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CN110382532A - 抗g-csf抗体及其用途 - Google Patents

抗g-csf抗体及其用途 Download PDF

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CN110382532A CN201880014855.6A CN201880014855A CN110382532A CN 110382532 A CN110382532 A CN 110382532A CN 201880014855 A CN201880014855 A CN 201880014855A CN 110382532 A CN110382532 A CN 110382532A
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Abstract

本申请披露了制备抗G‑CSF抗体的方法、抗G‑CSF抗体、筛选抗G‑CSF抗体的活性的方法、抗G‑CSF抗体的药物组合物、含有抗G‑CSF抗体的试剂盒，以及使用抗G‑CSF抗体治疗疾病的方法。

Description

抗G-CSF抗体及其用途
本申请要求于2017年2月7日提交的美国临时专利申请序列号62/455,991的优先权，将其全部内容通过引用特此并入。
背景技术
在发达国家癌症是死亡的主要原因之一，并且每年全球有超过1400万新发癌症病例。遗传和环境因素可导致癌症，并且癌症风险随着年龄的增长而显著增加。在发展中国家随着人们寿命的延长以及生活方式的改变，癌症发生率也在增加。免疫系统激活失效和慢性炎症可以支持癌症生长。
感染或炎症通常与细胞因子的释放有关，细胞因子在感染的清除中起生物学作用。在慢性炎症期间，这些相同的细胞因子可在维持炎症和疾病症状中起重要作用。此外，越来越多的证据表明细胞因子可以通过改变神经元信号传导来影响疼痛。粒细胞集落刺激因子(G-CSF)在癌症和慢性炎性疾病(如关节炎)中起重要作用。
发明内容
根据本披露的一个方面，提供了分离的或纯化的、结合粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：1或在其中具有保守取代的SEQ ID NO：1所示的重链CDR1；如SEQ ID NO：2或在其中具有保守取代的SEQID NO：2所示的重链CDR2；如SEQ ID NO：3或在其中具有保守取代的SEQ ID NO：3所示的重链CDR3；如SEQ ID NO：4或在其中具有保守取代的SEQ ID NO：4所示的轻链CDR1；如SEQ IDNO：5或在其中具有保守取代的SEQ ID NO：5所示的轻链CDR2；以及如SEQ ID NO：6或在其中具有保守取代的SEQ ID NO：6所示的轻链CDR3。在一种情况下，分离的或纯化的抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：7所示的重链可变区和如SEQ ID NO：8所示的轻链可变区。在另一种情况下，这种抗体被称为1B11。
根据本披露的另一方面，提供了分离的或纯化的、结合粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：9或在其中具有保守取代的SEQ ID NO：9所示的重链CDR1；如SEQ ID NO：10或在其中具有保守取代的SEQID NO：10所示的重链CDR2；如SEQ ID NO：11或在其中具有保守取代的SEQ ID NO：11所示的重链CDR3；如SEQ ID NO：12或在其中具有保守取代的SEQ ID NO：12所示的轻链CDR1；如SEQID NO：13或在其中具有保守取代的SEQ ID NO：13所示的轻链CDR2：以及如SEQ ID NO：14或在其中具有保守取代的SEQ ID NO：14所示的轻链CDR3。在一种情况下，分离的或纯化的抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：15所示的重链可变区和如SEQ ID NO：16所示的轻链可变区。在另一种情况下，这种抗体被称为3B3。
根据本披露的另一方面，提供了分离的或纯化的、结合粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：24、SEQ IDNO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：30所示的重链，在其中均具有保守取代；以及如SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26所示的轻链，在其中均具有保守取代。
根据本披露的另一方面，提供了编码本文所述的抗体或其抗原结合片段的核酸。在一种情况下，本文所述的抗G-CSF抗体具有由SEQ ID NO：17编码的可变重链和由SEQ IDNO：18编码的可变轻链。在另一种情况下，本文所述的抗G-CSF抗体具有由SEQ ID NO：19编码的可变重链和由SEQ ID NO：20编码的可变轻链。可以制备表达载体和/或宿主细胞，该表达载体和/或宿主细胞包含本文所述或编码本文所述的多肽序列的核酸序列。
在一些实施方式中，本文所述的分离的抗G-CSF抗体或其抗原结合片段包含2nM或更小的对G-CSF的结合亲和力(KD)，所述结合亲和力是在37℃下通过表面等离子共振测量的。
在一些实施方式中，本文所述的抗体或其抗原结合片段可以是IgG、IgM、IgE、IgA或IgD，或自其衍生。当抗体或其抗原结合片段是IgG时，IgG可以是IgG1、IgG2a、IaG2b、IgG3或IgG4。
在一些实施方式中，本文所述的抗体或其抗原结合片段在一些情况下可包含Fc区的部分或全部。
在一些实施方式中，本文所述的抗体可以是例如单克隆抗体、移植抗体(graftedantibody)、嵌合抗体、人抗体、人源化抗体等。
在一些实施方式中，本文所述的抗体或其抗原结合片段还可以是例如去免疫(de-immunized)抗体。
在一些实施方式中，抗原结合片段可以是Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、Fv片段、scFv片段、单链结合多肽、Fd片段、可变重链、可变轻链、dAb片段、单域抗体等。
在一些实施方式中，已经工程化了分离的或纯化的抗体或其抗原结合片段，用于提高G-CSF从受试者体内循环的清除。在一些实施方式中，双特异性抗体结合G-CSF和Fc受体以允许提高结合的G-CSF从受试者体内循环的清除率。
在一些实施方式中，本文所述的抗体或其抗原结合片段可以与治疗剂缀合。治疗剂可以是例如毒素、药物、酶、细胞因子、放射性核素、光动力剂等。
在一些实施方式中，毒素可以是例如蓖麻毒素A链(ricin A chain)、突变型假单胞菌外毒素(mutant Pseudomonas exotoxins)、白喉类毒素(diphtheria toxoid)、链黑霉素(streptonigrin)、博霉素(boamycin)、皂草素(saporin)、白树毒素(gelonin)、商陆抗病毒蛋白(pokeweed antiviral protein)等。
在一些实施方式中，药物可以是例如柔红霉素(daunorubicin)、甲氨蝶呤(methotrexatee)、卡奇霉素(calicheamicin)或本领域已知的其他治疗剂。
在一些实施方式中，放射性核素包括但不限于放射性金属。
在一些实施方式中，细胞因子可以是例如转化生长因子(TGF；例如，TGF-β)、白细胞介素(IL)、干扰素(IFN)或肿瘤坏死因子(TNF)。
在一些实施方式中，光动力剂可以是例如光卟啉(photoporphyrin)或其衍生物。
根据本披露的另一方面，提供了药物组合物，该药物组合物包含本文所述的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
在一些实施方式中，药物组合物进一步包含血管生成抑制剂，该血管生成抑制剂可以是例如抗VEGF剂或化疗剂。
在一些实施方式中，药物组合物可以配制用于口服、舌下、经由吸入、透皮、皮下、静脉内、动脉内、关节内、关节周围或肌肉内施用。
根据本披露的另一方面，提供了治疗有需要的受试者的癌症的方法，该方法包括向受试者施用本文所述的药物组合物。
在一些实施方式中，癌症可以是例如肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、胰腺癌、脑癌或皮肤癌。
根据本披露的另一方面，提供了治疗有需要的受试者的关节炎的方法，该方法包括向受试者施用本文所述的药物组合物。
在一些实施方式中，药物组合物可以通过静脉内、口服、舌下、经由吸入、透皮、皮下、动脉内、关节内、关节周围或肌肉内施用。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段的施用抑制或中和G-CSF活性。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段提高树突细胞发育、树突细胞成熟或其组合。
在一些实施方式中，在施用抗体或其抗原结合片段或包含其的药物组合物后，受试者表现出减少的T细胞抑制。
在一些实施方式中，试剂盒、药物包装和其他组合物可包含本文所述的抗体或抗原结合片段、药物组合物等。
鉴于以下描述，本披露的另外方面将是显而易见的。
通过引用并入
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，如同每一单独的出版物、专利或专利申请具体且单独地指明通过引用而并入。
将贯穿本申请描述的序列通过引用并入本文。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求中具体阐述。通过参考对说明性实施方式进行阐述的以下详细说明，将获得对本披露的特征和优点的更好理解，在所述实施方式中利用了本披露的原理，并且在所述附图中：
图1A-B.若干种抗G-CSF抗体克隆中和响应于人G-CSF的NFS-60细胞的增殖。A)在抗G-CSF抗体克隆上清液(1/5稀释液)存在下，将2.5×103个NFS-60细胞与0.125ng/mL重组人G-CSF一起培养6天。这些图显示了识别每个克隆的孔位置的板布局，并且右图显示了每个孔的相应细胞计数。B)在第6天，使用计数细胞。
图2.抗G-CSF抗体中和低浓度的0.125ng/mL的人G-CSF(hG-CSF)。在抗G-CSF抗体克隆上清液(1/5稀释液)存在下，将2.5×103个NFS-60细胞与0.125ng/mL重组人G-CSF一起培养6天。在第6天，使用计数细胞。使用t检验，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001
图3.抗G-CSF抗体中和高浓度的0.625ng/mL的人G-CSF(hG-CSF)。在抗G-CSF抗体克隆上清液(1/5稀释液)存在下，将2.5×103个NFS-60细胞与0.625ng/mL重组人G-CSF一起培养6天。在第6天，使用计数细胞。使用t检验，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001
图4.抗G-CSF克隆对人G-CSF比对小鼠G-CSF表现出更强的活性，这表明跨物种的交叉反应性很小。在抗G-CSF抗体克隆上清液(1/5稀释液)存在下，将2.5×103个NFS-60细胞与0.125ng/mL重组人G-CSF(左)或重组小鼠G-CSF(右)一起培养6天。在第6天，使用计数细胞。所有结果一式三份，并且显示平均值+SD。使用单因素方差分析(one way ANOVA)计算P值，然后针对与G-CSF对照相比的显著性进行邓尼特(Dunnett)多重比较检验。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001
图5A-B.抗人G-CSF克隆表现出针对糖基化和非糖基化人G-CSF两者的活性。在抗G-CSF抗体克隆上清液(1/5稀释液)或纯化的抗体(10μg/mL)存在下，将2.5×103个NFS-60细胞与未糖基化的、大肠杆菌产生的重组人G-CSF(左；A)或与糖基化的、CHO表达的人G-CSF(右；B)一起培养6天。在第6天，使用计数细胞。所有结果一式三份并显示平均值+SD，并且所有结果的p值＜0.0001。.1和.2名称是指每个第一抗体克隆的亚克隆。
图6A-D.将1B11.2(A)、3A3.2(B)、3B2.2(C)和2B3.2(D)以剂量依赖性方式中和G-CSF的生物活性。在各种稀释度的抗G-CSF抗体克隆上清液存在下，将2.5×103个NFS-60细胞与0.125ng/mL重组人G-CSF一起培养6天。在第6天，使用计数细胞。所有结果一式三份，并且显示平均值+SD。
图7.与1B11相比，3B3的中和活性。在各种浓度的纯化的抗G-CSF抗体克隆3B3(正方形)或1B11(圆形)存在下，将2.5×103个NFS-60细胞与0.125ng/mL重组人G-CSF一起培养6天。在第6天，使用计数细胞。所有结果一式三份，并且显示平均值±SD。
图8.抗人G-CSF克隆1B11和3B3逆转了G-CSF对flt3L诱导的骨髓树突细胞发育的影响。在存在或不存在抗G-CSF克隆1B11或3B3(10μg/mL)的情况下，在存在来自产生人G-CSF的NOP12肿瘤的各种浓度上清液的情况下，将小鼠骨髓与重组Flt3L(200ng/mL)一起培养9天。第9天计数细胞(A)。评估MHC II类和CD11c在细胞上的表达(B)，作为成熟树突细胞(MHC II类+CD11c+)频率的量度。
图9A-B.抗人G-CSF克隆1B11和3B3逆转G-CSF对MHC II类在GM-CSF诱导的骨髓树突细胞上的表达的影响。在存在或不存在抗G-CSF克隆1B11或3B3(10μg/mL)的情况下，在存在来自产生人G-CSF的NOP12肿瘤的1％(左；A)或5％(右；B)上清液的情况下，将小鼠骨髓与GM-CSF(1/1000稀释度的293T-G-CSF上清液)一起培养9天。评估MHC II类在细胞上的表达，作为树突细胞发育的量度。直方图表示在没有抗体(红色)、有克隆1B11(蓝色)或有3B3(橙色)的情况下，MHC II类在生长的细胞上的表达。
图10.抗G-CSF克隆1B11和3B3阻断原代人嗜中性粒细胞中的G-CSF信号传导。将各种浓度的人G-CSF(金斯瑞公司(Genscript))与10μg/mL纯化的抗体克隆1B11、3B3或同种型对照一起预温育。30分钟后，将G-CSF/抗体混合物添加到每孔含有5×100个纯化的人嗜中性粒细胞的板中。将板温育20分钟，之后立即固定细胞并根据制造商的方案(BD生物科学公司(BD Biosciences))染色细胞内磷酸化的Stat3(P-Tyr 705)。没有细胞因子和没有抗体培养的嗜中性粒细胞分别充当阴性和阳性对照。根据[MFI(平均荧光强度)实验样品]/[阳性对照的MFI]×100％，计算每个样品的最大Stat3磷酸化的百分比。此图表明克隆3B3和1B11两者均阻断人嗜中性粒细胞中的早期G-CSF信号传导，并且克隆3B3表现出比1B11多2-3倍的中和活性。3B3(底组圆圈)；1B11(中间组圆圈)和同种型对照(顶部组圆圈)。
图11A-B.对体内肿瘤G-CSF生产的中和降低MDSC的频率和T细胞抑制能力。用工程化以表达人G-CSF的1×106个MC38结肠癌细胞接种C57B1/6小鼠。7天后，每周用200μg抗G-CSF克隆1B11或3B3或同种型对照抗体治疗动物3次。A)在第25天，对动物实施安乐死并取出脾，并通过流式细胞术分析CD11b+Ly6G+细胞(MDSC)的存在。B)将来自荷瘤小鼠的脾用作抑制细胞(MDSC)的来源，并将其以各种比例添加到用增殖染料标记的OT-I TCR转基因脾细胞中。将全OVA(200μg/mL)添加至培养物中，作为抗原的来源。OT-I细胞还在IFN-γ启动子的控制下表达YFP，该YFP允许基于YFP表达检测IFN-γ产生。在第4天，用PMA(50ng/mL)刺激细胞，并通过流式细胞术分析增殖和IFN-γ产生。将在不存在MDSC的情况下单独用OVA培养的OT-I脾细胞和用缺乏MDSC的非荷瘤脾细胞培养的OT-I脾细胞(无肿瘤组)作为阳性对照。将在不存在OVA的情况下培养的OT-I脾细胞用作阴性对照。左上方的数字代表已经历至少一次分裂并且能够产生IFN-γ的OT-IT细胞。在10∶1的肿瘤脾细胞与OT-I脾细胞比率下，存在对OT-I增殖的明显抑制。与同种型对照处理组相比，来自1B11和3B3治疗的小鼠的脾细胞抑制OT-I增殖的能力降低。
图12是说明15种人源化1B11抗体变体的特征的表。
图13是说明通过1B11抗体的人源化变体体外阻断G-CSF依赖性STAT3信号传导的流式图。
图14是说明人源化1B11变体7和12抗体对NFS60细胞的G-CSF依赖性生长的中和的柱状图。
图15是说明通过人源化1B11变体7和12抗体以剂量依赖性方式中和G-CSF依赖性STAT3活化的流式图。
图16A和B是说明通过人源化1B11变体12抗体减少G-CSF诱导的中性白细胞增多和阻断嗜中性粒细胞pSTAT3信号传导的图。
具体实施方式
除非另有说明，本发明的实践将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些技术在本领域的技术范围内。这些技术在如以下文献中有充分解释，例如，Molecular Cloning：A LaboratoryManual[分子克隆：实验室手册]，第二版(Sambrook等人，1989)Cold Spring HarborPress[冷泉港出版社]；Oligonucleotide Synthesis[寡核苷酸合成](M.J.Gait编，1984)；Methods in MolecularBiology[分子生物学方法]，Humana Press[胡玛纳出版社]；Cell Biology：ALaboratoryNotebook[细胞生物学：实验室笔记](J.E.Cellis编，1998)Academic Press[学术出版社]；Animal Cell Culture[动物细胞培养](R.I.Freshney编，1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture[细胞和组织培养简介](J.P.Mather和P.E.Roberts，1998)Plenum Press[普菜纽姆出版社]；Cell and Tissue Culture：Laboratory Procedures[细胞和组织培养：实验室程序](A.Doyle，J.B.Griffiths和D.G.Newell编，1993-1998)J.Wiley and Sons[约翰威立父子公司]；Methods inEnzymology[酶学方法](Academic Press，Inc.[学术出版社公司])；Handbook ofExperimental Immunology[实验免疫学手册](D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells[哺乳动物细胞的基因转移载体](J.M.Miller和M.P.Cabs编.1987)；Current Protocols in Molecular Biology[分子生物学当代方案](F.M.Ausubel等人编，1987)；PCR：The Polymerase Chain Reaction[PCR：聚合酶链式反应]，(Mullis等人编，1994)；Current Protocols in Immunology[免疫学当代方案](J.E.Coligan等人编，1991)；Short Protocols in Molecular Biology[精编分子生物学实验指南](Wiley and Sons[约翰威立父子公引，1999)；Immunobiology[免疫生物学](C.A.Janeway和P.Travers，1997)；Antibodies[抗体](P.Finch，1997)；Antibodies：apractical approach[抗体：实用方法](D.Catty.编，IRL出版社，1988-1989)；Monoclonalantibodies：a practical approach[单克隆抗体：实用方法](P.Shepherd和C.Dean编，Oxford University Press[牛津大学出版社]，2000)；Using antibodies：a laboratorymanual[使用抗体：实验室手册](E.Harlow和D.Lane，Cold Spring Harbor LaboratoryPress[冷泉港实验室出版社]，1999)；以及TheAntibodies[抗体](M.Zanetti和J.D.Capra编，Harwood Academic Publishers[哈伍德学术出版社]，1995)。
术语“约”包括等于(并且考虑给定测量中的实验误差的范围)，并且可以指加或减5％、4％、3％、2％或1％或其间的任何位置。
如本文所用，“基本上纯的”、“分离的”或“纯化的”是指至少为50％纯(即，不含污染物)、更优选至少90％纯、更优选至少95％纯、更优选至少98％纯、更优选至少99％纯的物质。可以通过饱和硫酸铵沉淀法、优球蛋白沉淀法、己酸法、辛酸法、离子交换色谱法(DEAE或DE52)，或使用抗Ig柱或蛋白质A、G或L柱使用本领域公认的常规方法的亲和色谱，从上述培养上清液或腹水中分离并纯化抗体。
在本文中可互换使用的术语“多肽”、“寡肽”、“肽”和“蛋白质”是指任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可以是直链或支链的，它可以包含经修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。这些术语还涵盖天然地被修饰或通过干预而修饰的氨基酸聚合物；例如，通过二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操纵或修饰，如与标记组分缀合。该定义内还包括例如含有一种或更多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。应理解，因为本发明的多肽基于抗体，所以多肽能以单链或缔合链存在。
如本文中可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸聚合物，并包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基和/或它们的类似物，或者是可以通过DNA或RNA聚合酶掺入聚合物中的任何底物。多核苷酸可以包含经修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和它们的类似物。如果存在对核苷酸结构的修饰，那么在组装聚合物之前或之后进行。核苷酸序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合之后如通过与标记组分缀合来进一步修饰。其他类型的修饰包括例如“帽(cap)”、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰(比如，具有不带电荷的键(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酸酰胺酯(phosphoamidates)、氨基甲酸酯等)和带电荷的键(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些，含有悬垂部分的那些(比如，蛋白质(例如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等))，具有嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)的那些，含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化金属等)的那些，含有烷基化剂的那些，具有经修饰的键的那些(例如，α异头核酸等)，以及一种或更多种多核苷酸的未修饰形式)。此外，通常存在于糖中的任何羟基基团可以被例如膦酸酯基团、磷酸基团替换，被标准保护基团保护，或被活化以与另外的核苷酸制备另外的键，或者可以与固体支持物缀合。5′和3′末端OH可以被磷酸化或被胺或1至20个碳原子的有机封端基团部分取代。其他羟基也可以衍生为标准保护基团。多核苷酸还可以含有本领域通常已知的类似形式的核糖或脱氧核糖，包括例如2′-O-甲基-核糖、2′-O-烯丙基-核糖、2′-氟-核糖或2′-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、α-异头糖、差向异构糖(如阿拉伯糖、木糖或来苏糖)、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、无环类似物和无碱基核苷类似物(如甲基核糖苷)。一个或多个磷酸二酯键可以被替代性连接基团替换。这些替代性连接基团包括但不限于其中磷酸酯被P(O)S(“硫代酯”)、P(S)S(“二硫代酯”)、(O)NR2(“酰胺化物”)、P(O)R、P(O)OR′、CO或CH2(“甲缩醛(formacetal)”)替换的实施方式，其中每个R或R′独立地为H或取代或未取代的烷基(1-20个C)(任选地含有醚(--O--)键)、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有键都必须相同。前面的描述适用于本文提及的所有多核苷酸(包括RNA和DNA)。
