）与药学上可接受的载剂（例如载体、赋形剂等）组合，制备用于贮存和使用的制剂（Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版，University of the Sciences Philadelphia 2005）。合适的药学上可接受的载剂包括但不限于无毒缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；盐，诸如氯化钠；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂，诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；尼泊金烷基酯，诸如尼泊金甲酯或尼泊金丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚；低分子量多肽（小于约10个氨基酸）；蛋白，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；糖类，诸如单糖、二糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子，诸如钠；金属复合物，诸如Zn-蛋白复合物；和/或非离子表面活性剂，诸如吐温或聚乙二醇（PEG）。

可以以用于局部治疗或全身性治疗的任何多种方式施用本发明的药物组合物。施用可以是局部的（例如施用至粘膜，包括阴道递送和直肠递送），诸如透皮贴剂、膏剂、洗剂、霜剂、凝胶、滴剂、栓剂、喷剂、液体和粉末；例如通过吸入或吹入粉末或气雾剂（包括通过喷雾器）等肺递送、气管内、鼻内、表皮和透皮递送；口服；包括静脉内、动脉内、肿瘤内、皮下、腹膜内或肌肉内注射或输注等胃肠外递送；或诸如脑膜内或脑室内等颅内递送。

治疗制剂可以是单位剂量形式。所述制剂包括用于口服、胃肠外或直肠施用或用于通过吸入施用的片剂、丸剂、胶囊剂、粉末剂、颗粒剂、水中或非水性介质中的溶液或悬浮液、或栓剂。在诸如片剂等固体组合物中主要活性成分与药物载体混合。常规的制片成分包括玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶和其它稀释剂（例如水），从而形成含有本发明化合物或其无毒药学上可接受的盐的均匀混合物的固体预制剂组合物。然后所述固体预制剂组合物再分成本文所述种类的单位剂型。可以对该新型组合物的片剂、丸剂等进行包衣或以其它方式配制，从而提供具有延长作用优点的剂型。例如，所述片剂或丸剂可以包括被外部组分覆盖的内部组分。另外，两种组分可以被肠溶层分隔，所述肠溶层用于抵抗崩解，并且允许内部组分完整地通过胃或延迟释放。对于所述肠溶层或包衣可以使用各种材料，所述材料包括许多聚合酸和聚合酸的混合物，所述材料如虫胶、十六烷醇和乙酸纤维素。

药物制剂包括与脂质体复合的本发明的抗体（Epstein等,1985,PNAS,82:3688；Hwang,等,1980,PNAS,77:4030；和美国专利No.4,485,045和4,544,545）。具有延长的循环时间的脂质体公开于美国专利No.5,013,556。可以利用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺（PEG-PE）的脂质组合物通过反相蒸发产生某些脂质体。将脂质体通过规定孔径的过滤器挤出，从而产生具有所需直径的脂质体。

还可以将所述抗体包埋在微胶囊中。例如根据Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版，University of the Sciences Philadelphia 2005所述，在胶体药物递送系统（例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊）中或在大乳液中分别通过凝聚技术或通过界面聚合，制备所述微胶囊，例如羟甲基纤维素或明胶-微胶囊或聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。

另外可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质是成型物的形式（例如膜或微胶囊）。缓释基质的实例包括聚酯、诸如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇)等水凝胶、聚交酯（美国专利第3,773,919号）、L-谷氨酸和7乙基-L-谷氨酰胺的共聚物、不可降解乙烯-乙酸乙烯酯、诸如LUPRON DEPOT TM（由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林组成的可注射微球）等可降解乳酸-乙醇酸共聚物、蔗糖乙酸异丁酸酯和聚-D(-)-3-羟基丁酸。在一些实施方案中，可以使用所述抗体来治疗特征在于表达癌干细胞标志物和/或细胞对癌干细胞标志物的应答性增加的各种疾病。特别地，设想使用针对癌干细胞标志物例如Notch1的抗体来治疗增殖性疾病，所述疾病包括但不限于肾、肝、膀胱、乳腺、胃、卵巢、结肠、直肠、前列腺、肺、外阴、甲状腺、头颈部、脑（例如成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、成髓细胞瘤）的良性肿瘤和恶性肿瘤、和血液癌症诸如白血病和淋巴瘤。

在某些实施方案中，除了施用Notch1结合剂以外，该方法或治疗还包括施用至少一种另外的治疗剂。另外的治疗剂可在施用该Notch1结合剂之前、同时、和/或随后施用。还提供包含该Notch1结合剂和另外的治疗剂的药物组合物。在一些实施方案中，至少一种另外的治疗剂包括1、2、3或更多种另外的治疗剂。

利用至少两种治疗剂的联合治疗通常使用以不同作用机制起作用的剂，但这不是必需的。使用具有不同作用机制的剂的联合治疗可导致加和或协同效果。联合治疗可允许比单治疗中使用每种剂的较低剂量，从而减少毒性副作用。联合治疗可能降低癌细胞发展耐药性的可能性。联合治疗可允许一种剂靶向致瘤性的癌干细胞而第二剂靶向非致瘤性的癌细胞。

应理解的是，Notch1结合剂与另外的治疗剂的组合可以任何顺序或同时施用。在一些实施方案中，该Notch1结合剂将施用于此前已经历用第二治疗剂治疗的患者。在某些其它实施方案中，该Notch1结合剂与第二治疗剂基本上同时或并发地施用。例如，受治疗者可被提供Notch1结合剂（例如抗体），同时经历用第二治疗剂治疗的过程（例如化疗）。在某些实施方案中，该Notch1结合剂在用第二治疗剂治疗1年内施用。在某些替代性实施方案中，该Notch1结合剂在用第二治疗剂的任何治疗的10、8、6、4或2个月内施用。在某些其它实施方案中，该Notch1结合剂在用第二治疗剂的任何治疗的4、3、2或1周内施用。在一些实施方案中，该Notch1结合剂在用第二治疗剂的任何治疗的5、4、3、2或1天内施用。还应理解的是，两种（或更多种）剂或治疗可在大约几小时或几分钟内（即，基本上同时地）施用于受治疗者。

用于治疗血液癌症的治疗剂包括但不限于抗生素，诸如道诺霉素、阿霉素、米托蒽醌和伊达比星；拓扑异构酶抑制剂，诸如依托泊苷、替尼泊苷和托泊替康；DNA合成抑制剂，诸如卡铂；DNA损伤剂，诸如环磷酰胺和和异环磷酰胺；细胞毒性酶诸如天冬酰胺酶和培门冬酶；酪氨酸激酶抑制剂，诸如甲磺酸伊马替尼、达沙替尼和尼罗替尼；抗代谢药，诸如阿扎胞苷、氯法拉滨、阿糖胞苷、克拉屈滨、氟达拉滨、羟基脲、巯基嘌呤、氨甲喋呤、硫鸟嘌呤和奈拉滨；合成激素，诸如泼尼松、泼尼松龙和地塞米松，抗有丝分裂剂，诸如长春新碱；和蛋白酶抑制剂，诸如硼替佐米。

可联合该Notch1结合剂施用的治疗剂包括以上提到的治疗剂以及其它化学治疗剂。因此在一些实施方案中，治疗方法包括将Notch1结合剂或抗体与化学治疗剂或多种不同的化学治疗剂的混合物联合施用。可以在施用化学治疗剂之前、同时或之后进行使用Notch1结合剂或抗体的治疗。联合施用可以包括以单一药物制剂或使用分开制剂的共施用，或以任何顺序但通常在一段时间内的连续施用，从而使得所有活性剂可以同时发挥其生物活性。可以根据制造商说明书或有经验的从业者根据经验确定，来使用用于所述化学治疗剂的制剂和给药方案。用于所述化学治疗的制剂和给药方案还描述于Chemotherapy Service编，M.C.Perry，Williams & Wilkins,Baltimore,Md.(1992)。

