CN102841195B

CN102841195B - 具有分析试剂的分析模块及其制备和使用方法

Info

Publication number: CN102841195B
Application number: CN201210109497.1A
Authority: CN
Inventors: E·N·格莱泽尔; B·杰弗里-科克尔; J·D·迪拜德; S·M·库马尔; G·西加尔; G·斯皮莱斯; M·契恩克斯基; M·沃诺克
Original assignee: Meso Scale Technologies LLC
Current assignee: Meso Scale Technologies LLC
Priority date: 2005-12-21
Filing date: 2006-12-21
Publication date: 2016-02-03
Anticipated expiration: 2026-12-21
Also published as: CA3179247A1; EP1963853A4; HK1128527A1; MX342351B; AU2006330913A1; MX2008008280A; US9878323B2; IL192156A; EP3032257A1; IL192156A0; WO2007076023A2; US20180154353A1; CA2634522C; JP5345854B2; US20130065788A1; EP3032257B1; CN102841195A; IL228029A0; US20210339243A1; KR20090003156A

Abstract

本发明提供分析模块(如分析板、盒、多孔分析板、反应容器等)、其制备方法和用其实施分析的方法。试剂可以游离形式或受固相包括分析模块隔室(例如室、槽、流动池、孔等)的表面或胶体、珠或其他微粒支持物的表面支持的形式存在。具体地，干燥的试剂可以掺入到这些分析模块的隔室内并在用于分析方法之前被重建。可以用干燥剂材料将这些试剂保持并稳定于干燥状态。

Description

具有分析试剂的分析模块及其制备和使用方法

本申请为申请日为2006年12月21日、申请号为200680053208.3、发明名称为“具有分析试剂的分析模块及其制备和使用方法”的发明专利申请的分案申请。

相关申请的相互引用

本申请要求2005年12月21日提交的美国临时申请No.60/752,475、2005年12月21日提交的美国临时申请No.60/752,513、以及2006年12月21日提交的题为“分析装置、方法和试剂”的美国申请No.11/_，_，(Atty.Dkt.4504-16)的优先权；在此通过引用将上述内容并入本申请。关于联邦政府资助研究的声明

本发明得到了国防部授权的编号为HDTRA1-05-C-0005的联邦政府资助。美国政府对本发明拥有一定的权益。

技术领域

本发明涉及分析模块例如分析板、盒、多孔分析板、反应容器，以及用于实施化学分析、生物化学分析、和/或生物学分析的方法。本发明也涉及向这些模块内掺入干燥的试剂和/或所述干燥的试剂在这些方法中的用途。

背景技术

已经开发出了多种用于实施化学分析、生物化学分析和/或生物学分析的方法和系统。这些方法和系统在包括医学诊断、食品和饮料检验、环境监测、产品质量控制、药物开发和基础科学研究的各种应用中都是重要的。

根据应用的不同，分析方法和系统需要具有一种或多种以下特性：i)高通量；ii)高敏感度；iii)大的动态范围；iv)高精度和/或准确度；v)低价格；vi)低试剂消耗；vii)与现有用于样品加工处理的设备的兼容性；viii)出结果时间短；ix)多路处理能力；和x)对干扰物和复杂样品基质不敏感。在多种应用中也需要用容易实施的、能够自动化的、和/或使用稳定干燥的试剂的分析格式来获得这些性能优势。具有这些特征的新的分析方法和系统是非常有价值的。

已经开发出了多种提供了用于分析的干燥的稳定形式的试剂的方法。美国专利5,413,732描述了某些能够溶解于溶液的干燥的试剂球。

美国专利6,429,026描述了某些使用干燥的试剂和时间分辨荧光检测的免疫分析法。捕获抗体被固定于微滴定孔的表面上。在孔底捕获抗体的上方干燥含有碳水化合物和/或蛋白的隔离层。在隔离层的上方加入少量的标记抗体并干燥。用能够被解离增强镧系荧光免疫分析(DELFIA)技术检测到的镧系螯合物标记抗体。加入样品和常用的分析缓冲液来启动免疫分析。在容许发生抗体反应之后，洗涤孔数次，加入DELFIA增强缓冲液，并实施荧光寿命测定。