“补体依赖性细胞毒性”和“CDC”是指在补体存在下裂解靶标。补体活化途径是通过补体系统的第一组分(C1q)结合到与同源抗原复合的分子(例如，抗体)而起始的。为了评估补体活化，可以进行CDC测定，例如，如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods[免疫学方法杂志]，202∶163(1996)中所述。
如本文所用，“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”是指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如，自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体，随后引起靶细胞的裂解。目的分子的ADCC活性可以使用体外ADCC测定(例如美国专利号5,500,362或5,821,337中所述的)来评估。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和NK细胞。可替代地或另外地，可以在体内，例如在Clynes等人，1998，PNAS USA[美国国家科学院院刊]，95∶652-656中披露的动物模型中评估目的分子的ADCC活性。
术语“细胞凋亡”或“程序性细胞死亡”是指在发育和其他正常生物过程中消除不需要的或无用的细胞的生理过程。细胞凋亡是在正常生理条件下发生的细胞死亡模式，并且细胞是其自身死亡(“细胞自杀”)的积极参与者。它最常见于正常细胞更新和组织稳态、胚胎发生、诱导和维持免疫耐受、神经系统发育和内分泌依赖性组织萎缩期间。经历凋亡的细胞显示出特有的形态学和生物化学特征。这些特征包括染色质聚集、细胞核和细胞质缩合、细胞质和细胞核分裂成膜结合的囊泡(凋亡小体，其含有核糖体、形态完整的线粒体和核质)。在体内，这些凋亡小体被巨噬细胞、树突细胞或邻近的上皮细胞迅速识别和吞噬。由于体内这种去除凋亡细胞的有效机制，不会引发炎性应答。在体外，凋亡小体以及剩余的细胞碎片最终溶胀并最终裂解。这种体外细胞死亡的终末期被称为“继发性坏死”。细胞凋亡可以通过本领域技术人员已知的方法测量，这些方法像DNA片段化、膜联蛋白V的暴露、半胱天冬酶的活化、细胞色素c的释放等。已被诱导死亡的细胞在本文中称为“凋亡细胞”。
可以使用标准膜联蛋白V细胞凋亡测定来测试细胞凋亡：使NIH：OVCAR-3细胞在6孔板(NUNC)中生长并用拮抗剂(或与另一种抗癌药物组合)照射或治疗4-48小时，用膜联蛋白V-FITC(BD-Pharmingen公司)洗涤和染色1小时。通过流式细胞术(BD公司(Becton-Dickinson)，CellQuest)分析细胞，用碘化丙啶复染，并在流式细胞仪中再次分析。
如本文所用，术语“粒细胞集落刺激因子”和“G-CSF”是指主要由来自骨髓基质的成纤维细胞和内皮细胞以及由免疫活性细胞(单核细胞、巨噬细胞)产生的糖蛋白。G-CSF的受体(G-CSFR)属于细胞因子和血细胞生成素受体超家族的一部分。如本文所用，G-CSF包括所有哺乳动物物种(例如人、犬、猫、马、牛等)的天然序列G-CSF。
抗体
如本文所用，“抗G-CSF抗体”是指能够结合G-CSF并抑制G-CSF生物活性和/或由G-CSF信号传导介导的一种或更多种下游途径的抗体。抗G-CSF抗体涵盖阻断、拮抗、抑制或降低(包括显著地)G-CSF生物活性(包括由G-CSF信号传导介导的下游途径)的抗体。出于本申请的目的，将明确理解术语“抗G-CSF抗体”涵盖所有先前鉴定的术语、标题，以及功能状态和特征，由此G-CSF本身、G-CSF生物活性(包括但不限于其治疗癌症的能力)或生物活性的结果在任何有意义的程度上基本上无效、减少或中和。在一个实施方式中，抗G-CSF抗体结合G-CSF并中和其活性。
本文提供了分离或纯化的、结合粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：1或在其中具有保守取代的SEQ IDNO：1所示的重链CDR1；如SEQ ID NO：2或在其中具有保守取代的SEQ ID NO：2所示的重链CDR2；如SEQ ID NO：3或在其中具有保守取代的SEQ ID NO：3所示的重链CDR3；如SEQ IDNO：4或在其中具有保守取代的SEQ ID NO：4所示的轻链CDR1；如SEQ ID NO：5或在其中具有保守取代的SEQ ID NO：5所示的轻链CDR2；以及如SEQ ID NO：6或在其中具有保守取代的SEQ ID NO：6所示的轻链CDR3。在一种情况下，分离的或纯化的抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：7所示的重链可变区和如SEQ ID NO：8所示的轻链可变区。在另一种情况下，这种抗体被称为1B11。
本文还提供了分离的或纯化的、结合粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：9或在其中具有保守取代的SEQID NO：9所示的重链CDR1；如SEQ ID NO：10或在其中具有保守取代的SEQ ID NO：10所示的重链CDR2；如SEQ ID NO：11或在其中具有保守取代的SEQ ID NO：11所示的重链CDR3；如SEQID NO：12或在其中具有保守取代的SEQ ID NO：12所示的轻链CDR1；如SEQ ID NO：13或在其中具有保守取代的SEQ ID NO：13所示的轻链CDR2；以及如SEQ ID NO：14或在其中具有保守取代的SEQ ID NO：14所示的轻链CDR3。在一种情况下，分离的或纯化的抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：15所示的重链可变区和如SEQ ID NO：16所示的轻链可变区。在另一种情况下，这种抗体被称为3B3。
应当理解，本文所述的抗体可以如下所述或如本领域已知地被修饰。
可用于本发明的“抗体”涵盖但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段(例如，Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、Fc等)、嵌合抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、异源缀合抗体、单链(ScFv)、其突变体、包含抗体部分的融合蛋白(例如，结构域抗体)、人源化抗体、人抗体、单域抗体，以及免疫球蛋白分子的任何其他修饰构型(包含具有所需特异性的抗原识别位点，包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体和共价修饰的抗体)。术语“嵌合”是指其中重链和/或轻链的一部分衍生自特定来源或物种、而重链和/或轻链的其余部分衍生自不同来源或物种的抗体。
根据重链恒定结构域的氨基酸序列，可以将免疫球蛋白分为不同的类别。存在五大类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的一些可以进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是本领域熟知的。
来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”基于它们的恒定结构域的氨基酸序列可分为两种明显不同的类型之一，称为“κ”(或“K”)和λ。
如本文所用，“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群体获得的抗体，即除了可能以少量存在的可能天然发生的突变之外，构成该群体的各个抗体是相同的。与典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂形成对照，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇(表位)。修饰语“单克隆”指示如从基本上均质的抗体群体获得的抗体的特征，并且不应理解为要求通过任何具体方法产生抗体。例如，根据本发明所用的单克隆抗体可通过Kohler和Milstein，1975，Nature[自然]，256：495首次描述的杂交瘤方法制得，或可以通过重组DNA方法(如描述于美国专利号4,816,567)制得。单克隆抗体也可以从例如使用McCafferty等人，1990，Nature[自然]，348：552-554中描述的技术产生的噬菌体文库中分离。其他方法是本领域已知的并且预期用于本文。
如本文所用，“人源化”抗体是指非人(例如鼠)抗体的形式，其是含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的特异性嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2、scFv或抗体的其他抗原结合子序列)。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自接受者的互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(供体抗体)(例如小鼠、大鼠或兔)的CDR的、具有所期望特异性、亲和力和生物活性的残基替换。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应非人残基替换。此外，人源化抗体可包含既不在受体抗体中也不在输入的CDR或框架序列中发现的残基，但这些残基被包括在内以进一步改善和优化抗体性能。通常，人源化抗体将基本上包含所有的至少一个以及典型地两个可变结构域，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些CDR区，并且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些FR区。人源化抗体还最佳地将包含免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白的至少一部分。抗体可具有如在例如WO 99/58572中所述修饰的Fc区。其他形式的人源化抗体具有一个或多个CDR(一个、两个、三个、四个、五个或六个)，这些CDR相对于原始抗体被改变，也被称为“衍生自”原始抗体的一个或多个CDR的一个或多个CDR。
如本文所用，“人抗体”意指如下抗体，该抗体具有与由人产生的和/或使用本领域已知的或本文披露的用于制造人抗体的任何技术制备的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列。人抗体的这种定义包括含有至少一种人重链多肽或至少一种人轻链多肽的抗体。一个这样的实例是包含鼠轻链多肽和人重链多肽的抗体。人抗体可以使用本领域中已知的多种技术产生。在一个实施方式中，人抗体选自噬菌体文库，其中该噬菌体文库表达人抗体(Vaughan等人，1996，Nature Biotechnology[自然生物技术]，14：309-314；Sheets等人，1998，PNAS USA[美国国家科学院院刊]，95：6157-6162；Hoogenboom和Winter，1991，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]，227：381；Marks等人，1991，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]，222：581)。还可以通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物(例如，其中内源性免疫球蛋白基因已部分或完全失活的小鼠)中来制备人抗体。该方法在描述于美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016中。可替代地，可以通过将产生针对靶抗原的抗体的人B淋巴细胞永生化来制备人抗体(此类B淋巴细胞可以从个体回收或可以在体外免疫)。参见，例如Cole等人，Monoclonal Antibodies and CancerTherapy[单克隆抗体和癌症治疗]，Alan R.Liss，第77页(1985)；Boerner等人，1991，J.Immunol.[免疫学杂志]，147(1)：86-95；和美国专利号5,750,373。
抗体的“可变区”是指抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区，单独地或组合地。重链和轻链的可变区各自由通过三个互补决定区(CDR，也称为高变区)连接的四个框架区(FR)组成。每条链中的CDR由FR紧密靠近地保持在一起，并且与来自另一条链的CDR一起促进抗体的抗原结合位点的形成。有用于确定CDR的至少两种技术：(1)基于跨物种序列变异性的方法(即，Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest[免疫学感兴趣的蛋白质序列]，(第5版，1991，National Institutes ofHealth[国立卫生研究院]，马里兰州贝塞斯达))；和(2)基于抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法(Al-Iazikani等人(1997)J.Molec.Biol.[分子生物学杂志]273：927-948)。如本文所用，CDR可以指由任一种方法或这两种方法的组合所定义的CDR。
抗体的“恒定区”是指抗体轻链的恒定区或抗体重链的恒定区，单独地或组合地。
“表位”是指能够与抗体的可变区结合口袋形成结合相互作用的抗原或其他大分子的一部分。此类结合相互作用可以表现为与一个或多个CDR的一个或多个氨基酸残基的分子间接触。抗原结合可以涉及例如CDR3或CDR3对，或者在一些情况下，涉及VH和VL链的至多所有六个CDR的相互作用。表位可以是线性肽序列(即，“连续的”)或可以由非连续的氨基酸序列构成(即，“构象的”或“不连续的”)。抗体可以识别一个或多个氨基酸序列；因此，表位可以定义一个以上不同的氨基酸序列。抗体识别的表位可以通过本领域技术人员熟知的肽作图和序列分析技术来确定。结合相互作用表现为抗原上的表位与CDR的一个或多个氨基酸残基之间的分子间接触。
与抗体或多肽“优先结合”或“特异性结合”(在本文中可互换使用)的表位是本领域熟知的术语，并且用于确定此类特异性或优先结合的方法也是本领域熟知的。如果抗体以比与其他物质更大的亲和力、亲合力，更容易和/或更长的持续时间结合，则抗体特异性结合或优先结合靶标。例如，特异性或优先结合G-CSF表位的抗体是以比与其他G-CSF表位或非G-CSF表位更大的亲和力、亲合力，更容易和/或更长的持续时间结合该靶标的抗体。通过阅读此定义还可以理解，例如，特异性或优先结合第一靶标的抗体(或部分或表位)可以或可以不特异性或优先结合第二靶标。因此，“特异性结合”或“优先结合”不一定需要(尽管它可以包括)专一结合。通常但不必须地，提及结合意指优先结合，其中抗体或其抗原结合片段的亲和力比抗体对无关氨基酸序列的亲和力高至少2倍、高至少3倍、高至少4倍、高至少5倍、高至少6倍、高至少7倍、高至少8倍、高至少9倍、高10倍、高至少20倍、高至少30倍、高至少40倍、高至少50倍、高至少60倍、高至少70倍、高至少80倍、高至少90倍、高至少100倍或高至少1000倍。
术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C-末端区域。“Fc区”可以是天然序列Fc区或变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链Fc区的边界可能改变，但人IgG重链Fc区通常被定义为从位置Cys226(或从Pro230)的氨基酸残基延伸至其羧基末端。Fc区中残基的编号是EU索引的编号，如Kabat等人(Sequences ofProteins ofImmunological Interest[免疫学感兴趣的蛋白质序列]，第5版Public Health Service[公共卫生署]，National InstitutesofHealth[国立卫生研究院]，马里兰州贝塞斯达，1991)。免疫球蛋白的Fc区通常包含两个恒定结构域，即CH2和CH3。
如本文所用，“Fc受体”和“FcR”描述了与抗体的Fc区结合的受体。
“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的至少一种效应子功能。示例性“效应子功能”包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬；下调细胞表面受体(例如，B细胞受体；BCR)等。此类效应子功能通常需要Fc区与结合结构域(例如，抗体可变结构域)组合，并且可以使用本领域已知的用于评估此类抗体效应子功能的多种测定来评估。
“天然序列Fc区”包含与在自然界中发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。“变体Fc区”包含由于至少一个氨基酸修饰而不同于天然序列Fc区的氨基酸序列，但保留天然序列Fc区的至少一种效应子功能。优选地，变体Fc区与天然序列Fc区或与亲本多肽的Fc区相比具有至少一个氨基酸取代，例如，在天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区中的从约一至约十个氨基酸取代，优选从约一至约五个氨基酸取代。本文的变体Fc区将优选地与天然序列Fc区和/或与亲本多肽Fc区具有至少约80％的序列同一性，并且最优选地与其具有至少约90％的序列同一性，更优选地与其至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％的序列同一性。
当在本文中使用时，术语“高变区”和“CDR”是指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。CDR包含来自以互补方式与抗原结合的三个序列区域的氨基酸残基，并且对于VH和VL链中的每一个称为CDR1、CDR2和CDR3。根据Kabat等人(同上)，在轻链可变结构域中，CDR通常大约对应于残基24-34(CDRL1)、50-56(CDRL2)和89-97(CDRL3)，并且在重链可变结构域中，CDR通常大约对应于残基31-35(CDRH1)、50-65(CDRH2)和95-102(CDRH3)。应理解，不同抗体的CDR可含有插入，因此氨基酸编号可以不同。卡巴特编号系统(Kabatnumbering system)用编号方案解释这类插入，该编号方案利用附接至特定残基的字母(例如，轻链中CDRL1的27A、27B、27C、27D、27E和27F)来反映不同的抗体之间的编号中的任何插入。可替代地，根据Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]，196：901-917(1987)，在轻链可变结构域中，CDR通常大约对应于残基26-32(CDRL1)、50-52(CDRL2)和91-96(CDRL3)，并且在重链可变结构域中，CDR通常大约对应于残基26-32(CDRH1)、53-55(CDRH2)和96-101(CDRH3)。
如本文所用，“框架区”或“FR”是指形成抗原结合口袋或沟的一部分的框架氨基酸残基。在一些实施方式中，框架残基形成作为抗原结合口袋或沟的一部分的环，并且环中的氨基酸残基可以或可以不接触抗原。框架区通常包含CDR之间的区域。根据Kabat等人(同上)，在轻链可变结构域中，FR通常大约对应于残基0-23(FRL1)、35-49(FRL2)、57-88(FRL3)和98-109，并且在重链可变结构域中，FR通常大约对应残基0-30(FRH1)、36-49(FRH2)、66-94(FRH3)和103-133。如上文对轻链用卡巴特编号所讨论的，重链也以相似方式解释插入(例如，重链中CDRH1的35A、35B)。可替代地，根据Chothia和Lesk(J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]，196：901-917(1987))，在轻链可变结构域中，FR通常大约对应于残基0-25(FRL1)、33-49(FRL2)、53-90(FRL3)和97-109(FRL4)，并且在重链可变结构域中，FR通常大约对应于残基0-25(FRH1)、33-52(FRH2)、56-95(FRH3)和102-113(FRH4)。
可以通过检查抗体重链和/或抗体轻链的三维结构来评估和确定FR的环氨基酸。可以分析三维结构的溶剂可及氨基酸位置，因为这样的位置可能形成环和/或在抗体可变结构域中提供抗原接触。一些溶剂可及位置可以耐受氨基酸序列多样性，而其他位置(例如，结构位置)通常不太多样化。抗体可变结构域的三维结构可以衍生自晶体结构或蛋白质建模。
如本文所用，术语“kon”旨在是指抗体与抗原缔合的速率常数。
如本文所用，术语“Koff”旨在是指抗体与抗体/抗原复合物解离的速率常数。
如本文所用，术语“亲和力”是指两种试剂可逆结合的平衡常数，并表示为KD。本文所述抗体的结合亲和力(KD)可为约0.02pM至约250nM或其间的任何整数。在一些实施方式中，结合亲和力是约250nM、约225nM、约200nM、约175nM、约150nM、约125nM、100nM、约75nM、约50nM、约25nM、约10nM、约5nM、约4nM、约3nM、约2.5nM、约2nM、约1.5nM、约1nM、约1nM、约750pM、约500pM、约275pM、约250pM、约225pM、约100pM、约75pM、约60pM、约50pM、约25pM、约20pM、约15pM、约10pM、约5pM、约2pM、约1pM、约0.5pM、约0.1pM、约0.05pM或约0.02pM、约1飞摩尔(fM)中的任一个，或其间的任何整数。
结合亲和力可以使用表面等离子共振(SPR)、Kinexa生物传感器、闪烁亲近测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、ORIGEN免疫测定(IGEN)、荧光猝灭、荧光转移、酵母展示或其任何组合来确定。还可以使用合适的生物测定法筛选结合亲和力。
如本文所用，术语“亲合力”是指两种或更多种试剂的复合物在稀释后对解离的抗性。表观亲和力可以通过比如酶联免疫吸附测定(ELISA)等方法或本领域技术人员熟悉的任何其他技术来确定。亲合力可以通过比如斯卡查德分析(Scatchard analysis)等方法或本领域技术人员熟悉的任何其他技术来确定。
可以通过使用保守或非保守取代在氨基酸序列中进行一个或多个取代来修饰抗体或其抗原结合片段。
短语“保守氨基酸取代”是指基于某些共同特性对氨基酸进行分组。定义单个氨基酸之间的共同特性的功能性方法是分析同源生物的相应蛋白质之间氨基酸改变的标准化频率(Schulz，G.E.和R.H.Schirmer，Principles ofProtein Structure[蛋白质结构的原理]，Springer-Verlag[斯普林格出版社])。根据这样的分析，可以定义氨基酸组，其中组内的氨基酸彼此优先交换，因此它们对总体蛋白质结构的影响最相似。以这种方式定义的氨基酸组的实例包括：
(i)带电荷的组，该组由Glu和Asp、Lys、Arg和His组成；