可用于本发明的化学治疗剂包括但不限于烷化剂，诸如噻替派和环磷酰胺；烷基磺酸酯，诸如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶，诸如苯佐替派、卡波醌、美妥替哌和乌瑞替派；乙烯亚胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲蜜胺；氮芥，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯代环磷酰胺、雌氮芥、异环磷酰胺、氮芥、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新氮芥、胆甾醇对苯乙酸氮芥、泼尼氮芥、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；硝基脲，诸如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素，诸如阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、加利车霉素、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌素、色霉素、更生霉素、道诺红菌素、地托比星、6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、紫菜霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢药，诸如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶（5-FU）；叶酸类似物，诸如二甲叶酸、氨甲蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如安西他滨、阿扎胞苷、6-阿扎尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU；雄激素，诸如卡鲁睾酮、丙酸甲雄烷酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺药，诸如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，诸如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；百托布；比山群；依达曲沙、得福安；脱羧秋水仙碱；地吖醌；艾福敏；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK.；雷佐生；西索菲兰；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加胞嘧啶；阿拉伯糖苷（Ara-C）；紫杉烷，诸如紫杉醇和多西他赛；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；铂类似物，诸如顺铂和卡铂；长春碱；铂；足叶乙苷；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；异长春花碱；诺消灵；替尼泊苷；道诺霉素；氨蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；CPT11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸；视黄酸；埃斯波霉素；卡培他滨；和上述任何一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。化学治疗剂还包括用于调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，如抗雌激素剂，包括例如，三苯氧胺、雷洛昔芬、芳香化酶抑制性4(5)-咪唑、4-羟基三苯氧胺、曲沃昔芬、雷洛西芬盐酸盐、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬（Fareston）；以及抗雄激素剂，如氟他米特、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；和上述任何一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。

在某些实施方案中，化学治疗剂是拓扑异构酶抑制剂。拓扑异构酶抑制剂是干扰拓扑异构酶（例如拓扑异构酶I或II）作用的化学治疗剂。拓扑异构酶抑制剂包括但不限于盐酸多柔比星、道诺红菌素柠檬酸盐、盐酸米托蒽醌、放线菌素D、足叶乙苷、盐酸托泊替康、替尼泊苷和伊立替康，和上述任何一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。

在某些实施方案中，化学治疗剂是抗代谢药。抗代谢药是具有与正常生化反应所需的代谢物类似的结构的化学品，但是不同之处足够干扰细胞的一种或多种正常功能，例如细胞分裂。抗代谢药包括但不限于吉西他滨、氟尿嘧啶、卡培他滨、氨甲蝶呤钠、雷替曲塞、培美曲塞、喃氟啶、胞嘧啶阿拉伯糖苷、硫鸟嘌呤、5-氮胞苷、6-巯基嘌呤、硫唑嘌呤、6-硫鸟嘌呤、喷司他丁、氟达拉滨磷酸盐和克拉屈滨，以及这些中任何一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。

在某些实施方案中，该化学治疗剂是抗有丝分裂剂，包括但不限于结合微管蛋白的剂。在一些实施方案中，该剂是紫杉烷。在某些实施方案中，该剂是紫杉醇或多西他赛、或紫杉醇或多西他赛的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在某些替代性实施方案中，抗有丝分裂剂包括长春花生物碱，诸如长春新碱、长春花碱、长春瑞滨或长春地辛、或其药学上可接受的盐、酸或衍生物。

在一些实施方案中，该治疗包括本文所述的Notch1结合剂（例如抗体）联合选自以下组成的组的化学治疗剂：泼尼松、长春新碱、道诺霉素、L-天冬酰胺酶、氨甲喋呤和环磷酰胺。在一些实施方案中，另外的治疗剂是伊马替尼、奈拉滨或达沙替尼。在一些实施方案中，另外的治疗剂是伊达比星、阿糖胞苷、米托蒽醌或吉姆单抗、奥佐米星。

在某些实施方案中，所述治疗包括将本发明的Notch1结合剂（例如抗体）与放射治疗联合施用。可以在施用放射治疗之前、同时或之后使用Notch1结合剂进行治疗。可以由熟练从业者确定所述放射治疗的给药方案。在一些实施方案中，结合剂或抗体在放射治疗之后施用。在一些实施方案中，结合剂或抗体与放射治疗一起施用。

在一些实施方案中，第二治疗剂包括抗体。如此，治疗可包括组合施用本发明的Notch1结合剂（例如抗体）与针对另外的肿瘤相关抗原的其它抗体，包括但不限于结合EGFR、ErbB2、DLL4、Notch或NF-_KB的抗体。示例性的抗DLL4抗体描述在例如，美国专利No.7,750,124。另外的抗DLL4抗体描述在，例如，国际专利公布No.WO 2008/091222和WO 2008/0793326、和美国专利申请公布号No.2008/0014196；2008/0175847；2008/0181899；和2008/0107648。示例性的抗Notch抗体描述在，例如，美国专利申请公布No.2008/0131434。联合施用可以包括以单一药物制剂或使用分开制剂的共施用，或以任何顺序但通常在一段时间内的连续施用，从而使得所有活性剂可以同时发挥其生物活性。

另外，以本文所述Notch1结合剂治疗可以包括以一种或多种细胞因子（例如淋巴因子、白介素、肿瘤坏死因子和/或生长因子）联合治疗，或可以伴随着外科手术除去肿瘤、癌细胞；或治疗医师确信必须的任何其它治疗。对于疾病的治疗，本发明的抗体或其它试剂的合适剂量取决于待治疗疾病的类型，疾病的严重性和进展，疾病的响应性，为了治疗还是预防目的施用所述抗体、先前治疗、患者临床史等，所有这些都由治疗医师判断。所述抗体或试剂可以施用一次，或在持续几天到几个月的一系列治疗中施用，或直到治愈，或直到达到疾病状态消退（例如肿瘤尺寸减少）。最佳给药方案可以由对患者体内的累积药物的测量来计算，并且可以根据各拮抗剂的相对效力而变化。施用医师可以容易地确定最佳剂量、给药方法和重复速率。通常，剂量为0.01μg至100mg/千克体重，并且可以每天、每周、每月或每年给予1次或多次。治疗医师可以基于体液或组织中抗体或剂的测定的停留时间和浓度估算给药的重复速率。

本发明提供药盒，所述药盒包含本文所述的抗体，并可用于执行本发明的方法。在一些实施方案中，药盒在一个或多个容器中包含至少一种经纯化的针对人Notch1的抗体。在一些实施方案中，药盒在一个或多个容器中包含至少一种经纯化的针对人Notch1的胞外域的非配体结合近膜区的抗体。在一些实施方案中，药盒包含抗体52M51或52M51的人源化变体。

实施例

实施例1

针对Notch1的非配体结合区，特别是针对胞外域的非配体结合近膜区产生抗体。在特定实施方案中，产生人Notch1胞外域的重组多肽片段作为用于抗体产生的抗原。使用标准重组DNA技术来分离编码人Notch1氨基酸序列1427-1732的胞外域的近膜区的多核苷酸（SEQ ID NO:1）。使这些多核苷酸单独在N末端框架内连接至人Fc和组氨酸标签，并且克隆到转移质粒载体中，以用于在昆虫细胞中进行杆状病毒介导的表达。使用标准转染、感染和细胞培养方案来产生表达与包含氨基酸1427-1732的近膜区相对应的相应Notch1多肽（SEQ ID NO:2）的重组昆虫细胞（O’Reilly等,1994,Baculovirus Expression Vectors:A Laboratory Manual,Oxford:Oxford University Press）。