美国申请2003/0108973描述了一种三明治免疫分析法，其采用了含有冻干混合物的试管，所述冻干混合物包括固定于2.8μm可磁化聚苯乙烯珠上的捕获抗体和经电化学发光标记物标记的检测抗体。混合物也包括减少检测抗体和珠在冻干过程中的非特异性结合的封闭剂。加入含有感兴趣的分析物的样品造成了在珠上形成三明治复合物。然后将珠悬浮液吸入到可重复使用的流动池内，其中所述珠被聚集到电极上并用点化学发光(ECL)检测技术进行分析。

Wohlstadter等的美国专利6,673,533描述了使用干燥的试剂的基于ECL的三明治免疫分析法。捕获抗体被固定于复合电极上。通过加入并冻干含有与ECL标记相连接的检测抗体、磷酸、三丙胺、牛血清白蛋白、蔗糖、氯乙烯胺和TRITONX-100的溶液可以将检测所用的其他试剂都干燥于电极表面上。通过向电极上被干燥的试剂中加入样品、温育溶液、向电极施加电能以诱导ECL来实施免疫分析。不需要洗涤步骤。

已经开发出了各种用于增加分析通量的技术。多孔分析板(也称作微量滴定板或微量板)的应用容许对分布于板的多个孔内的多个样品进行平行处理和分析。多孔分析板可以取不同的形式、尺寸和形状。为了便利起见，用于处理用于高通量分析的样品的设备已经形成了一些标准。多孔分析板通常被制成标准的尺寸和形状，具有标准的孔排列。孔排列包括在96孔板(12x8孔阵列)、384孔板(24x16孔阵列)以及1536孔板(48x32孔阵列)中所见的孔排列。生物分子筛选学会已经发表了多种板格式的推荐的微量板规范(见http://www.sbsonline.org)。

Wohlstadter等的美国出版物2004/0022677和2005/0052646以及美国申请10/185,274和10/185,363分别描述了用于在多孔板格式中进行单路和多路ECL分析的溶液。它们包括板，所述板包括具有形成孔的孔壁的通孔的板顶以及密封住板顶以便形成孔底的板底。板底具有图案化(patterned)的导电层，所述导电层提供了具有电极表面的孔，所述电极表面既用作结合反应的固相支持物又用作诱导ECL的电极。导电层也可以包括用于给电极表面施加电能的电触点。

尽管已经具有了这些已知的用于实施分析的方法和系统，但是仍然需要改良的用于实施化学分析、生物化学分析、和/或生物学分析的分析模块。

发明内容

本发明涉及分析模块(例如分析板、盒、或多孔分析板、反应容器等)，所述分析模块具有预装于分析模块的孔、室或分析区内的分析试剂。在某些实施方式中，存放干燥状态的这些检测试剂。此外，分析模块还可以包括用于将这些分析试剂保持在稳定干燥状态的干燥剂材料。提供了用于制备这种分析模块的方法以及在分析中使用所述分析模块的方法。

本发明提供多孔板，其包括至少一个具有以下特征的孔：(1)具有固定化于其上的第一结合试剂的结合表面，和(2)至少一种额外的干燥的试剂，其中至少一种额外的干燥的试剂不接触结合表面。多孔板可以具有整合于多孔板的其中至少一个孔内的结合表面和电极表面。