(ii)带正电荷的组，该组由Lys、Arg和His组成；
(iii)带负电荷的组，该组由Glu和Asp组成；
(iv)芳香族的，该组由Phe、Tyr和Trp组成；
(v)氮环组，该组由His和Trp组成；
(vi)大的脂肪族非极性组，该组由Val、Leu和Ile组成；
(vii)轻微极性组，该组由Met和Cys组成；
(viii)小残基组，该组由Ser、Thr、Asp、Asn、Gly、Ala、Glu、Gln和Pro组成；
(ix)脂肪族组，该组由Val、Leu、Ile、Met和Cys组成；以及
(x)小羟基组，该组由Ser和Thr组成。
除了上面给出的组之外，每个氨基酸残基可以形成其自己的组，并且由单个氨基酸形成的组可以简单地由如上所述的、本领域常用的该氨基酸的一个和/或三个字母缩写来指代。
“保守残基”是在一系列相似蛋白质中相对不变的氨基酸。通常保守的残基仅通过被相似的氨基酸替换而变化，如上文对“保守氨基酸取代”所述。
除非另外明确说明，否则如本文氨基酸序列中使用的字母“x”或“xaa”旨在表示可将20种标准氨基酸中的任何一种置于此位置。出于肽模拟物设计的目的，氨基酸序列中的“x”或“xaa”可以被靶序列中存在的氨基酸的模拟物替换，或者氨基酸可以被不干扰肽模拟物活性的基本任何形式的间隔子替换。
“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。可以通过比较每个序列中能用于比较目的而比对的位置各自确定同源性和同一性。当比较序列中的等同位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则这些分子在那个位置处是具有同一性的；当等同位点被相同或相似的氨基酸残基(例如，空间性质和/或电子性质相似)占据时，则这些分子在那个位置可被称为同源(相似)。作为同源性/相似性或同一性百分比的表述是指在比较序列共享的位置处相同或相似氨基酸的数目的函数。“无关”或“非同源”的序列与本发明的序列共享小于40％的同一性，但优选共享小于25％的同一性。在比较两个序列时，不存在残基(氨基酸或核酸)或存在额外残基也会降低同一性和同源性/相似性。
术语“同源性”描述了基于数学的序列相似性的比较，其用于鉴定具有相似功能或基序的基因或蛋白质。本发明的核酸(核苷酸、寡核苷酸)和氨基酸(蛋白质)序列可以用作“查询序列”以对公共数据库进行检索，从而例如鉴定其他家族成员、相关序列或同源物。可以使用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215：403-10的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)来执行此类检索。可以用NBLAST程序(评分＝100，字长＝12)进行BLAST核苷酸检索，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序(评分＝50，字长＝3)进行BLAST氨基酸检索，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目标的空位比对，可以利用如在Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.[核酸研究]25(17)：3389-3402中所述的空位BLAST。当利用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和BLAST)的默认参数(参见，www.ncbi.nlm.nih.gov)。
如本文所用，“同一性”意指当将序列进行比对使得序列匹配最大化时(即，考虑空位和插入)，在两个或更多个序列中的相应位置处的相同核苷酸或氨基酸残基的百分比。可以通过已知方法容易地计算同一性，这些方法包括但不限于Computational MolecularBiology[计算分子生物学]，Lesk，A.M.编，Oxford University Press[牛津大学出版社]，纽约，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects[生物计算：信息学和基因组计划]，Smith，D.W.编，Academic Press[学术出版社]，纽约，1993；Computer Analysisof Sequence Data[序列数据的计算机分析]，第I部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编，Humana Press[胡玛纳出版社]，新泽西州，1994；Sequence Analysis in MolecularBiology[分子生物学的序列分析]，von Heinje，G.，Academic Press[学术出版社]，1987；和Sequence Analysis Primer[序列分析引物]，Gribskov，M.和Devereux，J.编，M.Stockton Press[斯托克顿出版社]，纽约，1991；以及Carillo，H.和Lipman，D.，SIAM J.[美国工业和应用数学学会杂志]Applied Math.[应用数学]，48：1073(1988)。用于确定同一性的方法被设计为在测试的序列之间给出最大匹配。此外，在公开可用的计算机程序中编码了用于确定同一性的方法。用于确定两个序列之间的同一性的计算机程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux，J.等人，Nucleic Acids Research[核酸研究]12(1)：387(1984))、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S.F.等人，J.Molec.Biol.[分子生物学杂志]215：403-410(1990)和Altschul等人Nuc.Acids Res.[核酸研究]25：3389-3402(1997))。BLAST X程序可从NCBI和其他来源公开获得(BLAST Manual[BLAST手册]，Altschul，S.等人，NCBINLM NIH马里兰州贝塞斯达20894；Altschul，S.等人，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215：403-410(1990))。熟知的史密斯-沃特曼算法(Smith Waterman algorithm)也可以用来确定同一性。
如果需要，可以评估本文所述的抗体或其抗原结合片段的免疫原性，并且根据需要，使本文所述的抗体或其抗原结合片段去免疫化(即，通过改变抗体的一个或多个T细胞表位使抗体免疫反应性降低)。可以经由使用软件和特定数据库来进行本文所述的抗体和抗原结合片段中存在的免疫原性和T细胞表位的分析。示例性软件和数据库包括由英国剑桥的Antitope开发的iTopeTM。iTopeTM是一种用于分析肽与人MHC II类等位基因结合的经由计算机模拟的技术。
iTopeTM软件预测肽与人MHC II类等位基因的结合，从而为这种“潜在T细胞表位”的位置提供初步筛选。iTopeTM软件预测肽的氨基酸侧链与34个人MHC II类等位基因的结合沟内的特异性结合口袋之间的有利相互作用。关键结合残基的位置通过经由计算机模拟生成9mer肽(9聚肽，9mer peptide)来获得，这些9mer肽与跨越测试抗体可变区序列的一个氨基酸重叠。可以针对34种MHC II类同种异型中的每一种测试每种9mer肽，并基于它们与MHCII类结合沟的潜在“拟合”和相互作用进行评分。对＞50％的MHCII类等位基因产生较高平均结合评分(iTopeTM评分函数中＞0.55)的肽被认为是潜在的T细胞表位。在此类区域，分析MHC II类沟内用于肽结合的核心9氨基酸序列，以确定MHC II类口袋残基(P1、P4、P6、P7和P9)和可能的T细胞受体(TCR)接触残基(P-1、P2、P3、P5、P8)。
在鉴定任何T细胞表位后，可以引入氨基酸残基改变、取代、添加和/或缺失以去除所鉴定的T细胞表位。可以进行这样的改变以保留抗体结构和功能，同时仍然去除所鉴定的表位。示例性改变可包括但不限于保守氨基酸改变。
本文提供了与G-CSF结合并抑制G-CSF活性的中和抗体或抗原结合片段。
抗G-CSF抗体或其抗原结合片段的抑制/中和的百分比(％)为阴性对照的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍或更大表明抗体或其抗原结合片段抑制或中和G-CSF。抗G-CSF抗体或其抗原结合片段对G-CSF的抑制百分比比阴性对照大少于2倍表明抗体或其抗原结合片段不抑制G-CSF。
本文所述的抗体或其抗原结合片段还可用作免疫缀合物。如本文所用，出于说明书和权利要求的目的，免疫缀合物是指包含根据本发明的抗G-CSF抗体或其片段和至少一种治疗标记的缀合物。治疗标记包括抗肿瘤剂和血管生成抑制剂。此类抗肿瘤剂是本领域已知的，并且包括但不限于毒素、药物、酶、细胞因子、放射性核素和光动力剂。毒素包括但不限于蓖麻毒素A链、突变型假单胞菌外毒素、白喉类毒素、链黑霉素、博霉素、皂草素、白树毒素和商陆抗病毒蛋白。药物包括但不限于柔红霉素、甲氨蝶呤和卡奇霉素。放射性核素包括放射性金属。细胞因子包括但不限于转化生长因子β(TGF-β)、白细胞介素、干扰素和肿瘤坏死因子；这些细胞因子中的每种的实例及其功能是本领域熟知的。光动力剂包括但不限于卟啉及其衍生物。另外的治疗标记是本领域已知的并且也在本文中考虑。用至少一种试剂复合抗G-CSF mAb或其抗原结合片段的方法是本领域技术人员熟知的(即，抗体缀合物，如通过Ghetie等人，1994，Pharmacol.Ther.[药物治疗]63：209-34综述的)。此类方法可以利用若干种可用于偶联或连接分子的异双功能试剂中的一种。用于将抗体与其他部分缀合的接头是本领域熟知的并且在本文中考虑。
缀合或连接多肽的方法是本领域熟知的。抗体与标记之间的缔合(结合)包括本领域已知的任何方法，这些方法包括但不限于共价和非共价相互作用、化学缀合，以及重组技术。
抗体或其抗原结合片段可以使用本领域已知的技术(比如通过添加聚乙二醇(PEG))进行修饰以用于各种目的。PEG修饰(聚乙二醇化)可以导致改善的循环时间、改善的溶解性、改善的蛋白水解抗性、降低的抗原性和免疫原性、改善的生物利用度、降低的毒性、改善的稳定性和更容易的配制中的一种或更多种(综述参见，Francis等人，InternationalJournal of Hematology[国际血液学杂志]68：1-18，1998)。
改善循环中基于抗体的融合蛋白的半衰期的其他方法也是已知的，比如，描述于美国专利号7,091,321和6,737,056中(将其各自通过引用特此并入)。另外，可以产生或表达抗体及其抗原结合片段，使得它们在其复合的N-糖苷连接的糖链上不含岩藻糖。已知从复合的N-糖苷连接的糖链中去除岩藻糖会增加抗体和抗原结合片段的效应子功能，这些效应子功能包括但不限于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。相似地，可以结合G-CSF的抗体或其抗原结合片段可以在其C-末端附接至衍生自任何抗体同种型(例如，IgG、IgA、IgE、IgD和IgM)和任何同种型亚类(特别是IgG1、IgG2b、IgG2a、IgG3和IgG4)的免疫球蛋白重链的全部或部分。
结合G-CSF的抗体或其抗原结合片段也可用于纯化G-CSF和/或检测样品或受试者中的G-CSF水平。本文所述的抗体和抗原结合片段的组合物可用作非治疗剂(例如，作为亲和纯化剂)。通常，在一个这样的实施方式中，使用本领域已知的常规方法将目的蛋白固定在比如Sephadex树脂或滤纸等固相上。使固定的蛋白质与含有要纯化的目的靶标(或其片段)的样品接触，然后用合适的溶剂洗涤支持物，除了靶蛋白(其与固定抗体结合)之外，该溶剂基本上去除样品中的所有物质。最后，用另一种合适的溶剂(例如甘氨酸缓冲液，pH5.0)洗涤支持物，这将释放靶蛋白。
抗体或其抗原结合片段可以与亲和标签(例如，纯化标签)缀合或被亲和标签重组工程化。亲和标签，比如，His6标签(His-His-His-His-His-His；SEQ ID NO：21)在本领域是常规的。
制备抗体的方法
本文所述的抗体可以通过本领域已知的任何方法制备。如本文进一步描述的，宿主动物的免疫途径和方案通常与用于抗体刺激和产生的已建立且常规的技术一致。用于产生人抗体和小鼠抗体的一般技术是本领域已知的，并且在本文和下文的实例中描述。
预期可以操纵包括人的任何哺乳动物受试者或来自其的产生抗体的细胞以用作哺乳动物(包括人)杂交瘤细胞系的产生基础。通常，宿主动物通过腹膜内、肌肉内、口服、皮下、足底内和/或真皮内接种一定量的免疫原(包括如本文所述的)。
使用双功能剂或衍生剂，例如马来酰亚胺基苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或本领域已知的任何其他辅助剂，用人蛋白或片段(该片段含有与在要免疫物种中具有免疫原性的辅助剂(例如，钥孔虫戚血兰蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂)缀合的靶氨基酸序列)免疫宿主动物可产生抗体群。
使用Kohler，B.和Milstein，C.(1975)Nature[自然]256：495-497的一般体细胞杂交技术或如通过Buck，D.W.等人，知Vitro[体外]，18：377-381(1982)所修改的，由免疫动物的淋巴细胞和永生化骨髓瘤细胞制备杂交瘤。可用的骨髓瘤系(包括但不限于X63-Ag8.653和来自索尔克研究所(Salk Institute)，细胞分布中心(Cell Distribution Center)，美国加利福尼亚州圣地亚哥的那些)可用于杂交。通常，该技术涉及使用融合剂(如聚乙二醇)或通过本领域技术人员熟知的电学方法融合骨髓瘤细胞和淋巴样细胞。融合后，将细胞从融合培养基分离，并使其在选择性生长培养基(如次黄嘌呤-氨蝶呤-胸苷(HAT)培养基)中生长，以消除未杂交的亲本细胞。本文所述的任何补充有或没有血清的培养基可用于培养分泌单克隆抗体的杂交瘤。作为细胞融合技术的另一种替代方案，EBV永生化B细胞可用于产生单克隆抗体。如果需要，将杂交瘤扩增并亚克隆，并通过常规免疫测定方法(例如，放射免疫测定、酶免疫测定、荧光免疫测定等)测定上清液的抗免疫原活性。
可用作抗体来源的杂交瘤包含产生单克隆抗体或其部分的亲本杂交瘤的所有衍生物、后代细胞。
产生此类抗体的杂交瘤可以使用已知方法在体外或体内生长。如果需要，可以通过常规免疫球蛋白纯化方法(如硫酸铵沉淀法、凝胶电泳、透析、色谱和超滤)从培养基或体液中分离单克隆抗体。
可以除去不希望的活性(如果存在的话)，例如，通过将制剂运行在由附接至固相的免疫原制成的吸附剂上，并从免疫原洗脱或释放所期望的抗体。
可以使用本领域已知的任何方法重组制备并表达抗体。
抗体可以通过噬菌体展示技术重组制备。参见，例如，美国专利号5,565,332；5,580,717；5,733,743；和6,265，150；以及Winter等人，Annu.Rev.Immunol.[免疫学年度评论]12：433-455(1994)。可替代地，噬菌体展示技术(McCafferty等人，Nature[自然]348：552-553(1990))可用于在体外从未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因库中产生人抗体和抗体片段。根据此技术，将抗体V结构域基因进行框内克隆到丝状噬菌体(例如M13或fd)的主要或次要外壳蛋白基因中，并作为功能性抗体片段展示在噬菌体颗粒的表面上。因为丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以基于抗体功能特性的选择还会导致选择编码展现这些特性的抗体的基因。因此，噬菌体模拟B细胞的一些特性。噬菌体展示能以多种形式进行；对于综述，参见例如，Johnson，Kevin S和Chiswell，David J.，CurrentOpinion in Structural Biology[结构生物学最新观点]，3：564-571(1993)。若干种V基因区段的来源可用于噬菌体展示。Clackson等人，Nature[自然]352：624-628(1991)从衍生自免疫小鼠的脾的V基因的小的随机组合文库中分离出多种抗噁唑酮抗体。可以构建来自未免疫的人供体的V基因库，并且可以基本上按照由Mark等人，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]222：581-597(1991)或Griffith等人，EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12：725-734(1993)描述的技术分离针对多种抗原(包括自身抗原)的抗体。在天然免疫应答中，抗体基因以高速率累积突变(体细胞超突变)。引入的一些改变将赋予更高的亲和力，以及在随后的抗原激发期间展示高亲和力表面免疫球蛋白的B细胞优先被复制和分化。可以通过采用称为“链改组”的技术来模拟此自然过程。Marks等人，Bio/Technol.[生物/技术]10：779-783(1992)。在此方法中，通过用从未免疫供体获得的V结构域基因的天然存在的变体(库)的库顺序地替换重链和轻链V区基因，可以改善通过噬菌体展示获得的“初级”人抗体的亲和力。此技术允许产生具有pM-nM范围内的亲和力的抗体和抗体片段。Waterhouse等人，Nucl.Acids Res.[核酸研究]21：2265-2266(1993)已经描述了制备非常大的噬菌体抗体库(也称为“所有库之母”)的策略。基因改组也可用于从啮齿动物抗体获得人抗体，其中人抗体对起始啮齿动物抗体具有相似的亲和力和特异性。根据此方法(也称为“表位印记”)，通过噬菌体展示技术获得的啮齿动物抗体的重链或轻链V结构域基因被人V结构域基因库替换，这产生啮齿动物-人嵌合体。对抗原的选择导致分离能够恢复功能性抗原结合位点的人可变区，即表位管理配偶体的选择(给配偶体的选择加印记)。当重复该过程以替换剩余的啮齿动物V结构域时，获得人抗体(参见，于1993年4月1日公开的PCT公开号WO93/06213)。与通过CDR嫁接进行的啮齿动物抗体的传统人源化不同，此技术提供完全人抗体，其不具有啮齿动物来源的框架或CDR残基。
人源化单克隆抗体有四个一般步骤。这些步骤是：(1)确定起始抗体轻链和重链可变结构域的核苷酸和预测的氨基酸序列，(2)设计人源化抗体，即决定在人源化过程中使用哪个抗体框架区，(3)实际的人源化方法/技术，(4)人源化抗体的转染和表达。参见，例如，美国专利号4,816,567；5,807,715；5,866,692；6,331,415；5,530,101；5,693,761；5,693,762；5,585,089；以及6,180,370。
已经描述了许多包含衍生自非人免疫球蛋白的抗原结合位点的“人源化”抗体分子，这些抗体分子包括具有啮齿动物V区或经修饰的啮齿动物V区的嵌合抗体及其与人恒定结构域融合的相关互补决定区(CDR)。参见，例如，Winter等人Nature[自然]349：293-299(1991)；Lobuglio等人Proc.Nat.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86：4220-4224(1989)；Shaw等人J.Immunol.[免疫学杂志]138：4534-4538(1987)；以及Brown等人CancerRes.[癌症研究]47：3577-3583(1987)。
其他参考文献描述了在与合适的人抗体恒定结构域融合之前嫁接到人支持性框架区(FR)中的啮齿动物CDR。参见，例如，Riechmann等人Nature[自然]332：323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science[科学]，239：1534-1536(1988)；以及Jones等人，Nature[自然]，321：522-525(1986)。另一篇参考文献描述了由重组镶饰的啮齿动物框架区支持的啮齿动物CDR。参见，例如，欧洲专利公开号0519596。设计这些“人源化”分子以使对啮齿动物抗人抗体分子的不需要的免疫应答最小化，所述不需要的免疫应答限制了这些部分在人受体中的治疗应用的持续时间和有效性。例如，可以工程化抗体恒定区以使其具有免疫学惰性(例如，不引发补体裂解)。参见，例如，PCT公开号WO99/058572；和英国专利申请号9809951.8。
还可以利用的人源化抗体的其他方法由以下披露：Daugherty等人，Nucl.AcidsRes.[核酸研究]，19：2471-2476(1991)；以及美国专利号6,180,377；6,054,297；5,997,867；5,866,692；6,210,671；和6,350,861；以及PCT公开号WO 01/27160。
在又另一个替代方案中，可以通过使用已工程化以表达特异性人免疫球蛋白蛋白质的可商购小鼠来获得完全人抗体。被设计用于产生更令人期望的(例如，完全人抗体)或更强的免疫应答的转基因动物也可用于产生人源化或人抗体。此类技术的实例是来自安根尼克斯公司(Abgenix)(加利福尼亚州弗里蒙特(Fremont，Calif.))的XENOMOUSETM，以及来自梅达雷克斯公司(Medarex)(新泽西州普林斯顿(Princeton，N.J.))的和TC MOUSETM。
显而易见的是，尽管上述讨论涉及人源化抗体，但所讨论的一般原理适用于定制例如用于狗、猫、灵长类动物、马和牛中的抗体。进一步显而易见的是，可以组合人源化本文所述抗体的一个或多个方面，例如CDR嫁接、框架突变和CDR突变。
如果需要，可以使用任何已知方法对目的抗体进行测序，然后可以将多核苷酸序列克隆到载体中用于表达或增殖。
编码目的抗体的序列可以保持在宿主细胞的载体中，然后可以扩增和冷冻宿主细胞以备将来使用。在一个替代方案中，多核苷酸序列可用于遗传操作以使抗体“人源化”或改善抗体的亲和力或其他特征。例如，如果抗体用于人的临床试验和治疗，则恒定区可以被工程化以更类似于人恒定区从而避免免疫应答。
本文还提供了制备任何这些抗体或多肽的方法。可以使用本领域已知的任何常规方法制备本发明的抗体。多肽可以通过蛋白水解或抗体的其他降解，通过如上所述的重组方法(即，单一或融合多肽)或通过化学合成来产生。通过化学合成方便地制备抗体的多肽(尤其是多至约50个氨基酸的较短多肽)。化学合成方法是本领域已知的并且是可商购的。例如，可以通过使用固相方法的自动化多肽合成仪来产生抗体。还参见美国专利号5,807,715；4,816,567；以及6,331，415。
通过首先从宿主动物中分离抗体和产生抗体的细胞，获得基因序列，并使用该基因序列在宿主细胞(例如，CHO细胞)中重组地表达抗体，可以重组地制备抗体。可以采用的另一种方法是在植物(例如烟草)或转基因乳中表达抗体序列。已经披露了在植物或乳中重组地表达抗体的方法。参见，例如，Peeters等人，Vaccine[疫苗]19：2756(2001)；Lonberg，N.和D.Huszar Int.Rev.Immunol[国际免疫学综述]13：65(1995)；以及Pollock等人，JImmunol Methods[免疫学方法杂志]231：147(1999)。用于制备抗体衍生物(例如单链等)的方法是本领域已知的。
如本文所用，“宿主细胞”包括单个细胞或细胞培养物，其可以是或已经是用于掺入多核苷酸插入物的载体的受体。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，并且由于天然的、意外的或故意的突变，后代可能不一定与原始亲本细胞完全相同(在形态学或基因组DNA互补物方面)。宿主细胞包括用本发明的多核苷酸转染的细胞。
编码抗体的DNA可以使用常规方法(例如，通过使用能够与编码单克隆抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)容易地进行分离和测序。杂交瘤细胞可以作为这种DNA的优选的来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体(如PCT公开号WO 87/04462中披露的表达载体)中，然后将这些表达载体转染到不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞(如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞)中，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。参见，例如，PCT公开号WO 87/04462。DNA也可以被修饰，例如，通过将人重链和轻链恒定结构域的编码序列替换为同源鼠序列(Morrison等人，Proc.Nat.Acad.Sci.[美国国家科学院院刊]81∶6851(1984))，或通过将非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价结合至免疫球蛋白编码序列。以这种方式，制备“嵌合”或“杂合”抗体，这些抗体具有本文所述抗体的结合特异性。
