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CN102939388B - 可消化木质纤维素生物质和提取物及其制备方法 - Google Patents

可消化木质纤维素生物质和提取物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及处理木质纤维素生物质的方法，用以从所述生物质获取有用的产品。

Description

可消化木质纤维素生物质和提取物及其制备方法
本申请要求2010年4月19日提交的美国临时申请No.61/325,560的优先权，其内容在此通过引用全部纳入本文。
背景技术
纤维素生物质能用于生产各种产品。然而，许多常规方法非常昂贵，需要很高的资本投入，用于比如高压反应器和大量的添加剂。
发明内容
本发明一般涉及通过酶改进木质纤维素生物质(lignocellulosicbiomass)的可消化性(digestibility)的方法，从而能够由其更为有效地制备有用的产品。
本发明的一方面是由木质纤维素生物质制备产品的方法，其包括通过采用液氨对木质纤维素生物质进行预处理而将原生纤维素Iβ转化成纤维素IIII以形成经过预处理的生物质，并且由其制备所述的产品。所述液氨可以是无水氨。在其它实施方式中，液氨是溶剂中80％-99％的氨。例如，所述溶剂可以是水或有机溶剂。可以使用的溶剂的例子包括水，丙酮，乙醇，甲醇，异丙醇，二氯甲烷，乙酸甲酯，乙酸乙酯，氯仿以及它们的组合。
在进一步的实施方式中，所述液氨与丙酮结合用于预处理。如本文描述，丙酮∶氨导致由纤维素I(celluloseI)有效地形成纤维素III(celluloseIII)。在一些实施方式中，液氨对丙酮的体积∶体积之比可以为10∶90至99∶1。
木质纤维素生物质可以用液氨进行预处理约1分钟至3小时。用液氨(带有或没有溶剂)处理木质纤维素生物质的可采用的温度包括从约20℃至约140℃，或从约4℃至约160℃。在一些实施方式中，其他的温度也可采用。
液氨与纤维素生物质的重量比可以是8∶1至2∶1。
在一些实施方式中，所述预处理还可以包括提取(extracting)植物细胞壁成分，例如木质素、半纤维素、阿拉伯聚糖及它们的降解产物。这样的提取可以与无水液氨预处理同时进行，或者所述提取是在无水液氨预处理之后进行。在提取后，葡聚糖和/或木聚糖基本上与经过预处理的生物质一起保留。经过提取的木质素和/或半纤维素可以转化为树脂、聚合物、生物燃料、生化制品，热量和/或电。
然而，在一些实施方式中，木质纤维素生物质的预处理会产生容易被消化和/或被发酵的纤维素III，尽管植物细胞壁的成分未被提取。
预处理之后，经过预处理的生物质可以由酶的组合(combinationofenzymes)而被消化。例如，组合酶可以包括至少一种外切纤维素酶(exocellulase)和至少一种内切纤维素酶(endocellulase)。因此，组合酶可以包括来自里氏木霉(Trichodermareesei)的Cel7A(纤维二糖水解酶I(CellobiohydrolaseI))、Cel6A(纤维二糖水解酶II(CellobiohydrolaseII))和Cel7B(EGI)。组合酶还可包括来自里氏木霉的Cel5A_tr，来自解纤维热酸菌(Acidothermuscellulolyticum)的Cel5A_ac或其组合。在一些具体实施方式中，所述组合酶可以进一步包括里氏木霉纤维素酶Cel12A、Cel61A、Cel61B或其组合。
另外，如本文所述，尽管经过预处理的生物质对总酶的比率高，显著的葡聚糖(glucan)和木聚糖(xylan)转化为糖类(sugars)和/或低聚糖(oligosaccharides)是容易实现的。例如，经过预处理的生物质的酶水解能够以比未经前述液氨预处理的生物质要快至少1.5倍的速度进行。
在一些具体实施方式中，用于预处理的氨和/或溶剂被回收(recycled)。在另外的具体实施方式中，液氨和/或溶剂被回用(re-used)于另一批木质纤维素生物质的预处理。如此液氨和/或溶剂的回收和/或回用能够以批式或半批式或连续的方式进行。
按照本文所述的预处理方法所得到的最终产品可以是生物燃料。
本发明的其他方面以及实施方式，将在下文中进一步描述。
附图说明
图1A为表示木质纤维素生物质的生化转换的工艺流程图。图1B显示了对木质纤维素生物质进行提取的基于液氨的预处理的工艺示意图。该工艺过程包括使用：1)氨预处理池，和2)提取物收集/分离池。
图2A和2B为显示未经处理的(A)和经过低氨(0.5∶1氨对生物质；0.6∶1水对生物质载荷)氨纤维膨胀/爆炸(AFEX)处理的(B)玉米秸秆的组织类型和细胞壁的高分辨电子显微图像。字母标识M、P、S1、S2和S3分别代表胞间层(middlelamella)、初生细胞壁(primarycellwall)、和次生胞壁层(secondarycellwalllayers)1-3。
图3A和3B提供了(A)采用不同化学物质将纤维素I转化为其它纤维素同质异形体的方案以及(B)对不同纤维素同质异形体(celluloseallomorphs)所获得的粉末X射线衍射光谱。
图4A显示了在本发明的具体实施方式中采用液氨(纤维素III；0.5小时，10℃，7∶1氨对干生物质载荷，0.05∶1水对干生物质载荷)、氢氧化钠(纤维素II)、28％氢氧化铵(1小时，4℃，10∶1液体对干生物质载荷)以及浓磷酸(非晶形纤维素)处理的纤维素(纤维素I)的粉末X射线衍射光谱。在所有例子中均采用艾维素(Avicel)作为纤维素基质(cellulosicsubstrate)。Y轴和X轴分别标示强度计数和两个θ角。
图4B显示了在本发明的具体实施方式中未经处理的(纤维素I)以及采用液氨(纤维素III；0.5小时，10℃，7∶1氨对干生物质载荷，0.05∶1水对干生物质载荷)处理的纤维素的粉末X射线衍射光谱。艾维素(Avicel)、棉短绒(cottonlinters)和原生棉(nativecotton)被用作纤维素基质。Y轴和X轴分别标示强度计数和两个θ角。
图5显示了在本发明的具体实施方式中不同纤维素同质异形体(有关样品制备条件详见图4A)在由SPEZYMECP和NOVOZYME188于50℃经过6和24小时酶水解的百分葡聚糖转换。
图6显示了在本发明的具体实施方式中液氨处理温度对纤维素III的酶消化性的影响。纤维素III衍生于艾维素。纤维素III的酶消化性，在5种不同的温度状态，经过24小时采用1.5FPU/g葡聚糖的SpezymeCP(配有Novo188；FPU＝酶的滤纸单位)进行了分析。在高于373K的温度，纤维素经过下述Maillard反应的降解导致水解产率的降低，表明较低温度会有益于尽量减少基于分解产物的葡聚糖的形成。
图7描述了在本发明的具体实施方式中未经处理的(纤维素I)和经液氨处理的(纤维素III)纤维素的酶消化性(有关样品制备条件详见图4B)。棉短绒和原生棉纤维作为纤维素酶的基物，酶的载荷为1.5或15FPU/g葡聚糖的SpezymeCP(补充有Novo188)。Y轴描绘水解6或24小时后的百分葡聚糖转换。
图8A描述了在艾维素(AV)中存在的晶体同质异形体的量的相对变化，有或没有氨+水处理(N＝氨载荷和W＝水载荷，每单位干重生物质)基于拉曼(Raman)谱峰强度(Iwavenumber)于各自的波数(如380和350cm-1)。预处理的条件标示于图例说明。拉曼峰的高度380和350cm-1被用作衡量处理后样品中存留的纤维质I的量，其中：
Pk(380/350)＝1-(I380/I350)；及
％Δ(380/350)unknown＝100*[Pk(380/350)]AV-unknown/[Pk(380/350)]AV-I.
图8B描述了未经处理的玉米秸秆(CS)、常规AFEX处理的玉米秸秆(AFCS，形成于130℃经过15分钟，采用1∶1氨对干生物质载荷，0.6∶1水对干生物质载荷)以及液氨处理的(富含纤维素III的)玉米秸秆的酶消化率(15FPUSpezymeCP纤维素酶/g葡聚糖)。在常规AFEX过程中没有纤维素III形成。在氨处理过的玉米秸秆中的纤维素III是通过AFCS由无水液氨(7∶1氨对干生物质载荷，0.05∶1水对干生物质载荷)在25℃经历2小时而形成的。
图9描述了通过X射线衍射检测的氨对干生物质载荷的重量比对于液氨预处理过程中纤维素III形成的影响。测得的氨对艾维素的重量比为6∶1，3∶1，2∶1和1∶1氨∶艾维素(wt∶wt)。预处理的时间为10分钟，除了6∶1氨∶艾维素0分钟的试样，其在采用液氨收缩试样后立即进行取样。未经处理的艾维素作为对照。
图10A描述了测定基于液氨的预处理过程中玉米秸秆内纤维素III生成的X射线衍射与拉曼光谱结果的相关性。预处理条件与前面图8B中针对液氨处理的玉米秸秆(富含纤维素III)所描述的相同。
图10B显示了在图10A中所使用的相同液氨预处理条件下在玉米秸秆和艾维素内部的纤维素III形成程度的相关性，表明通过使用相似的氨预处理条件在这两种基质中纤维素均能够被转化为纤维素III。
图11描述了木质素损失和％葡聚糖转换之间的相关性。一般来说，木质素去除程度的增加与葡聚糖转换的提高相关。木质素是通过采用一种基于氨法提取(Extractive-Ammonia)的工艺过程从生物质中去除的，该过程允许通过使用液氨连同细胞壁组分的提取来生产纤维素III。
图12显示了组成在采用常规AFEX预处理或提取液氨预处理(预处理条件详见表3)之后玉米秸秆的成分。通过采用提取过程并结合液氨预处理工艺所提取的各种成分的当前重量相对于未经处理的对照样显示于下面的X轴。因此，提取液氨预处理工艺提取了玉米秸秆中73％的阿拉伯聚糖和34.3％的酸不溶性木质素(被提取的酸溶性木质素未被测定)。然而，提取液氨预处理工艺只提取了6.3％葡聚糖，其余为处理前的生物质。
图13描述了在酶消化12、24和72小时之后针对下述基质观测的％葡聚糖转化：采用常规AFEX方法处理的玉米秸秆，采用提取液氨处理的玉米秸秆，未经处理的艾维素(纤维素I)以及用液氨处理的艾维素以生成纤维素III。所采用的酶是15mgAccelerase1500(GenencorDanisco)纤维素每克葡聚糖并且纤维素基质是在50℃及250RPM搅拌下按指定的时间进行培养。
图14A-D描述了在168小时水解后富含纤维素I(A，C)和富含纤维素III(B，D)的经过预处理的玉米秸秆在高固体载荷以及低(15mg/g葡聚糖)和高(30mg/g葡聚糖)纤维素酶载荷的葡聚糖和木聚糖转化。富含纤维素I经过预处理的玉米秸秆是经过常规AFEX预处理(130℃，1∶1氨对干生物质载荷，0.6∶1水对干生物质载荷，15分钟反应时间)获得的。富含纤维素III经过预处理的玉米秸秆是在液氨预处理(100℃，7∶1氨对干生物质载荷，0.05∶1水对干生物质载荷，2小时反应时间)之后未经提取而获得的。
图15描述了混合酶对于实现未经提取玉米秸秆，其是采用液氨预处理(100℃，7∶1氨对干生物质载荷，0.05∶1水对干生物质载荷，2小时反应时间)以生成纤维素III，的最佳消化的影响。观察到葡聚糖和木聚糖的消化。所使用的酶的总量为30mg并且消化过程被允许持续24小时。混合物沿着x轴以序号标示。酶1、2和3分别为Acellerase1500(A)，Multifect木聚糖酶(X)和Multifect果胶酶(P)。酶混合物4、5和6分别为50％A和50％X，50％A和50％P，50％P和50％X。混合物7有等量的A、X和P。混合物8、9和10分别有67％A-16％X-17％P，67％X-16％A-17％P和67％P-16％A-17％X。
图16A-F描述了以结晶状态和所用纤维素酶的函数关系表述的纤维素的酶消化性。针对衍生于艾维素(A)、棉短绒(C)和棉纤维(E)的纤维素I(菱形标记)和III(方形标记)显示了水解的时间过程。有关各种基质的X-射线衍射图谱显示于百分葡萄糖产量对时间的图示之上。艾维素是采用1.5FPUSpezymeCP纤维素酶/g葡聚糖进行水解的，而棉衍生基质是采用15FPUSpezymeCP纤维素酶/g葡聚糖进行水解的。为衍生于艾维素(B)，棉短绒(D)和棉纤维(F)的纤维素I(空白条)和III(阴影条)针对里氏木霉外切纤维素酶(Cel7A，Cel6A)和内切纤维素酶(Cel7B，Cel5A)的各种组合显示了酶性消化性能。每个测试所添加的当量酶载荷为2.5mg各种纤维素酶/g艾维素或者为10mg各种纤维素酶/g棉衍生基质。此外，将总纤维素酶的10％β-葡糖苷酶添加到每个试验混合物中以防止纤维二糖(cellobiose)的累积。在所有例子中，纤维素III是在95℃、7∶1氨对干生物质载荷、0.05∶1水对干生物质载荷，以及30分钟反应时间的条件下制备而成的。
图17描述了内切纤维素酶增加在晶体纤维素I(阴影条)和III(空白条)的水解过程中针对外切纤维素酶(Cel7A+Cel6A)所观察到的协同效应程度(degreeofsynergisticeffect，DSE)的影响。将内切酶Cel7B或Cel5A_tr(两者均来自里氏木霉)或Cel5A_ac(来自解纤维热酸菌(Acidothermuscellulolyticum))与外切纤维素酶Cel7A+Cel6A结合，如图沿x轴所示。被检测的基质是衍生自艾维素的纤维素I和纤维素III。所述基质用2.5mg示出的纯化酶进行培育。β-葡糖苷酶(纤维素酶总量的10％)被添加到每个试验中以防止由纤维二糖产生的抑制作用。y轴显示酶的不同组合的协同程度，其中较大的值表示基质的协同消化作用的增加。