使用本领域技术人员已知的蛋白A和Ni⁺⁺-螯合亲和色谱从昆虫细胞裂解物中纯化对Notch1近膜区（Notch1氨基酸1472-1732）多肽。用PBS（pH=7）对经纯化的Notch1近膜区多肽进行透析，浓缩到约1mg/ml，并在制备中无菌过滤以进行免疫。

使用标准技术以经纯化的Notch1抗原蛋白（抗体溶液；Mountain View，CA）对小鼠（n=3）进行免疫。使用ELISA和FACS分析（如本文所述）在初始免疫后约70天筛选个体小鼠的血液对抗原的识别。选择具有最高抗体滴度的两只动物以用于最终的抗原增强，其后分离脾细胞以用于杂交瘤产生。以每孔1个细胞在96孔板中将杂交瘤细胞铺板，通过ELISA和FACS分析对各孔的上清液进行针对Notch1近膜区多肽的筛选。选择几个具有高抗体滴度的杂交瘤，并且在静态瓶培养中扩增。使用蛋白A或蛋白G琼脂糖色谱从杂交瘤上清液中纯化抗体。再次通过本发明所述的FACS测试经纯化的单克隆抗体。分离出几种识别人Notch1的胞外域的近膜区的抗体。按照布达佩斯条约的规定，将表达抗体52M51的杂交瘤细胞系于2008年8月7日保藏在ATCC，并给予ATTC专利保藏号PTA-9405。确定抗体52M51的重链（SEQ ID NO:9和10）和轻链（SEQ ID NO:3和4）的核苷酸序列和预测的蛋白序列。

人抗体

在替代性实施方案中，使用噬菌体展示技术分离特异性识别Notch1受体的胞外域的非配体结合近膜区的人抗体。在特定实施方案中，筛选可特异性和高亲和性识别本文所述的Notch受体抗原的含有人抗体可变域的合成抗体。在特定实施方案中，使用一系列包含Notch1受体的胞外域的非配体结合近膜区的重组蛋白对人Fab噬菌体展示文库进行筛选。简言之，在第1轮中使2×10¹³个Fab展示噬菌体颗粒与重组蛋白（经被动固定）一起温育，洗掉非特异的噬菌体，然后用低pH（细胞）或DTT（重组蛋白）洗脱特异性噬菌体。使用洗脱产物来感染TG1F+细菌，用辅助噬菌体进行援助，然后用IPTG（0.25mM）诱导Fab展示。将该过程重复另外两轮，然后在针对被动固定抗原（5μg/ml）的ELISA中筛选第3轮。

经由侧翼限制性位点对文库中的CDR盒进行特异性交换，以用于抗体优化。然后将经优化的人可变区克隆到含有人IgG1重链和κ轻链的Ig表达载体中，以用于在CHO细胞中表达人抗体。

表位作图

为了鉴定特异性识别Notch1受体胞外域的非配体结合近膜区的抗体，进行表位作图。在某些实施方案中，使用标准重组DNA技术产生哺乳动物表达质粒载体，所述质粒载体包含在编码作为Fc融合蛋白的细胞外Notch1域的片段的多核苷酸上游的CMV启动子。在某些实施方案中，使用一系列融合蛋白和从约氨基酸1427至约氨基酸1732的人Notch1的胞外域的近膜区的缺失，完成52M系列的非配体结合区抗体的表位作图。这些重组融合蛋白在瞬时转染的HEK 293细胞中表达，在转染后24小时至48小时从所述HEK 293细胞收集条件培养基以用于ELISA。

在某些实施方案中，在SDS-PAGE凝胶上分离Notch1融合蛋白片段，并且使用检测所有融合蛋白存在的抗Fc抗体相对于检测由各抗Notch抗体识别的结构域的各抗Notch抗体进行探查。

实施例2

产生针对人Notch1的胞外域的近膜区的人源化抗体。基本上按照Larrick,J.M.等,1989,Biochem.Biophys.Res.Comm.160:1250和Jones,S.T.& Bendig,M.M.,1991, Bio/Technology 9:88所述，使用简并PCR从杂交瘤系中分离鼠单克隆抗体52M51的可变域，并且测序。然后将与亲本52M51抗体氨基酸序列可能结构上类似的人重链和轻链可变框架区视为参照人框架区，以帮助指导新型合成框架的设计。为了鉴定与52M51鼠框架类似的人框架区，使用BLAST检索储存在Genbank中的人序列，将由52M51的V_H和V_L鼠可变域编码的预测蛋白序列与由所表达的人cDNA编码的人抗体序列比较。使用该方法，选择出所表达的人cDNA序列（例如Genbank DA975021、DB242412）和种系Vh域（例如IGHV1-24）以用于在设计重链框架时进一步分析。类似地，在设计轻链框架时考虑所表达的人cDNA序列（例如Genbank CD709370、CD707373）和种系Vl（例如IGLV7-46、IGLV8-61）。

评价候选人源化框架重链和亲本鼠单克隆抗体52M51重链可变域以及轻链可变域之间的氨基酸差异的可能重要程度，并且作出每个位置差异是否有助于可变域的正确折叠和功能的判断。通过其它抗体片段的解析出的晶体结构（例如，Trakhanov等,1999,Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 55:122-28描述的Fab 2E8结构，以及其它蛋白晶体结构（例如，蛋白数据库结构1ADQ和1GIG））的检查指导该分析。使用包括Jmol、快速PDB和Pymol的计算机软件对结构建模。需要考虑的有：位于给定位置的氨基酸对β-折叠框架的填充的潜在影响、重链和轻链可变域之间的相互作用、氨基酸侧链的溶剂暴露程度和氨基酸影响CDR环的定位的可能性。从该分析看出，构想了9个与人IgG2恒定区框架内融合的候选V_H链和8个与人IgLC1恒定区框架内融合的候选Vl链，并进行化学合成。候选重链包括：i)设计成模拟天然人框架的合成框架和ii)亲本52M51鼠抗体CDR。

通过共转染到哺乳动物细胞测试各候选变体人源化重链和轻链的功能性。将上述9个候选人源化52M51重链的每一个与鼠52M51轻链cDNA共转染到HEK 293细胞中，并且通过ELISA检测条件培养基的Notch1结合活性。选择显示最牢固结合的52M51重链变体。与示例人框架（例如IGHV1-24）相比，除了鼠CDR之外，该变体“52M51-H4”（SEQ ID NO:22）还含有在Vh框架内的3个框架位置（Kabat位20、48和71）的变化。然后将52M51-H4人源化重链与8个候选人源化轻链的每个共转染到HEK293细胞中，通过ELISA再次检测条件培养基的抗原结合。发现两个轻链变体“52M51L3”（SEQ ID NO:26）和“52M51L4”（SEQ ID NO:30）展示比其它候选物更好的结合，将其选出以用于进一步研究。与示例人框架（例如IGLV7-46）相比，除了鼠CDR之外，变体52M51L3还含有在Kabat位49的1个框架位的变化。开发出两个人源化变体抗体，52M51H4L3和52M51H4L4。按照布达佩斯条约的规定，编码52M51H4L3的多核苷酸于2008年10月15日保藏在ATCC，并给予保藏号PTA-9549。

使用Biacore 2000仪器确定人和小鼠Notch1的亲和性。简言之，使用标准的基于胺的化学法（NHS/EDC）在CM5芯片上固定重组人和小鼠Notch1蛋白。将不同浓度的抗体注射在所述蛋白表面上，并且收集随时间变化的动力学数据。使用联立全拟合方程对数据进行拟合，从而产生各Notch1的解离常数（K_D,nM）（表2）。