如本文所用，“载体”意指构建体，其能够在宿主细胞中递送、并优选表达一种或更多种目的基因或序列。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂相关的DNA或RNA表达载体、包封在脂质体中的DNA或RNA表达载体，以及某些真核细胞(如生产细胞)。
如本文所用，“表达控制序列”意指指导核酸转录的核酸序列。表达控制序列可以是启动子(如组成型或诱导型启动子)或增强子。表达控制序列与要转录的核酸序列可操作地连接。
在一些情况下，可以期望遗传操作抗体序列以获得对G-CSF的更大亲和力和更大的抑制和/或中和G-CSF的功效。对于本领域技术人员显而易见的是，可以对抗体进行一种或更多种多核苷酸改变并使其仍然保持对G-CSF的结合能力。
表达载体可用于指导抗体的表达。本领域技术人员熟悉表达载体的施用以获得体内外源蛋白的表达。参见，例如美国专利号6,436,908；6,413,942；以及6,376,471。
本文描述了抗体的单链可变区片段(“scFv”)。可以通过使用短连接肽连接轻链和/或重链可变区来制备单链可变区片段。Bird等人(1988)Science[科学]242：423-426。连接肽的实例是(GGGGS)3(SEQ ID NO：22)，其在一个可变区的羧基末端与另一个可变区的氨基末端之间桥接大约3.5nm。已经设计并使用了其他序列的接头。Bird等人(同上)。为了另外的功能(如附接药物或附接固体支持物)，还可以修饰接头。可以重组地或合成地产生单链变体。对于scFv的合成产生，可以使用自动合成仪。对于scFv的重组产生，可以将含有编码scFv的多核苷酸的合适质粒引入合适的宿主细胞(真核细胞(如酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞)或原核细胞(如大肠杆菌))。可以通过常规操作(如连接多核苷酸)制备编码目的scFv的多核苷酸。可以使用本领域已知的标准蛋白质纯化技术分离所得的scFv。
还涵盖其他形式的单链抗体，如双抗体和单域抗体。双抗体是二价、双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单一多肽链上表达，但使用的接头太短而不允许在同一条链上的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链上的互补结构域配对并且产生两个抗原结合位点(参见，例如，Holliger,P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]，90：6444-6448(1993)：和Poljak，R.J.等人，Structure[结构]，2：1121-1123(1994))。
例如，可以使用本文披露的抗体制备双特异性抗体，即对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体。制备双特异性抗体的方法是本领域已知的(参见，例如，Suresh等人，1986，Methodsin Enzymology[酶学方法]121：210)。传统上，双特异性抗体的重组产生基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两个重链具有不同的特异性(Millstein和Cuello，1983，Nature[自然]，305，537-539)。双特异性抗体可以由以下构成：在一个臂中具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和在另一个臂中的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)。这种不对称结构(仅在双特异性分子的一半中具有免疫球蛋白轻链)促进了所期望的双特异性化合物与不需要的免疫球蛋白链组合的分离。此方法描述于PCT公开号WO 94/04690中。
根据制备双特异性抗体的一种方法，将具有所期望的结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原结合位点)与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。融合物优选地具有免疫球蛋白重链恒定结构域，该重链恒定结构域包含至少部分铰链、CH2区和CH3区。优选具有存在于至少一种融合物中的第一重链恒定区(CH1)，该第一重链恒定区含有轻链结合所必需的位点。将编码免疫球蛋白重链融合物和免疫球蛋白轻链(如果需要)的DNA插入单独的表达载体中，并共转染到合适的宿主生物中。当在构建体中使用的三条多肽链的不等比例提供最佳产率时，这在调节实施方式中三种多肽片段的各自比例方面提供了很大的灵活性。然而，当以相等比例表达至少两条多肽链导致高产率或当比例没有特别重要时，将两条或所有三条多肽链的编码序列插入一个表达载体中是可能的。
包含两个共价连接的抗体的异源缀合抗体也在本发明的范围内。此类抗体已用于将免疫系统细胞靶向不需要的细胞(美国专利号4,676,980)。异源缀合抗体可以使用任何便利的交联方法制备。合适的交联剂和技术是本领域熟知的，并且描述于美国专利号4,676,980中。
嵌合或杂合抗体也可以使用合成蛋白质化学的已知方法(包括涉及交联剂的那些)在体外制备。例如，可以使用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。用于此目的的合适试剂的实例包括亚氨基硫醇盐和甲基-4-巯基丁酰亚胺酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)。
可以使用本领域已知的方法鉴定或表征抗G-CSF抗体及其抗原结合片段，由此检测和/或测量G-CSF生物活性的减少、改善或中和。
可以使用本领域熟知的方法表征抗体。例如，一种方法是鉴定与其结合的表位，或“表位作图”。本领域已知许多方法用于绘制和表征蛋白质上表位的位置，这些方法包括解决抗体-抗原复合物的晶体结构、竞争测定、基因片段表达测定和基于合成肽的测定，如例如在Harlow和Lane，Using Antibodies，aLaboratory Manual[使用抗体，实验室手册]，Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社]，冷泉港，纽约，1999中的第11章所述。在另外的实例中，表位作图可用于确定抗G-CSF抗体结合的序列。表位作图是从各种来源(例如Pepscan系统公司(Pepscan Systems)(Edelhertweg 15，8219PH菜利斯塔德，荷兰))可商购的。表位可以是线性表位(即包含在氨基酸的单个区段中)或由氨基酸的三维相互作用形成的构象表位(其可以不必包含在单个区段中)。可以分离或合成(例如，重组地)不同长度的肽(例如，至少4-6个氨基酸长)，并将其用于与抗G-CSF抗体的结合测定。在另一个实例中，可以通过使用衍生自抗G-CSF序列的重叠肽并确定抗G-CSF抗体的结合来在系统筛选中确定抗G-CSF抗体结合的表位。根据基因片段表达测定，编码G-CSF的开放阅读框随机地或通过特定的遗传构建被片段化，并确定G-CSF的表达片段与要测抗体的反应性。例如，基因片段可以通过PCR产生，然后在放射性氨基酸存在下将其在体外转录并翻译成蛋白质。然后通过免疫沉淀和凝胶电泳确定抗体与放射性标记的G-CSF片段的结合。还可以通过使用在噬菌体颗粒表面上展示的大的随机肽序列文库(噬菌体文库)来鉴定某些表位。可替代地，可以在简单结合测定中测试重叠肽片段的确定文库与测试抗体的结合。在另外的实例中，可以进行抗原结合结构域的诱变、结构域交换实验和丙氨酸扫描诱变以鉴定表位结合所需的、足够的和/或必需的残基。例如，可以使用突变型G-CSF进行结构域交换实验，其中G-CSF多肽的各种片段已经被来自密切相关但抗原性不同的蛋白的序列替换(交换)。通过评估抗体与突变型G-CSF的结合，可以评估特定G-CSF片段对抗体结合的重要性。
可用于表征抗G-CSF抗体的又另一种方法是使用与已知结合同一抗原的其他抗体(即，G-CSF上的各种片段)的竞争测定法，来确定抗G-CSF抗体是否与其他抗体结合同一表位。竞争测定法是本领域技术人员所熟知的。
本文还提供了亲和力成熟的抗体。例如，亲和力成熟的抗体可以通过本领域已知的方法产生(Marks等人，1992，Bio/Technology[生物/技术]，10：779-783；Barbas等人，1994，ProcNat.Acad.Sci，USA[美国国家科学院院刊]91：3809-3813；Schier等人，1995，Gene[基因]，169：147-155；Yelton等人，1995，J.Immunol.[免疫学杂志]，155：1994-2004；Jackson等人，1995，J.Immunol.[免疫学杂志]，154(7)：3310-9；Hawkins等人，1992，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]，226：889-896；和WO 2004/058184)。
在一些实施方式中，抗G-CSF抗体是工程化的抗体。例如，可以通过本领域已知的方法产生扫除抗体(sweeping antibodies)，扫除抗体在神经pH下可以增加与细胞表面新生Fc受体的结合，以增加与抗体结合的抗原从受试者体内循环中的清除(Higuchi等人，2013：8(5)，e63236)。可以通过本领域已知的方法产生双特异性/双补位性(biparatopic)抗体，其形成大的免疫复合物，该免疫复合物结合Fcγ受体并允许结合的抗原从受试者体内循环中的清除(Kasturirangan等人，2017，J.Biol.Chem.[生物化学杂志]，10：4361-4370)。
以下方法可用于调节抗体的亲和力并用于表征CDR。表征抗体的CDR和/或改变(如改善)多肽(如抗体)的结合亲和力的一种方法被称为“文库扫描诱变”。通常，文库扫描诱变如下工作。使用本领域公认的方法，用两个或更多个(如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)氨基酸替换CDR中的一个或多个氨基酸位置。这产生小的克隆文库(在一些实施方式中，一个克隆文库针对所分析的每个氨基酸位置)，每个克隆文库具有两个或更多个成员(如果在每个位置取代两个或更多个氨基酸)的复杂性。通常，文库还包括含有天然(未取代的)氨基酸的克隆。筛选来自每个文库的少量克隆(例如约20-80个克隆(取决于文库的复杂性)对靶多肽(或其他结合靶标)的结合亲和力，并且确定具有增加的、相同的、减少的结合或无结合的候选物。用于确定结合亲和力的方法是本领域熟知的。可以使用Biacore表面等离子共振分析来确定结合亲和力，该分析检测出结合亲和力的差异为约2倍或更高。当起始抗体已经以相对较高的亲和力(例如约10nM或更低的KD)结合时，Biacore特别有用。
在一些实施方式中，使用本领域公认的诱变方法(其中一些在本文中描述)，用所有20种天然氨基酸替换CDR中的每个氨基酸位置(在一些实施方式中，一次一个)。这产生小的克隆文库(在一些实施方式中，一个克隆文库针对所分析的每个氨基酸位置)，每个克隆文库具有20个成员的复杂性(如果在每个位置取代所有20个氨基酸)。
在一些实施方式中，要筛选的文库包含两个或更多个位置的取代，这些位置可以在相同的CDR中或在两个或更多个CDR中。因此，文库可以在一个CDR中的两个或更多个位置包含取代。文库可以在两个或更多个CDR中的两个或更多个位置包含取代。文库可包含在3、4、5或更多个位置的取代，所述位置在二、三、四、五或六个CDR中发现。可以使用低冗余密码子来制备取代。参见，例如，Balint等人，Gene[基因]，137(1)：109-18(1993)中的表2。CDR可以是CDRH3和/或CDRL3。CDR可以是CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2和/或CDRH3中的一个或多个。CDR可以是Kabat CDR、Chothia CDR或延伸的CDR。
可以对具有改善的结合的候选物进行测序，从而鉴定产生改善的亲和力的CDR取代突变体(也称为“改善的”取代)。也可以对结合的候选物进行测序，从而鉴定保留结合的CDR取代。
可以进行多轮筛选。例如，具有改善的结合的候选物(各自包含在一个或多个CDR的一个或多个位置处的氨基酸取代)还可用于设计第二文库，该第二文库在每个改善的CDR位置(即，取代突变体显示出改善的结合的、CDR中的氨基酸位置)处至少含有原始氨基酸和取代的氨基酸。下面进一步讨论该文库的制备、筛选或选择。
文库扫描诱变还提供了表征CDR的方法，具有改善的结合、相同的结合、降低的结合或没有结合的克隆的频率还提供了与每个氨基酸位置对抗体-抗原复合物的稳定性的重要性有关的信息。例如，如果CDR中的一个位置在改变为全部20个氨基酸时保留结合，则该位置被鉴定为抗原结合不太可能需要的位置。相反，如果CDR中的一个位置仅在一小部分的取代中保留结合，则该位置被鉴定为对CDR功能很重要的位置。因此，文库扫描诱变方法产生关于CDR中可以改变为许多不同氨基酸(包括所有20个氨基酸)的位置，以及CDR中不能改变或只能改变为少数氨基酸的位置的信息。
具有改善的亲和力的候选物可以组合在第二文库中，该第二文库包括改善的氨基酸、该位置的原始氨基酸，并且可以在该位置进一步包括另外的取代，这取决于所期望的或使用所期望的筛选或选择方法所允许的文库的复杂性。此外，如果需要，可以将邻近的氨基酸位置随机化为至少两个或更多个氨基酸。邻近氨基酸的随机化可以允许突变型CDR中的另外的构象灵活性，这反过来允许或促进大量的改善突变的引入。该文库还可以包含在第一轮筛选中未显示出改善的亲和力的位置处的取代。
使用本领域已知的任何方法筛选或选择第二文库中具有改善的和/或改变的结合亲和力的文库成员，包括使用Biacore表面等离子共振分析进行的筛选，以及使用本领域已知的用于选择的任何方法(包括噬菌体展示、酵母展示和核糖体展示)进行的选择。
组合物
本文所述的抗体的治疗性配制剂(formulation)可以通过将具有所期望的纯度的抗体与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合(Remington，The Science andPractice of Pharmacy[药学科学与实践]第20版Mack Publishing[麦克出版社](2000))，以冻干配制剂或水溶液的形式存储。
如本文所用，“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”包括当与活性成分组合时允许该成分保持生物活性并且与受试者的免疫系统不反应的任何物质。实例包括但不限于任何标准药物载体，如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(如油/水乳液)，以及各种类型的润湿剂。用于气溶胶或肠胃外施用的优选稀释剂是磷酸盐缓冲盐水或生理(0.9％)盐水。包含此类载体的组合物通过熟知的常规方法配制(参见，例如，Remington′sPharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学]，第18版，A.Gennaro编，Mack PublishingCo.[麦克出版有限公司]，宾夕法尼亚州伊斯顿，1990；和Remington，The Science andPractice ofPharmacy[药学科学与实践]第20版Mack Publishing[麦克出版社]，2000)。
可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度下对受体是无毒的，并且可包含缓冲剂(如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸)；盐，如氯化钠；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚；丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子，如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
可以对用于体内施用的配制剂进行灭菌。这可以通过例如无菌过滤膜过滤或任何其他本领域公认的用于灭菌的方法来实现。抗体组合物一般是放置在具有无菌进入孔的容器中，例如具有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。用于灭菌和过滤的其他方法是本领域已知的并且在本文中考虑。
在本发明的一个实施方式中，将组合物配制成不含热原(pyrogen)，使得它们对于施用受试者是可接受的。测试针对热原的组合物并制备不含热原的药物组合物是被本领域普通技术人员很好理解的。
根据本发明的组合物可以是用于静脉内、口服、肠胃外或直肠施用，或通过吸入或吹入施用的单位剂型，如溶液或悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、颗粒剂或栓剂等。
短语“药学上可接受的”指当施用受试者时，生理上耐受的且通常不产生过敏或类似不良反应(如肠胃不适、头晕等)的分子实体和组合物。
在一些情况下，抗体可以与一种或更多种载体结合。载体可以是有活性的和/或有惰性的。熟知的载体的实例包括聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、玻璃、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁铁矿。出于本发明的目的，载体的性质可以是可溶的或不可溶的。本领域技术人员应知道用于结合抗体的其他合适的载体，或者将能够使用常规实验确定这些载体。
当用于提及治疗性组合物或药物组合物时，术语“单位剂量”是指适合作为对于人的单位剂量的物理上离散的单位，每个单位含有经计算以产生与所需稀释液(即载体或媒介)结合的所期望的治疗效果的预定量的活性物质。
组合物能以与剂量配制剂相容的方式、并以治疗有效量施用。要施用的量取决于要治疗的受试者、受试者免疫系统利用活性成分的能力，以及所期望的结合能力程度。需要施用的活性成分的精确量取决于从业者的判断并且是每个个体特有的。用于初始施用和加强注射的合适方案也是可变的，但典型的是初始施用，然后通过后续注射或其他施用以一个或多个小时间隔的重复剂量。加强剂量也能以2周、2个月、6个月的间隔或任何其他适当的间隔施用。可替代地，考虑了足以在血液中维持浓度的连续静脉内输注。
一个实施方式考虑使用本文所述的抗体来制造用于治疗本文所述的病症、疾病或障碍的药物。药物可以基于需要治疗的受试者的身体特征来配制，并且可以基于病症、疾病或障碍的阶段以单一或多种配制剂进行配制。药物可以包装在具有适当标签的合适包装中，用于分配到医院和诊所，其中标签用于指示治疗患有本文所述疾病的受试者。药物能以单个或多个单位包装。组合物的剂量和施用说明可以包括在如下所述的包装中。本发明进一步涉及具有本文所述的抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体的药物。
本文提供了结合G-CSF的抗体及其抗原结合片段的组合物，并且包括如本文其他地方所述的那些。如本文所述的结合G-CSF的抗体及其抗原结合片段可用于治疗各种形式的癌症(例如原发性肿瘤和转移瘤)。
取决于要治疗的病症，可以将组合物(本文所述的抗体或抗原结合片段)单独施用或与第二组合物组合施用(同时或顺序地)。在一个实施方式中，第二治疗性治疗是血管生成抑制剂(例如，抗VEGF剂或化疗剂)。当施用两种或更多种组合物时，可以将组合物组合施用(顺序地或同时)。组合物能以单剂量或多剂量施用。预期用于本文所述方法中的抗VEGF剂包括但不限于兰尼单抗(ranibizumab，)、阿柏西普(aflibercept，VEGF-Trap)、舒尼替尼(sunitinib，)、索拉非尼(sorafenib，)、阿西替尼(axitinib)、哌加他尼(pegaptanib)和帕唑帕尼(pazopanib)。
本发明的一个实施方式考虑使用本发明的任何组合物来制备用于治疗癌症的药物。药物可以基于需要治疗的受试者的身体特征来配制，并且可以基于病碍(disorder)以单一或多种配制剂进行配制。本发明的药物可以包装在具有适当标签的合适药物包装中，用于分配到医院和诊所，其中标签用于指示治疗受试者的如本文所述的癌症。药物能以单个或多个单位包装。本发明药物组合物的剂量和施用说明可以包括在药物包装中。
治疗方法
通过本文的方法治疗的“个体”或“受试者”可以是哺乳动物，更优选是人。哺乳动物还包括但不限于农场动物、竞赛动物(sportanimal)和宠物，这些动物包括但不限于灵长类动物、马、牛、羊驼、狗、猫、兔、小鼠和大鼠。
应当理解，“有需要的受试者”可能患有疾病(如癌症或其转移)，但可能尚未出现该疾病的症状。例如，在癌症是结肠癌(其与突变型K-ras蛋白质相关)的情况下，在结肠的一些细胞中具有突变型K-ras蛋白质的受试者是根据本发明的受试者，即使该受试者可能还没有结肠癌的症状。有需要的受试者也可以是患有关节炎或其他炎性疾病的受试者。
“疾病的体征或症状”是临床上公认的疾病表现或适应症。
如本文所用，本文所述药物组合物的“治疗有效剂量”或“治疗有效量”是足以产生有益或所期望的结果的量。有益或所期望的结果包括比如减轻疾病的严重性或延迟疾病进展等结果，这些结果包括疾病的生化、组织学和/或行为症状，疾病发展期间出现的并发症和中间病理表型。治疗剂(包括激动剂、拮抗剂和/或类似物)的治疗有效量可以基于不同的因素而变化，这些因素例如疾病状态，受试者的年龄、性别和体重，以及治疗剂在受试者中引起所期望的应答的能力。治疗有效量也是其中治疗上有益的作用超过物质/分子、激动剂或拮抗剂的任何毒性或有害作用的一个量。
如在临床背景中所理解的，药物组合物的有效剂量可以与或可以不与另一种药物、化合物或药物组合物结合而实现。因此，“有效剂量”可以在施用一种或更多种治疗剂的背景下考虑，并且，如果与一种或更多种其他药剂结合可以获得所期望的结果或实现所期望的结果，则可以考虑以有效量施用单一药剂。因此，在一些情况下，可以向受试者施用一种或更多种治疗剂。在其他情况下，用本文所述的药物组合物的治疗在本文所述的一种或更多种其他治疗方式之前或之后进行。
术语“治疗(treatment/treat/treating)”是指试图改变所治疗个体的自然进程的临床干预，并且可以用于预防或在临床病理学过程中进行。治疗的效果可包括预防疾病的发生或复发、缓解症状、减少疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展速度、改善疾病状态、最小化临床损害或由疾病引起的症状、减少受试者所遭受的任何疼痛或不适、缓解或改善预后，以及使受试者的生存期延长超过在没有这种治疗的情况下本来预期的生存期。治疗可以由减少疾病引起的免疫功能的抑制(例如抑制T细胞等)而引起。
通过“治疗”患有癌症或其转移的受试者，意味着在根据本发明的治疗后，受试者的症状可以部分缓解、完全缓解或保持静止。已经治疗的受试者可以表现出部分或完全缓解肿瘤负荷。在一个非限制性实例中，治疗患有高度转移性癌症(例如，乳腺癌)的受试者，在该受试者中，与未接受治疗的受试者相比，另外的转移不发生或者数量减少。在另一个非限制性实例中，治疗受试者，其中与未接受治疗的受试者相比，该受试者的实体癌尺寸减小或尺寸不增加。在又另一个非限制性实例中，与未接受治疗的受试者中的癌细胞数相比，治疗的受试者中的癌细胞数不增加或减少。还可以将改善定义为例如细胞增殖减少、细胞数量减少、凋亡增加和/或受治疗的受试者的存活率增加。癌症的治疗还包括抑制或阻止癌细胞的发展或扩散，或通过限制、悬浮、终止或以其他方式控制癌症中涉及的细胞的成熟和增殖。