图18显示在液氨预处理过程中添加丙酮作为共同溶剂导致纤维素I到纤维素III的有效转换。艾维素用含有丙酮的液氨在25℃下以不同的时间(2.5，7.5，10以及60分钟)进行处理。如图示，基本上所有的在液氨/丙酮混合物中孵化的纤维素I在2.5分钟之内都被转化为纤维素III。
图19A-D显示微生物发酵性能，针对的是富含纤维素III预处理玉米秸秆6％葡聚糖荷载水解物(关于如何制备这种水解产物详见图14)，其是在液氨预处理(100℃，7∶1氨对干生物质荷载，0.05∶1水对干生物质荷载，2小时反应时间)且未经提取之后获得的。这种改良过的酵母(酿酒酵母424A(Saccharomycescerevi-siae424A))能够生长到高细胞密度(图19A)并且容易在水解物中发酵葡萄糖(图19B)和木糖(图19C)从而在给定发酵期间内并且在未添加任何外源性营养物质或经过预处理的生物质解毒过程的情况下提供至少40g/L乙醇(图19D)。
具体实施方式
本发明涉及木质纤维素生物质(lignocellulosicbiomass)的预处理用来生成经过预处理的生物质，其更易于被消化为有用的糖类(sugars)，双糖(disaccharides)和低聚糖(oligosaccharides)。如本领域技术人员所知，从木质纤维素生物质释出有用产物的过程更为复杂，而且通常涉及与从基本上纯的纤维素释出产物的过程相比更多的步骤。
在下述有关优选实施方式的详细描述中，结合作为本发明之一部分的附图，并且通过举例可实施本发明的具体的优选的实施方式进行说明。这里以使本领域技术人员能够实施本发明技术的程度来对这些实施方式进行描述。应理解的是，可以采用其它实施方式，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以进行化学上、程序上以及其他方面改变。因此，以下详细描述不应看作是限制性的，本发明的范围只是由所附权利要求书以及由这些权利要求所享有的等同物的全部范围所限定。
定义
本文使用的术语“氨纤维爆炸(AmmoniaFiberExplosion)”或“氨纤维膨胀(AmmoniaFiberExpansion)”(下文中称为“AFEX”)预处理是指用氨预处理生物质使得木质素/半纤维素增溶和从在植物细胞壁之间再沉积到在生物质的外植物细胞壁表面再沉积的过程。AFEX一般包括用氢氧化铵处理生物质并且在常规AFEX过程中所采用的氢氧化铵浓度为55-65％。常规的AFEX条件也一般包括1∶1的氢氧化铵对生物质载荷，0.6∶1的水对生物质，130℃，以及15分钟的反应时间。由于在常规AFEX过程中添加相当量的水，从原生纤维素I结晶状态并不形成纤维素III结晶状态。然而，AFEX预处理会破坏木质纤维素基质，从而改变木质素的结构，部分地水解半纤维素，并增加纤维素和余留半纤维素对于后续酶性降解的可及性。木质素是原生生物质的酶水解的主要障碍，并且木质素的去除或转换是多种主要预处理技术，包括AFEX，的可能机理。然而，与许多其他的预处理过程形成对比，AFEX过程的较低温度和非酸性条件阻止木质素和/或半木质素转化为会对酶/微生物活动产生负面作用的糠醛、羟甲基糠醛、酚类和有机酸。该过程进一步使纤维素纤维扩展和膨胀并且进一步地使得非晶形半纤维素在木质生物质基质中分裂。这些结构性变化敞开了植物细胞壁结构，促进由木质纤维素生物质到增值产品的更为有效和完整的转化，同时保留物料的营养价值和成分。参见，比如，在美国专利6,106,888、7187,176、5,037,663和4,600,590中所描述的方法，所有这些专利在此通过引用完整地并入本文。
本文使用的术语“生物质(biomass)”一般来说是指由可更新的生物来源作为能量来源收获或收集的有机物质。可更新的生物来源可包括植物材料、动物材料和/或通过生物方法生产的材料。认为术语“生物质”不包括化石燃料，化石燃料不可更新。
本文使用的术语“植物生物质(plantbiomass)”或“木质纤维素生物质(lignocellulosicbiomass)”或“纤维素生物质(cellulosicbiomass)”是指实际上基于可持续发展的基础能用于能量的任何衍生自植物的有机物质(木质或非木质)。植物生物质可包括但不限于农作物废料和残余物，例如玉米秸秆、小麦秸秆、稻草、甘蔗渣等。植物生物质还包括但不限于木本能源作物、木材废料和残余物，例如树，包括果树，如结果的树(例如，苹果树、橘子树等)、软木森林疏伐、含树皮的废料、锯末、纸和纸浆行业废物流、木材纤维等。另外的牧草作物可能大规模生产作为另外的植物生物质来源，例如各种大草原草，包括大草原互花米草(prairiecordgrass)、柳枝稷(switchgrass)、芒草(miscanthus)、大须芒草(bigblues-tem)、小须芒草(littlebluestem)、垂穗草(sideoatsgrama)等。对于城市范围，潜在的植物生物质原料包括庭院垃圾(例如，草的修剪、叶子、树的修剪、灌木丛等)和蔬菜加工废物。已知植物生物质为自然界可用的碳水化合物的最普遍的形式，玉米秸秆为目前美国容易获得的植物生物质的最大的来源。
本文使用的术语“生物燃料(biofuel)”是指通过生物方法生产的任何可更新的固体、液体或气态燃料，例如，衍生自生物质的那些。大多数生物燃料起初衍生自生物过程，例如光合作用过程，由此可认为是太阳能或化学能量来源。其它生物燃料，例如天然聚合物(例如，几丁质或微生物纤维素的某些来源)，不是在光合作用过程中合成的，但是由于可生物降解而能看作是生物燃料。通常认为存在三种类型的衍生自在光合作用过程中合成的生物质的生物燃料，即，农业生物燃料(以下定义)、城市废物生物燃料(住宅和照明工业垃圾或废物，其中除去了大多数可再循环的材料如玻璃和金属)和林业生物燃料(例如，树、来自木材产品、木材纤维、纸浆和纸行业的废物或副产物流)。不是在光合作用过程中合成的由生物质生产的生物燃料包括但不限于衍生自几丁质的生物燃料，这些物质为纤维素的化学改性形式，称为N-乙酰基葡糖胺聚合物。由于含有海产品的壳，甲壳质为水产业所生产的废物中的显著的组分。
本文使用的术语“农业生物燃料(agriculturalbiofuel)”是指衍生自以下物质的生物燃料：农作物(例如，谷物，如玉米)、作物残余物、谷物加工设备废料(例如，小麦/燕麦壳、玉米/豆粉、规格外的材料等)、牲畜生产设备废物(例如，粪肥、尸体等)、牲畜加工设备废物(例如，不需要的部位、清洁流、被污染的材料等)、食品加工设备废物(例如，已分离的废物流，如油脂、脂肪、茎、壳、中间过程残余物、漂洗/清洁流等)、有附加值的农业设备副产物(例如，蒸馏器的湿谷物(DWG)和来自乙醇生产设备的浆等)等。牲畜行业的实例包括但不限于牛肉、猪肉、火鸡、鸡肉、蛋和奶设备。农作物的实例包括但不限于任何类型的非木质植物(例如，棉花)、谷物例如玉米、小麦、大豆、高梁、大麦、燕麦、黑麦等、药草(例如，花生)、短循环草本作物，如柳枝稷、苜蓿等。
纤维素(Cellulose)是一种分子式为(C6H10O5)n的多糖，其中n为100-200,000的整数。这样，一般来说，纤维素由数百至超过一万个β(1→4)连接的D-葡萄糖基的直链组成。所述β(1→4)链接有别于存在于淀粉、糖原和其他碳水化合物的α(1→4)糖苷键。与淀粉不同，纤维素是一种不带螺旋和分支的直链聚合物。相反，纤维素具有延伸的并且是相当僵硬的棒状构型，其中葡萄糖由一个链上的羟基与相同或相邻链上的氧形成氢键，将这些链并排地把持在一起并且形成微纤维。
有多种不同的纤维素晶体结构，这通常相对于在链之间或内部的氢键位置。原生纤维素是具有Iα和Iβ结构的纤维素I。由细菌和藻类产生的纤维素是富有Iα(Ialpha)而高等植物的纤维素主要由Iβ(Ibeta)构成。纤维素I经由含水氢氧化钠处理被不可逆地转化为纤维素II。纤维素IIII经由氨(例如，采用本文所述方法)处理能够由纤维素I而产生，而纤维素IIIII是由纤维素II而产生。这里所指的纤维素III是纤维素IIII。纤维素IV通常是在适当的溶剂(如丙三醇)中通过加热纤维素III而制备形成的。针对纤维素的不同晶体结构的X-射线衍射2θ角被列于后述的表1。
表1
纤维素I 14.6 16.4 22.6
纤维素III 11.7 20.6
纤维素IV 15.5 22.4
本文使用的术语“水分含量(moisturecontent)”是指生物质的水分百分比(例如，木质纤维素生物质)。用水的克数除以湿生物质(生物质干料加上水)的克数乘以100％来计算水分含量。在一些具体实施方式中，生物质(木质纤维素生物质)有约1％至约25％的水分。在另一些具体实施方式中，生物质(木质纤维素生物质)有约5％至约20％的水分。在进一步的具体实施方式中，生物质(木质纤维素生物质)有约10％至约20％的水分。在更进一步的具体实施方式中，生物质(木质纤维素生物质)有约15％至约20％的水分。
本文使用的术语“预处理步骤(pretreatmentstep)”是指热任何步骤用以改变天然生物质使其能够更为有效和经济地转化为反应性中间体化合物，例如糖类、有机酸等，其可被进一步加工成各种增值产品，例如增值化学品，比如乙醇。预处理能够影响聚合物基质的结晶程度，降低木质素对生物质转变的影响并且预水解一些结构上的碳水化合物，从而增加其酶性消化性并且加速生物质降解为可用产品。预处理方法可以利用具有不同浓度的酸(包括硫酸、盐酸、有机酸等)和/或其它组分例如氨、氢氧化铵、石灰等。预处理方法可以另外或可选择地利用水热处理，包括水、热量、蒸汽或加压蒸汽。预处理可以在各种类型的容器、反应器、管道、流通池等中进行或操作。大多数预处理方法会引起木质素的部分或完全增溶和/或去稳，以及/或着使半纤维素水解成为戊糖单体或低聚物。有关包括用液氨和/或植物壁成分的独特的预处理步骤或工艺过程，将于后文详细描述。
纤维素结构
纤维素以不同的多晶形态(I□，II，III，和IV)存在。纤维素的同质异形体(allomorphs)由含有链内和链间的氢键的分层的片层组成，并且，在某些情况下，这些片层可以通过氢键相互作用(Davisetal.，inAgriculturalBiomass，BiobasedProducts，andBiofuels.Chicago，Illinois(2007))。一些纤维素同质异形体(I及其可相互转化的同属IV1)缺乏层间的氢键而被认为呈现平行片层叠合，然而其它的(I，II和III)则含有层间的氢键。晶链组合(Crystalchainpacking)被认为在酶水解动力学中有重要作用。发现不同纤维素同质异形体用胃瘤细菌消化的消化相对速率按照下列顺序变化：非晶形＞IIII＞IVI＞IIIII＞I＞II。例如，在一项研究中，当使用纤维二糖水解酶I(Cel7A)时，纤维二糖从纤维素III1的生成比从纤维素I的生成高5倍(Igarashietal.，FEBSJournal274(7)：1785-1792(2007))。当利用确定的条件生产时，纤维素III可以通过在高温下与丙三醇或者水发生反应而转化回纤维素I。
纤维素的不同同质异形体可以通过多种方法制备，并且所述同质异形体能够基于其X-射线的属性或者使用拉曼光谱进行区分。图3A显示使用不同的化学品将纤维素I转化为其它异形体的方案。图3B显示不同纤维素同质异形体的粉末X-射线衍射图谱。亦见，Weimeretal.，ApplEnvironMicrobiol.57(11)：3101-3106(1991)。
用浓磷酸(＞81％w/w；4°，1hr)处理纤维素I导致固体完全溶解，并通过向溶液中加入过量的水而获得蓬松的低密度固体(Zhangetal.，BiotechnologyandBioengi-neering97(2)，214-223(2007)；Zhangetal.，Biomacromolecules7(2)，644-648(2006)；Swatloskietal.，JournaloftheAmericanChemicalSociety124(18)，4974-4975(2002))。已经知道纤维素在磷酸中的溶解会完全破坏纤维素结构的超分子构造，从而导致其从结晶态到非晶态的转变而不改变聚合程度。再生的非晶形纤维素的X-射线衍射图谱显示出相对平坦的没有特征峰的图谱，表明结晶度几乎完全失去。
艾维素(97-99％葡聚糖含量)可以采用不同的化学品进行处理以获得各种纤维素的同质异形体，从而在可比的酶载荷的情况下比较它们的X-射线衍射谱图(图3B)和酶性消化性。用氢氧化钠(25％，w/w)对艾维素在4℃下处理1小时给出特征的纤维素II模式，并且在22度2-西塔(2θ)的X-射线衍射峰相对降低并伴有在20和12度2θ的峰的增高。
用氢氧化铵(28-30％，w/w)在4℃处理纤维素I(艾维素)1小时，未引起晶体结构的明显改变。这个结果并非完全出乎意料，因为氢氧化钠是一种强碱并且需要高于10-15％的浓度去破坏原生纤维素I中的氢键网络并形成纤维素II。