本发明提供多孔分析板，其包括具有如在此限定的多个孔的板体，所述多个孔包括具有固定化于其上的捕获试剂的结合表面以及可重建的(reconstitutable)干燥的试剂。任选地，可以选择出适合用作电化学分析或电化学发光分析中的电极的结合表面。此外，可以用可重建的保护层涂覆结合表面。干燥的试剂可以是标记检测试剂，其可以是独立存在的或者可以位于孔中不与结合表面重叠的表面上。在一个具体的实例中，结合表面位于孔底，可重建的干燥的试剂位于孔壁，任选地位于孔壁的试剂存放用架状物(shelf)上。在另一个实例中，结合表面和可重建的干燥的试剂可以位于孔底面的非重叠区。在另一个具体的实例中，可重建的干燥的试剂是独立存在的丸。

多孔分析板还可以包括可重建的干燥的分析对照分析物，其可以对固定化的捕获试剂和/或标记检测试剂(如果存在)具有结合亲和力。在特定的实施方式中，对照分析物可以对孔内的固定化的捕获试剂和/或标记检测试剂具有亲和力，但是对照分析物以不与结合表面或标记检测试剂相接触的未结合形式存在。

多孔分析板还可包括一种或多种额外的固定化的捕获试剂。捕获试剂和额外的捕获试剂在结合表面上被图案化，以便在结合表面上形成结合区阵列。这些结合区/捕获试剂可以对结合配偶体具有不同的特异性或亲和力。另外，孔可以具有多种不同的可重建的干燥的标记检测试剂，所述试剂对结合配偶体具有不同的特异性或亲和力。

可以在实施分析的方法中使用上述的多孔板，包括向板的一个或多个包括固定化的捕获试剂和可重建的干燥的标记检测试剂的孔内加入样品；重建这些孔内可重建的干燥的材料，以便形成反应混合物；在能够促进所述捕获试剂和检测试剂与相应的结合配偶体结合的条件下温育反应混合物，以及测定出包括固定化的捕获试剂和标记的结合试剂的复合物的形成。通过选择合适的捕获试剂和检测试剂，这些方法可以包括三明治结合分析法和竞争性结合分析法。

本发明提供制备用于分析法中的多孔分析板的方法，包括在板的至少两个孔内实施以下步骤：将捕获试剂固定于所述板的孔表面上，以便形成结合表面；将包括标记检测试剂的液体试剂分配到不与结合表面重叠的孔表面；干燥液体试剂以形成可重建的干燥的检测试剂。方法还可以包括将保护试剂分配到结合表面上，并干燥保护试剂，以便在结合表面上形成可重建的干燥的保护层。例如，在分配包括标记检测试剂的液体试剂之前分配并干燥保护试剂。

在特定的具体实施方式中，结合表面位于孔底，液体试剂被分配到非重叠的孔底面或孔壁上并干燥。任选地，孔壁包括液体存放用架状物，以及液体试剂被(i)分配到架状物上并干燥或(ii)分配到孔壁的架状物上方的某个位置，使得可以收集沿着孔壁流下的液体试剂，随后所述试剂在架状物上被干燥。

用于制备板的方法还包括固定一种或多种额外的捕获试剂，使得在结合表面上形成对结合配偶体具有不同的特异性或亲和力的结合区阵列。同样，液体试剂可以包括一种或多种对结合配偶体具有不同的特异性或亲和力的额外的标记检测试剂。此外，方法可以包括分配并干燥额外的液体试剂，所述试剂包括对捕获或标记检测试剂具有结合亲和力的分析对照分析物，额外的液体试剂可以被分配并干燥，使得它们不会接触捕获试剂或标记检测试剂。

在上述方法的特定的实施方式中，省略了分配并干燥包括标记检测试剂的液体试剂的步骤，而是加入了独立形式例如独立丸的可重建的干燥的标记检测试剂。优选地，在加入检测试剂之前，在结合表面上分配并干燥保护试剂，以便形成可重建的保护层。方法也可以包括固定一种或多种额外的捕获试剂，使得在所述结合表面上形成对结合配偶体具有不同的特异性或亲和力的结合区阵列。同样，可重建的干燥的试剂可以包括一种或多种对结合配偶体具有不同的特异性或亲和力的额外的标记检测试剂。此外，方法可以包括向孔内加入额外的独立存在的干燥的试剂，所述干燥的试剂包括对捕获或标记检测试剂具有结合亲和力的分析对照分析物。