抗G-CSF抗体的各种配制剂可用于施用。在一些实施方式中，可以纯净地施用抗G-CSF抗体。在一些实施方式中，抗G-CSF抗体和药学上可接受的赋形剂可以处于各种配制剂中。药学上可接受的赋形剂是本领域已知的，并且是相对惰性的物质，其有助于施用药理学有效的物质。例如，赋形剂可以提供形式或稠度，或充当稀释剂。合适的赋形剂包括但不限于稳定剂、润湿剂和乳化剂、用于改变渗透压的盐、囊封剂、缓冲剂以及皮肤渗透增强剂。用于肠胃外和非肠胃外药物递送的赋形剂以及配制剂陈述于Remington，The Science andPractice of Pharmacy[药学科学与实践]第20版Mack Publishing[麦克出版社](2000)中。
在一些实施方式中，配制这些抗体用于通过已知方法施用受试者，这些方法包括但不限于口服施用、肠胃外施用(例如，筋膜外(epifascial)、囊内、皮内(intracutaneous)、真皮内(intradermal)、肌肉内、眶内、腹膜内、脊柱内、胸骨内、血管内、静脉内、薄壁组织或皮下施用)、透皮施用等。因此，这些药剂可以与药学上可接受的媒介物(如盐水、林格氏溶液(Ringer′s solution)、右旋糖溶液等)组合。具体的剂量方案(即剂量、时间和重复)将取决于具体个体和个体的病史。
对于口服施用，抗体的配制剂能以胶囊、片剂、粉剂、颗粒剂或悬浮液存在。配制剂可以具有常规添加剂，如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉。配制剂还可以与粘合剂(如结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶)一起提供。另外，配制剂可以与崩解剂(如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠)一起提供。配制剂还能以无水磷酸氢钙或淀粉乙醇酸钠提供。最后，配制剂能以润滑剂(如滑石粉或硬脂酸镁)提供。
对于肠胃外施用，可以将抗体悬浮在无菌水溶液中，该无菌水溶液优选与受试者的血液等渗。可以通过将固体活性成分溶解在含有生理相容物质(如氯化钠、甘氨酸等)并具有与生理条件相容的缓冲pH的水中以产生水溶液，然后使所述溶液无菌来制备这样的配制剂。配制剂可提供在单位剂量容器或多剂量容器(如密封的安瓿或小瓶)中。配制剂可以通过任何注射方式递送，这些方式包括但不限于筋膜外、囊内、皮内、真皮内、肌肉内、眶内、腹膜内、脊柱内、胸骨内、血管内、静脉内、薄壁组织或皮下。
如本文所述，也可以经由吸入施用抗G-CSF抗体。
通常，对于抗G-CSF抗体的施用，初始候选剂量可为约2mg/kg。出于本发明的目的，典型的日剂量可以高达3μg/kg、高达约30μg/kg、高达约300μg/kg、高达约3mg/kg、高达30mg/kg、高达100mg/kg或更高，或其间的任何整数，这取决于上述因素。例如，可以使用约1mg/kg、约2.5mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg或约25mg/kg的剂量。
对于经数天或更长时间的重复施用(取决于病症)，持续治疗直至出现所期望的症状抑制或直至达到足够的治疗水平，例如减轻疼痛。示例性施用方案包括施用约2mg/kg的初始剂量，然后施用约1mg/kg抗G-CSF抗体的每周维持剂量，或者然后每隔一周施用约1mg/kg的维持剂量。
然而，取决于执业医生希望实现的药代动力学衰减的模式，其他剂量方案可以是有用的。例如，在一些实施方式中，预期每周给药一次至四次。通过常规技术和测定可以容易地监测治疗的进展。给药方案可随时间变化。
抗G-CSF抗体的合适剂量将取决于所采用的抗G-CSF抗体、要治疗疾病的类型和阶段、先前的手术和/或治疗、受试者的临床病史和对抗体的应答，以及主治医生的判定。
典型地，临床医生将施用抗G-CSF抗体，直至达到所期望结果的剂量。剂量和/或频率可在治疗过程中变化。
经验考虑(如半衰期)通常将有助于确定剂量。例如，与人免疫系统相容的抗体(如人源化抗体或完全人抗体)可用于延长抗体的半衰期并防止抗体被宿主免疫系统攻击。
可以在治疗过程中确定和调整施用频率。可替代地，抗G-CSF抗体的持续连续释放配制剂可能是适当的。用于实现持续释放的各种配制剂和设备是本领域已知的。为了评估抗G-CSF抗体的功效，可以遵循疾病的指标。
如本文进一步使用的，癌症的治疗包括淤滞(stasis)、部分或完全消除癌性生长或肿瘤。治疗或部分消除包括例如生长或肿瘤大小和/或体积的倍数减少如约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约10倍、约20倍、约50倍或两者之间的任何倍数减少。类似地，治疗或部分消除可包括生长或肿瘤大小和/或体积的百分比减少约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％、100％或其间的任何百分比减少。
在本领域中良好建立了癌症的诊断或评估。可以基于主观测量(如患者对症状的表征)来进行评估。还可以基于客观测量(比如，测试血液或组织样品中的一种或更多种癌抗原)来进行评估。另外的评估类型如下所述。
可以通过本领域熟知的方法评估治疗功效。
肿瘤的非限制性实例包括肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、胰腺癌、脑癌或皮肤癌。
术语“肿瘤”在本文中用于指癌组织(与相同类型的正常组织的表示相比)。肿瘤可包括实体瘤和半实体瘤。在某些情况下，肿瘤也可能是转移性的。
肺癌
在本文所述的方法中，向患有肺癌的有需要的受试者施用治疗有效量的药物组合物，该药物组合物包含本文所述的抗体或其抗原结合片段。
最常见的肺癌类型是非小细胞肺癌(NSCLC)，其占肺癌的大约80％-85％，并且分为鳞状细胞癌、腺癌和大细胞未分化癌。小细胞肺癌约占肺癌的15％-20％。
肺癌分期是对癌症从其原始来源的传播程度的评估。它是影响肺癌的预后和潜在治疗的重要因素。非小细胞肺癌从IA(“一个A”；最佳预后)到IV(“四个”；最差预后)进行分期。如果将小细胞肺癌限制在胸部的一半并且在单一放疗领域的范围内，则将其归类为局限期；否则，其是扩散期。
可以根据TNM系统，使用EUS(内窥镜超声)或CT或MRI扫描或在手术中对非小细胞肺癌进行分期以对疾病程度进行分类。这些受试者经受作为考虑预后和治疗的过程的一部分的分期。AJCC推荐TNM分期，然后进一步分组。
原发肿瘤(T)：TX：无法评估原发肿瘤，或在痰或支气管肺泡灌洗中存在恶性细胞但在成像或支气管镜检中未见；Tis：原位癌。T0：无原发性肿瘤证据。T1：肿瘤的最大尺寸小于3cm，周围有肺或脏层胸膜，并且支气管镜检下没有侵入主支气管。T2：肿瘤具有以下任何一种：最大尺寸超过3cm；扩散到主支气管(但在隆突远端超过2cm)；以及阻塞性肺炎(但不累及整个肺)。T3：肿瘤具有以下任何一种：侵入胸壁、膈膜、纵隔胸膜或心包壁层；扩散到主支气管，距隆突2cm，但不累及隆突；以及整个肺的阻塞性肺炎。T4：肿瘤具有以下任何一种：侵入纵隔、心脏、大血管、气管、食道、椎骨或隆突；在同一叶中的孤立肿瘤结节；以及恶性胸腔积液。淋巴结(N)：NX：无法评估淋巴结；N0：不累及淋巴结；N1：转移到同侧支气管周围淋巴结或同侧肺门淋巴结；N2：转移到同侧纵隔淋巴结或隆突下淋巴结；和N3：转移到以下任何一个：同侧锁骨上淋巴结；同侧斜角肌淋巴结；和对侧淋巴结。远处转移(M)：MX：无法评估远处转移；M0：无远处转移；和M1：存在远处转移。
在考虑组合疗法用于治疗肺癌的情况下，一种或更多种另外的治疗性治疗是手术、放疗(例如，胸部放疗、带电粒子放射治疗)、尿嘧啶-替加氟和基于铂的化疗(例如，顺铂、卡铂、奥沙利铂等)、长春瑞滨、埃罗替尼吉非替尼抗表皮生长因子受体抗体(例如.西妥昔单抗)、抗血管内皮生长因子抗体(例如，贝伐单抗)、酪氨酸激酶的小分子抑制剂、参与肺癌细胞增殖的蛋白质的直接抑制剂、极光激酶抑制剂、激光诱导的热疗、RNAi疗法、经遗传修饰以分泌粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的全肿瘤细胞(也称为GVAX)或其任何组合。另外的治疗性治疗包括紫杉醇，培美曲塞，抗CTLA-4(YERVOY)，抗PD-1(OPDIVO、KEYTRUDA)，抗PDL1(BMS-936559、MPDL3280A)，其他正在开发的：由Medivation/CureTech公司开发的匹地利珠单抗(Pidilizumab)(CT-011，抗PD-1)，由阿斯利康公司(AstraZeneca)开发的MEDI4736(抗PD-L1)，以及由默克-索罗诺公司(Merck-Sorono)开发的阿维鲁单抗(Avelumab)(MSB0010718C，抗PD-L1)。
在其他情况下，当考虑组合疗法用于治疗肺癌时，一种或更多种另外的治疗性治疗是免疫疗法，包括但不限于嵌合抗原受体(CAR)-重定向T细胞(CAR-T)细胞疗法或过继性T细胞疗法(ACT)。
乳腺癌
在本文所述的方法中，向患有乳腺癌的有需要的受试者施用治疗有效量的药物组合物，该药物组合物包含本文所述的抗体或其抗原结合片段。如本文所用，“乳腺癌”还涵盖在个体中展示出发展乳腺癌的倾向的表型。
使用本文所述的方法治疗的乳腺癌包括可以在女性受试者中发展的任何类型的乳腺癌。例如，乳腺癌可以表征为管腔上皮A型(ER+和/或PR+、HER2-、低Ki67)、管腔上皮B型(ER+和/或PR+、HER2+(或具有高Ki67的HER2-)、三阴性/基底样(ER-、PR-、HER2-)或HER2型(ER-、PR-、HER2+)。在另一个实例中，乳腺癌可能对比如烷化剂、铂剂、紫杉烷、长春花药剂、抗雌激素药物、芳香酶抑制剂、卵巢抑制剂、内分泌剂/激素剂、双膦酸盐治疗剂或靶向性生物治疗剂等治疗具有抗性。
原位小叶癌和原位导管癌是已经分别在小叶和导管中发展、但还没有扩散到乳房周围的脂肪组织或身体的其他区域的乳腺癌。浸润性(或侵入性)小叶和导管癌是分别在小叶和导管中发展、并且已经扩散到乳房的脂肪组织和/或身体的其他部分的癌症。在一个方面，本文提供了治疗乳腺癌(如乳腺中的导管组织中的导管癌，为Her2-和/或ER-和/或PR-的乳腺癌)的方法。受益于这些方法的治疗的其他乳腺癌是髓样癌、胶样癌、管状癌和炎性乳腺癌。
在一个实施方式中，根据TNM系统对乳腺癌进行分期。预后与分期结果密切相关，并且分期也用于在临床试验和临床实践中给患者分配治疗。
简而言之，分期信息如下：TX：无法评估原发肿瘤。T0：无肿瘤证据。Tis：原位癌，无侵入；T1：肿瘤为2cm或更小；T2：肿瘤超过2cm但不超过5cm；T3：肿瘤超过5cm；T4：长入胸壁或皮肤中的任何大小的肿瘤，或炎性乳腺癌。NX：无法评估附近的淋巴结N0：癌症尚未扩散到局部淋巴结。N1：癌症已扩散到1至3个上颌淋巴结或一个内乳淋巴结N2：癌症已扩散到4至9个上颌淋巴结或多个内乳淋巴结N3：适用于以下之一：癌症已扩散到10个或更多上颌淋巴结，或者癌症已扩散到锁骨(clavicle/collar bone)下方的淋巴结，或癌症已扩散到锁骨上方的淋巴结，或癌症累及上颌淋巴结并使内乳淋巴结增大，或癌症累及4个或更多个上颌淋巴结，以及少量癌症在前哨淋巴结活检中在内乳淋巴结中发现。MX：无法评估远处扩散(转移)的存在。M0：无远处扩散。M1：已经发生扩散到远处器官(不包括锁骨上淋巴结)。
在考虑组合疗法用于治疗乳腺癌的情况下，一种或更多种另外的治疗性治疗是手术、单克隆抗体(例如，Her-2抗体，赫赛汀)、辅助化疗如单药剂化疗或组合化疗(例如，基于蒽环霉素的和基于紫杉烷的多化疗法，紫杉醇，或在有或没有内分泌操作、有或没有PMRT下的靶特异性曲妥珠单抗，长春瑞滨)、阿霉素、环磷酰胺、卡培他滨(xeloda)、泰索帝(taxotere)、选择性雌激素受体调节剂如他莫昔芬和雷洛昔芬、变构性雌激素受体调节剂如曲洛司坦、辐射(例如，间质近距放射治疗、Mammosite设备、三维适形外照射和术中放疗)、抑制全身合成的芳香酶抑制剂(例如，阿那曲唑、依西美坦和来曲唑)、RNAi疗法、具有免疫抑制和抗增殖作用的雷帕霉素的静脉内类似物(如替西罗莫司(CCI779))或其任何组合。另外的治疗包括但不限于抗CTLA-4(YERVOY)，抗PD-1(OPDIVO、KEYTRUDA)，抗PDL1(BMS-936559、MPDL3280A)，其他正在开发的：由Medivation/CureTech公司开发的匹地利珠单抗(CT-011，抗PD-1)，由阿斯利康公司开发的MEDI4736(抗PD-L1)，以及由默克-索罗诺公司(Merck-Sorono)开发的阿维鲁单抗(MSB0010718C，抗PD-L1)。
在其他情况下，当考虑组合疗法用于治疗乳腺癌时，一种或更多种另外的治疗性治疗是免疫疗法，包括但不限于嵌合抗原受体(CAR)-重定向T细胞(CAR-T)细胞疗法或过继性T细胞疗法(ACT)。
卵巢癌
在本文所述的方法中，向患有卵巢癌的有需要的受试者施用治疗有效量的药物组合物，该药物组合物包含本文所述的抗体或其抗原结合片段。
根据病理学报告中获得的肿瘤组织学，对卵巢癌进行分类。表面上皮-间质瘤(也称为卵巢上皮癌)是最典型的卵巢癌类型。它包括浆液性肿瘤、子宫内膜样肿瘤和粘液性囊腺癌。性索-间质瘤(包括产生雌激素的颗粒细胞瘤和男性化的塞-菜二氏细胞瘤(Sertoli-Leydig cell tumor)或男性细胞瘤)占卵巢癌的8％。生殖细胞肿瘤占卵巢肿瘤的大约30％，但仅占卵巢癌的5％，因为大多数生殖细胞肿瘤是畸胎瘤，而大多数畸胎瘤是良性的。生殖细胞肿瘤往往发生在年轻女性和女孩身上。预后取决于生殖细胞肿瘤的特定组织学，但总体上是有利的。混合瘤含有多于一种以上肿瘤组织学类别的元素。
卵巢癌也可能是继发性癌症，该继发性癌症是身体其他部位的原发癌转移的结果。常见的原发癌是乳腺癌和胃肠癌(在这种情况下，卵巢癌是克鲁肯伯格癌(Krukenbergcancer))。表面上皮-间质瘤可以起源于腹膜(腹腔内壁)，在这种情况下卵巢癌继发于原发性腹膜癌，但治疗基本上与累及腹膜的原发表面上皮-间质瘤相同。
卵巢癌分期是根据FIGO分期系统并且使用手术后获得的信息进行的，所述手术可以包括经腹全子宫切除术、卵巢和输卵管两者的摘除、网膜切除术和用于细胞学检查的盆腔(腹膜)冲洗。AJCC期与FIGO期相同。
I期是指卵巢癌局限于一侧或两侧卵巢：IA-累及一侧卵巢；包膜完整；卵巢表面无肿瘤；腹水或腹膜冲洗液中无恶性细胞；IB-累及两侧卵巢；包膜完整；卵巢表面无肿瘤；阴性冲洗液；以及IC-肿瘤局限于卵巢，具有以下中任何一种：包膜破裂、卵巢表面有肿瘤、阳性冲洗液。
II期是指盆腔扩散或种植：IIA-扩散或种植到子宫或输卵管上；阴性冲洗液；IIB-扩散或种植到其他盆腔结构上；阴性冲洗液；以及IIC-盆腔扩散或种植，具有阳性腹膜冲洗液
III期是指显微镜下盆腔外腹膜种植；或局限于盆腔扩散至小肠或网膜：IIIA-显微镜下盆腔外腹膜转移；IIIB-肉眼可见盆腔外腹膜转移，大小小于2cm；以及IIIC-盆腔外的＞2cm的腹膜转移，或淋巴结转移
IV期是指远处转移到肝脏或腹膜腔外。
主动脉旁淋巴结转移被认为是局部淋巴结转移(IIIC期)。
在一些实施方式中，本文所述的方法治疗选自以下的卵巢癌：卵巢中的腺癌和从卵巢迁移到腹腔的腺癌。
在考虑组合疗法用于治疗卵巢癌的情况下，一种或更多种另外的治疗性治疗是手术、化疗(例如，多柔比星、阿霉素(doxil)、吉西他滨、鲁比替康和基于铂的化学治疗剂(如顺铂、卡铂和奥沙利铂))、美法仑、紫杉醇、拓扑异构酶I抑制剂(如拓扑替康和伊立替康)、基于紫杉烷的疗法、激素、放射疗法、全身低温、异黄酮衍生物(如Phenoxodial)、细胞毒性大环内酯(如埃博霉素)、血管生成抑制剂(如贝伐单抗)、信号转导抑制剂(如曲妥珠单抗)、基因疗法、RNAi疗法、免疫疗法、单克隆抗体、磷脂酰肌醇样激酶抑制剂(如雷帕霉素)或其任何组合。在一个实施方式中，该组合是抗G-CSF抗体或其抗原结合片段和阿霉素。在另一个实施方式中，该组合是抗G-CSF抗体或其抗原结合片段和拓扑替康。在又另一个实施方式中，该组合是抗G-CSF抗体或其抗原结合片段和VEGF受体抑制剂。VEGF受体抑制剂的非限制性实例包括贝伐单抗兰尼单抗阿柏西普(VEGF-Trap)、舒尼替尼索拉非尼阿西替尼、哌加那尼和帕唑帕尼。由于来自共同施用治疗的协同效应，本文所述的抗体和抗原结合片段与卵巢癌疗法的组合疗法还可以提供较低剂量的任一疗法或两者。另外的治疗包括但不限于抗CTLA-4(YERVOY)，抗PD-1(OPDIVO、KEYTRUDA)，抗PDL1(BMS-936559、MPDL3280A)，其他正在开发的：由Medivation/CureTech公司开发的匹地利珠单抗(CT-011，抗PD-1)，由阿斯利康公司开发的MEDI4736(抗PD-L1)，以及由默克-索罗诺公司开发的阿维鲁单抗(MSB0010718C，抗PD-L1)。
在其他情况下，当考虑组合疗法用于治疗卵巢癌时，一种或更多种另外的治疗性治疗是免疫疗法，包括但不限于嵌合抗原受体(CAR)-重定向T细胞(CAR-T)细胞疗法或过继性T细胞疗法(ACT)。
结肠癌或结肠直肠癌
在本文所述的方法中，向患有结肠癌的有需要的受试者施用治疗有效量的药物组合物，该药物组合物包含本文所述的抗体或其抗原结合片段。结肠直肠癌(也称为结肠癌或大肠癌)包括结肠、直肠(肛门)和阑尾的癌性生长。
可以使用杜克斯(Dukes)分类基于A-D期对结肠直肠癌进行分类。A期是指局限于粘膜的结肠直肠癌(即，没有侵入肠壁)。B1期是指扩散到固有肌层，但未穿透它(即淋巴结未被侵入)；而B2期癌症已穿入固有肌层，但未穿透它(即淋巴结未被侵入)。C1期是指癌症扩散到固有肌层，但未穿透它(即累及淋巴结)；而C2期是指癌症扩散到固有肌层并穿透它(即累及淋巴结)。D期是指远处转移性扩散。根据本领域已知的常规方法，TNM系统也可用于对结肠直肠癌进行分期。
当考虑组合疗法用于治疗结肠癌或结肠直肠癌时，一种或更多种另外的治疗性治疗是手术、放射疗法和化疗(例如，5-氟尿嘧啶、左旋咪唑、甲酰四氢叶酸或司莫司汀(甲基CCNU))、N-[2-(二甲基氨基)乙基]吖啶-4-甲酰胺和其他相关的羧酰胺抗癌药物；非拓扑异构酶II抑制剂、伊立替康、脂质体拓扑替康、紫杉烷类抗癌剂(例如，紫杉醇或多西紫杉醇)、呫吨酮乙酸类化合物(例如，5，6-二甲基咕吨酮-4-乙酸、PMAA)、昆布多糖、位点选择性环状AMP类似物(例如，8-氯腺苷3′，5′-环磷酸酯)、环氧合酶-2的吡喃并吲哚抑制剂、环氧合酶-2的咔唑抑制剂、环氧合酶-2的四氢咔唑抑制剂、环氧合酶-2的茚抑制剂、NSAIDS的局部抑制剂(例如，邻氨基苯甲酸、阿司匹林(5-乙酰水杨酸)、偶氮二钠(azodisal sodium)、碳杂环酸、卡洛芬、苯丁酸氮芥、双氯芬酸(diclophenac)、芬布芬(fenbufen)、芬氯酸(fenclofenac)、非诺洛芬(fenoprofen)、氟芬那酸(flufenamic acid)、氟比洛芬(flurbiprofen)、氟洛芬(fluprofen)、呋塞米(furosemide)、硫代苹果酸金钠(goldsodium thiomalate)、布洛芬、吲哚美辛、吲哚洛芬、酮洛芬、氯那唑酸(lonazolac)、氯索洛芬(loxoprofen)、甲氯芬那酸、甲芬那酸、美法仑、萘普生、青霉胺、苯乙酸、丙酸、水杨酸、柳氮磺胺吡啶(salazosulfapyridine)、舒林酸(sulindac)、托美丁(tolmetin)、吡唑啉酮丁氮酮丙氮酮NSAID(pyrazolonebutazonepropazoneNSAID)、美洛昔康(meloxicam)、昔康(oxicams)、吡罗昔康(piroxicam)、费啶(feldene)、吡罗昔康β环糊精、替诺昔康(tenoxicam)、依托度酸(etodolac)和奥沙普秦(oxaprozin))、HER-2/neu的抑制剂、RNAi疗法、GM-CSF、单克隆抗体(例如，抗Her-2/neu抗体、抗CEA抗体、A33(HB 8779)、100-210(HB11764)和100-310(HB 11028))、爱必妥(erbitux)、维克替比(vectibix)、激素疗法、嘧啶胺、喜树碱衍生物(例如，CPT-11)、亚叶酸(FA)、吉西他滨、Ara-C、基于铂的化学治疗剂(如顺铂、卡铂和奥沙利铂)、cGMP特异性磷酸二酯酶抑制剂或其任何组合。另外的治疗包括但不限于抗CTLA-4(YERVOY)，抗PD-1(OPDIVO、KEYTRUDA)，抗PDL1(BMS-936559、MPDL3280A)，其他正在开发的：由Medivation/CureTech公司开发的匹地利珠单抗(CT-011，抗PD-1)，由阿斯利康公司开发的MEDI4736(抗PD-L1)，以及由默克-索罗诺公司开发的阿维鲁单抗(MSB0010718C，抗PD-L1)。
在其他情况下，当考虑组合疗法用于治疗结肠癌时，一种或更多种另外的治疗性治疗是免疫疗法，包括但不限于嵌合抗原受体(CAR)-重定向T细胞(CAR-T)细胞疗法或过继性T细胞疗法(ACT)。
胰腺癌
在本文所述的方法中，向患有胰腺癌的有需要的受试者施用治疗有效量的药物组合物，该药物组合物包含本文所述的抗体或其抗原结合片段。
通过本文所述的方法治疗的胰腺癌包括但不限于胰管组织中的上皮癌和胰管中的腺癌。胰腺癌的最常见类型是腺癌，其发生在胰管的内壁。
在考虑组合疗法用于治疗胰腺癌的情况下，一种或更多种另外的治疗性治疗是手术、放射疗法(RT)、氟尿嘧啶(5-FU)和RT、全身治疗、支架术(stenting)、吉西他滨吉西他滨和RT、西妥昔单抗、埃罗替尼放化疗、贝伐单抗或其任何组合。在又另一个实施方式中，该组合是抗G-CSF抗体或其抗原结合片段和VEGF受体抑制剂。VEGF受体抑制剂的非限制性实例包括贝伐单抗兰尼单抗阿柏西普(VEGF-Trap)、舒尼替尼索拉非尼阿西替尼、哌加那尼和帕唑帕尼。另外的治疗包括但不限于抗CTLA-4(YERVOY)，抗PD-1(OPDIVO、KEYTRUDA)，抗PDL1(BMS-936559、MPDL3280A)，其他正在开发的：由Medivation/CureTech公司开发的匹地利珠单抗(CT-011，抗PD-1)，由阿斯利康公司开发的MEDI4736(抗PD-L1)，以及由默克-索罗诺公司开发的阿维鲁单抗(MSB0010718C，抗PD-L1)。
在其他情况下，当考虑组合疗法用于治疗胰腺癌时，一种或更多种另外的治疗性治疗是免疫疗法，包括但不限于嵌合抗原受体(CAR)-重定向T细胞(CAR-T)细胞疗法或过继性T细胞疗法(ACT)。
脑癌
在本文所述的方法中，向患有脑癌的有需要的受试者施用治疗有效量的药物组合物，该药物组合物包含本文所述的抗体或其抗原结合片段。
还可以修饰本文所述的抗体或其抗原结合片段，使得它们能够穿过血脑屏障。对本文所述的抗体或抗原结合片段的这种修饰允许治疗脑疾病，如多形性胶质母细胞瘤(GBM)。允许蛋白质(如抗体或抗原结合片段)穿过血脑屏障的示例性修饰描述于美国专利申请公开2007/0082380(关于修饰穿过血脑屏障的抗体，将其通过引用特此并入)中。
使用本文所述的方法治疗的原发性脑肿瘤包括但不限于脑膜瘤、星形细胞瘤(如胶质母细胞瘤，例如多形性胶质母细胞瘤(GBM))，以及恶性髓母细胞瘤。诊断通常通过医学检查以及计算机断层扫描或磁共振成像进行。可以通过活检确认诊断。基于研究结果，肿瘤被分为不同严重等级。
在考虑组合疗法用于治疗脑癌的情况下，治疗还可包括手术、放射疗法、化疗和/或抗惊厥药物。地塞米松和呋塞米可用于减少肿瘤周围的肿胀。另外的治疗包括但不限于抗CTLA-4(YERVOY)，抗PD-1(OPDIVO、KEYTRUDA)，抗PDL1(BMS-936559、MPDL3280A)，其他正在开发的：由Medivation/CureTech公司开发的匹地利珠单抗(CT-011，抗PD-1)，由阿斯利康公司开发的MEDI4736(抗PD-L1)，以及由默克-索罗诺公司开发的阿维鲁单抗(MSB0010718C.抗PD-L1)。
在其他情况下，当考虑组合疗法用于治疗脑癌时，一种或更多种另外的治疗性治疗是免疫疗法，包括但不限于嵌合抗原受体(CAR)-重定向T细胞(CAR-T)细胞疗法或过继性T细胞疗法(ACT)。
皮肤癌
在本文所述的方法中，向患有皮肤癌的有需要的受试者施用治疗有效量的药物组合物，该药物组合物包含本文所述的抗体或其抗原结合片段。
皮肤癌有三种主要类型：基底细胞皮肤癌(BCC)、鳞状细胞皮肤癌(SCC)和黑色素瘤。
黑色素瘤是黑素细胞的恶性肿瘤，其主要在皮肤中发现，但也在肠和眼(葡萄膜黑色素瘤)中发现。它是罕见的皮肤癌类型之一，但导致大多数的皮肤癌相关的死亡。恶性黑色素瘤是由称为黑素细胞的色素细胞不受控制的生长引起的严重类型的皮肤癌。黑色素瘤还包括但不限于脉络膜黑色素瘤、恶性黑色素瘤、皮肤黑色素瘤和眼黑色素瘤。