纤维素III的形成可以由其特征的X-射线衍射图谱模式来检测，其中在22度2θ峰消失并伴有在20度和12度2θ突峰的形成。这样的X-射线衍射图谱模式与文献中对来自棉的纤维素III的报道是类似的。用氢氧化铵(不同浓度的)对纤维素III的处理也被报道过会导致逆转为纤维素I。
本发明的一方面是描述纤维素晶体结构对纤维素酶消化性的影响。各种纤维素基质(例如艾维素、棉短绒、棉和玉米秸秆)都被用于这些研究中。在一个具体实施方式中，通过对基质利用无水液氨或者含有80％或以上氨的溶液进行处理，原生纤维素I□可以转换为纤维素IIII。与某些报告不同，采用氢氧化铵对纤维素I□进行处理后基本上没有纤维素III的形成。事实上，在通过常规步骤用氨对对纤维素I□进行处理的过程中大量水的存在抑制了纤维素III的形成。
采用液氨的预处理
本发明的一方面是一种由木质纤维素生物质制造产品的方法，包括通过采用液氨处理木质纤维素生物质将转化原生纤维素Iβ转化为高度可消化的纤维素III同质异形体。液氨可以是无水的或者是溶剂中80％-90％氨的溶液。通常情况下，本文所描述的预处理条件是降低严重程度的(温度、压力、停留时间和单位量生物质的化学品载荷)从而提高生物炼制的经济可行性。在一个具体实施方式中，所述方法还涉及提取植物壁组分，例如由木质纤维素生物质提取木质素，这可以在预处理过程中或之后完成。
本发明所描述的方法一般允许在单位重量的生物质中降低酶的载荷，从而能够进一步提高生物炼制的经济可行性。预处理操作和酶一起往往占常规生物炼制中大约27％的总运行成本，这通常被认为是在原料成本(33％)之后的第二重要的因素。因此，需要降低生物质解构到可发酵糖类的成本以提高生物炼制过程的经济可行性。
对于预处理参数(氨/水载荷，停留时间，温度)对纤维素I转化为纤维素III的影响，通过X-射线衍射和拉曼光谱研究进行了量化。对于在经过预处理的纤维素样品中葡聚糖可参与酶水解的程度，也通过采用带有选定的酶的样品的消化作用进行了评估。如本文所述，某些酶组合对经过预处理的纤维素的消化是特别有效的，而其他的组合效力就差一些。
针对纤维素的不同酶水解动力学依赖于纤维素的结晶形式，其中纤维素的最易被消化到最不易被消化形态的顺序是：非晶形纤维素＞纤维素IIII＞纤维素II＞纤维素I。纤维素IIII的酶水解率至少是超过原生纤维素I的两倍。如本文所述，纤维素III水解率的显著改善可以通过使用内切葡聚糖酶来实现。此外，最佳水解率是通过使用选定的外切纤维素酶和内切纤维素酶的组合而获得的。纤维素III相对于原生纤维素在葡聚糖链组合(通过氢键的改变以及疏水相互作用)上的差异或许会是导致水解率大幅提高的原因。
利用浓酸或离子液体溶解纤维素然后通过其由水的沉淀作用，在结晶纤维素内对分子间氢键的完全破坏，形成了大部分的非晶形纤维素。这样的处理过程能够有助于提高酶的水解率。目前还没有研究解释为什么纤维素片层内和片层间氢键网络的完全破坏提高了纤维素酶的活性。不过，即使非晶形纤维素通常更容易被消化，纤维素生物炼制的非晶形纤维素工业规模生产通常是能耗大且在环境上是不可持续的。因此，从其它形式的纤维素生产有用的糖类和葡聚糖的工艺过程是本发明的重点。
本文描述的方法允许将纤维素的氢键网络从其天然存在的结晶形式(称为纤维素I)改变为活化的形式(称为纤维素III)，其比纤维素I更容易被消化。这种纤维素I到纤维素III的转化是通过将纤维素I与无水液氨或者含有80％及以上氨的溶液进行反应来有效地进行。液氨和纤维素I晶体之间的相互作用导致链内和片层内的氢键模式的变化以及新的片层间氢键的形成。在纤维素I至III的转化过程中，氨分子穿透到纤维素I晶体中并形成称为氨-纤维素I的结晶复合物，在此每个氨分子都处于由四个相邻的葡聚糖链的边缘所定义的扭曲的框格中。X-射线和中子衍射研究已经表明，在晶体内的氨分子通过多个氢键与相邻的链发生相互作用。氨蒸发之后，纤维素并未逆转到其初始的结晶形式(纤维素I)而是采取新的纤维素III形式。图3和4显示纤维素I和纤维素III的X-射线衍射光谱是不同的。本发明人已经发现，在纤维素III氢键网络内的这种微妙的结构上的变化提高了其整体酶水解率，高达原生纤维素I的五倍。
此外，由于采用了降低的水量，从氨水-水物流中回收氨的成本也就降低了。
对常规AFEX(氨纤维膨胀)的预处理参数对衍生于艾维素的纤维素III的形成程度的影响利用拉曼光谱进行了研究。纤维素I到III转化的程度通过在380和350cm-1拉曼峰的相对强度进行评估，对应于100％的纤维素III标准样，其相对于纤维素I表现出在峰比值上的82％减少。当纤维素I在有水存在(在NH4OH中有16％或更多的水)的情形下进行常规的AFEX处理，该比值只出现了稍微的下降(3-6％)。然而，当纤维素I采用基本上没有加入水(液氨中＜5％的水)的氨进行处理的时候，该比值呈现31-39％的下降，表明发生了纤维素I向纤维素III的明显转化。
已获结果表明，通过调整预处理条件能够同时改善纤维素的可及性(通过去除使纤维素原纤维结壳的木质素-半纤维素)和改变纤维素I到纤维素III的晶体结构。一般来说，使用无水液氨或含有80％-85％或以上的溶液可以实现由纤维素I至纤维素III的完全转化。不存在明显的水也可以防止纤维素III逆转为纤维素I。以前，在有水存在和/或过度加热的情况下观察到纤维素III至纤维素I的40-100％逆转(Lewin&Roldan，J.Polym.Sci.PartC-Polym.Sympos.36：213-229(1971))。
此外，用氨预处理的温度是重要的。例如，艾维素(基本纯的纤维素I)通过液氨(7∶1氨∶艾维素)在不同的温度(5-130℃)下处理30min用以研究在氨处理过程中温度对于酶性消化率的影响。如图6所示，尽管在所有这些反应条件下纤维素I被转化为纤维素III，在经过高于100℃预处理的纤维素上的纤维素酶的酶活性有明显的降低，而且在这些较高温度下的产物常常发黑。这种变黑和消化性差可归因于形成了Maillard降解产物，其经本发明人观察为是在基于高温的预处理过程中形成的。
艾维素是基本纯的纤维素Iβ。在对木质纤维素生物质进行预处理时，可采用稍高一些的温度。这种较高的温度可以帮助释放木质素以及其它植物壁组分。
因此，虽然较低的温度通常足以在基本纯的纤维素样品中使大部分的纤维素I转化为纤维素III，稍高的温度可以用于木质纤维素生物质的预处理。采用液氨对木质纤维素生物质进行预处理的适用温度范围包括从约10℃至约180℃。在一些具体实施方式中，采用液氨的预处理温度范围包括约20℃至约150℃。在另一些具体实施方式中，采用液氨的预处理温度范围包括约50℃至约140℃。在进一步的具体实施方式中，采用液氨的预处理温度范围包括约80℃至约120℃。所采用的液氨可以是无水氨或含有80％或以上氨的溶液。
木质纤维素生物质一般是用选定的液氨预处理约1分钟至约48小时。在一些具体实施方式中，预处理持续约2分钟至约24小时。在进一步的具体实施方式中，预处理持续约3分钟至约6小时。在其它具体实施方式中，预处理持续约5分钟至约2小时。
氨对生物质的比值可以不同。特别是，氨对生物质的重量比可以在2∶1至8∶1氨对生物质载荷的范围变化。
在一个具体实施方式中，将碾磨/干燥的木质纤维素生物质施于液氨预处理达到合适的停留时间，比如至少为约15分钟或以上，例如高达约30，60，90，129，150，180，210或240分钟及其间的任何范围，在合适的温度，比如至少约0℃或以上，例如高达约5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，75，80，85，90，95或100℃及其间的任何范围或特定的温度。由于碾磨/干燥的生物质在液氨中被完全浸泡，相比于常规AFEX处理而言质量转移会得到改善。
采用的液氨可以是无水液氨或在溶剂中80％-99％氨溶液。具体地，用于预处理的液氨可以是从约80％至约99％之间的任意百分比的氨。在一些具体实施方式中，所述液氨是在溶剂中82％-98％氨的溶液。在另外的具体实施方式中，所述液氨是在溶剂中85％-95％氨的溶液。在进一步的具体实施方式中，所述液氨是在溶剂中80％-90％氨的溶液。在更进一步的具体实施方式中，所述液氨是在溶剂中87％-98％氨的溶液。所述溶剂可以是水。或者，所述溶剂可以是有机溶剂如丙酮，乙醇，甲醇，异丙醇，二氯甲烷，乙酸甲酯，乙酸乙酯，氯仿以及它们的组合。用挥发性溶剂代替水也可以改善植物壁组分(例如木质素)采用本文所述的提取步骤(见实施例4)所进行的提取。此外，用挥发性溶剂代替水可以减少工艺过程中对氨进行回收的能量投入。
亦如本文所述，纤维素III可以由含有纤维素I的原料通过使用液氨在有机溶剂(例如丙酮)存在情况下制备而成。在一些具体实施方式中，所述溶剂是水或丙酮或它们的组合。如本文所述，使用丙酮结合氨在预处理过程中将纤维素I转化为纤维素III是一种高效的方式。事实上，相当量的丙酮可被有效地利用。因此，液氨对丙酮的体积∶体积之比值可为10∶90至99∶1，或为10∶90和99∶1之间的任意比例。在一些具体实施方式中，液氨对丙酮的体积∶体积之比值为10∶90至80∶10。在其它具体实施方式中，液氨对丙酮的体积∶体积之比值为20∶90至80∶10。在进一步的具体实施方式中，液氨对丙酮的体积∶体积之比值为30∶90至70∶10。
注意到，木质纤维素生物质通常含有水。此外，在木质纤维素生物质中水的量是可以变化的，例如，约3％至20％的水。在一些具体实施方式中，生物质在氨处理之前被研磨和干燥到合适的含水程度。例如，含水程度可被降低到基于干重(dwb)少于约15％含水量以提供研磨/干燥的生物质。当描述用于预处理的氨的百分比或浓度的时候，木质纤维素生物质中的水含量一般不予考虑。因此，当提到使用无水氨或在溶剂中80％-99％氨的预处理的时候，无水氨或80-99％氨是添加到木质纤维素生物质中的实际预处理液体。
液氨预处理可以在任何合适的场所进行。在一个具体实施方式中，液氨预处理是在利用从当地生物质处理中心提供的经过常规氨预处理的原料的集中生物炼制设施中进行的(Carolanetal.，JAgriFoodIndOrg5，10(2007))。
本文描述了使用高浓度液氨有效地将木质纤维素生物质中的纤维素I转化成纤维素III的方法。这不同于采用常规AFEX预处理的方法，后者需更多的水并且使用高压反应器以维持氨处于液相。通常地，在施用于常规AFEX预处理的木质纤维素生物质中很少或没有纤维素III形成。
然而，在另一具体实施方式中，本文所描述的新方法是在木质纤维素生物质被施用于比如AFEX、ARP(氨循环渗滤(ammoniarecyclepercolation))或者类似的常规预处理过程之后进行的。这些常规预处理不形成纤维素III，因此，纤维素I在这些处理过的生物质样品中是通过使用本文所述的过量的液氨而转化成纤维素III的。然而，液氨预处理可以在低温(＜25℃)和/或低压下进行。例如，所述温度可以是约10℃至约50℃，而且液氨预处理可以在常压下按照约0.5小时至2小时的合适停留时间进行操作。结果是，所述生物质在不需大的热量和使用高压反应器的情况下可被成功地进行预处理。不同于常规高含水的AFEX预处理方法，从浓的氨溶液(或无水氨)形成的纤维素III不会逆转为纤维素I。
此外，一些研究表明AFEX预处理增加生物质的孔隙度，即使可能有很少的纤维素I转化为纤维素III。例如，图2A和2B分别显示通过高分辨电子显微镜检测未经处理的(A)和AFEX处理过的(B)玉米秸秆的植物组织和细胞壁(Chundawat，S.，2009.ChemicalEngineering&MaterialsScience.Ph.D.Dissertation.MichiganStateUniversity，EastLansing)。因此，这样的AFEX处理过程可以使得生物质对于酶处理更为可及。
在一个具体实施方式中，在当地生产处理中心生产了低成本丸状的、常规AFEX处理过的原料以同时用来作为动物饲料。在一个具体实施方式中，所述AFEX处理过的原料被输送到生物精炼设施采用液氨做进一步的预处理。采取这种方式，纤维素I在低温下被转化为纤维素III，从而尽量降低了对高压反应器的需要，并且允许分别地回收木质素物流和半纤维素物流，因此允许通过化学催化生产其他的燃料。这也将有助于最大限度地降低为了生产纤维素III的在高压反应器上的投资，同时，低成本的常规AFEX有助于破坏木质素-碳水化合物复合体(LCC)的酯键连接以改善酶可及性。
在一个具体实施方式中，采用低温下液氨处理也可以防止由次级细胞壁木质素聚结(由于玻化转变温度＞130℃)成为酶抑制球体(Chundawat，S.，2009.Ultrastruc-turalandphysicochemicalmodificationswithinammoniatreatedlignocellulosiccellwallsandtheirinfluenceonenzymaticdigestibilityChemicalEngineering&MaterialsScience.Ph.D.Dissertation.MichiganStateUniversity，EastLansing)。