表2

实施例3

Notch受体信号传导

确定Notch1抗体阻断配体介导的Notch信号传导的能力。使在补充有抗生素和10%FCS的DMEM中培养的经工程化而过表达Notch1的HeLa细胞（Notch1-Hela）与以下共转染：1)含有在萤火虫荧光素酶报道基因上游的Notch响应性启动子的pGL48X CBF萤火虫荧光素酶以测量响应于DLL4配体的Notch信号传导水平；和2)用作转染效率的内部对照的海肾荧光素酶报道子（Promega,Madison,WI）。向用200ng/孔hDLL4-Fc蛋白过夜包被的培养板添加经转染的细胞，然后向细胞培养基添加针对Notch1的抗体。转染后48小时，使用双荧光素酶测定药盒（Promega,Madison WI）测量荧光素酶水平，将萤火虫荧光素酶活性对海肾荧光素酶活性进行标准化。从而确定抗体抑制Notch1途径活化的能力。与其它Notch1抗体相比，针对人Notch1的胞外域的近膜区产生的抗体52M51、52M63、52M74和52M80（图1A）显著地减少荧光素酶活性，表明Notch1信号传导减少（图1B）。另外，在减少荧光素酶活性方面，抗体52M51的人源化变体，变体52M51H4L3展示类似的效力（图1C）。

Notch受体被弗林蛋白酶、ADAM和γ-分泌酶切割导致Notch胞内域（ICD）的形成，然后触发细胞核中的下游Notch信号传导。通过蛋白质印迹分析确定Notch1抗体阻断配体介导的受体激活的能力。使Notch1-Hela细胞在293-SMII培养基（Invitrogen,Carlsbad CA）中以悬浮培养生长。将培养的细胞转移到96孔板，所述板中已经用在补充有2%FBS和1μM MG 132的DMEM（Calbiochem,San Diego CA）中的人DLL4-Fc融合蛋白（2μg/ml）对选择孔进行预包被。向细胞培养基添加针对人Notch1的胞外域的近膜区产生的抗体，使细胞在37℃下温育5小时。然后对孔进行抽吸，使细胞再悬浮于2×SDS运行缓冲液中。在室温下对样品进行超声处理，然后进行SDS-PAGE并且根据制造商建议（Cell Signaling Technology，Danvers MA）使用对切割的Notch1ICD特异性的抗体进行蛋白质印迹分析。抗体52M51以及抗体52M63、52M74和52M80显著地抑制配体刺激后ICD的产生（图1D）。

实施例4

在白血病异种移植模型中对抗Notch1抗体的评价

6至8周大的NOD/SCID小鼠接受来自带有MXR X射线管的Pantak HF320X射线机的350拉德总全身辐射。之后立即，经由尾静脉注射0.2ml无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的1×10⁷个人骨髓单核细胞（MNC）（Lonza,Walkersville MD）。7天后，将5×10⁶个活的原代人白血病细胞悬浮在0.2ml PBS中并经由尾静脉注射。开始1天后，用对照抗体（LZ1）或结合人Notch1的胞外域的近膜区的抗体（52M51）处理动物。抗体以15mg/kg i.p.的剂量每周一次施用。

白血病细胞注射和抗体5周处理后，通过流式细胞术评价小鼠中白血病细胞移入的水平。使用双色免疫荧光来鉴定人白血病细胞。使用针对人CD45标志物的抗体分析小鼠脾的人细胞。在Pharmlyse（BD Biosciences,San Jose CA）中溶解小鼠脾的细胞悬液，然后在HBSS加2%FBS中洗涤和重悬。在每种情况中，用CD34抗体（BDBiosciences,San Jose CA）和CD45抗体染色细胞。针对人溶菌酶（LZ-1）产生的小鼠抗体用作同种型对照抗体。还用作为细胞存活力标志物的DAPI染色细胞。

染色后，洗涤细胞，重悬在HBSS加2%FBS中，在分析之前保持在冰上。使用Canto II流式细胞仪（Beckman Coulter,Brea CA）分析细胞。不可存活的细胞基于DAPI获取被门控出，对每种组织样品运行匹配的同种型对照并用来界定门控设置，其排除同种型对照中至少99.9%的细胞。来自首次用于试验的NOD/SCID小鼠的脾用作验证门控设置的另外的对照。人白血病细胞移入定义为样品中至少0.1%CD45阳性细胞的表述。

如图2所示，与用对照抗体处理的小鼠相比（61.8%），注射了人白血病细胞并用抗Notch1抗体52M51处理的小鼠具有显著降低的移入水平（39.7%,p<0.001）。

实施例5

HPB-ALL细胞中Notch1抑制的体外评价

HPB-ALL细胞从DSMZ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen）获得。HPB-ALL细胞系从患有急性淋巴母细胞性白血病和胸腺瘤的患者的外周血建立，被分类为人T细胞白血病。将5000HPB-ALL细胞铺板在96孔板的每孔中的生长培养基（RPMI加15%FBS）中，用抗Notch1抗体52M51（-■-）、对照抗体

或一种γ分泌酶抑制剂二苯并吖庚因（-●-）处理。抗体以100ug/ml的浓度使用，3倍连续稀释到1.7ng/ml。二苯并吖庚因以12uM的浓度使用，3倍连续稀释到0.2nM并用作阳性对照。一式三份地分析样品，实验重复至少4次。8天后，按照制造商的说明书使用

发光细胞存活力检验（Promega,Madison WI）分析细胞存活力。如图3所示，抗Notch1抗体52M51能够减少HBP-ALL细胞的细胞存活力，证明Notch1抑制能够在体外对人T-细胞白血病细胞有作用。

实施例6

Notch1对HPB-ALL细胞增殖的抑制的体外评价

Ki67是增殖的人细胞中存在的核抗原，并且能够用于定量细胞培养物中增殖的细胞的百分比。在12uM DBZ、100ug/ml 52M51或100ug/ml对照抗体存在下培养HBP-ALL细胞。5天后更新培养基，在第9天分析细胞的Ki67蛋白。简单地说，在PBS中洗涤细胞，在PBS中4%甲醛溶液中固定5分钟。在PBS中洗涤细胞，使用含0.5%皂角苷和2.5%BSA的PBS缓冲液将其通透化。以抗Ki67-FITC共轭物（BD Biosciences,San Jose CA）检测Ki67蛋白。如图4所示，抗Notch1抗体52M51比以对照抗体处理的细胞减少增殖的HPB-ALL细胞百分比的大约40%（60%Ki67阳性细胞相比于98%Ki67阳性细胞）。

实施例7

Notch1对ICD形成的抑制的体外评价

在12uM DBZ、100ug/ml 52M51、100ug/ml A2G1或100ug/ml对照抗体存在下培养HBP-ALL细胞。5天后更新培养基，在第9天收集细胞。以含蛋白酶抑制剂混合物的放射免疫沉淀检验缓冲液（Roche Molecular,Pleasanton CA）准备全细胞蛋白提取物。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离蛋白并转移到硝酸纤维素膜。将膜在含5%脱脂奶粉的TBS-T（Tris缓冲盐水加0.1%吐温20）中培养以阻断非特异性结合。然后将膜与检测Notch1的胞内域（ICD）的兔单克隆抗体（克隆D3B8,Cell Signaling Technology，Danvers,MA）一起在室温在带有0.5%奶粉的PBS-T中培养1小时。还以小鼠抗肌动蛋白抗体（克隆AC-15,Sigma,St.Louis MO）探测膜。以抗兔/小鼠HRP共轭抗体（Jackson ImmunoResearch Labs,West Grove PA）检测结合的一抗并以ECL Plus^TM蛋白质印迹试剂（GE Healthcare,Piscataway，NJ）显现。如图5所示，与用对照抗体处理的细胞相比，抗Notch抗体52M51减少处理的HPB-ALL细胞中ICD形成的量。