黑色素瘤可分为以下类型：恶性雀斑样痣、恶性雀斑样痣黑色素瘤、表面扩散黑色素瘤、肢端雀斑黑色素瘤、粘膜黑色素瘤、结节性黑色素瘤、息肉样黑色素瘤、促结缔织增生性黑色素瘤、无黑色素的黑色素瘤、软组织黑色素瘤和葡萄膜黑色素瘤。
在考虑组合疗法用于治疗皮肤癌的情况下，一种或更多种另外的治疗包括但不限于手术、化疗、(体外束放疗或近距放射治疗)、局部化疗(咪喹莫特或5-氟尿嘧啶)、冷冻疗法(冻坏癌症)、靶向疗法、光动力疗法、局部化疗、电干燥法、刮除术或其组合。在疾病已经扩散到身体其他部位的受试者中，可以使用姑息护理来改善生活质量。另外的治疗包括但不限于抗CTLA-4(YERVOY)，抗PD-1(OPDIVO、KEYTRUDA)，抗PDL1(BMS-936559、MPDL3280A)，其他正在开发的：由Medivation/CureTech公司开发的匹地利珠单抗(CT-011，抗PD-1)，由阿斯利康公司开发的MEDI4736(抗PD-L1)，以及由默克-索罗诺公司开发的阿维鲁单抗(MSB0010718C，抗PD-L1)。
在其他情况下，当考虑组合疗法用于治疗皮肤癌时，一种或更多种另外的治疗性治疗是免疫疗法，包括但不限于嵌合抗原受体(CAR)-重定向T细胞(CAR-T)细胞疗法或过继性T细胞疗法(ACT)。
关节炎
在本文所述的方法中，向患有关节炎(包括抗体介导的炎性关节炎，如类风湿性关节炎)的有需要的受试者施用治疗有效量的药物组合物，该药物组合物包含本文所述的抗G-CSF抗体或其抗原结合片段。
最近的文献和出版物(如Lee等人，2017，J.Immunol[免疫学杂志]，198：3565-35758；Campbell等人，2016，J.Immunol.[免疫学杂志]，197：4392-4402和加拿大专利申请号2496485)表明使用抗体(如抗G-CSF抗体)阻断G-CSF/G-CSF受体信号传导可以治疗炎性关节炎(包括减轻疼痛和改善预后)。
关节炎的治疗包括淤滞、部分或完全消除疼痛和/或炎症。治疗还包括改善受试者的整体功能。
在本领域中良好建立了关节炎的诊断或评估。可以基于主观测量(如患者对症状的表征)来进行评估。还可以基于客观测量(比如，成像、测试血液或组织样品的一种或更多种关节炎生物标志物(如类风湿因子和抗瓜氨酸化蛋白抗体))来进行评估。评估还可包括抗环瓜氨酸肽ELISA。
可以通过本领域熟知的方法评估治疗功效。
当考虑组合疗法用于治疗炎性疾病(如关节炎)时，可以将抗G-CSF抗体或其抗原结合片段与用于治疗关节炎的、本领域技术人员已知的其他抗炎剂或药物(包括止痛药)组合。
试剂盒
本文还提供了用于本发明方法中的试剂盒。试剂盒可包括一个或多个容器，这些容器包含本文所述的抗G-CSF抗体和根据本文所述任何方法使用的说明书。通常，这些说明书包含对根据本文所述的任何方法施用抗G-CSF抗体来治疗癌症的描述。基于鉴定受试者是否具有癌症症状或受试者是否患有癌症但无症状，试剂盒可以进一步包含对选择适合于治疗的个体的描述。在仍其他实施方式中，说明书包含对向有需要的受试者施用抗G-CSF抗体的描述。
关于抗G-CSF抗体的使用的说明书通常包括关于预期治疗的剂量、给药方案和施用途径的信息。这些容器可以是单位剂量、散装包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。本发明的试剂盒中提供的说明书通常是在标签或包装说明书(例如，包括在试剂盒中的纸张)上的书面说明书，但机器可读式说明书(例如，磁盘或光盘存储盘上携带的说明书)也是可以接受的。
标签或包装说明书表明该组合物用于治疗癌症。可以提供用于实践本文所述的任何方法的说明书。
能以合适的包装提供试剂盒。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶子、广口瓶、软包装(例如，密封的聚酯薄膜(Mylar)或塑料袋)等。还考虑了与特定设备(如吸入器、鼻腔施用设备(例如喷雾器)或输注设备(如微型泵))联用的包装。试剂盒可以具有无菌进入口(例如，该容器可以是具有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。容器也可以具有无菌进入口(例如，该容器可以是具有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本文所述的抗G-CSF抗体。容器可进一步包含第二药物活性剂。
试剂盒可以任选地提供另外的组分(如缓冲液)和解释信息。通常，试剂盒包含容器以及在容器上或与容器相关的标签或包装说明书。
实施例
通过参考以下非限制性实施例可以更好地理解本申请，这些实施例作为本申请的示例性实施方式提供。提供以下实施例是为了更全面地说明实施方式，但决不应将其解释为限制本申请的广泛范围。
实施例1：制备抗G-CSF抗体的方法
抗G-CSF抗体由免疫精确抗体有限公司(ImmunoPrecise Antibodies Ltd.)(不列颠哥伦比亚省维多利亚市(Victoria，BC))使用其专有的快速引发(Rapid Prime)技术产生。
用重组人G-CSF(金斯瑞公司)免疫小鼠。在免疫和引发程序后，将脾细胞与SP2/0骨髓瘤融合并筛选产生抗体的细胞。
实施例2：筛选抗G-CSF抗体与G-CSF的结合的方法
在免疫精确抗体有限公司，使用直接ELISA，在用碳酸盐缓冲液中的人G-CSF(金斯瑞公司)以0.1μg/孔涂覆的板上测试通过实施例1的方法产生的抗G-CSF抗体的结合。测试来自928个杂交瘤克隆的上清液，并选择具有最强信号(吸光度＞0.200)的180个克隆用于进一步测试。通过针对人G-CSF和非特异性蛋白(人转铁蛋白)的直接ELISA进一步测试这180个克隆。发现87个克隆特异性结合人G-CSF而不结合转铁蛋白。
实施例3：中和测定
一旦鉴定出抗体与人G-CSF特异性结合，就首先在以下2种测定中测试这些抗体的中和能力：(1)抑制G-CSF依赖性细胞系(NFS-60)的增殖和(2)抑制在FLT3L+G-CSF中培养的小鼠骨髓细胞的增殖。
抑制GCSF依赖性细胞系(NFS60)的增殖
在0.125ng/mL人G-CSF(金斯瑞公司)存在下，将2.5×103个NFS-60细胞在完全DMEM或RPMI培养基中培养。将来自87个抗人G-CSF抗体克隆的上清液(抗体上清液的1/5稀释液)添加到孔中并在37℃培养7天(5％CO2)。将有和没有G-CSF的孔作为阴性和阳性对照。
使用在第7天计数细胞。若干个克隆表明NFS-60细胞计数减少到接近在没有G-CSF的情况下生长的NFS-60细胞的水平，这表明那些克隆中和G-CSF活性。
图1.在来自多种抗G-CSF克隆的上清液(1/5稀释液)存在下，在G-CSF中培养的NFS-60细胞的板布局和细胞计数。每个克隆以单个重复进行测试，但将该测定重复3次。
抑制在FLT3L+G-CSF中培养的小鼠骨髓细胞的增殖
在来自抗G-CSF克隆的上清液(上清液的1/5稀释液)存在下，用重组FLT3L(200ng/mL)+人G-CSF(0.125ng/mL)培养小鼠骨髓细胞[106个细胞/mL]9天。在第9天，目测检查孔中骨髓细胞增殖的改变。由于在G-CSF存在下在Flt3L中培养的骨髓细胞显示细胞数增加3-4倍，预期任何中和G-CSF的抗体都会引起培养中的细胞的数量减少。将用和不用G-CSF培养的细胞用作阴性和阳性对照。
在第9天目测检查细胞，并且注意到细胞数减少的孔含有潜在中和抗体。将此测定重复两次，并将结果与NFS-60测定的结果组合以产生用于进一步测试的中和克隆的候选清单。
测试中和克隆的候选名单
用FLT3L-DC筛选和NFS-60筛选两者鉴定的中和抗体是：1B11、1C7、2F6、3A3、3B2、3B3、3G5、9B7、10B9、1A1、3G10、6F5、7H6、10G1、6F3、7F8和8H12。这些抗体基于初始筛选板(1-10)和来自上述实施例2的对应孔标识符(A-H；1-12)来命名。例如，克隆1B11对应于板#1孔B11中的克隆。
以一式三份测试克隆1B11、1C7、2F6、3A3、3B2、3B3、3G5、9B7、10B9、1A1、3G10、6F5、7H6、10G1、6F3、7F8和8H12中和用0.125ng/mL或0.625ng/mL人G-CSF培养的NFS-60细胞的增殖的能力。
图2显示了使用0.125ng/mL的人G-CSF，抗体的中和活性。在此研究中，克隆1B11、1C7、2F6、3A3、3B2、3B3、3G5、9B7、10B9和10G1均显著降低NFS60细胞的增殖。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
图3表明克隆1B11、3A3、3B2、3B3、1C7、3G5和10B9中和高浓度的人G-CSF(0.625ng/mL)。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
抗体1B11、1C7、2F6、3A3、3B2、3B3、3G5、9B7、10B9和10G1被鉴定为抑制人G-CSF依赖性NFS-60增殖。(图2和3)。在较高浓度的G-CSF(0.625ng/mL)存在下，克隆1B11、3A3、3B2和3B3最显著地减少NFS-60增殖。
抗人G-CSF克隆对小鼠G-CSF的最小活性
以一式三份重新测试克隆1B11、1C7、2F6、3A3、3B2、3B3、3G5、9B7、10B9、1A1、3G10、6F5、7H6、10G1、6F3、7F8和8H12中和用0.125ng/mL人或小鼠G-CSF培养的NFS-60细胞的增殖，以测试交叉反应性。
图4显示许多中和人G-CSF诱导的增殖的克隆(左图)对小鼠G-CSF具有很小活性或没有活性(右图)。尽管一些克隆似乎确实中和了小鼠G-CSF，但与使用人G-CSF所见的活性(左图)相比，NFS-60细胞增殖的减少是微不足道的。
实施例4：亚克隆和中和活性
基于中和克隆对人G-CSF的高度显著的中和作用，选择九个中和克隆：2F6、3G5、10B9、9B7、10G1、1B11、3A3、3B2和3B3用于进一步开发和亚克隆(图3和4)。
由免疫精确抗体有限公司进行亚克隆，并递送产生每个克隆的亚克隆的两个高度稳定抗体。
亚克隆的G-CSF中和活性
使用NFS-60测定，测试亚克隆(2F6.1和2F6.2、3G5.1和3G5.2、10B9.1和10B9.2、9B7.1和9B7.2、10G1.1和10G1.2、1B11.2和3B3.2)中和未糖基化的人G-CSF(大肠杆菌产生，金斯瑞公司)或糖基化的人G-CSF(CHO产生，金斯瑞公司)的能力。
图5显示所有亚克隆可以中和糖基化的或未糖基化的人G-CSF的生物活性。
在0.125ng/mL未糖基化的(左图；图5A)或糖基化的(右图；图5B)人G-CSF(金斯瑞公司)存在下，在20％抗G-CSF抗体上清液(克隆2F6.1和2F6.2、3G5.1和3G5.2、10B9.1和10B9.2、9B7.1和9B7.2、10G1.1和10G1.2)或10μg/mL的纯化抗体(克隆1B11.2和3B3.2)存在下，将2.5×103个NFS-60细胞在完全DMEM或RPMI培养基中培养6天。在第6天，使用计数细胞，并与存在G-CSF(阳性对照)或不存在G-CSF(阴性对照)下生长的NFS-60细胞进行比较。
基于它们一致的中和人G-CSF生物活性的能力，选择亚克隆(1B11.2、3A3.2、3B2.2和3B3.2)作为主要候选物，并测试了它们以剂量依赖性方式中和G-CSF诱导的NFS-60细胞增殖的能力。
图6显示1B11.2(图6A)、3A3.2(图6B)、3B2.2(图6C)和3B3.2(图6D)均以剂量依赖性方式中和人G-CSF的生物活性。
在人G-CSF(0.125ng/mL)和来自亚克隆的各种浓度的上清液存在下，将2.5×103个NFS-60细胞在完全DMEM或RPMI培养基中培养。所有测试均以一式三份进行，并且数据代表平均值+/-SD。
实施例5：序列
通过金斯瑞公司测序克隆1B11、3A3、3B2和3B3。从冷冻的杂交瘤细胞中提取总RNA，并由RNA合成cDNA。然后进行PCR以扩增抗体的可变区(重链和轻链)，然后将可变区分别克隆到标准克隆载体中并测序。
发现克隆1B11和3A3具有相同的序列并被确定为同一抗体。
发现克隆3B2和3B3具有相同的序列并被确定为同一抗体。
序列表
1B11
重链：氨基酸序列(138AA)
1B1 VH CDR1(SEQ ID NO：1)IYTMH
1B1 VH CDR2(SEQ ID NO：2)YINPSIGYANYNQKFRD
1B1 VH CDR3(SEQ ID NO：3)GGYGDSLFAY
轻链：氨基酸序列(132AA)
1B1 VL CDR1(SEQ ID NO：4)RSSKSLLHSNGITYLY
1B1 VL CDR2(SEQ ID NO：5)QMSNLAS
1B1 VL CDR3(SEQ ID NO：6)AQNLELPYT
1B11 VH(SEQ ID NO：7)
QVHLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFPIYTMHWIKQRPGQGLEWIGYINPSIGYANYNQKFRDKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGGYGDSLFAYWGQGTLVTVSA
1B11 VL(SEQ ID NO：8)
DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKLEIK
3B3
重链：氨基酸序列(137AA)
3B3 VH CDR1(SEQ ID NO：9)PYTMH
3B3 VH CDR2(SEQ ID NO：10)YINPSINYTNYNQKFKD
3B3 VH CDR3(SEQ ID NO：11)RGSYGNFDY
轻链：氨基酸序列(132AA)
3B3 VL CDR1(SEQ ID NO：12)RSNKSLLHSNGITYLY
3B3 VL CDR1(SEQ ID NO：13)QMSNLAS
3B3 VL CDR1(SEQ ID NO：14)AQNLELPLT
3B3 VH(SEQ ID NO：15)
QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTPYTMHWVKQRPGQDLEWIGYINPSINYTNYNQKFKDKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARRGSYGNFDYWGQGTTLTVSS
3B3 VL(SEQ ID NO：16)
DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSNKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPLTFGAGTKLELK
1B11核酸序列
1B11可变重链：(SEQ ID NO：17)
CAGGTCCACCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGCAAGACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTCCTATCTACACGATGCACTGGATAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAGCATTGGTTATGCTAATTACAATCAGAAGTTCAGGGACAAGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGAGGGGGGTATGGTGACTCCCTCTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
1B11可变轻链：(SEQ ID NO：18)
GATATTGTGATGACGCAGGCTGCATTCTCCAATCCAGTCACTCTTGGAACATCAGCTTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTACATAGTAATGGCATCACTTATTTGTATTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATTTATCAGATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTAGCAGTGGGTCAGGAACTGATTTCACACTGAGAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTTATTACTGTGCTCAAAATCTAGAACTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
3B3核酸序列
3B3可变重链：(SEQ ID NO：19)
CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGCAAGACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACTCCCTACACGATGCACTGGGTGAAACAGAGGCCTGGACAGGATCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAGCATTAATTATACTAATTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTATATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTTCTGTGCAAGAAGAGGGTCTTATGGTAACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
3B3可变轻链：(SEQ ID NO：20)
GATATTGTGATGACGCAGGCTGCATTCTCCAATCCAGTCACTCTTGGAACATCAGCTTCCATCTCCTGCAGGTCTAATAAGAGTCTCCTACATAGTAATGGCATCACTTATTTGTATTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATTTATCAGATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTAGCAGTGGGTCAGGAACTGATTTCACACTGAGAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTTATTACTGTGCTCAAAATCTAGAACTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
SEQ ID NO：21His-His-His-His-His-His
SEQ ID NO：22(GGGGS)3
实施例6：3B3和1B11的中和活性的比较
在人G-CSF(0.125ng/mL)和各种浓度的纯化抗体存在下，将2.5×103个NFS-60细胞在完全DMEM或RPMI培养基中培养6天。在第6天，使用计数NFS-60细胞。每种抗体浓度以一式三份进行，并且数据代表平均值+/-SD。
图7是剂量响应曲线，该曲线显示在各种浓度的中和抗体存在下，相对于人G-CSF(0.125ng/mL)，NFS-60细胞的增殖。发现克隆3B3在中和G-CSF的生物活性方面比克隆1B11更有效约2-3倍，如图7所示。
在0.125ng/mL人G-CSF存在下，在各种稀释度的纯化的抗G-CSF抗体克隆1B11或3B3存在下，将2.5×103个NFS-60细胞在完全DMEM或RPMI培养基中培养6天。在第6天，使用计数细胞。数据显示针对每种抗体浓度的平均值+/-SD。
实施例7：抗G-CSF抗体克隆的亲和力
通过SPR测量克隆2F6、1B11、3G5、10B9、9B7、10G1和3B3的亲和力。这项工作是在加拿大国家研究委员会(National Research Council of Canada)(魁北克省蒙特利尔(Montreal，Quebec))进行的。
在抗小鼠Fc抗体上捕获2.5％上清液(除变体1B11.2和10B9.1.2使用4％以外)，与30、10、3.33、1.11和0.37nM浓度系列的人G-CSF和空白缓冲液流动。使用BioRadProteOnTM仪器测量缔合(ka)和解离(kd)速率。亲和力(KD)计算为ka/kd。
表1显示了多种抗G-CSF克隆的亲和力。
克隆的亲和力范围从1.5×10-9M(3G5)降至6.4×10-11M(1B11)。克隆1B11是最高亲和力克隆(64pM)，并且克隆3B3(310pM)表现出最佳结合动力学。
实施例8：抗G-CSF抗体克隆1B11和3B3逆转人G-CSF对树突细胞发育的负作用
图8显示抗G-CSF克隆1B11和3B3可以逆转乳腺肿瘤衍生的G-CSF对FLT3L诱导的树突细胞的体外发育的作用。
将小鼠G-CSF的基因从自然产生小鼠G-CSF的小鼠乳腺肿瘤细胞系NOP12敲除。随后在CMV启动子下，用编码人G-CSF的质粒(义翘神州科技公司(SinoBiological))转染NOP12细胞。使用潮霉素抗性，选择用于稳定整合质粒的细胞。将来自NOP12人G-CSF(NOP12hGCSF)克隆的培养基以各种浓度添加至含有106个细胞/mL和FLT3L(200ng/mL)的骨髓培养物中。以10μg/mL添加抗G-CSF抗体1B11或3B3。收获培养物并在第10天计数，然后针对MHC II类和CD11c进行FACS分析。
图8A显示了培养物的细胞计数，并表明在没有任何阻断抗体的情况下，添加来自NOP12hGCSF细胞的上清液增加培养物中的细胞计数。添加1B11或3B3显著降低NOP12hGCSF上清液的作用。此外，中和克隆1B11和3B3也增加培养物中成熟树突细胞的频率，所述频率是通过CD11c+MHC II+细胞的增加的频率测量的(图8B)。
总之，结果表明中和G-CSF抗体可以克服肿瘤衍生的G-CSF对FLT3L诱导的树突细胞发育的作用。
除了研究肿瘤衍生的G-CSF对FLT3L诱导的树突细胞培养物的作用之外，我们还研究它是否对GM-CSF诱导的DC培养物有任何作用。
图9显示用克隆1B11或3B3阻断G-CSF可以克服来自NOP12hGCSF细胞的G-CSF对GM-CSF诱导的树突细胞发育的作用，所述作用是通过细胞上的MHC II类表达测量的。
图9.将骨髓细胞(2×105个细胞/mL)置于非TC处理的培养皿(10mL)或24孔超低附着板(1mL)中，该培养皿或附着板具有来自用G-CSF转染的293T细胞的上清液(1/1000)。在培养开始时添加来自NOP12Hgcsf细胞的上清液(1％或5％)，同时还添加针对人G-CSF的抗体(1B11或3B3)(10μg/mL)。在第3天，向培养物中添加一半体积的新鲜培养基。在第6天，去除一半体积的培养基并添加一半体积的新鲜培养基。在第8天，去除一半体积的培养基并添加一半体积的新鲜培养基。在第9天或第10天收获细胞并染色用于FACS分析。
实施例9：抗G-CSF抗体克隆1B11和3B3阻断人嗜中性粒细胞中G-CSF诱导的STAT3活化
图10显示抗G-CSF克隆1B11和3B3在纯化的人嗜中性粒细胞中都阻断响应于G-CSF刺激的STAT3活化。
抗G-CSF克隆1B11和3B3阻断原代人嗜中性粒细胞中的G-CSF信号传导。将各种浓度的人G-CSF(金斯瑞公司)与10μg/mL纯化的抗体克隆1B11、3B3或同种型对照一起预温育。30分钟后，将G-CSF/抗体混合物添加到每孔含有5×105个纯化的人嗜中性粒细胞的板中。将板温育20分钟，之后立即固定细胞并根据制造商的方案(BD生物科学公司)染色细胞内磷酸化的Stat3(P-Tyr 705)。没有细胞因子和没有抗体培养的嗜中性粒细胞分别充当阴性和阳性对照。根据[MFI(平均荧光强度)实验样品]/[阳性对照的MFI]×100％，计算每个样品的最大Stat3磷酸化的百分比。3B3(底组圆圈)；1B11(中间组圆圈)和同种型对照(顶部组圆圈)。
实施例10：对体内肿瘤G-CSF生产的中和降低MDSC的频率和T细胞抑制能力。
图11显示抗G-CSF克隆1B11和3B3在表达人G-CSF的MC38肿瘤接种的小鼠脾中降低MDSC的频率和T细胞抑制活性。