在一个具体实施方式中，木质素-碳水化合物复合物(lignin-carbohydratecom-plex，LCC)的酯键连接在预处理过程中被裂解，这改善了酶的可及性。较高的温度(＞50℃)或较长的停留时间(数小时至数天)有助于酯键的氨解作用。Chundawat，S.，2009.UltrastructuralandphysicochemicalmodificationswithinammoniatreatedlignocellulosiccellwallsandtheirinfluenceonenzymaticdigestibilityChemicalEngineering&MaterialsScience.Ph.D.Dissertation.MichiganStateUniversity，EastLansing。
令人惊讶的是，由本发明人进行的研究表明吸附到纤维素I的同质异形体的酶总量可能大于吸附到纤维素III的同质异形体的量。然而，结合到纤维素III同质异形体的酶通常具有更高的效力，尤其是在使用特定的酶的组合的情形。因此，尽管酶可以通过疏水的和其他相互作用结合到纤维素I同质异形体，这样的结合更少会造成纤维素链的断裂。与发生于纤维素I的相反，与纤维素III同质异形体结合的酶趋向于有更大的进行性(processivity)，并且，由于葡聚糖链更大的热振动和纤维素III纤维表面降低的疏水性降低，所述酶可以更好地穿透纤维素III物质。
与常规的预处理方法相比，酶载荷是降低了，而且与常规的预处理方法相比，酶水解作用是增加了。在一个具体实施方式中，纤维素IIII的酶水解率是至少两倍高于原生纤维素Iβ。
在液氨预处理过程中从原生纤维素I形成的纤维素III同质异形体具有至少两倍，高达2.5倍(或更高)的酶水解率。令人惊讶的是，吸附到的纤维素I同质异形体的酶(包括纤维素酶)的总量可能大于吸附到纤维素III同质异形体的量。然而，结合到纤维素III同质异形体的酶通常是更高效的，尤其是在使用特定的酶的组合的情形。因此，尽管酶可以通过疏水的和其他相互作用结合到纤维素I同质异形体，这样的结合，与酶结合到纤维素III同质异形体的情形相比更少会造成纤维素链的断裂。与发生于纤维素I的相反，与纤维素III同质异形体结合的酶趋向于有更大的进行性，并且，由于葡聚糖链更大的热振动和纤维素III纤维表面降低的疏水性降低，所述酶可以更好地穿透纤维素III物质。
根据本发明，某些酶和酶的组合在消化纤维素III同质异形体上是特别有效的。分泌真菌纤维素酶和络合细菌纤维素酶都被研究作为潜在方式解构木质纤维素用于生物燃料应用。然而，里氏木霉，由于其分泌真菌酶的高蛋白滴度和显著的水解活性，一般来说更具有商业价值。很可能纤维素同质异形体的类型也会影响真菌纤维素酶在利用能够有效地水解糖苷键的基质形成催化活性复合物之前从同质异形体的晶体表面有效地提取纤维二糖单位或使其去晶。(参见Chundawatetal.，De-constructionofLignocellulosicBiomasstoFuelsandChemicals，Annu.Rev.Chem.Biomol.2(2011)，其特别地通过参考引用全部纳入本文)。在纤维素III中葡聚糖链的灵活性的增加是取决于其晶体结构，并导致整体水解产量的增加。
然而，并非所有观察到的增强作用都可归因于纤维素结构的重组，只有从外切纤维素酶和内切纤维素酶的一些特定混合物才能观察到消化效率的显著增加。如本文所示，与单独使用的外切纤维素酶相比，纤维素内切酶的加入明显地加速了纤维素III的解聚作用。
原真菌纤维素酶混合物通常由50-80％外切纤维素酶(40-60％Cel7A，10-20％Cel6A)和10-25％内切纤维素酶(5-10％Cel7B，1-10％Cel5A，1-5％Cel12A，＜1％Cel61A)组成。(Rosgaardetal.，Biotechnol.Prog.23(6)：1270-76(2007))。
但是，如本文所示，这样的混合物不包括大量最有效的纤维素酶组合。因此，本发明人发现，Cel7B是对于纤维素酶的最为有效的降解酶，随后是Cel5A，Cel12A和Cel61A。内切纤维素酶对于纤维素晶体沿着葡聚糖聚合物链任意地造成内切(endo-cuts)，这就协同地导致外切纤维素酶活性的增加。内切纤维素酶和外纤维素的协同作用，在对纤维素III具有工业意义的低酶载荷的情况下，允许葡聚糖向葡萄糖的接近理论上的转化。相反地，先前报道的工艺采用了10-20倍高的Cel7A量而没有加以内切纤维素酶，但所达到的是远低于理论上的葡聚糖转化(Igarashietal.，FEBSJournal274(7)：1785-92(2007))。当衍生于较低结晶度植物的纤维素III基质在具有工业意义的低酶载荷(＜10mg酶总载荷/g葡聚糖)条件下被水解时，本发明人发现，只有当Cel7A与合适的内切葡聚糖酶结合时，才会出现整体葡聚糖转化的明显改善。
举例来说，可以采用的酶包括，例如水解纤维素的酶，如纤维素酶(cellulase)，内切葡聚糖酶(endoglucanase)，纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase)以及β-葡萄糖苷酶(beta-glucosidase)。在另一具体实施方式中，所述酶可以是半纤维素酶(hemicellulase)，酯酶(esterase)，蛋白酶(protease)，漆酶(laccase)，过氧物酶(peroxidase)或它们的混合物。可用于消化纤维素III同质异形体的酶的其它例子包括纤维二糖水解酶和/或内切纤维素酶。这种纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase)和/或内切纤维素酶(endocellulase)的例子包括Cel7A，Cel6A，Cel7B，Ccl5A-tr，Cel61A，Cel61B，Cel5A-ac和Cel12A(参见网站www.cazy.org)。
在一些具体实施方式中，可以使用的酶的组合包括Cel7B。这样的组合可以包括两种或以上的酶。在另外的具体实施方式中，可以使用三种或更多的这样的酶的组合。本文提供的数据显示，下列酶的组合用于消化纤维素III同质异形体是很有效的：Cel7A和Cel7B。本文提供的另外的数据显示，下列酶的组合用于消化纤维素III同质异形体是很有效的：Cel7A，Cel6A和Cel7B。本文提供的进一步的数据显示，下列酶的组合用于消化纤维素III同质异形体是很有效的：Cel7A，Cel6A和Cel5A_tr和/或Cel7A，Cel6A和Cel5A_ac。在一些具体实施方式中，通过这样的酶的组合纤维素III同质异形体比纤维素I被消化至的程度更大。
这样的酶可以从包括里氏木霉的多种来源获得。
植物壁成分的提取
几乎所有形式的木质纤维素生物质，即植物生物质比如单子叶植物，包括三个主要的化学组分：半纤维素，纤维素和木质素。半纤维素是短的、高支化的聚合物，其大多为五碳戊糖(木糖和树胶醛糖)而在较低程度上为含量的六碳己糖(半乳糖，葡萄糖和甘露糖)。双子叶植物，在另一方面，具有高含量的果胶酸脂和/或果胶，其为一种α-联接的葡糖醛酸的聚合物。果胶酸脂也可用甘露糖或鼠李糖“修饰”。这些糖类具有高度的乙酸取代。
纤维素往往构成来源于农业、城市及林业的残渣的30％至50％。纤维素比半纤维素更难以水解，但一旦水解，能比半纤维素更有效地通过葡萄糖发酵转化为乙醇。由于其支链化结构，半纤维素是非晶形的，并且通过酶或稀酸处理相对容易被水解(分解或分裂)成为单独的成份糖。与此对照，半纤维素的糖聚合物相对容易被水解，但不如纤维素那样采用标准发酵菌株而高效地转化(由葡萄糖生成乙醇)。虽然半纤维素糖对于转化为乙醇来说代表“低挂”的果实，但是相当高含量的纤维素表示基于每吨植物生物质使醇(例如乙醇)的产量最大化所具有的更大潜力。
如上所述，纤维素是葡萄糖类的线性聚合物，很像淀粉，其为干颗玉米粒和湿磨乙醇植物中的主要基质。然而，与淀粉不同，纤维素的葡萄糖类是通过β-葡萄糖苷键联接在一起，这使纤维素形成紧密联系的线型链。由于在纤维素链之间能够形成高度的氢键，纤维素形成刚性的晶体结构，该结构是高度稳定的并且与淀粉或半纤维素聚合物相比更能抵抗化学品的水解或酶的攻击。特别地，已经知晓纤维素结晶度、木质素-碳水化合物复合体(LCC)的酯键连接以及对细胞壁成分(如木质素)的非特异性酶结合对于有效的细胞壁解构是主要的速度限制步骤。
木质素，其为一种酚类分子的聚合物，对植物提供结构上的完整性，并在植物生物质中的糖类被发酵成乙醇之后仍保持为残余料。木质素是一种乙醇生产的副产物，并且由于其低硫含量和热值(其接近次烟煤的热值)而被认为是一种优质的固体燃料。
然而，用于消化纤维素原料以及发酵有用糖类的酶类和微生物由于与木质素的相互作用而受到抑制。其他植物壁材料和通过预处理产生的降解产物也可以抑制这些酶和微生物(Pan，J.BiobasedMater.Bioenergy2(1)，25-32(2008)；Klinkeetal.，AppliedMicrobiologyandBiotechnology66(1)，10-26(2004))。这些抑制作用的程度取决于预处理条件以及细胞壁在预处理过程中发生了何种改变。
如本文所述，采用液氨的、以及导致形成高度可消化的纤维素III同质异形体的生物质预处理方法可以包括对生物学上抑制性的细胞壁成分(如木质素、木质素分解产物、低聚木糖、酰胺)进行提取(extraction)。所述细胞壁成分可以在液氨预处理过程当中或之后从木质纤维素生物质提取出来。通过采用本文所述预处理方法稳定纤维素III，以及通过提取出顽固的木质素/木质素降解化合物，可以降低酶的载荷，并且提高酶水解率。
木质素和半纤维素的去除，通过增加纤维素对酶的暴露表面积与体积比，能够增加酶对纤维素的可及性。最新进展表明，AFEX预处理增加生物质的孔隙度，尽管可能出现少量纤维素I转化为纤维素III。例如，图2A和2B分别显示通过高分辨电子显微镜观测的未经处理的(A)和经AFEX处理的(B)玉米秸秆的植物组织和细胞壁。(Chundawat，S.，2009.ChemicalEngineering&MaterialsScience.Ph.D.Dissertation.MichiganStateUniversity，EastLansing)。因此，AFEX处理，例如，在液氨处理之前可以使生物质对于酶处理来说有更高的可及性。
如上所述，木质素通常会抑制被预处理的生物质的酶和微生物的消化/发酵。因此，本发明的另一个方面涉及去除木质素(包括降解木质素和其它细胞壁降解产物)的方法以降低酶载荷和提高水解物的发酵性能。这样的方法可以提高纤维素生物炼制的经济可行性。
本发明的具体实施方式允许回收两部分的物流，即富含纤维素物流和富含半纤维素-木质素物流，例如，在氨预处理期间或之后。如本文所述，木质素通过氨预处理而动换并且大量的能够通过进行氨预处理的提取作用而被去除。
因此，例如，可以采用能够进行植物壁组分提取操作的反应器，其具有两个主要部分：1)氨预处理单元，以及2)提取物收集单元(图1B)。氨预处理可以在氨预处理单元中进行。这种预处理溶解将从生物质释放的提取物。一旦超过所选定的反应时间，通过使用加压氮气并开启这两个单元之间的阀门，使提取物收集单元的压力设为与氨预处理单元的相同。可以采用氮气过压来防止氨气在氨预处理单元中汽化并驱使液相流到提取物收集单元。在氨预处理单元的底部设置的过滤器防止固体流到提取物收集单元，但所述过滤器具有足够孔隙率的孔隙而允许液体和被溶解的植物壁组分通过。例如，所述过滤器可以是50微米，80微米或100微米的过滤器。可设置阀门用来使提取物收集通到排气室，从而氮/氨的蒸汽能够流进排气室，并且该汽流能被调节以防止氨在提取物单元中的快速蒸发。从氨预处理单元中除去提取物之后，氮气过压阀门被关闭，并且提取物收集器单元中的气体被缓慢地释放到排气室直到系统达到大气压。这时，经过预处理的生物质以及相应的提取物均可以从系统中移除，以做进一步分析。
在一个具体实施方式中，在确定的停留时间之后，液体部分(即液氨和可溶解的降解产物、木质素和低木聚糖)被分离出固体(其在该阶段后富含纤维素III)。然后，氨可以进一步由液体部分蒸发从而得到细胞壁提取物和重新获得的氨。在一个具体实施方式中，重新获的氨被回用或回收以用于氨预处理过程。在预处理过程(即具有细胞壁酯的氨解反应)消耗的氨的量也可以在此阶段补充或添加。在另外的具体实施方式中，带有提取物的液氨能够被用来以连续的方式对后续批次未处理的生物质进行预处理，然后再从提取物中重新获得。因此，本文中所描述的新方法可以采用连续的方式或者分批操作。
在一种具体实施方式中，富含纤维素的固体部分被用于生产生物燃料(在酶水解和发酵之后)。富含纤维素的固体部分可以与半纤维素和木质素分离开来。半纤维素和木质素也可以被分开。半纤维素被用于其他的用途，包括但不限于，作为可溶性诱导剂用于微生物以生产半纤维素酶、燃料和/或用于例如化学催化等的其它产物。被分离的木质素也可以用于多种途径，包括但不限于，燃烧发电，催化化学合成和/或作为在生物材料生产中的树脂/粘合料，以及诸如此类。
液体燃料和化学制品可由木质纤维素生物质通过基于“糖平台(sugarplatform)”的方法进行生产。在这个过程中，如上所述，木质纤维素生物质通过酶被预处理和水解以生产可发酵的糖类。然后，这些糖类可以用作发酵微生物的碳源以生产燃料/化学品和/或被直接用于通过如图1所示的催化过程的化学合成。通过这个过程，预处理和酶水解过程构成了将植物细胞壁解构生成可发酵的糖类的基础，而所述糖类可以用于生产商业上有用的产物，例如通过化学合成的各种化学产品和/或通过发酵过程的各种生物燃料。