本发明提供了多孔板，其包括板体，所述板体具有限定于其中的多个孔，其包括：a)多个带有可重建的第一干燥的试剂的第一试剂孔和b)多个带有第二干燥的试剂的第二试剂孔，其中第一和第二试剂是用于实施分析的相匹配的试剂。提供在这些板内实施分析的方法，包括a)向一个第一试剂孔内加入样品，b)重建第一试剂孔内的可重建的干燥的标记检测试剂，以便形成反应混合物，c)将测试用量(aliquot)的反应混合物转移到一个或多个第二试剂孔内，和d)温育第二试剂孔内的反应混合物，以便对所述样品实施所述分析。在一个实施方式中，多孔分析板被分成了多个由第一试剂孔和一个或多个第二试剂孔组成的孔组，所述方法还包括在每个孔组中重复(a)-(d)的过程。

在具有第一和第二试剂孔的多孔板的一个具体的实施方式中，按规则的二维模式排列第一试剂孔，所述第一试剂孔具有孔底和孔壁，所述孔壁具有内壁表面和外壁表面。此外，第二试剂孔具有孔底和孔壁，检测孔的外壁表面以及连接相邻检测孔的外壁表面的肋状元件限定出孔壁。任选地，第一试剂孔可以具有圆形的开口周界，和/或按8x12方形阵列排列第一试剂孔。

本发明提供了多孔分析板，其包括板体，所述板体具有限定于其中的多个孔，其包括：a)多个检测孔，每个检测孔包括具有固定化于其上的捕获试剂的结合表面，和b)多个试剂重建孔，每个试剂重建孔包括可重建的标记检测试剂，其中，至少一个检测孔和一个试剂孔包括用于测定感兴趣的分析物的相匹配的捕获试剂和检测试剂。任选地，可以选择出适合用作电化学或电化学发光分析中的电极的结合表面。在一个实施方式中，检测和试剂重建孔可以被成组为多个由一个试剂重建孔和一个或多个检测孔组成的分析组，一个组内的试剂重建孔和检测孔包括用于测定感兴趣的分析物的相匹配的捕获试剂和检测试剂。这些组可以由一个试剂重建孔和一个检测孔组成。

具有检测孔和试剂重建孔的多孔板的一个具体的实施方式包括：

a)多个检测孔，其中所述检测孔

i)具有孔底和孔壁，所述孔壁具有内壁表面和外壁表面；

ii)按规则的二维模式排列；和

iii)在每个所述检测孔的内表面上包括具有固定化于其上的捕获试剂阵列的结合表面；

b)多个试剂重建孔，其中所述试剂重建孔

i)具有孔底和孔壁，由所述检测孔的外壁表面以及连接相邻检测孔的外壁表面的肋状元件限定出孔壁，和

ii)每个试剂重建孔包括可重建的干燥的标记检测试剂。

任选地，检测孔的孔口周界没有凹陷的角或弯曲(例如圆形开口周界)，而试剂重建孔的孔口周界具有凹陷的角或弯曲。

具有检测孔和试剂重建孔的多孔板的检测或试剂重建孔还可以包括可重建的干燥的分析对照分析物。检测孔也可以包括一个或多个额外的固定化的捕获试剂。在这个实施方式中，捕获试剂被图案化形成结合表面上的对结合配偶体具有不同的特异性或亲和力的图案化的结合区阵列。此外，可重建的干燥的试剂还可以包括一个或多个额外的标记检测试剂，检测试剂和额外的检测试剂对结合配偶体具有不同的特异性或亲和力。