实施例8

抗Notch1抗体52M51对HPB-ALL肿瘤体内生长的抑制

将HPB-ALL细胞（7×10⁶个细胞）皮下注射到6-8周大的NOD/SCID小鼠中。允许肿瘤生长直到肿瘤平均尺寸为大约111mm³。在第13天，将动物随机分组（每组n=10）并用对照抗体（抗溶菌酶抗体LZ-1,-■-）或抗Notch1抗体52M51

处理。抗体通过每周两次腹膜内注射15mg/kg来施用。在处理后所示的天数以电子卡尺测量肿瘤生长。如图6所示，与对照抗体相比，以抗Notch1抗体52M51处理导致HPB-ALL肿瘤的生长显著减少（p<0.0001）。

实施例9

在弥散性白血病异种移植模型中对抗Notch1抗体的评价

HPB-ALL细胞用来在小鼠模型中建立弥散性白血病异种移植物。将HPB-ALL细胞（5×10⁶个细胞）注射到6-8周大的NOD/SCID小鼠的侧尾静脉中。白血病细胞注射1天后，将动物随机分组（每组n=11-13）并用对照抗体抗溶菌酶抗体LZ-1（-■-）或抗Notch1抗体52M51（-▲-）处理。抗体以15mg/kg为一个剂量施用。每周至少两次监测小鼠的疾病迹象，包括体重减少15%至20%、蜷缩身子和不理毛、头部膨胀和后肢瘫痪。在第38天，对照抗体处理组中的一部分小鼠表现体重减少15%，处死两个组中的所有动物。然后确定脾、外周血和骨髓中人白血病细胞的存在。

白血病细胞注射和抗体5周处理后，通过流式细胞术评价小鼠中白血病细胞移入的水平。使用双色免疫荧光来鉴定人白血病细胞。从小鼠收集骨髓、脾和外周血并使用针对人CD3标志物的抗体分析人细胞。在Pharmlyse（BD Biosciences）中溶解细胞悬液，然后在HBSS加2%FBS中洗涤和重悬。用抗小鼠CD45-FITC和抗小鼠 H-2K^d-FITC（分别是克隆30F11和S F1-1.1.1,eBioscience,San Diego CA）染色细胞来列举鼠细胞，并且用抗人CD3-PE（克隆OKT3,eBioscience,San Diego CA）染色细胞来列举人白血病细胞。还用作为细胞存活力标志物的DAPI染色细胞。

染色后，洗涤细胞，重悬在HBSS加2%FBS中，在分析之前保持在冰上。使用Canto II流式细胞仪（Beckman Coulter,Brea CA）分析细胞。不可存活的细胞基于DAPI获取被门控出，对每种组织样品运行匹配的同种型对照并用来界定门控设置，其排除同种型对照中至少99.9%的细胞。来自首次用于试验的NOD/SCID小鼠的细胞和体外培养的HPB-ALL细胞用作验证门控设置的另外的对照。

如图7所示，与用对照抗体处理的相比，用抗Notch1抗体52M51的处理导致骨髓中HPB-ALL细胞的百分比显著减少。用对照抗体处理的动物的骨髓中具有平均88%人CD3+细胞，与之相比用52M51处理的动物的骨髓中具有平均16%人CD3+细胞（p<0.0001）。另外，与用对照抗体处理的动物相比，抗Notch1抗体52M51在处理的动物的脾和外周血中减少HPB-ALL细胞百分比。用对照抗体处理的动物的脾中具有平均18%人CD3+细胞，与之相比用52M51处理的动物中具有不可检测的水平。相似地，用对照抗体处理的动物的外周血中具有平均13%人CD3+细胞，与之相比用52M51处理的动物中具有不可检测的水平。

应理解的是，本文所述的实施例和实施方案仅是为了描述的目的，且将对本领域技术人员暗示鉴于其的各种修改或变化，将包括在本申请的主旨和范围中。

本文提到的所有出版物、专利和专利申请为了所有目的通过引用全文并入，其程度如同每个单独出版物、专利和专利申请具体地和单独地表示为如此通过引用并入。

序列

SEQ ID NO:1 编码氨基酸1427-1732的Notch1多核苷酸

CACATCCTGGACTACAGCTTCGGGGGTGGGGCCGGGCGCGACATCCCCCCGCCGCTGATC

GAGGAGGCGTGCGAGCTGCCCGAGTGCCAGGAGGACGCGGGCAACAAGGTCTGCAGCCTG

CAGTGCAACAACCACGCGTGCGGCTGGGACGGCGGTGACTGCTCCCTCAACTTCAATGAC

CCCTGGAAGAACTGCACGCAGTCTCTGCAGTGCTGGAAGTACTTCAGTGACGGCCACTGT

GACAGCCAGTGCAACTCAGCCGGCTGCCTCTTCGACGGCTTTGACTGCCAGCGTGCGGAA

GGCCAGTGCAACCCCCTGTACGACCAGTACTGCAAGGACCACTTCAGCGACGGGCACTGC

GACCAGGGCTGCAACAGCGCGGAGTGCGAGTGGGACGGGCTGGACTGTGCGGAGCATGTA

CCCGAGAGGCTGGCGGCCGGCACGCTGGTGGTGGTGGTGCTGATGCCGCCGGAGCAGCTG

CGCAACAGCTCCTTCCACTTCCTGCGGGAGCTCAGCCGCGTGCTGCACACCAACGTGGTC

TTCAAGCGTGACGCACACGGCCAGCAGATGATCTTCCCCTACTACGGCCGCGAGGAGGAG

CTGCGCAAGCACCCCATCAAGCGTGCCGCCGAGGGCTGGGCCGCACCTGACGCCCTGCTG

GGCCAGGTGAAGGCCTCGCTGCTCCCTGGTGGCAGCGAGGGTGGGCGGCGGCGGAGGGAG

CTGGACCCCATGGACGTCCGCGGCTCCATCGTCTACCTGGAGATTGACAACCGGCAGTGT

GTGCAGGCCTCCTCGCAGTGCTTCCAGAGTGCCACCGACGTGGCCGCATTCCTGGGAGCG

CTCGCCTCGCTGGGCAGCCTCAACATCCCCTACAAGATCGAGGCCGTGCAGAGTGAGACC

GTGGAGCCGCCCCCGCCG

SEQ ID NO:2 Notch1氨基酸1427-1732

HILDYSFGGGAGRDIPPPLIEEACELPECQEDAGNKVCSLQCNNHACGWDGGDCSLNFND

PWKNCTQSLQCWKYFSDGHCDSQCNSAGCLFDGFDCQRAEGQCNPLYDQYCKDHFSDGHC

DQGCNSAECEWDGLDCAEHVPERLAAGTLVVVVLMPPEQLRNSSFHFLRELSRVLHTNVV

FKRDAHGQQMIFPYYGREEELRKHPIKRAAEGWAAPDALLGQVKASLLPGGSEGGRRRRE

LDPMDVRGSIVYLEIDNRQCVQASSQCFQSATDVAAFLGALASLGSLNIPYKIEAVQSET

VEPPPP

小鼠抗体52M51序列:

SEQ ID NO:3 52M51轻链多核苷酸序列(推测的信号序列加下划线)