常规预处理
在本领域中有多种已知的预处理方法。这些处理方法包括，例如，浓酸水解预处理和两段加酸水解预处理。其它预处理包括水热或化学预处理，随后酶水解(即酶催化水解)或同时酶水解和糖化。其它预处理方法还可以包括稀酸水解(Schelletal.，AppliedBiochemistryandBiotechnology105(1-3)：p.69-85(2003)；Wymanetal.inAIChEAnnualMeeting.SanFrancisco，California(2006)；Wyman，IntegrationofLeadingBiomassPretreatmentTechnologieswithEnzymaticDigestionandHydrolyzateFermentation，DepartmentofEnergy.p.1-10(2005)；Mohagheghietal.，ApplBiochemBiotechnol.33：67-81(1992)；Eggeman&Elander，Processandeconomicanalysisofpretreatmenttechnologies.BioresourceTechnology96(18)：2019-2025(2005)；Vargaetal.，AppliedBiochemistryandBiotechnology114(1-3)：509-523(2004))。此外，有些预处理工艺涉及采用高压热水的方法，即水热处理比如蒸汽喷发(steamexplosion)(Playne，BiotechnologyandBioengineering26(5)：p.426-433(1984)；Mackieetal.，JournalofWoodChemistryandTechnology5(3)：405-425(1985)；Ballesterosetal.，Ap-pliedBiochemistryandBiotechnology130(1-3)：496-508(2006)；Hongzhang&Liying，BioresourceTechnology98(3)：666-676(2007))。其它预处理涉及水相热水提取，反应器系统(例如，分批处理、连续流、逆流、穿流、等等)，AFEX，氨循环渗滤(ARP)，石灰处理和基于pH的处理。
基于氨的预处理促进了酯键的水解，是由于分别存在形成羟基离子和氨的水解(例如酸类)和氨解(例如氨基化合物)的降解物。对于氨具有高浓度的过程，氨解反应占主导，降低水解物的毒性。类似于其他的碱性预处理(NaOH，CaOH)，在AFEX过程中LCC键的断裂促使木质素和半纤维素离开纤维素的位移(Chunda-wat，S.，2009.ChemicalEngineering&MaterialsScience.Ph.D.Dissertation.MichiganStateUniversity，EastLansing)；Balanetal.，BiotechnologyProgress25(2)：365-375(2009)；Yoonetal.，AppliedBiochemistryandBiotechnology51-52(1)：5-19(1995)；Kim&Lee，BioresourceTechnology96(18)：2007-2013(2005)；Kimetal.，AppliedBio-chemistryandBiotechnology133(1)：41-57(2006)。
在这些过程中的温度可以为约50至约290℃。氨循环渗滤(ARP)和稀释氢氧化铵技术，例如，采用约150至约180℃的温度，具有约30至120分钟的停留时间，利用高压液体循环，并且带有每克干重生物质约3至20克水的水载荷。利用这些方法，通过将半纤维素和木质素从纤维素分离到液体部分(通常导致低固态载荷)生物质被分为固体和液体部分，随后为后续工艺过程进行中和与/或氨回收。然而，无论ARP还是以氢氧化铵为基础的常规处理过程都不会产生明显有效的纤维素III(其比原生纤维素I更易消化)。
此外，根据比如上文所提及的常规方法的植物生物质水解的预处理，常常会导致产生或者释放一些其它的抑制微生物发酵的化学物质。这些抑制性物质(例如糠醛)在很大程度上为糖降解物，从而需要有除去这些抑制性物质或者减少其形成的手段。或者，需要对这些抑制性物质具有抵御性的微生物菌株。
多种这样的方法提供对半纤维素成分几乎完全的水解，以有效地回收高产率的可溶的戊糖。然而，半纤维素的化学增溶也会产生有毒的产物，例如呋喃衍生物，其可以抑制下游微生物反应(比如发酵)。不管怎样，半纤维素的水解促进了周围半纤维素和木质素的物理去除，从而使纤维素暴露于后续处理操作。然而，大多数的(如果不是所有的)常规预处理方法并不会显著地水解生物质的纤维素部分。
与上述的常规预处理方法不同，在本文所述的预处理过程中纤维素I至非晶形纤维素或纤维素III1的转化形成高度可消化的生物质。在一种具体实施方式中，用于该过程中的生物质是植物木质纤维素生物质。
生物质转化为醇的工艺也会引起独特的有关发酵的考量。用于常规玉米乙醇植物的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的酵母菌，例如，可以发酵葡萄糖，但不能发酵如木糖的戊糖糖类。此外，目前没有天然存在的微生物可以有效地将存在于植物生物质中的所有主要糖类转化为乙醇。因此，基因改良过的酵母或细菌，其在理论上可以使葡萄糖和木糖发酵成醇，被用于生物质到醇的过程。然而，在实践中，共发酵是低效的并且葡萄糖发酵仍然是乙醇生产的主要反应。此外，发酵性微生物的基因改良过的重组菌株，包括酵母、细菌和真菌的重组菌株，以及来自此类成分的转基因核酸(DNA，RNA)，可能会带来环境处置和许可问题。
本发明将通过参考下面的实施例作进一步的阐述，这些实施例被用来进一步描述本发明的各种具体实施方式。然而，应当理解，可能有许多各种各样的变化和修改仍然落入本发明的范围之内。
实施例1：低温氨处理
本实施例描述了不同纤维素同质异形体的一些属性，并讨论了纤维素的来源是否会影响纤维素的转化以形成被酶更佳消化的形式。
通过观察针对各种纤维素X-射线衍射图谱峰(2θ＝12°，20°，22°)的峰强度的相对变化得到对各种纤维素基质处理后结构变化的定量信息。一般来说，2θ峰在18°的高度是纤维素非晶相的量度，而2θ峰在22°是结晶纤维素I的量度，18/22峰比值通常称为结晶度指数(CrI)其用于计算在22°峰的强度的相对变化。
对纤维素(艾维素)采取各种不同的方式进行处理并确定产物的结晶度指数。艾维素是基本纯的纤维素I，纤维素III是由艾维素而获得，是通过采用7∶1的氨∶生物质(wt.∶wt)对艾维素在95℃(以及在一些实施例中为10℃)处理2小时，其中艾维素有时带有0.05g水每克艾维素的残留水分。氢氧化铵处理的艾维素涉及使用10∶1比值的28-30％氨对艾维素(wt.∶wt.)在4℃达60分钟。
未经处理的艾维素所测得的结晶度指数为约0.65，而用氢氧化铵处理过的艾维素的结晶度指数要高出大约百分之三(+3％)，表明为稍微多结晶的基质。用氢氧化铵处理过的艾维素的稍微较高的结晶度指数可能是由于从原生艾维素提取/移除了残留的非晶形成分。相比之下，用氢氧化钠对艾维素进行处理导致结晶度指数下降18％(基于22°峰)并伴随着在20°峰处上升66％，这是纤维素II铜质多形体的典型特征。
用液氨处理艾维素导致结晶度指数下降75％，伴有在20°处峰的72％增加。对于非晶形纤维素也出现结晶度指数的类似降低(降70％)，但是在20°处没有出现峰相对强度的相应增加，这很可能是由于在磷酸预处理的非晶形纤维素中缺少明显的结晶度。
为了研究纤维素来源对原生纤维素I转化为III的程度的影响，获得了三种类型的原生纤维素I生物质∶艾维素(AVICEL)(经过加工的微晶纤维素(microcrystallinecellulose))，棉短绒(细致、柔滑的纤维，其在轧棉之后粘附于棉籽上)和棉花。棉短绒是生长于棉籽与长球棉纤维之间的棉球的短纤维。艾维素、棉短绒和棉花的聚合程度(DP)已有报道分别处于150-250、750-1000和5000-10000的范围。
液氨处理使用了7∶1氨∶棉短绒或棉纤维(wt.∶wt.)于10℃(或在一些实施方式中为95℃)达0.5小时，其中，所述生物质有时包含0.05g水每克生物质的残留水分。
图4所示是经历各种处理条件(包括氨处理)的纤维素生物质的代表性X射线衍射光谱。未处理的艾维素、棉短绒和棉花纤维素的谱图不依赖于纤维素的来源，并且是纤维素Iβ晶体同质异形体的典型谱图。用液氨的处理作用导致对于所有三种纤维素的X射线衍射光谱类似的改变，表现为12°处2θ峰的出现以及22°处2θ峰的消失。结晶度指数(即Pk18/22)在棉短绒和棉纤维素经过液氨处理后下降了78-83％，伴随Pk18/20相应地增加48-60％。
图4A显示采用液氨(以形成纤维素III)、氢氧化钠(以形成纤维素II)、氢氧化铵和浓磷酸(非晶形纤维素)进行处理的纤维素(纤维素I)的粉末X-射线衍射光谱，在此艾维素(经过加工的微晶纤维素)为纤维素基质。Y-轴和X-轴分别描述强度计数和2-西塔(2θ)角。
图4B显示未经处理的(纤维素I)和用液氨处理过的纤维素(纤维素III)的粉末X-射线衍射光谱，其中艾维素、棉短绒和原生棉被用作为纤维素基质。Y-轴和X-轴分别描述强度计量和2θ角。这些结果表明，纤维素结晶度在水解过程中是主要的速度限制因素，其可以通过使用低价的氨(在适当的预处理条件下)或者通过采用昂贵的基于离子液体或磷酸的预处理来调整。
此外，已经确定含水氢氧化铵(例如在比如ARP和其他的一些氨预处理过程中使用的)不会提高纤维素的可降解性，因为它不会导致纤维素III的形成。因此，采用1∶1氨对生物质(wt.∶wt.)以及0.6∶1水对生物质(wt.∶wt.)对纤维素生物质在130℃处理15分钟并不像液氨预处理那样有效。
在另一项研究中，针对纤维素I(艾维素)酶水解率是在液氨预处理之后或在采用含水氢氧化铵(30％)、含水氢氧化钠，或浓磷酸的预处理之后的两个时间点进行测定的。每克葡聚糖1.5FPU的纤维素被用于酶水解。对于基于无水液氨的预处理(ALAP)，5∶1液氨对干生物质(w/w)的艾维素在10℃下培育30分钟，接着在通风罩下干燥过夜。干燥后的产物采用X-射线衍射(XRD)分析。这样的处理过程，在采用SPEZYMECP与NOVOZYME188比值为3∶5的3mg/g葡萄糖(总酶载荷为6mg/g葡聚糖)进行24小时水解后，导致形成纤维素III，其具有植物纤维素可消化性2-2.5倍的增加。图5显示通过不同的预处理(氢氧化铵、氢氧化钠、无水液氨和磷酸)形成的纤维素同质异形体的葡聚糖转化，其后采用SPEZYMECP和NOVOZYME188于50℃进行6和24小时的酶水解。
对于艾维素，检测了温度(即10、25、60和95℃)对于纤维素III的液氨形成和酶水解率的影响。纤维素III是通过对于7∶1氨对艾维素(wt.∶wt.)的艾维素进行处理，在不同温度下经过0.5小时由艾维素而生成的，其中的艾维素可以具有每克艾维素0.05g水的残留水分。
酶载荷为1.5FPU/g葡聚糖SPEZYMECP(辅以NOVOZYME188)。图6显示液氨处理温度对于纤维素III同质异形体的酶消化率的影响。Y-轴表示24小时水解后的总葡聚糖转化。在所有情况下，与未经处理的纤维素I的情况相比，葡聚糖产量增加为大约2倍。然而，当液氨预处理是在10-95℃的各种温度下操作时，纤维素的酶消化率并没有显著变化。这表明，纤维素III的形成很大程度上与温度无关，且主要因素是液氨的量必须足以完全溶胀纤维素纤维。
然而，应该指出，提升温度高于100℃会引起葡聚糖转化的下降(图6)。纤维素样品的酶消化率在采用液氨于100℃以上温度进行处理后导致与在温度低于100℃下制备纤维素III的情况相比明显较低的酶水解率。在许多情况下，水解产率是类似于或显著低于原生纤维素I的情形。
采用液氨在高于100℃的温度下进行的处理还导致被处理样品在相当程度上发黑。纤维素在高于100℃的温度下的发黑现象可能是由于美拉德反应(Maillardbasedreactions)，即氨和还原糖之间的化学反应(如下所示)。
这样的美拉德反应已知受到高温度、低湿度和高碱性的促进影响。美拉德反应产物(以及碱诱发剥离反应产物)已知对纤维素酶和其它酶有抑制作用。
采用无水液氨和纤维素(使用艾维素和棉短绒)的研究表明：当使用过量的液氨完全浸泡基质的时候，30分钟的活化时间是绰绰有余的。因此，根据本发明并不需要高温度来加速纤维素III的形成。如此高的温度甚至可能对于有用的糖类和糖类化合物从纤维素的释放不利。
对无水液氨处理(10℃达30分钟)之后水解率的增加进行了进一步的探讨以比较棉短绒和原生棉纤维素基质相对于艾维素所获得的结果。用无水液氨处理后，纤维素基质用两种不同量(6和60mg/g葡聚糖)的未加工纤维素酶复合物(SPEZYMECP辅以NOVOZYME188)进行水解6-24小时。两种酶的载荷相当于1.5和15FPU纤维素酶载荷/g葡聚糖。