用工程化以表达人G-CSF的1×106个MC38结肠癌细胞接种C57Bl/6小鼠。7天后，每周用200μg抗GCSF克隆1B11或3B3或同种型对照抗体治疗动物3次。A)在第25天，对动物实施安乐死并取出脾，并通过流式细胞术分析CD11b+Ly6G+细胞(MDSC)的存在。B)将来自荷瘤小鼠的脾用作抑制细胞(MDSC)的来源，并将其以各种比例添加到用增殖染料标记的OT-I TCR转基因脾细胞中。将全OVA(200μg/mL)添加至培养物中，作为抗原的来源。OT-I细胞还在IFN-γ启动子的控制下表达YFP，该YFP允许基于YFP表达检测IFN-γ产生。在第4天，用PMA(50ng/mL)刺激细胞，并通过流式细胞术分析增殖和IFN-γ产生。将在不存在MDSC的情况下单独用OVA培养的OT-I脾细胞和用缺乏MDSC的非荷瘤脾细胞培养的OT-I脾细胞(无肿瘤组)作为阳性对照。将在不存在OVA的情况下培养的OT-I脾细胞用作阴性对照。左上方的数字代表已经历至少一次分裂并且能够产生IFN-γ的OT-IT细胞。在10：1的肿瘤脾细胞与OT-I脾细胞比率下，存在对OT-I增殖的明显抑制。与同种型对照处理组相比，来自1B11和3B3治疗的小鼠的脾细胞抑制OT-I增殖的能力降低。
实施例11：人源化1B11抗G-CSF抗体的产生
使用克隆1B11的重链和轻链多肽序列，通过以下可变轻链和可变重链序列以及相关恒定结构域的组合产生嵌合、杂合和人源化抗体：
1B11嵌合轻链(cL)：(SEQ ID NO：23)
DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKLEIK
1B11嵌合重链(cH)：(SEQ ID NO：24)
QVHLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFPIYTMHWIKQRPGQGLEWIGYINPSIGYANYNQKFRDKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGGYGDSLFAYWGOGTLVTVSA
1B11人源化轻链1(h1L)(SEQ ID NO：25)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIK
1B11人源化轻链2(h2L)(SEQ ID NO：26)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIK
1B11人源化重链1(h1H)：(SEQ ID NO：27)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFPIYTMHWVRQAPGQGLEWMGYINPSIGYANYNQKFRDRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYGDSLFAYWGQGTLVTVSS
1B11人源化重链2(h2H)：(SEQ ID NO：28)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFPIYTMHWIRQAPGQGLEWIGYINPSIGYANYNQKFRDRATLTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYGDSLFAYWGQGTLVTVSS
1B11人源化重链3(h3H)：(SEQ ID NO：29)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFPIYTMHWIKQAPGQGLEWIGYINPSIGYANYNQKFRDRATLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYGDSLFAYWGQGTLVTVSS
1B11人源化重链4(h4H)：(SEQ ID NO：30)
QVHLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFPIYTMHWIKQAPGQGLEWIGYINPSIGYANYNQKFRDKATLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYGDSLFAYWGQGTLVTVSS
总共产生了15个具有以下重链和轻链的组合的克隆：
用无血清培养基中的表达质粒转染CHO-3E7，以产生上文鉴定的每种1B11抗体变体。使用极性优势高效液相色谱(pAHPLC)和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)比较抗体的相对表达水平。
将使用亲和色谱纯化的1B11抗体变体进一步通过尺寸排阻色谱进行纯化。然后使纯化的抗G-CSF抗体进行表面等离子共振(SPR)分析和热稳定性测量。
SPR分析使用间接捕获方法，该方法涉及将纯化的1B11抗体变体和对照捕获到合适的抗Fc SPR表面上，并在捕获的抗体顶部使一系列浓度的抗原流动，并且缓冲液空白用于参考。该间接捕获方法确保简单的朗缪尔(Langmuir)结合，以允许确定每种1B11抗体变体的结合动力学和亲和力。
还对1B11抗体嵌合变体和人源化变体进行差示扫描量热法(DSC)以评估它们的热稳定性。DSC是本领域技术人员已知的分析技术(参见Durowoju等人，J.Vis.Exp.[可视化实验杂志]2017；(121)：55262)。DSC测量作为温度的函数的、样品的摩尔热容量。对于多肽，DSC谱提供了关于热稳定性的信息，并且在一些程度上提供了可用于评估结构构象的结构“指纹”。DSC涉及使用差示扫描量热计，其测量热转变温度(熔融温度；Tm)和破坏使多肽的三级结构稳定的相互作用所需的能量(焓；ΔH)。在配制剂以及生产批次之间进行比较，并且所得值的差异表明热稳定性和结构构象的差异。
图12显示了来自克隆1、7、8、9、10、12、13、14和15的抗G-CSF抗体变体的结合特征，其中Koff值范围为1.0-1.7(10-4×s-1)并且这些变体抗体的热稳定性范围从71℃至85℃。图12还显示了V-FR的人源化百分比，其范围从82.1％至100％。变体7抗G-CSF抗体是1B11IgG1的100％人源化形式，并且变体12抗G-CSF抗体具有保留在1B11亲本抗体的CDR支持区域中的单个小鼠残基。
图12说明变体12抗体具有200pM亲和力和1.1×10-4×s-1的Koff率，并且该抗体是热稳定的(例如，具有比曲妥珠单抗(赫赛汀)更高的Tm2和Tm3)。赫赛汀具有68℃的Tm1和80℃的Tm2，而变体12具有71℃的Tm1和82℃的Tm2。来自图12的数据还表明，当产生变体12抗G-CSF抗体时，不形成聚集体。
实施例12：人源化1B11抗体的中和分析。
对所有15种1B11变体抗体进行中和测定。将结果与亲本1B11抗体进行比较。将BaF3-hGCSFR细胞与10ng/mL hG-CSF和10μg/mL人源化1B11抗体一起温育15分钟。随后将细胞固定，透化，并根据制造商的说明用抗磷酸化STAT3抗体(生命科技公司(LifeTechnologies))染色。然后经由流式细胞仪收集样品，并使用Flowjo软件分析STAT3水平。
图13显示了阻断体外G-CSF依赖性STAT3信号传导的1B11的所有15种变体。在图13所示的流式图中，灰色阴影指示没有治疗对照；蓝线指示仅用hG-CSF治疗；红线指示用人源化1B11抗体治疗。
实施例13：通过变体7和变体12人源化1B11抗体中和NFS-60细胞的生长。
使用亲本1B11抗体作为对照，使用NFS-60(对hG-CSF有响应)细胞来测试变体7和变体12人源化1B11抗体的中和能力。
使NFS60细胞在具有0.125ng/mL hG-CSF以及不同浓度(μg/mL)的变体7和变体12人源化1B11抗体或亲本1B11抗体的培养基中生长。6天后，收集细胞、洗涤并与固定数量的计数珠混合。随后，在流式细胞仪上分析样品，并基于计数珠与NFS60细胞的比率确定细胞计数。
图14是显示具有0.01、0.3、0.1、0.3、1和3μg/mL 1B11抗体的培养基的细胞计数的条形图。将未经治疗和仅用hG-CSF治疗的细胞用作对照。图14表明亲本1B11抗体以及变体7和变体12人源化1B11抗体均以剂量依赖性方式中和NFS60细胞的G-CSF依赖性生长。
实施例14：变体7和变体12人源化1B11抗体的中和测定。
对变体7和变体12人源化1B11抗体进行中和测定。将结果与亲本1B11抗体进行比较。
对于第一组实验(在图15中的流式图的前三行中显示)，将10ng/mL hG-CSF用各种浓度(μg/mL)的亲本或人源化1B11抗体(即，变体7或变体12)预处理30分钟。将hG-CSF和人源化/亲本1B11抗体的混合物添加到BaF3-hGCSFR细胞中。将混合物温育15分钟。随后将细胞固定，透化，并根据制造商的说明用抗磷酸化STAT3抗体(生命科技公司)染色。然后经由流式细胞仪收集样品，并使用Flowjo软件分析STAT3水平。
对于第二组实验(在图15中的流式图的后三行中显示)，将BaF3-hGCSFR细胞与10ng/mLhG-CSF和各种浓度的亲本或人源化1B11抗体一起温育15分钟。随后将细胞固定，透化，并根据制造商的说明用抗磷酸化STAT3抗体(生命科技公司)染色。然后经由流式细胞仪收集样品，并使用Flowjo软件分析STAT3水平。
在图15的流式图中，灰色阴影指示没有治疗对照；红线指示仅用hG-CSF治疗；蓝线指示用人源化1B11抗体变体或亲本1B11抗体治疗。
实施例15：克隆12人源化1B11抗体的中和测定。
对变体12人源化1B11抗体进行进一步的中和测定。对于此测定，将单剂量的20mg/kg的变体12人源化1B11抗体腹膜内注射到雌性8周龄C57B1/6小鼠中(每组n＝3，平均值+/-SEM)。在注射变体12人源化1B11抗体后16小时，将临床级重组人G-CSF(Filagastrim)皮下注射到相同的小鼠中。在相同的时间点和施用途径下，向基线对照小鼠注射磷酸盐缓冲盐水(PBS)。为了测量中和活性，在注射G-CSF后1小时对来自小鼠的血液取样，并在冰上用针对CD11b和Ly6G(生命科技公司)的抗体染色。随后，将细胞洗涤、固定、透化、并根据制造商的说明书用抗磷酸化STAT3抗体(生命科技公司)染色。洗涤后，将样品与计数珠混合，并通过流式细胞术分析对循环性嗜中性粒细胞(CD11b+Ly6G+)频率的抑制和对嗜中性粒细胞中pSTAT3信号传导活性的阻断。通过学生t检验评估统计学显著性(*p＜0.05，**p＜0.01)。结果分别显示在图16A和16B中。
如图16A和16B所示，变体12人源化1B11抗体减少G-CSF诱导的中性白细胞增多并阻断嗜中性粒细胞pSTAT3信号传导。
实施例16：嫁接进SCID小鼠中的人皮肤中预先形成的人乳腹癌肿瘤的治疗
可以针对本文所述的抗G-CSF抗体对在嫁接进SCID小鼠中的人皮肤中生长的预先形成的人乳腺癌肿瘤的抗癌作用，评估其作用。
简而言之，当嫁接物未显示出炎症、收缩或排斥的迹象时，将MCF-7细胞(在0.1mLPBS中的8×106个细胞)进行真皮内移植到嫁接进SCID小鼠中的人全厚皮肤中。对小鼠未进行治疗，直至出现明显可触及的肿瘤(大多数情况下直径为3至6mm)。将具有不同肿瘤的小鼠分成用于治疗性研究的组。用含有小鼠血清白蛋白的无菌PBS(0.05％终浓度)稀释抗G-CSF抗体和同种型匹配的对照IgG。对于抗体疗法，经由小鼠的尾静脉静脉内(i.v.)施用1至20mg/kg抗G-CSF抗体或对照IgG。每两到三天施用一次。
在治疗期间，每天监测小鼠的肿瘤大小和发病率。使用电子天平(OHAUSTMGT210型号)每周两次称重小鼠。使用利用OPTODEMOTM软件(福勒公司(Fowler Co.))的、连接到计算机的电子卡尺(PRO-MAX6英寸卡尺；福勒公司，马萨诸塞州牛顿市(Newton，Mass.))，每周三次测量肿瘤大小。使用以下公式将测量的肿瘤直径转换为肿瘤体积：V＝长×宽×高×pi/6。使用学生t检验进行不同组小鼠的比较数据的统计分析。
实施例17：卵巢癌的小鼠模型
为了确定抗G-CSF抗体或其抗原结合片段治疗卵巢癌的能力，可以在SCID或裸小鼠中使用卵巢癌细胞系。
简而言之，将卵巢癌细胞植入SCID或裸小鼠中以产生卵巢肿瘤。通过静脉内(i.v.)施用递增剂量(起始于1.8mg/kg体重)的抗G-CSF抗体或对照IgG来治疗荷有已建立的肿瘤的小鼠组。每周进行2或3次治疗。VEGF抑制剂和/或其他抗癌剂可以在单独的测试组中使用。监测小鼠并每周2或3次测量肿瘤生长。
实施例18：结肠直肠癌的小鼠模型
为了确定抗G-CSF抗体或其抗原结合片段治疗结肠直肠癌的能力，可以在SCID小鼠、裸小鼠或免疫活性小鼠中使用结肠直肠癌细胞系。
简而言之，将结肠直肠癌细胞植入SCID小鼠、裸小鼠或免疫活性小鼠中以产生结肠直肠肿瘤。通过i.v.施用递增剂量(起始于1.8mg/kg体重)的抗G-CSF抗体或对照IgG来治疗荷有已建立的肿瘤的小鼠组。每周进行2或3次治疗。VEGF抑制剂和/或其他抗癌剂可以在单独的测试组中使用。监测小鼠并每周2或3次测量肿瘤生长。肿瘤可以通过标准成像测试(包括PET和超声)进行成像。可以移植经治疗的肿瘤，以通过免疫组织化学来评估细胞内信号传导途径或血管分布。
实施例19：结肠直肠癌的组合疗法的临床试验
该实施例描述了随机、盲法、安慰剂对照、多中心、2期研究，其被设计以提供对抗G-CSF抗体在结肠直肠癌患者中的安全性和有效性的初步评估。登记约100-约800名患者，其中约50至约400名患者被分配到治疗组，并且约50至约400名患者被分配到安慰剂组。该试验将由以下组成：每一周、两周或三周静脉内施用约0.1至约20mg/kg的重复剂量的抗G-CSF抗体或安慰剂，持续6-10个周期。VEGF抑制剂和/或其他抗癌剂可以在单独的测试组中使用。研究的时间范围估计为约6个月至约5年，在初始研究结束时，对所述应答者进行持续治疗。另外的结果指标如下：
主要结果指标：总体应答率。该研究的一个目标是证明用抗G-CSF抗体治疗后无进展生存期增加了35％。
可以评估的次要结果指标包括总体应答率、应答持续时间、总体存活率、严重和非严重不良事件。例如，治疗可以预防疾病的进展(即，淤滞)或可以导致改善。可替代地(或此外)，可以针对以下中的一项或多项来测量其他目标：减少肿瘤负荷、降低血管分布、减少副作用、减少不良反应和/或增加患者依从性。
实施例20：卵巢癌的组合疗法的临床试验
该实施例描述了随机、盲法、安慰剂对照、多中心、2期研究，其被设计以提供对抗G-CSF抗体与的组合在卵巢癌患者中的安全性和功效的初步评估。登记约100-约800名患者，其中约50-约400名患者被分配到治疗组，并且约50-约400名患者被分配到安慰剂组。该试验包括：与每4周施用一次约5至约50mg/m2的组合，每一周、两周或四周静脉内施用约0.1至约20mg/kg的重复剂量的抗G-CSF抗体或安慰剂。研究的时间范围估计为6个月至约5年，在初始研究结束时，对所述应答者进行持续治疗。另外的结果指标如下：
主要结果指标：无进展生存期。该研究的一个目标是证明无进展生存期从加安慰剂组的约3-6个月增加至加抗G-CSF抗体组的约4-12个月(或更长时间)。
可以评估的次要结果指标包括应答持续时间、肿瘤进展时间、总体存活率、严重和非严重不良事件。例如，治疗可以预防疾病的进展(即，淤滞)或可以导致改善。可替代地(或此外)，可以针对以下中的一项或多项来测量其他目标：减少肿瘤负荷、降低血管分布、减少副作用、减少不良反应和/或增加患者依从性。
实施例21：卵巢癌的基于铂的组合疗法的临床试验
该实施例描述了随机、盲法、安慰剂对照、多中心、2期研究，其被设计以提供对抗G-CSF抗体与基于铂的化疗的组合在卵巢癌患者中提供安全性和功效的初步评估。登记约100-约800名患者，其中从约50至约400名患者被分配到治疗组，并且约50-约400名患者被分配到安慰剂组。该试验包括：与静脉输注的基于铂的化疗方案(例如卡铂和紫杉醇)组合，每一周、两周或三周静脉内施用约0.1至约20mg/kg的重复剂量的抗G-CSF抗体或安慰剂，在整个研究过程中重复进行这些过程。研究的时间范围估计为约6个月至约5年，在初始研究结束时，对所述应答者进行持续治疗。另外的结果指标如下：
主要结果指标：无进展生存期。该研究的一个目标是证明无进展生存期从拓扑替康加安慰剂组的约12-18个月增加至基于铂的化疗加抗G-CSF抗体组的约12-24个月(或更长时间)。
可以评估的次要结果指标包括应答持续时间、肿瘤进展时间、总体存活率、严重和非严重不良事件。例如，治疗可以预防疾病的进展(即，淤滞)或可以导致改善。可替代地(或此外)，可以针对以下中的一项或多项来测量其他目标：减少肿瘤负荷、降低血管分布、减少副作用、减少不良反应和/或增加患者依从性。
实施例22：对SCID小鼠中的人乳腺癌肿瘤的治疗
可以针对本文所述的抗G-CSF抗体对在嫁接进SCID小鼠中的人皮肤中生长的预先形成的人乳腺癌肿瘤的抗癌作用，评估其作用。
简而言之，将MDA-MB-231细胞(在0.1mL PBS中的1-2×106个细胞)皮下移植到SCID小鼠的侧腹中。对小鼠未进行治疗，直至出现明显可触及的肿瘤(大多数情况下直径为3至6mm)。将具有不同肿瘤的小鼠分成用于治疗性研究的组。用含有小鼠血清白蛋白的无菌PBS(0.05％终浓度)稀释抗G-CSF抗体和同种型匹配的对照IgG。对于抗体疗法，经由小鼠的尾静脉静脉内(i.v.)或腹腔内(i.p.)施用1至20mg/kg抗G-CSF抗体或对照IgG。每两到三天施用一次。
在治疗期间，每天监测小鼠的肿瘤大小和发病率。使用电子天平(OHAUSTM GT210型号)每周两次称重小鼠。使用利用OptoDemoTM软件(福勒公司)的、连接到计算机的电子卡尺(PRO-MAX6英寸卡尺；福勒公司，马萨诸塞州牛顿市)，每周三次测量肿瘤大小。使用以下公式将测量的肿瘤直径转换为肿瘤体积：V＝长×宽×高×pi/6。使用学生t检验进行不同组小鼠的比较数据的统计分析。
实施例23：皮肤癌的组合疗法
以下研究是抗G-CSF抗体与伊匹单抗的组合相比伊匹单抗加安慰剂的组合在转移性黑色素瘤患者中的临床试验。
主要结果指标包括但不限于：
1期：具有不良事件的患者人数，作为安全性和耐受性的量度。每3周测量一次基线和结果，直至停药或死亡。估计的时间范围是从登记的第一位患者到停药或死亡的最后一位患者的29个月。
2期：每4周测量总体存活率直至第50例死亡发生，然后对其余患者每3个月进行一次随访。
次要结果指标包括但不限于：
通过肿瘤应答评估初步功效。在基线处和之后每九周(3个周期)评估肿瘤，估计每个患者进行研究的时间范围为11个月。
基于每4周一次的测量，评估无进展生存期，直至出现第50例死亡发生，然后随访是每3个月一次的测量。
组I每天两次施用抗G-CSF抗体，组合300mg伊匹单抗(ipilimumab)。
组II每天两次施用安慰剂，组合300mg伊匹单抗。
要治疗的受试者是18岁及以上年龄。
纳入标准：
18岁或以上患有不可切除或转移性黑色素瘤的男性或女性受试者。
预期寿命＞12周。
如方案中所限定的，符合实验室范围和医疗标准。
对于不可切除或转移性黑色素瘤，受试者可能已经接受了多于1种的先前系统治疗方案。
仅对于该研究的2期阶段，受试者必须具有可用的且在前6个月收集的入库肿瘤组织，或必须具有针对前治疗、研究活检的可访问的疾病。
排除标准：
孕妇或哺乳期妇女。
目前的研究性试验参与使用另一种研究性产品或以下受试者，这些受试者在筛选前21天内接受过任何抗癌药物(丝裂霉素C或亚硝基脲6周)。
接受单胺氧化酶抑制剂(MAOI)的受试者；接受一种或更多种血清素能药物(serotonergic drugs)后曾患有血清素综合征的受试者。
已接受免疫检查点抑制剂(例如，抗CTLA-4、抗PD-1、抗PD-L1等)的受试者，这些受试者具有3级或4级肝毒性、需要英利昔单抗的免疫结肠炎、通过替换无法控制的内分泌毒性、任何其他4级免疫不良事件(AE)或眼部毒性。
具有方案指定的活性自身免疫过程的受试者，白癜风或甲状腺炎除外。
具有会危及受试者安全或受试者对该方案的依从性的并发病症的受试者。
实施例24：乳腺癌和伊匹单抗
以下研究是与伊匹单抗一起施用的、抗G-CSF抗体的临床试验，该临床试验关于治疗实体瘤患者(实体瘤已扩散到体内其他部位，并且通常无法通过治疗而得以治愈或控制(转移性)或无法通过手术去除(不可切除))或人表皮生长因子受体2(HER2)阴性乳腺癌患者(癌症已从起始的地方扩散到附近的组织或淋巴结或身体的其他部位)。
要治疗的病症包括乳腺腺癌、HER2/Neu阴性、浸润性乳腺癌、复发性乳腺癌、实体瘤、IIIA期乳腺癌、IIIB期乳腺癌、IIIC期乳腺癌和IV期乳腺癌。
主要结果指标包括但不限于：根据美国国家癌症研究所(Naional CancerInstitute)的不良事件通用术语标准(Common Terminology Criteria for AdverseEvents，CTCAE)版本(v)4.0，在最后剂量的纳武单抗后长达100天内评估抗G-CSF抗体与伊匹单抗组合的不良事件的发生率。
通过各组中不良事件、严重不良事件和特定实验室异常情况(最差级别)的发生率来分析安全性和耐受性。基于CTCAE v4.0，将针对所有剂量的毒性按类型和等级制成表格，并使用频率和百分比表示。以精确的95％置信区间报告在每个剂量水平下的剂量限制性毒性的比例。
次要结果指标包括但不限于：肿瘤活检中Teff与Treg比率的改变，所述改变通过在基线至施用抗G-CSF抗体后长达2周时石蜡包埋的肿瘤样本的IHC染色来测量。改变被视为连续变量，并用描述性统计进行汇总。使用探索图(例如，条形图、箱形图等)以图形方式描绘改变，并且以95％置信区间估计平均值。使用配对t检验或非参数威尔科克森(Wilcoxon)符号秩检验确定数据是否显示自基线改变的证据。
基于RECIST v1.1和irRC(晚期乳腺癌患者的扩散群组)，将疾病控制率定义为达到CR、PR或稳定疾病(SD)的患者在所有应答可评估患者中的百分比。长达5年对效果进行观察。通过将实现证实的应答的患者数量加持续至少6个月具有稳定疾病的患者数量的和除以可评估患者的总数来估算疾病控制率。
评估总体应答的持续时间(患有晚期乳腺癌患者的扩散群组)。时间测量标准满足CR或PR(以先记录者为准)，直到复发性或进行性疾病被客观记录或死亡(以先出现者为准)，评估长达5年。如果有必要，使用卡普兰-梅尔(Kaplan-Meier)方法描述应答的持续时间。将以RP2D处理的剂量递增部分中的晚期乳腺癌患者(如果有的话)与剂量扩展群组中的患者合并用于这些分析。
稳定疾病的持续时间基于RECIST v1.1和irRC(晚期乳腺癌患者的扩散群组)。时间测量标准满足SD，直到复发性或进行性疾病被客观记录或死亡(以先出现者为准)，评估长达5年。如果有必要，将使用卡普兰-梅尔方法描述稳定疾病的持续时间。将以RP2D处理的剂量递增部分中的晚期乳腺癌患者(如果有的话)与剂量扩展群组中的患者合并用于这些分析。
将客观应答率定义为5年中具有完全应答(CR)或部分应答(PR)的患者总数除以目的人群(晚期乳腺癌患者的扩散群组)中的患者总数。基于RECIST v1.1和免疫相关应答标准(irRC)评估肿瘤。
将无进展生存期(PFS)定义为存活患者和无疾病进展的患者(晚期乳腺癌患者的扩展群组)的比例。在6个月时评估从治疗开始的时间到疾病进展或死亡的时间(以先发生者为准)。将提供精确的二项式95％置信区间。如果有必要，将使用卡普兰-梅尔方法描述PFS的分布、应答持续时间和稳定疾病的持续时间。将以RP2D处理的剂量递增部分中的晚期乳腺癌患者(如果有的话)与剂量扩展群组中的患者合并用于这些分析。
其他结果指标包括但不限于：CD86基因多态性，作为免疫介导的不良事件的遗传决定因素；恶性组织中候选基因再表达、循环DNA中基因甲基化沉默和治疗前后恶性组织的改变；改变被估计为比率改变(后/前)，并将数据进行适当的对数变换以诱导对称性并稳定变异性；使用配对t检验或适用于连续变量的威尔科克森符号秩检验，以及针对二分变量或分类变量的麦克尼马尔检验(McNemar′s test)来探索治疗前和治疗后的差异；评估临床应答者和非应答者的免疫参数分布，并将其使用箱形图(使用J-T趋势检验(Jonckheere-Terpstra trendtest)评估这些参数随肿瘤应答的改变)以图形方法展示出来；在治疗前和治疗后在肿瘤活检中识别肿瘤特异性突变型新抗原的T细胞的频率改变；通过流式细胞术在治疗前和治疗后测量的外周血和肿瘤活检中的MDSC数量的改变；在治疗前和治疗后在肿瘤活检或PBL中其他免疫相关生物标志物(例如，效应T细胞：调节性T细胞的比例、炎性T细胞特征、TCR库)的改变；药效学结果(例如，安全性、功效和基因甲基化状态的改变)；通过IHC测量的、在肿瘤活检中检查点抑制剂(PD-1/PD-L1)的组合治疗后的表达；和/或通过全外显子组测序测量的、肿瘤活检中患者T细胞识别的肿瘤特异性突变和突变型新抗原。