ATGGCCTGGATTTCACTTATACTCTCTCTCCTGGCTCTCAGCTCAGGGGCCATTTCCCAG

GCTGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGAAACAGTCACACTCACT

TGTCGCTCAAGTACTGGGGCTGTTACAACTAGTAACTACGCCAACTGGGTCCAAGAAAAA

CCTGATCATTTATTCACTGGTCTAATAGGTGGTACCAACAACCGAGCTCCAGGTGTTCCT

GCCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGAGACAAGGCTGCCCTCACCATCACAGGGGCACAG

ACTGAGGATGAGGCAATATATTTCTGTGCTCTATGGTACAGCAACCACTGGGTGTTCGGT

GGAGGAACCAAACTGACTGTCCTAGGCCAGCCCAAGTCTTCGCCATCAGTCACCCTGTTT

CCACCTTCCTCTGAAGAGCTCGAGACTAACAAGGCCACACTGGTGTGTACGATCACTGAT

TTCTACCCAGGTGTGGTGACAGTGGACTGGAAGGTAGATGGTACCCCTGTCACTCAGGGT

ATGGAGACAACCCAGCCTTCCAAACAGAGCAACAACAAGTACATGGCTAGCAGCTACCTG

ACCCTGACAGCAAGAGCATGGGAAAGGCATAGCAGTTACAGCTGCCAGGTCACTCATGAA

GGTCACACTGTGGAGAAGAGTTTGTCCCGTGCTGACTGTTCCTAG

SEQ ID NO:4 52M51轻链氨基酸序列(推测的信号序列加下划线)

MAWISLILSLLALSSGAISQAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEK

PDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFG

GGTKLTVLGQPKSSPSVTLFPPSSEELETNKATLVCTITDFYPGVVTVDWKVDGTPVTQG

METTQPSKQSNNKYMASSYLTLTARAWERHSSYSCQVTHEGHTVEKSLSRADCS

SEQ IDNO:5

52M51轻链可变区多核苷酸序列(推测的信号序列加下划线)

ATGGCCTGGATTTCACTTATACTCTCTCTCCTGGCTCTCAGCTCAGGGGCCATTTCCCAG

GCTGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGAAACAGTCACACTCACT

TGTCGCTCAAGTACTGGGGCTGTTACAACTAGTAACTACGCCAACTGGGTCCAAGAAAAA

CCTGATCATTTATTCACTGGTCTAATAGGTGGTACCAACAACCGAGCTCCAGGTGTTCCT

GCCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGAGACAAGGCTGCCCTCACCATCACAGGGGCACAG

ACTGAGGATGAGGCAATATATTTCTGTGCTCTATGGTACAGCAACCACTGGGTGTTCGGT

GGAGGAACCAAACTGACTGTCCTAGGC

SEQ ID NO:6 52M51轻链可变区氨基酸序列(推测的信号序列加下划线)

MAWISLILSLLALSSGAISQAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEK

PDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFG

GGTKLTVLGQPKSSPSVTLFPPSSEELETNKATLVCTITDFYPGVVTVDWKVDGTPVTQG

SEQ ID NO:7 52M51轻链可变区多核苷酸序列、无推测的信号序列

CAGGCTGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGAAACAGTCACACTC

ACTTGTCGCTCAAGTACTGGGGCTGTTACAACTAGTAACTACGCCAACTGGGTCCAAGAA

AAACCTGATCATTTATTCACTGGTCTAATAGGTGGTACCAACAACCGAGCTCCAGGTGTT

CCTGCCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGAGACAAGGCTGCCCTCACCATCACAGGGGCA

CAGACTGAGGATGAGGCAATATATTTCTGTGCTCTATGGTACAGCAACCACTGGGTGTTC

GGTGGAGGAACCAAACTGACTGTCCTAGGC

SEQ ID NO:8 52M51轻链可变区氨基酸序列、无推测的信号序列

QAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGV

PARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTKLTVLG

SEQ ID NO:9 52M51重链多核苷酸序列(推测的信号序列加下划线)

ATGGAATGGACCTGGGTCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGTAACTGCAGGTGTCCACTCCCAG

GTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGATGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATATCC

TGCAAGGCTGCTGGCTACACAATGAGAGGCTACTGGATAGAGTGGATAAAGCAGAGGCCT

GGACATGGCCTTGAGTGGATTGGACAGATTTTACCTGGAACTGGGAGAACTAACTACAAT

GAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTCACTGCAGATACATCCTCCAACACAGCCAACATG

CAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTGCAAGATTTGATGGT

AACTACGGTTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGATCCTCAGTCACCGTCTCCTCA

GCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAAC

TCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACC

TGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGAC

CTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCCCTCGGCCCAGCGAGACCGTC

ACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGG

GATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTC

CCCCCAAAGCCCAAGGATGTCCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTG

GTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAG

GTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTC

AGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTC

AACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATATCCAAAACCAAAGGCAGACCG

AAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTC

AGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATAACAGTGGAGTGGCAGTGG

AATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGAACACGAATGGCTCT

TACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTC

ACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCAC

TCTCCTGGTAAATGA

SEQ ID NO:10 52M51重链氨基酸序列(推测的信号序列加下划线)

MEWTWVFLFLLSVTAGVHSQVQLQQSGAELMKPGASVKISCKAAGYTMRGYWIEWIKQRP

GHGLEWIGQILPGTGRTNYNEKFKGKATFTADTSSNTANMQLSSLTSEDSAVYYCARFDG

NYGYYAMDYWGQGSSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVT

WNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSPRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPR

DCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVE

VHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRP

KAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGS

YFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK

SEQ ID NO:11 52M51重链可变区多核苷酸序列(推测的信号序列加下划线)

ATGGAATGGACCTGGGTCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGTAACTGCAGGTGTCCACTCCCAG

GTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGATGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATATCC

TGCAAGGCTGCTGGCTACACAATGAGAGGCTACTGGATAGAGTGGATAAAGCAGAGGCCT

GGACATGGCCTTGAGTGGATTGGACAGATTTTACCTGGAACTGGGAGAACTAACTACAAT

GAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTCACTGCAGATACATCCTCCAACACAGCCAACATG

CAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTGCAAGATTTGATGGT

AACTACGGTTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGATCCTCAGTCACCGTCTCCTCA

SEQ ID NO:12 52M51重链可变区氨基酸序列(推测的信号序列加下划线)

MEWTWVFLFLLSVTAGVHSQVQLQQSGAELMKPGASVKISCKAAGYTMRGYWIEWIKQRP

GHGLEWIGQILPGTGRTNYNEKFKGKATFTADTSSNTANMQLSSLTSEDSAVYYCARFDG

NYGYYAMDYWGQGSSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVT

SEQ ID NO:13 52M51重链可变区多核苷酸序列、无推测的信号序列

CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGATGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATA

TCCTGCAAGGCTGCTGGCTACACAATGAGAGGCTACTGGATAGAGTGGATAAAGCAGAGG

CCTGGACATGGCCTTGAGTGGATTGGACAGATTTTACCTGGAACTGGGAGAACTAACTAC

AATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTCACTGCAGATACATCCTCCAACACAGCCAAC

ATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTGCAAGATTTGAT

GGTAACTACGGTTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGATCCTCAGTCACCGTCTCC

TCA

SEQ ID NO:14 52M51重链可变区氨基酸序列、无推测的信号序列

QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKAAGYTMRGYWIEWIKQRPGHGLEWIGQILPGTGRTNY

NEKFKGKATFTADTSSNTANMQLSSLTSEDSAVYYCARFDGNYGYYAMDYWGQGSSVTVS

SA

SEQ ID NO:15 52M51重链CDR1

RGYWIE

SEQ ID NO:16 52M51重链CDR2

QILPGTGRTNYNEKFKG

SEQ ID NO:17 52M51重链CDR3

FDGNYGYYAMDY

SEQ ID NO:18 52M51轻链CDR1

RSSTGAVTTSNYAN

SEQ ID NO:19 52M51轻链CDR2

GTNNRAP

SEQ ID NO:20 52M51轻链CDR3

ALWYSNHWVFGGGTKL

人源化52M51序列：

SEQ ID NO:21 52M51-H4重链多核苷酸序列(推测的信号序列加下划线)

ATGGATTGGACATGGAGGGTGTTCTGCCTCCTCGCTGTGGCTCCTGGAGTCCTGAGCCAG

GTCCAGCTCGTCCAGAGCGGGGCTGAAGTCAAGAAGCCTGGCGCTAGCGTCAAAATCAGC

TGTAAGGTCAGCGGATACACACTGAGGGGATACTGGATCGAGTGGGTGAGGCAGGCTCCA

GGAAAGGGCCTGGAATGGATCGGCCAGATCCTGCCTGGAACCGGAAGGACAAATTACAAT

GAGAAGTTTAAGGGAAGGGTCACAATGACAGCAGACACAAGCACAGACACAGCTTATATG

GAACTCAGCTCCCTCAGATCCGAGGACACCGCTGTCTACTATTGTGCCAGGTTCGATGGA

AATTACGGATACTATGCCATGGATTACTGGGGACAGGGGACAACGGTCACCGTGAGCTCA

GCCAGCACAAAGGGCCCTAGCGTCTTCCCTCTGGCTCCCTGCAGCAGGAGCACCAGCGAG

AGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCG

TGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCA

GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACC

TACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGC

AAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTC

CTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGC

GTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGC

GTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGT

GTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGC

AAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGG

CAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAAC

CAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGG

GAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGAC

GGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAAC

GTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTC

TCCCTGTCTCCGGGTAAATGA

SEQ ID NO:22 52M51H4重链氨基酸序列(推测的信号序列加下划线)

MDWTWRVFCLLAVAPGVLSQVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKVSGYTLRGYWIEWVRQAP

GKGLEWIGQILPGTGRTNYNEKFKGRVTMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARFDG

NYGYYAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVS

WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVER

KCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDG

VEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKG

QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSD

GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:23 52M51-H4重链可变区氨基酸序列(推测的信号序列加下划线)

MDWTWRVFCLLAVAPGVLSQVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKVSGYTLRGYWIEWVRQAP

GKGLEWIGQILPGTGRTNYNEKFKGRVTMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARFDG

NYGYYAMDYWGQGTTVTVSSA

SEQ ID NO:24 52M51-H4重链可变区氨基酸序列、无推测的信号序列

QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKVSGYTLRGYWIEWVRQAPGKGLEWIGQILPGTGRTNY

NEKFKGRVTMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARFDGNYGYYAMDYWGQGTTVTVS

SA

SEQ ID NO:25 52M51-L3轻链多核苷酸序列(推测的信号序列加下划线)

ATGAGCGTCCCTACAATGGCTTGGATGATGCTCCTGCTGGGACTCCTGGCTTATGGAAGC

GGAGTGGATAGCCAGGCCGTCGTCACACAGGAACCTAGCCTCACCGTTAGCCCTGGAGGA

ACAGTCACACTGACCTGTAGGAGCTCCACAGGAGCTGTGACAACAAGCAATTACGCTAAC

TGGTTCCAGCAGAAGCCCGGTCAAGCCCCTAGAACCCTCATCGGCGGCACCAATAACAGA

GCTCCCGGAGTCCCCGCCAGGTTCTCCGGCTCCCTCCTGGGTGGCAAGGCTGCTCTGACA

CTCAGCGGTGCCCAGCCAGAGGATGAAGCGGAGTACTACTGTGCACTGTGGTACAGCAAC

CATTGGGTTTTCGGAGGCGGAACAAAGTTAACCGTCCTCGGGCAGCCTAAGGCTGCTCCT

AGCGTCACACTGTTCCCCCCATCTAGCGAGGAGCTGCAGGCTAACAAGGCAACCCTCGTC

TGCCTGGTTAGCGACTTCTACCCTGGCGCTGTCACAGTGGCCTGGAAAGCTGACGGCTCC

CCTGTGAAAGTTGGCGTCGAAACCACAAAGCCTTCTAAGCAGAGCAATAATAAATATGCC

VGCAAGCTCCTACCTCTCCCTGACTCCTGAGCAGTGGAAAAGCCATAGGAGCTACTCCTGC

CVGGGTCACACACGAAGGAAGCACAGTGGAAAAGACAGTCGCCCCTGCTGAGTGTAGCTGA

SEQ ID NO:26 52M51-L3轻链氨基酸序列(推测的信号序列加下划线)

MSVPTMAWMMLLLGLLAYGSGVDSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYAN

WFQQKPGQAPRTLIGGTNNRAPGVPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSN

HWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLVSDFYPGAVTVAWKADGS

PVKVGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCRVTHEGSTVEKTVAPAECS

SEQ ID NO:27 52M51L3轻链可变区氨基酸序列(推测的信号序列加下划线)

MSVPTMAWMMLLLGLLAYGSGVDSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYAN

WFQQKPGQAPRTLIGGTNNRAPGVPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSN

HWVFGGGTKLTVLG

SEQ ID NO:28 52M51–L3轻链可变区氨基酸序列、无推测的信号序列

SGVDSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWFQQKPGQAPRTLIGGTNN

RAPGVPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNHWVFGGGTKLTVLG

SEQ ID NO:29 52M51-L4轻链多核苷酸序列(推测的信号序列加下划线)

ATGAGCGTCCCTACAATGGCTTGGATGATGCTCCTGCTGGGACTCCTGGCTTATGGAAGC

GGAGTGGATAGCCAGACCGTCGTCACACAGGAACCTAGCTTTTCCGTTAGCCCTGGAGGA

ACAGTCACACTGACCTGTAGGAGCTCCACAGGAGCTGTGACAACAAGCAATTACGCTAAC

TGGTATCAGCAGACTCCCGGTCAAGCCCCTAGAACCCTCATCGGCGGCACCAATAACAGA

GCTCCCGGAGTCCCCGACAGGTTCTCCGGCTCCATCCTGGGAAATAAAGCTGCTCTGACA

ATCACAGGTGCCCAGGCTGACGATGAAAGCGACTACTACTGTGCACTGTGGTACAGCAAC

CATTGGGTTTTCGGAGGCGGAACAAAGTTAACCGTCCTCGGGCAGCCTAAGGCTGCTCCT

AGCGTCACACTGTTCCCCCCATCTAGCGAGGAGCTGCAGGCTAACAAGGCAACCCTCGTC

TGCCTGGTTAGCGACTTCTACCCTGGCGCTGTCACAGTGGCCTGGAAAGCTGACGGCTCC

CCTGTGAAAGTTGGCGTCGAAACCACAAAGCCTTCTAAGCAGAGCAATAATAAATATGCC

GCAAGCTCCTACCTCTCCCTGACTCCTGAGCAGTGGAAAAGCCATAGGAGCTACTCCTGC

CGGGTCACACACGAAGGAAGCACAGTGGAAAAGACAGTCGCCCCTGCTGAGTGTAGCTGA

SEQ ID NO:30 52M51-L4轻链氨基酸序列(推测的信号序列加下划线)

MSVPTMAWMMLLLGLLAYGSGVDSQTVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYAN

WYQQTPGQAPRTLIGGTNNRAPGVPDRFSGSILGNKAALTITGAQADDESDYYCALWYSN

HWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLVSDFYPGAVTVAWKADGS

PVKVGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCRVTHEGSTVEKTVAPAECS

SEQ ID NO:31 52M51-L4轻链可变区氨基酸序列(推测的信号序列加下划线)

MSVPTMAWMMLLLGLLAYGSGVDSQTVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYAN

WYQQTPGQAPRTLIGGTNNRAPGVPDRFSGSILGNKAALTITGAQADDESDYYCALWYSN

HWVFGGGTKLTVLG

SEQ ID NO:32 52M51-L4轻链可变区氨基酸序列、无推测的信号序列

SGVDSQTVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWYQQTPGQAPRTLIGGTNN

RAPGVPDRFSGSILGNKAALTITGAQADDESDYYCALWYSNHWVFGGGTKLTVLG

SEQ ID NO:33 FLAG-标签

DYKDDDK

Claims

1.一种治疗受治疗者中血液癌症的方法，包括向所述受治疗者施用治疗有效量的特异性结合人Notch1的胞外域的非配体结合近膜区的抗体，其中所述抗体包括：

(a)包含RGYWIE（SEQ ID NO:15）的重链CDR1、包含QILPGTGRTNYNEKFKG（SEQ ID NO:16）的重链CDR2、和包含FDGNYGYYAMDY（SEQ ID NO:17）的重链CDR3；和/或

(b)包含RSSTGAVTTSNYAN（SEQ ID NO:18）的轻链CDR1、包含GTNNRAP（SEQ ID NO:19）的轻链CDR2、和包含ALWYSNHWVFGGGTKL（SEQ ID NO:20）的轻链CDR3。

2.一种治疗受治疗者中血液癌症的方法，包括向所述受治疗者施用治疗有效量的特异性结合人Notch1的胞外域的非配体结合近膜区的抗体，其中所述抗体包括：

(a)包含RGYWIE（SEQ ID NO:15）、或包含1、2、3或4个氨基酸取代的其变体的重链CDR1；

(b)包含QILPGTGRTNYNEKFKG（SEQ ID NO:16）、或包含1、2、3或4个氨基酸取代的其变体的重链CDR2；

(c)包含FDGNYGYYAMDY（SEQ ID NO:17）、或包含1、2、3或4个氨基酸取代的其变体的重链CDR3；

(d)包含RSSTGAVTTSNYAN（SEQ ID NO:18）、或包含1、2、3或4个氨基酸取代的其变体的轻链CDR1；

(e)包含GTNNRAP（SEQ ID NO:19）、或包含1、2、3或4个氨基酸取代的其变体的轻链CDR2；和

(f)包含ALWYSNHWVFGGGTKL（SEQ ID NO:20）、或包含1、2、3或4个氨基酸取代的其变体的轻链CDR3。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述氨基酸取代是保守性氨基酸取代。

4.一种治疗受治疗者中血液癌症的方法，包括向所述受治疗者施用治疗有效量的特异性结合人Notch1的胞外域的非配体结合近膜区的抗体，其中所述抗体包括：

(a)与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:24具有至少约90%序列同一性的重链可变区；和/或

(b)与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:32具有至少约90%序列同一性的轻链可变区。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述抗体包括：

(a)与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:24具有至少约95%序列同一性的重链可变区；和/或

(b)与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:32具有至少约95%序列同一性的轻链可变区。

6.如权利要求4所述的方法，其中所述抗体包括：

(a)包含SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:24的重链可变区；和/或

(b)包含SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:32的轻链可变区。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述抗体包括：

(a)包含SEQ ID NO:14的重链可变区和

(b)包含SEQ ID NO:8的轻链可变区。

8.如权利要求6所述的方法，其中所述抗体包括：

(a)包含SEQ ID NO:24的重链可变区和

(b)包含SEQ ID NO:28的轻链可变区。

9.如权利要求6所述的方法，其中所述抗体包括：

(a)包含SEQ ID NO:24的重链可变区和

(b)包含SEQ ID NO:32的轻链可变区。

10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述抗体是重组抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、或抗体片段。

11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述抗体是单特异性抗体或双特异性抗体。

12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述抗体是单价抗体。

13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述抗体是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM抗体。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述抗体是IgG1或IgG2抗体。

15.一种治疗受治疗者中血液癌症的方法，包括向所述受治疗者施用治疗有效量的特异性结合人Notch1的胞外域的非配体结合近膜区的抗体，其中所述抗体由在ATCC以52M51或专利保藏号PTA-9405保藏的杂交瘤细胞系产生。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述抗体是52M51的人源化形式。

17.一种治疗受治疗者中血液癌症的方法，包括向所述受治疗者施用治疗有效量的特异性结合人Notch1的胞外域的非配体结合近膜区的抗体，其中所述抗体由在ATCC以52M51H4L3或专利保藏号PTA-9549保藏的多核苷酸编码。

18.一种治疗受治疗者中血液癌症的方法，包括向所述受治疗者施用治疗有效量的特异性结合人Notch1的胞外域的非配体结合近膜区的抗体，其中所述抗体结合由以ATCC专利保藏号PTA-9405保藏的杂交瘤细胞系产生的抗体52M51结合的所述近膜区中的表位相同的表位。

19.一种治疗受治疗者中血液癌症的方法，包括向所述受治疗者施用治疗有效量的特异性结合人Notch1的胞外域的非配体结合近膜区的抗体，其中所述抗体与抗体52M51竞争对所述近膜区的特异性结合。

20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述受治疗者是人。

21.一种抑制血液癌症生长的方法，包括将所述癌细胞与有效量的特异性结合人Notch1的胞外域的非配体结合近膜区的抗体接触，其中所述抗体包括：

22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述Notch1的非配体结合近膜区包括SEQ ID NO:2。

23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述抗体特异性结合至少一种另外Notch受体的胞外域的非配体结合近膜区。

24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述抗体是Notch1拮抗剂。

25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述抗体抑制Notch1的激活。

26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述抗体抑制Notch1活性。

27.如权利要求26所述的方法，其中所述抗体抑制组成型激活的Notch1的活性。

28.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述抗体抑制Notch1信号传导。

29.如权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述抗体抑制所述近膜区中的裂解。

30.如权利要求29所述的方法，其中所述抗体抑制所述近膜区中在S2位点处的裂解。

31.如权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述抗体抑制Notch1的胞内域（ICD）的释放。

32.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述血液癌症是急性骨髓性白血病、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤或T细胞急性淋巴母细胞性白血病。

33.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述血液癌症是T细胞急性淋巴母细胞性白血病。

34.如权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述抗体抑制所述癌细胞的生长。

35.如权利要求1-34中任一项所述的方法，所述方法还包括施用至少一种另外的治疗剂。

36.如权利要求35所述的方法，其中所述另外的治疗剂是化学治疗剂。

37.如权利要求35所述的方法，其中所述另外的治疗剂是另外的治疗抗体。

38.如权利要求37所述的方法，其中所述另外的治疗抗体包括特异性结合第二Notch受体的抗体。

39.如权利要求37所述的方法，其中所述另外的治疗抗体包括特异性结合Notch受体配体的抗体。

40.如权利要求1-39中任一项所述的方法，其中所述抗体与细胞毒性剂共轭。

41.如权利要求1-40中任一项所述的方法，其中所述抗体在放射治疗后施用。

42.如权利要求1-40中任一项所述的方法，其中所述抗体与放射治疗一起施用。

43.一种通过减少包含癌干细胞的血液癌症中癌干细胞的频率或数量来减少所述血液癌症的致瘤性的方法，所述方法包括将所述癌细胞与有效量的抑制Notch1活性的抗体接触。