图7显示未经处理的(纤维素I)和经过液氨处理的(纤维素III)棉短绒和棉纤维素在6或24小时水解之后的酶可消化性。为了在这些纤维素生物质材料中生成纤维素III，所述生物质用7∶1氨对生物质(wt.∶wt.)在10℃下处理0.5小时。
未处理棉短绒和纤维的酶消化程度明显低于氨处理过的样品所观察到的结果。但是，经液氨处理的棉短绒和棉纤维相比于未处理的相对物，在采用6mg/g葡聚糖酶载荷水解6和24小时之后，观察到总的产率2-2.5倍的增加。用液氨处理后的棉短绒和棉纤维的葡聚糖消化率的相对增加量比相同蛋白质载荷下的艾维素略高一些。这可能是由于棉花和棉短绒纤维是由较高聚合度(DP)的纤维素组成，这可能更为得益于从纤维素I至III的转化，从而导致纤维素活性成比例的较大增加。
实施例2：无水预处理条件
本实施例显示纤维素材料通过无水氨预处理比常规AFEX处理更为有效。
所进行的初步试验被用来评估什么条件影响从纤维素I(艾维素(AVICEL))形成的结晶纤维素同质异形体的量和类型。特别是，通过使用拉曼光谱对纤维素同质异形体进行检测，对常规的基于氨纤维膨胀(AFEX)的预处理参数(氨载荷、水载荷、停留时间)的影响进行了研究，用以对纤维素I至III的转化程度进行量化分析。针对本初始研究，艾维素被用作纤维素基质。在四种条件下进行了探讨：
a.(a)(1-NH3，0.6-W)1克氨和0.6克水载荷每克基质在100℃进行15分钟，
b.(b)(3-NH3，0.6-W)3克氨和0.6克水载荷每克基质在100℃进行45分钟，
c.(c)(1-NH3，0.05-W)1克氨和0.05克水载荷每克基质在100℃进行15分钟，以及
d.(d)(3-NH3，0.05-W)3克氨和0.05克水载荷每克基质在100℃进行45分钟。
用液氨处理过的艾维素(10℃，30分钟)作为对照组，其中氨加载的范围是5-7克氨每克基质，含有0.05g水/g基质。
纤维素Iβ至IIII转化的程度通过利用380和350cm-1处峰值的相对强度，相对于100％纤维素IIII标准样品，进行了估算，呈现出相对峰值比值82％的降低。
如图8A所示，在四种条件下没有一种给出艾维素到纤维素III的完全转化。然而，艾维素到纤维素III转化的程度依赖于所采用的条件并且这样的部分转化提供了对纤维素III形成的影响因素的线索。包含显著水分(1NH3-0.6W和3NH3-0.6W)的条件对于纤维素I几乎没有影响，仅有3和6％的转化为纤维素III。事实上，只有当预处理是在不存在大量水而且存在足量的氨以完全浸透基质(3NH3-0.05W)的条件下进行才会有显著的转化成纤维素III(39％)(图8A)。这些数据表明，在氨预处理过程中水的存在往往会抑制由纤维素I到纤维素III的形成。
无水液氨的存在也有助于玉米秸秆中由纤维素I至III的完全转化(图8B)。因此，在常规AFEX的过程中，其中包括采用62％NH4OH在130℃下处理15分钟，没有形成纤维素III。尽管常规AFEX通常采用较高的温度，向纤维素III的转化也很少或是不存在的。事实上，在AFEX处理过的玉米秸秆(AFEXCS，含有0.05％水每克生物质)中，只有当其被进一步用无水液氨(7∶1氨∶生物质)在25℃下处理2小时的情况下，才会形成纤维素III。在这种采用无水液氨的处理之后，纤维素是高度可消化的并且从这种经过预处理的玉米秸秆获得较高程度的葡聚糖转化(图8B)。
这些数据表明，在氨处理过程中不存在水的状况能够允许纤维素III的稳定形成，这在常规AFEX过程处理纤维素I的场合不会发生。因此，在基本上无水的条件下使基质在液氨中完全浸泡可以允许纤维素I至III的完全转化。
实施例3：氨对生物质的比值
本实施例检验了氨对生物质载荷的比值对于纤维素III形成的影响。
艾维素被用作生物质。氨对生物质的wt.∶wt.比值在预处理中是变化的。特别是，所测氨对生物质的比值(wt.∶wt.)是6∶1、3∶1、2∶1及1∶1。所有的预处理是在25℃下进行的。在0或10分钟之后纤维素形成的量通过X光衍射分析进行测定，其中0分钟表示样本在浸泡到液体无水氨中之后立即被移去。
如图9所示，当氨对生物质载荷为1∶1时，在10分钟之内没有形成任何纤维素III。然而，当氨对生物质载荷增加到2∶1时，观察到了纤维素I到III的显著转化。特别是，当氨对生物质的比值为2∶1的时候，观察到纤维素I至纤维素III大约50-60％的转化。然而，当氨对生物质载荷超过3∶1的时候，纤维素I完全转化为纤维素III。
此外，在其他的采用7∶1氨对生物质载荷的提取的AFEX实验中，观察到了纤维素至纤维素III的I完全转化。
实施例4：提取的无水氨预处理
本实施例描述使预处理过程最佳化的条件，以采用实际的例如玉米秸秆的木质纤维素原材料来形成纤维素III。
本发明人已经表述常规的AFEX预处理通过使木质素/半纤维素发生移位以及增加纤维素酶对于嵌入结晶纤维素原纤维的接近来增强植物细胞壁的糖化率。然而，在植物细胞壁常规AFEX过程中不存在纤维素I的明显纤维素解晶作用或者甚至可检测量的纤维素III的明显形成。
然而，纤维素III的形成对于纤维素原料的酶消化率的最佳化来说是重要的。因此，发明人观察到对于富含纤维素III的AFEX玉米秸秆，相对于富含纤维素I的AFEX玉米秸秆，在酶水解过程6小时之内的葡聚糖消化率有80％的增长，这表明在实际的木质纤维素生物质中纤维素III的形成确实提高了整体水解产量。
本发明人的研究表明AFEX工艺可用于生产较大百分量的纤维素III以及回收氨。使用高浓度的液氨(例如，而不是更为稀释的氨水或NaOH)可以在生物炼制中使水的用量最小，并且很可能比其它工艺(例如，使用NaOH)会少一些环境问题。设计出经济的预处理工艺，其在使得由纤维素酶的溶剂暴露葡聚糖链解晶过程的热力学成本最低的同时为酶的进攻提供最大可及的纤维素表面，导致增加的生物质水解速率以及改善的更具成本效益的纤维素生物精炼。
已有文献报道通过水解酶去木质作用对于植物细胞壁消化的益处。最近，研究人员还发现在晶体结构上将原生纤维素(纤维素I)改变为纤维素III的其它方面的益处。在这样的改变之后，有可能高达5倍地显著提高纤维素的酶水解率(Igarashiet.al.，2007)。然而，这种增加是由针对产自藻类(纤维素Iα)的纯化纤维素的观察获得的，而这种纤维素具有与从植物获得的纤维素(纤维素Iβ)不同的晶体构型。此外，还没有证据表明木质纤维素植物生物质中的纤维素可以如此容易地被转化成纤维素III或者如此容易地被处理以允许高效的酶消化，这是因为木质素使纤维素I到纤维素III的转化变得复杂并且降低了这些原料的酶消化能力。因此，对于纯化纤维素所观察到的益处并没能体现于木质纤维素植物生物质，除非开发出新的工艺。
因此，本实施例探讨在非-无水条件下纤维素III转化的益处，其中使用玉米秸秆作为木质纤维素生物质的来源，并且将这种改变与木质素提取在单级过程中结合起来。就这些益处与基于非氨法提取的预处理方法进行了比较。
提取AFEX装置
设计和构建了一种能够在高温和高压下进行木质素提取的反应器(图1B)。该反应器由两个主要部分组成：1)提取单元和2)提取物收集器/分离器。提取单元是用于将生物质与氨反应并且使得将从生物质中释放出来的提取物发生溶解。这些提取物一般包括木质素、半纤维素成分、游离糖类、植物化学物质、蛋白质等，它们的组成取决于所使用的预处理溶剂。一旦反应时间结束，就利用加压氮气并使两个容器之间的阀开启，使所述提取物收集器设置为与所述提取单元具有相同的压力。过压氮气被用来防止氨在提取单元中蒸发并且用来驱使液相向下流动到提取物收集器。放置在提取单元底部的80微米过滤器可防止固体向下流动到提取物收集器。打开连接所述提取物收集器与所述排气室的阀被，并且控制氮/氨蒸汽流以防止提取单元中氨的迅速蒸发。当提取物被全部移除之后，关闭氮气过压阀，并将空气缓慢地释到排气室，直到系统达到大气压。在这时，经过预处理的生物质以及相应的提取物可从系统中移除而用于进一步分析。
在木质纤维原料中测量纤维素I向纤维素III的转化
虽然可以相对容易地通过X光衍射分析方法测量不含木质素的纯纤维素样本(例如艾维素)中形成的纤维素III的量，但是对于木质纤维素生物质来说却并非如此，因为木质素会干扰生物质的特征峰的检测。因此，为了测量从木质纤维素生物质所形成的纤维素III的量，必须对X-射线衍射光谱进行解卷积处理或者采用不同的检测程序。但是，纤维素I和纤维素III用拉曼光谱测定时均具有独特的谱峰，其与木质素拉曼光谱峰有区别。因此，玉米秸秆生物质中纤维素I向纤维素III的转化可以通过拉曼光谱测定。此外，由拉曼光谱检测的形成纤维素III的量可以通过X-射线衍射光谱数据的解卷积得出的数量进行关联(见图10A)。这些结果表明，通过玉米秸秆形成的纤维素III的转化程度可以精确地通过X-射线衍射光谱或拉曼光谱来确定。
图10B显示采用类似的液氨预处理条件在玉米秸秆和艾维素中纤维素III形成程度之间的高度关联。预处理条件包括对艾维素或玉米秸秆(即生物质)用7∶1氨∶生物质(wt.∶wt.)在25℃处理2小时，如图10B显示，当高浓度的液氨用于玉米秸秆的时候，产生了纤维素III。在玉米秸秆基质中这种纤维素III的形成也导致纤维素的酶水解的增加。
影响木质纤维素原料中葡聚糖形成的各种变量
为了证明对玉米秸秆中葡聚糖转化的增加有明显贡献的预处理反应参数，以及在提取过程中对木聚糖、阿拉伯聚糖和木质素损失有影响的参数，利用 软件(Minitab，Inc)建立了一种析因设计试验。对总共18种条件进行了测试。本研究中所考虑的变量因素包括在提取预处理过程中的温度、时间、液固比(L/S)以及氨对水的比值(A/W)。本研究中的因变量是葡聚糖转化(G转化)，％木聚糖损失，％阿拉伯聚糖损失以及木质素损失。并非所有的测试条件都能将纤维素I转化为纤维素III，然而，本发明人想确定利用氨水溶液的木质素提取并结合纤维素III转化对于整体酶消化能力的益处。
所述从实验结果中确定的因变量被进一步利用软件用于二阶方程式。对于每个因变量的残差图显示该模型与实验数据拟合相当好并且存在最低限度的误差传播。从该模型中得出的ANOVA表显示出影响各个因变量输出值的统计相关参数(表2A-2D)。
表2A：针对葡聚糖转化的评估效果和系数
表2B：针对％木质素损失的评估效果和系数
表2C：针对％阿拉伯聚糖损失的评估效果和系数
表2D：针对％木聚糖损失的评估效果和系数
这些结果表明温度对于所有测试的因变量是统计上相关联的参数。液固比(L/S)对于最大化提取木质素、阿拉伯聚糖和木聚糖也是相关变量。时间变量并非高度关联于任何因变量，而所分析的时间范围是在20至45分钟之间。这些数据表明，预处理可以在较低的停留物时间进行而不会影响任何因变量的结果。这些数据进一步表明，氨∶水(A/W)变量对于实现好的葡聚糖转化可能是重要的。
如图11所示，木质素的去除显著地改善纤维素向可用葡聚糖的转化。一般而言，葡聚糖的转化随生物质中木质素的损失量的减少而增加(图11)。然而，木质素损失并不是影响生物质抗拒性(biomassrecalcitrance)的唯一因素。因此，对于木质素损失和葡聚糖转化的R2值仅为0.7489。
在一种测试条件下，液氨与生物质接触而不存在任何添加水分。在这种情形下，在预处理过程中只存在生物质中的残留水分(接近6.5％水分)(表3)。
表3：AFEX和提取-氨处理的条件
研究表明，使用如表3所列的氨法提取的条件，纤维素III是最有可能形成的。因此对氨法提取的样本进行了更详细的分析，并将其与一般非提取的AFEX相比较。
图12显示有大约73％的阿拉伯聚糖是在氨法提取过程中进行的提取步骤被去除的。当只有1.8％的总木聚糖通过氨被提取时，大约34.3％的不溶于酸的木质素是通过氨法提取预处理而被去除的。注意到在本研究中只检测了不溶于酸的木质素，而对于可溶于酸的木质素并未加以测定。如果可溶于酸的木质素也被确定，那么在提取物中便可能测到更高的木质素总量损失。因此，提取步骤对于阿拉伯聚糖的去除是非常有效的，并且对于木质素的去除也是相当有效的。然而大部分残留在生物质中的葡聚糖并未被提取。如图12所示，只有6.3％的葡聚糖被提取，表明超过93％的葡聚糖仍留存在残料中。这些数据表明，氨对于提取某些细胞壁成分是有选择的。
将氨法提取预处理的玉米秸秆的消化能力与常规AFEX处理的玉米秸秆、液氨提取处理的玉米秸秆、艾维素(纤维素I)以及艾维素(纤维素III)进行了比较。常规AFEX的条件是1∶1氨对生物质(wt.∶wt.)以及0.6∶1的水对生物质(wt.∶wt.)在130℃下进行15分钟。所述艾维素(纤维素I)是未经处理的艾维素。对于液氨处理，玉米秸秆用7.5∶1氨∶生物质(wt.∶wt.)在100℃被处理45分钟。液氨处理过的玉米秸秆也如上所述被提取。艾维素(纤维素III)是将艾维素采用7∶1氨对生物质载荷在25℃下处理30分钟而制备的。在这些研究中，将每克葡聚糖15mg的Accelerase1500(Genencor-Danisco)纤维素酶与各种处理过的纤维素材料在50℃下以250RPM搅拌12、24和72小时进行培育。
图13表明，24小时消化后，用氨法提取预处理工艺处理的生物质比传统AFEX处理的生物质的酶水解率高1.7倍。氨法提取预处理的玉米秸秆也显示出比纯化纤维素(艾维素)较高的葡聚糖转化。在酶混合物中包含木聚糖酶和其他辅助的半纤维素酶有望进一步增加葡聚糖转化，从而生物质(例如玉米秸秆)的葡聚糖转化在氨法提取预处理之后会导致甚至更高的转化(类似于艾维素用氨处理所观察到的转化)。