实施例25：卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌和伊匹单抗
以下研究是调查研究抗G-CSF抗体作为单一药剂或与伊匹单抗的组合在6种肿瘤类型(三阴性乳腺癌(TNBC)、胃癌(GC)、胰腺癌(PC)和小细胞肺癌(SCLC)、膀胱癌(BC)，以及卵巢癌(OC))中的安全性和功效的临床试验。
主要结果指标包括但不限于长达17个月的客观应答率(ORR)。
次要结果指标包括但不限于：导致药物中断的治疗相关不良事件(AE)的数量；无进展生存期(PFS)；和长达12周的治疗的总体存活率(OS)。
每2周用抗G-CSF抗体溶液静脉内治疗组1，直至记录到疾病进展、由于毒性而停药、撤回同意书或研究结束。
每3周用抗G-CSF抗体溶液加伊匹单抗1mg/kg溶液(持续4个剂量)、然后每2周用抗G-CSF抗体静脉内治疗组2，直至记录到疾病进展、由于毒性而停药、撤回同意书或研究结束。
每3周用抗G-CSF抗体溶液加伊匹单抗3mg/kg(持续4个剂量)、然后每2周用抗G-CSF抗体静脉内治疗组3，直至记录到疾病进展、由于毒性而停药、撤回同意书或研究结束。
每3周用抗G-CSF抗体溶液加伊匹单抗1mg/kg(持续4个剂量)、然后每2周用抗G-CSF抗体静脉内治疗组4，直至记录到疾病进展、由于毒性而停药、撤回同意书或研究结束。
每3周用抗G-CSF抗体溶液与每6周用伊匹单抗1mg/kg的组合静脉内治疗组5，直至记录到疾病进展、由于毒性而停药、撤回同意书或研究结束。
对该研究合格的患者是18岁及以上年龄。
纳入标准：
具有以下肿瘤类型的组织学证实的局部晚期疾病或转移性疾病的受试者：三阴性乳腺癌、胃癌、胰腺癌、小细胞肺癌、膀胱癌或卵巢癌。
受试者必须患有可测量的疾病。
美国东部肿瘤协作组(Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG)0或1。
排除标准：
活性脑转移或软脑膜转移。
患有活跃的、已知的或疑似自身免疫性疾病的受试者。
患有需要在治疗14天内用皮质类固醇(每日＞10mg的泼尼松当量)或其他免疫抑制药物进行全身治疗的病症的受试者。
以下是被禁止的：用实验性抗肿瘤疫苗预先治疗；任何T细胞共刺激途径或检查点途径，如抗PD-1、抗PD-L1、抗PD-L2、抗CD137或抗CTLA-4抗体，包括伊匹单抗；或其他特异地靶向T细胞的药物。
实施例26：脑癌(胶质母细胞瘤或神经胶质肉瘤)和伊匹单抗
以下研究是研究以下的临床试验：伊匹单抗和/或抗G-CSF抗体与替莫唑胺组合治疗患有新诊断的胶质母细胞瘤或神经胶质肉瘤的患者。
此I期试验研究了伊匹单抗、抗G-CSF抗体或两者与替莫唑胺的组合治疗患有新诊断的胶质母细胞瘤或神经胶质肉瘤的患者的安全性和最佳剂量。单克隆抗体(如伊匹单抗和抗G-CSF抗体)可通过靶向某些细胞以不同方式阻断肿瘤生长。化疗中使用的药物(如替莫唑胺)以通过杀死细胞、通过阻止细胞分裂或通过阻止细胞扩散的不同方式起作用，以阻止肿瘤细胞的生长。
主要结果指标包括但不限于：伊匹单抗和抗G-CSF抗体的组合当与替莫唑胺一起施用时的免疫相关DLT；用抗G-CSF抗体进行的单一药剂治疗的免疫相关DLT；用伊匹单抗进行的长达8周的单一药剂治疗的免疫相关剂量限制性毒性(DLT)。
次要结果指标包括但不限于：使用标准免疫组织化学对肿瘤样品中的免疫细胞的生物标志物分析；不良事件的发生率，使用国家癌症研究所的不良事件通用术语标准4.0版进行评级；在新诊断的胶质母细胞瘤的维持期中，用伊匹单抗、纳武单抗进行的单一药剂治疗、及其与替莫唑胺一起施用时的组合的副作用特征；以及在免疫治疗开始后，长达2年的治疗后，存活的患者数量。
组I(替莫唑胺和伊匹单抗)
在放化疗完成后5周内，患者在第1-5天PO接受替莫唑胺。在不存在疾病进展或不可接受的毒性的情况下，每28天重复治疗，持续最多6个疗程。不存在不可接受的毒性的情况下，患者还每4周IV接受一次伊匹单抗超过90分钟，持续4个疗程，然后在疗程4后3个月开始，每3个月一次，持续4个疗程。
组II(替莫唑胺和抗G-CSF抗体)
在放化疗完成后5周内，患者在第1-5天PO接受替莫唑胺。在不存在疾病进展或不可接受的毒性的情况下，每28天重复治疗，持续最多6个疗程。不存在不可接受的毒性的情况下，患者还每2周IV接受一次抗G-CSF抗体超过60分钟，持续16周，然后每2周一次，持续48周。
组III(替莫唑胺、抗G-CSF抗体、伊匹单抗)
在放化疗完成后5周内，患者在第1-5天PO接受替莫唑胺。在不存在疾病进展或不可接受的毒性的情况下，每28天重复治疗，持续最多6个疗程。不存在不可接受的毒性的情况下，患者还每4周IV接受一次伊匹单抗超过90分钟，持续4个疗程，以及每2周IV接受一次抗G-CSF抗体超过60分钟，持续64周。
主要目标包括确定在新诊断的胶质母细胞的维持治疗期中，用伊匹单抗、抗G-CSF抗体进行的单一药剂治疗、及其与替莫唑胺一起施用时的组合的最大安全剂量。
次要目标包括
收集并记录在新诊断的胶质母细胞的维持期中，用伊匹单抗、抗G-CSF抗体进行的单一药剂治疗、及其与替莫唑胺一起施用时的组合的副作用特征；
对肿瘤样品中的免疫细胞进行初步研究，例如通过探查来自诊断性肿瘤块的肿瘤组织对肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)进行表型分析；以及
报告在新诊断的胶质母细胞的维持期中，在用伊匹单抗、抗G-CSF抗体进行的单一药剂治疗、及其与替莫唑胺一起施用时的组合开始之后1年和2年存活的患者数。
入选标准
组织病理学证明在病理报告登记之前诊断为胶质母细胞瘤或神经胶质肉瘤。
肿瘤必须是单病灶的、局限于幕上室(supratentorial compartment)、并且已经历了总的切除或接近总的切除；这将增加患者不需要皮质类固醇或发生假性进展的可能性。
登记后，必须将福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)的肿瘤组织块送去进行回顾中心病理检查。
患者必须在化放疗完成28天内登记。
登记前7天内，进行病史检查/体格检查。
患者必须在完成放射的28天内通过磁共振成像(MRI)进行评估，并且还必须在登记前7天内进行评估；MRI必须证明肿瘤无进展。
在登记前7天内，卡氏(Karnofsky)体能状态＞＝70。
绝对嗜中性粒细胞计数＞＝1,500个细胞/mm^3。
血小板计数＞＝100,000个细胞/mm^3。
血红蛋白(Hgb)＞9g/dL(可通过输血实现)。
血尿素氮(BUN)＝＜30mg/dl。
血清肌酸酐＝＜1.7mg/dl。
总胆红素(患有吉尔伯特氏综合征的患者除外，他们有资格进行该研究，但不符合总胆红素合格标准)＝＜2.0mg/dl。
丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)＝＜2.5倍正常上限(ULN)。
患者必须在美国肿瘤放射治疗协作组(Radiation Therapy Oncology Group，RTOG)/肿瘤学研究网络放疗协作组(NRG)先前建立的护理标准内完成如下化放疗(所有群组)：放射疗法；物理疗法(modality)：三维(3D)或强度调节放射疗法(IMRT)，或允许质子疗法；启动时间：放疗必须在手术后35天内或相当于35天内开始；靶体积：靶体积定义将基于术后增强的MRI；必要时，应将术前成像用于相关鉴定和改进鉴定；剂量指南：初始靶体积被处理为46戈瑞(Gy)、23个分次；在46Gy之后，锥形束降低或增强体积被处理为总共60Gy，以及各为2Gy的七个额外的分次(14Gy增强剂量)；在伴随性放射疗法期间的替莫唑胺；或者替莫唑胺必须以75mg/mA2的每日口服剂量从放疗的第1天到放射的最后一天连续施用，持续最多49天。
患者服用的皮质类固醇剂量不得超过生理替换剂量，该生理替换剂量被定义为每天30mg可的松或其等同量。
患者必须在进入研究之前提供研究特定的知情同意书。
排除标准：
进展性疾病的确切临床或放射学证据。
之前植入卡莫司汀植入膜剂(Gliadel wafer)或接受局部近距放射治疗。
使用免疫疗法(如疫苗疗法)、树突细胞疫苗或者腔内或对流增强型递送疗法。
先前侵袭性恶性肿瘤(非黑色素瘤皮肤癌除外)，除非不患病最少3年。
登记前最近6个月内，不稳定型心绞痛。
登记前最近6个月内，透壁性心肌梗死。
使用对在登记前7天内进行的心电图(EKG)的分析，S-T升高≥2mm的结果证实近期心肌梗死或缺血。
纽约心脏病协会II级或更高的充血性心力衰竭，需要在登记前12个月内住院治疗。
登记前6个月内中风、脑血管意外(CVA)或短暂性脑缺血发作的病史。
严重和不充分控制的心律失常。
显著的血管疾病(例如，主动脉瘤、主动脉夹层病史)或临床上显著的外周血管疾病。
出血性素质或凝血障碍的证据。
在登记前28天内，严重或不愈合的伤口、溃疡或骨折，或者腹瘘、胃肠穿孔、腹内脓肿的大外科手术、开放活检或显著外伤的病史，除用于肿瘤切除的开颅术之外。
登记时需要静脉注射抗生素的急性细菌或真菌感染。
登记时需要住院或阻止研究治疗的慢性阻塞性肺病恶化或其他呼吸道疾病。
导致临床黄疸和/或凝血缺陷的肝功能不全；但请注意，进入此方案不需要进行另外的肝功能检查和凝血参数的实验室测试。
基于目前疾病控制和预防中心(CDC)定义的获得性免疫缺陷综合症(AIDS)；但请注意，进入此方案不需要进行人体免疫缺陷病毒(HIV)测试。
在治疗医师看来可能使患者处于免疫毒性的高风险中的活动性结缔组织障碍(如狼疮或硬皮病)。
应排除具有活性自身免疫性疾病或可能复发的自身免疫性疾病史的患者，自身免疫性疾病可能影响重要器官功能或需要免疫抑制治疗(包括全身性皮质类固醇)；这些包括但不限于具有免疫相关的神经疾病、多发性硬化、自身免疫(脱髓鞘)神经病、吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barre syndrome)或慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、重症肌无力病史的患者；全身性自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮(SLE)、结缔组织疾病、硬皮病、炎性肠病(IBD)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肝炎；以及应排除具有中毒性表皮坏死松解症(TEN)、史蒂文斯-约翰逊综合征(Stevens-Johnson syndrome)或磷脂综合征病史的患者。
值得注意的是，患有白癜风、内分泌缺陷(包括用包括生理皮质类固醇在内的替换激素管理的甲状腺炎)的患者是合格的；患有类风湿性关节炎和其他关节病、干燥综合征(syndrome)，以及用局部药物控制的银屑病的患者，以及血清学阳性(如抗核抗体(ANA)、抗甲状腺抗体)的患者应被评估靶器官受累和潜在全身治疗需求的存在，但原本应该是合格的。
在研究者看来任何其他主要的医学疾病或精神损伤都会阻止方案治疗的施用或完成。
怀孕或哺乳的女性；有生育能力的女性必须在登记前7天内进行阴性血清妊娠测试。
对任何单克隆抗体有严重超敏反应的病史。
实施例27：结肠癌和伊匹单抗
此研究的目的是检测单独的抗G-CSF抗体、与伊匹单抗组合的抗G-CSF抗体或与伊匹单抗(Ipi)和考比替尼(Cobimetinib)组合的抗G-CSF抗体是否会对患有复发性和转移性结肠癌的患者显示出有意义的客观应答率。
主要结果指标包括但不限于：所有高MSI受试者的客观应答率(ORR)，如由研究者确定的。主要终点的最终分析将在最后一个登记的受试者的第一剂量研究治疗(大约最多34个月)后至少6个月发生。肿瘤显像评估将从第一次给药之日起每6周(wk)进行一次(+/-1wk)，持续第一个24周，然后每12wk(+/-1wk)进行一次，直至疾病进展或治疗中断(以较晚者为准)。肿瘤显像评估将从第一次给药之日起每6周进行一次(+/-1wk)，持续第一个24周，然后每12wk(+/-1wk)进行一次，直至疾病进展或治疗中断(以较晚者为准)。
次要结果指标包括但不限于：基于IRRC确定的所有MSI-H受试者的ORR，以及肿瘤显像评估将从第一次给药之日起每6周进行一次(+/-wk)，持续第一个24周，然后每12wk(+/-1wk)进行一次，直至疾病进展或治疗中断(以较晚者为准)。
实验：抗G-CSF抗体单一疗法：每2周IV输注施用3mg/kg剂量的抗G-CSF抗体，直至疾病进展。
实验：抗G-CSF抗体+伊匹单抗(Ipi)
每3周(wk)抗G-CSF抗体3mg/Kg IV与Ipi 1mg/Kg IV，持续4个剂量，然后每2wk抗G-CSF抗体3mg/Kg IV，直至进展
剂量递增期：(完整的)
剂量水平(DL)1：每3wk抗G-CSF抗体0.3mg/Kg与Ipi 1mg/Kg IV，持续4个剂量，然后每2wk抗G-CSF抗体3mg/Kg IV，直至进展
DL 1：每3wk抗G-CSF抗体1mg/Kg IV与Ipi 1mg/Kg IV，持续4个剂量，然后每2wk抗G-CSF抗体3mg/Kg IV，直至进展
DL 2a：每3wk抗G-CSF抗体1mg/Kg IV与Ipi 3mg/Kg IV，持续4个剂量，然后每2wk抗G-CSF抗体3mg/Kg IV，直至进展
DL 2b：每3wk抗G-CSF抗体3mg/Kg IV与Ipi 1mg/Kg IV，持续4个剂量，然后每2wk抗G-CSF抗体3mg/Kg IV，直至进展
群组C3：每2wk IV给药抗G-CSF抗体以及每6wk IV给药Ipi。
群组C4：每2wk IV给药抗G-CSF抗体，以及每6wk IV给药Ipi，并且与每天口服给药一次的考比替尼组合(21天给药/7天不给药)。
纳入标准：
男性和女性≥18岁；
美国东部肿瘤协作组(ECOG)体能状态为0至1；
组织学证实的结肠直肠癌；
通过CT或MRI确定的可测量的疾病；
测试MSI状态；
如由研究特定实验室测试定义的充分器官功能；
在整个研究中必须使用可接受的生育控制方式。在研究药物的最终剂量后，对于具有生育能力(WOCBP)的女性，必须使用可接受的生育控制方式23周，并且对于WOCBP性活跃的男性，必须使用可接受的生育控制方式31周；
签署知情同意书；
愿意并能够遵守研究程序；以及
进入C3群组的受试者必须未接受过针对转移性疾病的治疗。
排除标准：
不允许有活跃的脑转移或软脑膜转移；
先前用抗程序性死亡受体(PD)-1、抗PD-L1、抗PD-L2和抗细胞毒性T细胞淋巴瘤-4抗原(CTLA-4)抗体或特异性靶向T细胞共刺激途径或免疫检查点途径的任何其他抗体或药物进行治疗；
除局部可治愈的癌症外，之前的前3年内有活跃的恶性肿瘤；
患有活跃的、已知的或疑似自身免疫性疾病的受试者；以及
在施用研究药物14天内，患有需要用皮质类固醇或其他免疫抑制药物进行全身治疗的病症的受试者。
虽然本文已经示出并描述了本申请的某些实施方式，但显而易见的是，此类实施方式仅以举例的方式提供。在不脱离实施方式的情况下，本领域技术人员可以想到许多变化、改变和替代；应当理解，本文所述实施方式的各种替代方案可用于实践本文所述的用途、方法和组合物。虽然已经出于清楚和理解的目的相当详细地描述了前述实施方式，但是本领域技术人员从阅读本披露可以理解，可以在不脱离所附权利要求中的本发明真正范围的情况下进行不同的形式和细节变化。

Claims (44)

1.一种结合粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的分离的或纯化的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：1或在其中具有保守取代的SEQ ID NO：1所示的重链CDR1；如SEQ ID NO：2或在其中具有保守取代的SEQ ID NO：2所示的重链CDR2；如SEQID NO：3或在其中具有保守取代的SEQ ID NO：3所示的重链CDR3；如SEQ ID NO：4或在其中具有保守取代的SEQ ID NO：4所示的轻链CDR1；如SEQ ID NO：5或在其中具有保守取代的SEQ ID NO：5所示的轻链CDR2；以及如SEQ ID NO：6或在其中具有保守取代的SEQ ID NO：6所示的轻链CDR3。
2.如权利要求1所述的分离的或纯化的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：7所示的重链可变区和如SEQ ID NO：8所示的轻链可变区。
3.一种结合粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的分离的或纯化的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：9或在其中具有保守取代的SEQ ID NO：9所示的重链CDR1；如SEQ ID NO：10或在其中具有保守取代的SEQ ID NO：10所示的重链CDR2；如SEQ ID NO：11或在其中具有保守取代的SEQ ID NO：11所示的重链CDR3；如SEQ ID NO：12或在其中具有保守取代的SEQ ID NO：12所示的轻链CDR1；如SEQ ID NO：13或在其中具有保守取代的SEQ ID NO：13所示的轻链CDR2；以及如SEQ ID NO：14或在其中具有保守取代的SEQID NO：14的轻链所示CDR3。
4.如权利要求3所述的分离的或纯化的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：15所示的重链可变区和如SEQ ID NO：16所示的轻链可变区。
5.一种核酸，该核酸编码如权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
6.一种宿主细胞或表达载体，该宿主细胞或表达载体包含如权利要求5所述的核酸。
7.如权利要求1-6中任一项所述的分离的抗G-CSF抗体或其抗原结合片段，该抗G-CSF抗体或其抗原结合片段包含约2nM或更小的对G-CSF的结合亲和力(KD)，所述结合亲和力是在37℃下通过表面等离子共振测量的。
8.如权利要求1-7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体是IgG、IgM、IgE、IgA、IgD或自其衍生。
9.如权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体是选自由以下组成的组的IgG：IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgG4。
10.如权利要求1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含Fc区。
11.如权利要求1-10中任一项所述的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体、移植抗体、嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。
12.如权利要求1-11中任一项所述的抗体，其中所述抗体是去免疫抗体。
13.如权利要求1所述的抗原结合片段，其中该抗原结合片段选自由以下组成的组：Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、Fv片段、scFv片段、单链结合多肽、Fd片段、可变重链、可变轻链和dAb片段。
14.如权利要求1-13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，缀合至治疗剂。
15.如权利要求14所述的抗体或其抗原结合片段，其中该治疗剂选自由以下组成的组：毒素、药物、酶、细胞因子、放射性核素和光动力剂。
16.如权利要求15所述的抗体或其抗原结合片段，包含毒素，其中该毒素选自由以下组成的组：蓖麻毒素A链、突变型假单胞菌外毒素、白喉类毒素、链黑霉素、博霉素、皂草素、白树毒素和商陆抗病毒蛋白。
17.如权利要求15所述的抗体或其抗原结合片段，包含药物，其中该药物选自由以下组成的组：柔红霉素、甲氨蝶呤和卡奇霉素。
18.如权利要求15所述的抗体或其抗原结合片段，包含放射性核素，其中该放射性核素是放射性金属。
19.如权利要求15所述的抗体或其抗原结合片段，包含细胞因子，其中该细胞因子选自由以下组成的组：包括但不限于转化生长因子(TGF)-β、白细胞介素、干扰素和肿瘤坏死因子。
20.如权利要求15所述的抗体或其抗原结合片段，包含光动力剂，其中该光动力剂选自由以下组成的组：光卟啉及其衍生物。
21.一种药物组合物，该药物组合物包含如权利要求1-20中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
22.如权利要求21所述的药物组合物，该药物组合物进一步包含血管生成抑制剂。
23.如权利要求22所述的药物组合物，其中该血管生成抑制剂是抗VEGF剂或化疗剂。
24.如权利要求21-23中任一项所述的药物组合物，该药物组合物被配制为口服、舌下、经由吸入、透皮、皮下、静脉内、动脉内、关节内、关节周围或肌肉内施用。
25.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，该方法包括向该受试者施用如权利要求21-24中任一项所述的药物组合物。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述癌症是肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、胰腺癌、脑癌、皮肤癌或其任何转移。
27.如权利要求25或26所述的方法，其中所述药物组合物通过静脉内、口服、舌下、经由吸入、透皮、皮下、动脉内、关节内、关节周围或肌肉内施用。
28.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其中该药物组合物中的抗体或其抗原结合片段中和G-CSF活性。
29.如权利要求25-28中任一项所述的方法，其中该药物组合物中的抗体或其抗原结合片段提高树突细胞发育或成熟。
30.如权利要求25-29中任一项所述的方法，其中该药物组合物中的抗体或其抗原结合片段减少MDSC。
31.如权利要求25-29中任一项所述的方法，其中在施用该药物组合物后，该受试者表现出减少的T细胞抑制。
32.如权利要求25-29中任一项所述的方法，其中在施用该药物组合物后，该受试者表现出白细胞中STAT3活化的减少。
33.一种结合粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的分离的或纯化的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：30所示的重链，在其中均具有保守取代；以及如SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26所示的轻链，在其中均具有保守取代。
34.如权利要求33所述的分离的抗G-CSF抗体或其抗原结合片段，该抗G-CSF抗体或其抗原结合片段包含约2nM或更小的对G-CSF的结合亲和力(KD)，所述结合亲和力是在37℃下通过表面等离子共振测量的。
35.一种药物组合物，该药物组合物包含如权利要求33或34所述的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
36.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，该方法包括向该受试者施用如权利要求35所述的药物组合物。
37.一种治疗有需要的受试者的关节炎的方法，该方法包括向该受试者施用如权利要求21或权利要求35所述的药物组合物。
38.如权利要求1-4、7-20、33和34中任一项所述的分离的或纯化的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体经工程化以提高G-CSF从受试者体内循环的清除。
39.一种药物组合物，该药物组合物包含如权利要求38所述的抗体或其抗原结合片段。
40.包含本文所述的任何特征、特征的组合和/或特征的子组合的组合物。
41.包括本文所述的任何特征、特征的组合和/或特征的子组合的方法。
42.包含本文所述的任何特征、特征的组合和/或特征的子组合的用途。
43.包含本文所述的任何特征、特征的组合和/或特征的子组合的试剂盒。
44.包含本文所述的任何特征、特征的组合和/或特征的子组合的药物包装。
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