令人惊讶的是，即使是氨处理过程中存在显著的水分的情形，氨法提取预处理也会有效地进行(表4)。
表4：玉米秸秆中高葡聚糖转化的预处理条件
A/W＝氨∶水；L/S＝液∶固。
如表4所示，条件#1具有较低的氨∶水比值但仍显示较高的葡聚糖转化以及较多的木质素去除。由此，在液氨处理中可以存在一些水。还注意到条件#2对应于表3中所示用于生产纤维素III的相同条件。
在条件#1中，使用了水中约80％的氨，8∶1的液-固比，而生物质是在该溶液中于120℃培养45分钟。在这种条件下，72小时后观察到65.8％葡聚糖转化。相反，在相同条件下艾维素(纤维素I)只给出55％葡聚糖转化。因此，用80％氨通过氨法提取预处理过程将玉米秸秆中纤维素I转化为大量的纤维素III。这是令人惊讶的，因为大量数据表明只有无水氨才能够将纤维素I转化为纤维素III。
然而，氨法提取预处理过程会去除大量的木质素，这可能会促成玉米秸秆纤维素I向对照的纤维素III的更高转化。
使用富含纤维素I和富含纤维素III的经过预处理的玉米秸秆在两种不同的纤维素酶载荷条件下进行了基于高固载荷的酶水解试验。此处生物质是玉米秸秆。富含纤维素I的玉米秸秆是通过将玉米秸秆用1∶1氨对生物质(wt.∶wt.)和0.6∶1水∶生物质(wt.∶wt.)在130℃处理15分钟形成的。富含纤维素III的玉米秸秆是通过将玉米秸秆用7∶1氨对生物质(wt.∶wt.)在100℃处理2小时形成的，在此生物质带有0.05g水每克生物质的残留水分。如图14A-D所示，以较低的总纤维素酶载荷以及富含纤维素III的基质在工业上相关的固体加载量，有可能实现更高的葡聚糖转换。这项研究表明，对于纤维素III可在比纤维素I所需低3倍的纤维素酶载荷下实现当量转化，即使是在工业上相关的高加载量情形。还有，本发明人发现对于富含纤维素III的经过预处理的玉米秸秆，葡聚糖和木聚糖转化不受固体加载量的影响，因为该加载量是针对富有纤维素I的经过预处理的玉米秸秆，其在工业上相关的高固载荷条件下的酶水解过程中会有额外的优势。
富含纤维素III经过预处理的玉米秸秆是通过用7∶1氨∶生物质(wt∶wt)在100℃处理2小时形成的，在此所述生物质带有残留水分0.05g水每克生物质。没有进行植物壁成分的提取。通过改变用于酶消化过程酶的量和类别，针对这种富含纤维素III的AFEX玉米秸秆进行最佳转化所需的酶混合物进行了评价，如表5所示。
表5：用于富含纤维素III的AFEX玉米秸秆的水解的酶混合物
酶混合物 Acellerase1500 Multifect木聚糖酶 Multifect果胶酶
1 100％ 26 -->
2 100％
3 100％
4 50％ 50％
5 50％ 50％
6 50％ 50％
7 33.3％ 33.3％ 33.3％
8 67％ 16％ 17％
9 16％ 67％ 17％
10 16％ 17％ 67％
在各个试验中，水解24小时，所使用的总酶量为30mg。
所述结果示于图15。一般来说，当使用酶的组合物的时候，从非提取的富含纤维素III的AFEX玉米秸秆中能获得较高水平的葡聚糖和木聚糖。因此，在使用相当量的Acellerase1500，Multifect木聚糖酶和Multifect果胶酶的情形(酶混合物7)，高水平的葡聚糖和木聚糖均从玉米秸秆基质中释放出来。
实施例3内切纤维素酶增强纤维素III消化
本实施例描述的实验结果显示最合适消化纤维素同质异形体的酶的种类。
利用来自里氏木霉的两种外切纤维素酶(Cel7A(纤维二糖水解酶I即CBHI)和Cel6A(CBHII))和一种内切纤维素酶Cel7B(EGI)以不同的组合对衍生于艾纤素、棉纤维以及棉短绒的纤维素I和III进行了水解。纤维素I是未经处理的纯的纤维素(艾纤素、棉短绒或棉纤维)。为了在这些纤维素生物质材料中形成纤维素I，所述生物质用7∶1的氨∶生物质(wt.∶wt.)在95℃处理30分钟。
采用纯化的纤维素酶对这些纤维素处理24h并且对经过水解的可溶性葡聚糖(例如葡萄糖)的产率进行记录。将每种纯化的酶以2.5mg/每种的量加载并且在每个试验中还另外配有β-葡萄糖苷酶(以总纤维素酶的10％加入)用于防止由纤维素二糖产生的抑制作用。标准偏差处于所报告均值的±20％以内。然而，当被单独加到衍生于艾维素或棉短绒和棉纤维的纤维素III的时候，没有任何纤维素酶被发现在特定活性有显著提高(图16)。有趣的是，纤维素III，相对于纤维素I，在水解率上最显著的增加发生在采用内切纤维素酶和外切纤维素酶的组合物的情形。如此，Cel7A+Cel6A+Cel7B的组合是特别有效的(图16)。
测试了其它的酶，包括Cel7A，Cel6A，Cel7B，Cel5A_ac，Cel5A_tr，Cel12A，Cel61A和Cel61B的组合物。纤维素酶Cel5A_tr，Cel12A，Cel61A和Cel61B来自于里氏木霉(T.reesei)，而Cel5A_ac来自于解纤维热酸菌(Acidothermuscellulolyticum)。
观测了酶组合物的协同效应程度(degreeofsynergisticeffect，DSE)，在此所述协同效应程度(DSE)被定义如下：
其中：
ζi-mix为利用蛋白质混合物实现的葡聚糖转化程度；
ζi为利用单独的第i种蛋白质组分实现的葡聚糖转化程度。
如下面的表6所示，单一的酶对于纤维素I，与纤维素III相比，偶尔具有稍微好些的活性，然而，酶的组合一般会消化比纤维素III明显更多的纤维素I。这样，注意到单独的外切纤维素酶(Cel7A，Cel6A)对于纤维素III，与纤维素I相比，的水解率有小量的降低。但是，一般来说，在采用单一酶的场合，对这两种基质观测到相当类似的葡聚糖转化。对于二元的外切纤维素酶混合物，纤维素I和III基质的葡聚糖转化很少超过10％。然而，当使用某些外切纤维素酶+内切纤维素酶的组合的时候，观察到葡聚糖转化有一定程度的提高。
表6
纤维素酶组合 纤维素Iβ 纤维素IIII
Cel7A 3.8 1.6
纤维素酶组合 纤维素Iβ 纤维素IIII
Cel6A 3.0 1.7
Cel7B 2.6 3.7
Cel5A_tr 1.9 1.9
Cel61A 0.9 1.0
Cel61B 0.6 0.7
Cel5A_ac 3.4 2.7
Cel12A 1.8 1.8
Cel7A+Cel7B 16.0 23.7
Cel7A+Cel5A_tr 7.8 8.2
Cel7A+Cel61A 6.4 3.7
Cel7A+Cel61B 4.8 3.3
Cel7A+Cel5A_ac 12.6 9.1
Cel7A+Cel12A 11.7 7.9
Cel7A+Cel6A 12.1 11.8
Cel6A+Cel7B 9.2 11.4
Cel6A+Cel5A_tr 6.8 4.5
Cel6A+Cel61A 3.4 2.9
Cel6A+Cel61B 3.8 2.5
Cel6A+Cel5A_ac 9.3 8.6
Cel6A+Cel12A 6.0 5.0
Cel7A+Cel6A+Cel7B 31.3 68.9
Cel7A+Cel6A+Cel5A_tr 21.7 30.4
Cel7A+Cel6A+Cel61A 13.3 16.7
Cel7A+Cel6A+Cel61B 13.8 14.6
Cel7A+Cel6A+Cel5A_ac 20.4 25.728 -->
Cel7A+Cel6A+Cel12A 18.9 19.4
然而，对于三元的纤维素酶组合，大部分混合物导致纤维素I和III的葡聚糖转化分别在10-30％和15-70％的范围之间。与其它族的内切纤维素酶(例如GH12，61)相比，GH族5和7的内切纤维素酶通常导致对于纤维素III显著较高的转化(与对照组相比，水解率有＞25％的增加)。因此，如表6所示，最高的葡聚糖转化在相等质量Cel7A/Cel6A/Cel7B三元组合的情况下被观察到。进一步的研究表明使被水解的衍生于纤维素I和III的艾维素在24小时的产率最大化条件下最佳比例的Cel7A/Cel6A/Cel7B(总酶载荷15mg/g葡聚糖)具有稍高百分比的Cel7B(35wt％Cel7B相对于32wt％的其他纤维素酶蛋白；混合物最佳化数据未示出)。
还研究了在结晶纤维素I和III的水解过程中采用外切纤维素酶Cel7A+Cel6A针对内切纤维素酶的类型对于协同效应程度(DSE)的影响。纤维素I为未经处理的纯纤维素(艾维素、棉短绒或棉纤维)。为了在这些纤维素生物质材料中产出纤维素III，对所述生物质采用7∶1的氨∶生物质(wt.∶wt.)在95℃处理30分钟。
结合Cel7A和Cel6A包括来自解纤维热酸菌的Cel5A_ac，来自里氏木霉的Cel5A_tr和来自里氏木霉的Cel7B(EGI)，对来自于同源和不同糖基水解酶(GH)族的内切纤维素酶进行了测试。纤维素I和III基质是衍生于艾维素。一般来说，当采用外切纤维素酶和内切纤维素酶的组合时，纤维素III比纤维素I的被消化程度更大。因此，Cel7A/Cel6A和Cel7A/Cel7B的二元DSE，对于纤维素I分别为1.7和2.5，而相应地对于纤维素III分别为3.5和4.4。然而，如图17所示，当两种外切纤维素酶Cel7A+Cel6A和内切纤维素酶一起使用时，纤维素I和纤维素III的DSE分别增加了30-100％和40-370％。
Cel7A、Cel6A和Cel7B是最丰富的里氏木霉纤维素酶而且提供如上文所述的有效的纤维素水解。因此，这些酶对于酶结合的详细研究来说是理想的选择。酶-基质结合亲合力是通过将朗缪尔单点吸附模型(Langmuirsingle-siteadsorptionmodel)拟合到里氏木霉Cel7A、Cel6A和Cel7B对于艾维素衍生的纤维素I和III的结合等温线来确定的。纤维素I和纤维素III与50mg纤维素酶每克葡聚糖混合，且在4℃培养至吸附平衡。被测试的纤维素酶为Cel7A(纤维二糖水解酶I即CBHI)，Cel6A(CBHII)和内切纤维素酶Cel7B(EGI)。
令人惊讶的是，所有这三种纤维素酶对于纤维素III，相比于原生纤维素，表现较低的整体最大亲合力(基于最大结合亲合力系数；mg蛋白/g基质)。如表7所示，对于纤维素III的结合比与对于纤维素I的结合要低约50％-70％。
表7：结合到纤维素的酶的近似％值
CBHI(Cel7A) CBHII(Cel6A) EGI(Cel7B)
纤维素I 97％ 54％ 75％
纤维素III 29％ 27％ 35％
这与以前的文献报道是相反的。尤其是，以前的研究表明酶水解率直接与吸附到纤维素的酶的程度相关(Halletal.，FEBSJournal277：1571-82(20l0)；Carrardetal.，PNAS97：10342-47(2(2000))。事实上，本发明人所获得的酶-基质结合亲合力数据表明，对于更易消化的纤维素III同质异形体出现降低的纤维素酶结合。所有三种主要的木霉纤维素酶对于研究中应用的每种纤维素同质异形体呈现出相似的结合能力(Cel7A\Cel7B＞Cel6A)，而且它们对于纤维素I的结合能力比对于纤维素III的要高2-3倍。对于纤维素III的最大表面纤维素酶结合能力与对于纤维素I的相比要低50％-70％。
因此，上述(例如表6和图16-17中)观察到的纤维素III基质上的改善的水解活性不能按照纤维素酶对纤维素I和纤维素III的结合能力进行解释。先前的研究表明，通过范德华力以及涉及纤维素结合模块(cellulosebindingmodules，CBMs)的芳族残基和吡喃糖环的极化相互作用，里氏木霉纤维素酶优先地结合到轴向的纤维素I结晶表面(Lehtioetal.，Proc.Nat'lAcad.Sci.USA100(2)：484-489(2003))。多数里氏木霉纤维素酶包含高度同源族1CBMs，其通常对于各种纤维素同质异形体具有类似的结合亲和力。近来的分子动力学(MD)模拟研究表明，族1纤维素结合模块对于纤维素I的疏水表面，相比于其相对较为亲水性的表面，具有更大的亲和力(Yuietal.，J.Phys.Chem.B114(1)：49-58(2009))。有报告显示，纤维素酶对原生纤维素的结合是通过在族1CBMs中发现的芳香平面残基的相互作用驱动的，但纤维素酶的进行性可能是通过氢键促成的(Beckhametal.，J.Phys.Chem.114：1447-53(2010))。
本发明人进行了对纤维素I和纤维素III的分子动力学结构分析，并已观察到，纤维素III比纤维素I经受更大的片层内热波动。因此，纤维素III比纤维素I具有更大的回转半径(Rg2)。
表8：结晶纤维的热波动
中间层 层内 链轴 Rg2
纤维素Iβ 3.3 1.1 1.1 336.2
纤维素IIII 3.2 1.63 1.1 343.2
因此，纤维素III晶体结构在允许涉及暴露表面的葡聚糖链的与水分子结合的氢键方面的增加的倾向，会有利于酶的相互作用和酶的进行性(因此增加了纤维素酶的效率)，尽管整体的纤维素酶结合能力是降低的。
除了对于纤维素III和纤维素结合模块的结构和分子特性之外，酶通过酶的活性部位裂隙(activesitecleft)的催化域的相互作用的也发挥了作用。本发明人已经发现对于包含Cel7B的内切纤维素酶-外切纤维素酶混合物在纤维素III上的DSE至少比包含糖基水解酶族5内切纤维素酶(Cel5A_ac和Cel5A_tr)的混合物高两倍。对这些酶的活性部位裂隙的比较揭示，Cel7B，与Cel5A比较，具有长的且相对不受限制的活性部位裂隙。Cel7B的这种开放的活性部位裂隙对于为有用的结合和有效的催化作用提供易于接近的场所具有显著的作用。相应地，Cel6lA没有可观察到的开放的活性部位裂隙并且呈现DSE对纤维素III的最小程度的改善。基于蛋白结构和活性测试，看来，如具有更开放的和不受限制的活性部位裂隙的Cel7B的纤维素酶，与其他内切纤维素酶相比，能够进一步加速纤维素III的降解。此外，很可能内切纤维素酶对纤维素解晶作用的能垒比外切纤维素酶的更高些，这是因为通过进行性酶(processiveenzymes)的进程应当进一步地促使对解晶作用的热力学势垒的降低。这进一步强调了改变纤维素晶体结构(从I至III)的重要性，以降低解晶势垒并且改进纤维素水解的动力学。
实施例5：利用氨和丙酮的提取预处理
本实施例描述了在采用氨的生物质预处理过程中使用丙酮作为溶剂对形成纤维素III的影响。纤维素III逆转为纤维素I发生在水作为高浓度的溶剂的情形。因此，可通过采用其他类型的溶剂来避免这样的逆转。
进行了如实施例1所述的无水液氨预处理，之外还加入大量丙酮以确定是否丙酮会影响纤维素III的形成。特别地，0.2-0.3g生物质用11ml的1∶10氨对丙酮(vol.∶vol.)在25℃按不同的时间长度进行处理。样品预处理的时间为2.5、7.5、10和60分钟。纤维素III的形成是通过X-射线衍射分析进行监测的。
丙酮对纤维素III的形成没有产生不利的影响。事实上，如图18所示，观察到用无水液氨∶丙酮混合物对艾维素进行预处理只有2.5分钟后，纤维素I基本上完全转化为纤维素III。
这些结果表明，丙酮可以作为共溶剂用于液氨处理过程，以加快纤维素III的形成以及选择性地从木质纤维生物质中提取木质素。
实施例6：富含纤维素III的玉米秸秆的发酵
本实施例表明富含纤维素III的玉米秸秆易于发酵产生大量的乙醇。
所使用的生物质为玉米秸秆。富含纤维素III的玉米秸秆是通过用7∶1氨∶生物质(wt.∶wt.)在100℃处理玉米秸秆2小时所得到的，其中所述生物质带有0.1g水每克生物质的残留水分。
酶水解，如实施例4所描述的，是在处理过的玉米秸秆样品中进行的(数据如图14所示)。预处理过的玉米秸秆进行酶水解，使用了高固体加载量以及两种酶浓度：低(15mg/g葡聚糖)和高(30mg/g葡聚糖)的纤维素载荷。水解进行了168小时。
发酵是在30℃、pH5.5、采用0.2初始细胞光密度(OD)于150rpm搅拌的条件下进行的。未添加任何外来营养物质以促进细胞生长，除了基质以外：富含纤维素III的玉米秸秆基于6％葡聚糖的水解产物。从该基质中没有提取植物壁成分。使用了两种酶载荷来进行水解：15mg每克葡聚糖(方形标记)和30mg每克葡聚糖(菱形标记)。发酵进行了120小时。
如图19所示，产出了将近40g/L的乙醇，这是最终产品的工业规模蒸馏的合适的乙醇浓度。此外，富含纤维素III的玉米秸秆的发酵在使用15mg/g葡聚糖，与使用30mg/g葡聚糖相比，进行酶消化时具有同样的效率。相比之下，含有纤维素I的AFEX玉米秸秆的酶消化效率较低(图14)。因此，可用较少的酶有效地消化富含纤维素III的玉米秸秆，并且可以在发酵过程中产生较大含量的乙醇。
本文中所述的具体方法和组成是用来对优选的具体实施方式进行典型性的描述，并且只是示范性的而不是用来限定本发明的保护范围。其它的目的、方面或具体实施方式可能会由本领域技术人员在考虑本说明书时所想到，并且都应被包含在通过本权利要求书所定义的本发明的精神和范围之内。本领域的技术人员应当明白，对于本文所公开的发明内容可以做出各种替换和修改而不脱离本发明的范围和精神。
本文所描述的发明适当地可以在缺少本文中未特别指出为必要的任何一种或多种元素或限制因素的情况下进行实施。本文所描述的方法和过程可以适当地按不同的步骤顺序实施，并且它们并不必受限于本说明书或权利要求中所表述的步骤顺序。在本文中以及所附权利要求书中，单数形式的“一”、“一种”和“这”包括复数的指代，除非上下文清楚地另有所指。因此，例如，“一种微生物”的提法包括指代多数的这样的微生物(例如，一种培养基或群体)。在任何情况下，本专利都不可以被解释为受限于本文中具体披露的特定的实施例或具体实施方式或方法。在任何情况下，本专利都不可以被解释为受限于审查员或专利局的其他工作人员所做出的任何陈述，除非这样的陈述是由本申请人特别地并且无条件或保留地以书面答复的方式所明确做出的。
在此所采用的术语和表达是作为描述而不是限制，并且不存在任何意图将这些术语或表达用来排除任何与所提供和描述的特征的全部或部分的等同特征，因此，应该认为各种修改或变动都有可能会落在本发明所要求保护的范围之内。因此，应当理解，尽管本发明已通过优选实施方式和可选特征已被具体地披露，针对本文所公开的构思的修改和变动可能会被本领域技术人员所采用，而这样的修改和变动都应当被认为落在由本权利要求书所定义的发明范围之内。
本文对本发明进行了概括的和一般性的描述。各种落入所披露类属的较窄的品种和小类也是本发明的组成部分。这包括有关本发明的一般描述以及附带条件或负面限制，其用于从所述类属去除任何内容而无论被去除的内容是否在本文中被引述。此外，短语“基本上由......组成(consistingessentiallyof)”或“由......组成(consistingof)”可能用于代替在权利要求书中的术语“包括(comprising)”。凡是本发明的特征或方面按照马库什群组所描述的地方，本领域技术人员应当会理解本发明也由此可以马库什群组的任何单独的元素或元素的小组群进行描述。

Claims (43)

1.一种从木质纤维素生物质生成产品的方法，其包括：
采用液氨在50℃至140℃的温度对所述木质纤维素生物质进行预处理将原生纤维素Iβ转化为纤维素IIII，用以形成经过预处理的木质纤维素生物质，其中所述液氨是无水氨或溶剂中的80％-99％氨溶液，所述木质纤维素生物质中存在不到20％的水分并且包含木质素和/或半纤维素，所述液氨对木质纤维素生物质的重量比为2∶1至8∶1，以及
从所述经过预处理的木质纤维素生物质提取至少部分的木质素和/或半纤维素以生成经过提取的产品和经过预处理的生物质产品，其中所述经过提取的产品包含所述木质素和/或半纤维素。
2.根据权利要求1的方法，其中所述液氨对木质纤维素生物质的重量比为2∶1至6∶1。
3.根据权利要求1的方法，其中所述溶剂为水。
4.根据权利要求1的方法，其中所述溶剂是有机溶剂。
5.根据权利要求4的方法，其中所述有机溶剂是选自丙酮、乙醇、甲醇、异丙醇、二氯甲烷、甲基乙酸、乙酸乙酯、氯仿和它们的组合。
6.根据权利要求1的方法，其中所述木质纤维素生物质被用液氨预处理1分钟至3小时。
7.根据权利要求1的方法，其中所述温度为50℃至120℃。
8.根据权利要求1-7中任一项的方法，其中所述木质素是在所述提取步骤经过提取的多种植物细胞壁成分之一。
9.根据权利要求8的方法，其中所述植物细胞壁成分进一步包括阿拉伯聚糖以及阿拉伯聚糖和半纤维素的组合和降解产物。
10.根据权利要求1的方法，其中葡聚糖和木聚糖留存于所述经过预处理的生物质。
11.根据权利要求1的方法，其中所述提取步骤是与所述液氨预处理同时进行操作的。
12.根据权利要求1的方法，其中所述提取步骤是在所述液氨预处理之后进行操作的。
13.根据权利要求1的方法，其进一步包括用酶的组合来消化所述经过预处理的生物质。
14.根据权利要求13的方法，其中所述酶的组合包括至少一种外切纤维素酶，至少一种内切纤维素酶和/或β-葡萄糖苷酶。
15.根据权利要求14的方法，其中所述酶的组合包括分别来自里氏木霉(Trichodermareesei)的Cel7A(纤维二糖水解酶I)，Cel6A(纤维二糖水解酶II)和Cel7B(EGI)。
16.根据权利要求15的方法，其中所述酶的组合进一步包括来自里氏木霉(Trichodermareesei)的Cel5A_tr，来自解纤维热酸菌(Acidothermuscelluloly-ticum)的Cel5A_ac，或它们的组合。
17.根据权利要求16的方法，其中所述酶的组合进一步包括分别来自里氏木酶的纤维素酶Cel12A、Cel61A、Cel61B或它们的组合。
18.根据权利要求1的方法，其进一步包括对所述经过预处理的生物质进行水解的酶水解步骤，其中所述酶水解步骤是以比采用未经所述液氨预处理的植物生物质进行操作的水解步骤要快至少1.5倍的速度进行。
19.根据权利要求1的方法，其进一步包括回收所述液氨。
20.根据权利要求1的方法，其进一步包括回用所述液氨以预处理另一批木质纤维素生物质。
21.根据权利要求1的方法，其进一步包括回收所述溶剂。
22.根据权利要求21的方法，其进一步包括回用所述溶剂以预处理另一批木质纤维素生物质。
23.根据权利要求19或21的方法，其中所述回收是以批式、半批式或连续的方式进行。
24.根据权利要求20或22的方法，其中所述回用是以批式、半批式或连续的方式进行。
25.根据权利要求8的方法，其中所述经过提取的产品被转化为包括树脂、聚合物、生物燃料、生化制品的生物产品，热量和/或电。
26.根据权利要求1的方法，其中所述液氨与丙酮结合。
27.根据权利要求26的方法，其中所述液氨对丙酮的容积∶容积之比为10∶90至99∶1。
28.根据权利要求1所述的方法，其中所述经过预处理的生物质包括含有纤维素的的固体部分和液体部分。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述生物质还含有半纤维素，并且所述方法进一步包括从所述半纤维素和所述木质素分离所述含有纤维素的固体部分。
30.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在所述木质素被提取之后对所述经过预处理的生物质进行利用以生成第二产品。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述第二产品为生物燃料。
32.根据权利要求1所述的方法，其中所述经过预处理的木质纤维素生物质包括含有纤维素的固体部分和液体部分。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述木质纤维素生物质还包括半纤维素，并且在所述经过预处理的木质纤维素生物质中的所述含有纤维素的固体部分能够与所述半纤维素和所述木质素分离开来。
34.一种从木质纤维素生物质生成含有木质素的产品的方法，其包括：
采用液氨在50℃至140℃的温度对所述木质生物质进行预处理以形成经过预处理的生物质，其中所述液氨是无水氨或溶剂中的80％-99％氨溶液，所述液氨对生物质的重量比为2∶1至8∶1，以及
用酶的组合来消化所述经过预处理的生物质用以从中生产可发酵的糖类，其中所述酶的组合包括至少一种外切纤维素酶，至少一种内切纤维素酶和/或β-葡萄糖苷酶。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述预处理将原生纤维素Iβ转化为纤维素IIII。
36.一种从木质纤维素生物质生产消化产品的方法，其包括：
采用液氨在50℃至140℃的温度对所述木质纤维素生物质进行预处理，其中所述液氨是无水氨或溶剂中的80％-99％氨溶液，所述液氨对木质纤维素生物质的重量比为2∶1至8∶1；以及
用酶的组合来消化所述经过预处理的生物质以生产可发酵的糖类，其中所述酶的组合包括至少一种外切纤维素酶，至少一种内切纤维素酶和/或β-葡萄糖苷酶。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述预处理将原生纤维素Iβ转化为纤维素IIII。
38.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述液氨对木质纤维素生物质的重量比为2∶1至3∶1。
39.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述液氨对木质纤维素生物质的重量比为3∶1。
40.根据权利要求36或37所述的方法，其中采用所述液氨对所述木质纤维素生物质进行预处理是在至少100℃的温度进行。
41.一种从木质纤维素生物质生成含有木质素的提取物的方法，其包括：
采用液氨在50℃至140℃的温度对所述木质纤维素生物质进行预处理将原生纤维素Iβ转化为纤维素IIII，用以形成经过预处理的生物质，其中所述液氨是无水氨或溶剂中的80％-99％氨溶液，所述液氨对木质纤维素生物质的重量比为2∶1至8∶1；以及
从所述经过预处理的生物质提取木质素以生成所述含有木质素的提取物和经过预处理的生物质产品，其中经过提取的产品包含所述木质素。
42.根据权利要求41所述的方法，其进一步包括利用所述经过预处理的生物质以生成第二产品。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述第二产品为生物燃料。
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