本发明提供了在具有检测孔和试剂重建孔的多孔板内实施分析的方法。一个实施方式包括a)向一个试剂重建孔内加入样品；b)在重建孔内重建可重建的干燥的标记检测试剂，以形成反应混合物；c)将测试用量的反应混合物转移到一个或多个检测孔内；c)在促进捕获试剂和检测试剂与它们相应的结合配偶体结合的条件下温育检测孔内的反应混合物；和d)测定包括固定化的捕获试剂和标记的结合试剂的复合物的形成。任选地，多孔板可以被分成多个包括一个试剂孔和一个或多个第二试剂孔的孔组，以及方法还包括在每个孔组内重复(a)-(d)的过程。

本发明提供了多孔分析板，其具有多个限定于其中的孔的板体，所述孔具有孔底以及从所述孔底延伸到所述孔底上方高度h_w处的孔壁，所述孔被成型为能够提供高度为h_s的架状元件(shelfelement)，其中0＜h_s＜h_w。可以按标准的多孔板格式排列孔，包括排列在方形格子中的4x6、8x12、16x24、和32x48的孔阵列。在特定的实施方式中，h_s大于或等于0.02h_w、0.05h_w或0.1h_w，但小于或等于0.1h_w、0.25h_w或0.5h_w。在其他实施方式中，h_s大于或等于约0.1mm、0.2mm、0.5mm、或1mm，但小于或等于约1mm、2mm、或5mm。可以用架状元件存放干燥的试剂。因此，另一个实施方式是具有架状物上的可重建的干燥的试剂的板。本发明提供了用于制备用于检测的板的方法，包括将液态试剂分配到具有架状元件的多孔板的孔内，干燥的试剂以便形成可重建的干燥的试剂，其中试剂被分配到架状物上并干燥或者可以被分配到架状物上方的孔壁上并干燥，使得在架状物上收集沿着孔壁流下的液体试剂并在架状物上干燥。

在具有带架状元件的孔的板的特定的实施方式中，板体是单片注射成型件。在其他的实施方式中，板体包括具有多个限定出孔壁的通孔的板顶和密封所述板顶并限定出孔底的板底。任选地，板底提供了暴露于孔的内容积中的导电电极表面的并且可以用作电化学分析或电化学发光分析中的电极。

本发明提供了多孔板，其包括

a)具有多个限定于其中的孔的板体，包括：

i)多个包括干燥的分析试剂的分析孔；和

ii)多个包括干燥剂的干燥剂孔；和

b)密封所述板体的板盖，据此将所述的多个孔与外周环境分开。

任选地排列板，使得孔处于标准的孔排列(例如排列于方形格子中的4x6、8x12、16x24或32x48孔阵列)。合适的分析孔构型包括但不限于具有如在上面的实施方式中所述的干燥的试剂(例如捕获试剂和/或检测试剂)的孔。有利地，可以用干燥管路连接干燥剂孔和分析孔，管路容许水蒸汽从分析孔弥散到干燥剂孔，还在分析孔的干燥的分析试剂位置上方的高度处与孔相交。在一个实施方式中，通过用板盖密封板体顶面上的连接分析孔与干燥剂孔的凹槽可以提供这样的管路。在某些实施方式中，所述板的孔被分成了多个包括至少一个分析孔和至少一个干燥剂孔的分析小组(panel)。在这些实施方式中，分析小组中的孔经干燥管路彼此相互连接，但并不与其他分析小组中的孔相连接。在一个具体的实施方式中，分析小组包括一个分析孔和一个干燥剂孔。

在具有分析孔和干燥剂孔的多孔板的一个实施方式中，分析孔包括具有固定化于其上的捕获试剂的结合表面以及可重建的干燥的标记检测试剂。分析孔还可以包括一个或多个额外的固定化的捕获试剂，捕获试剂和额外的捕获试剂在所述结合表面上形成图案化的结合区阵列，所述结合区对结合配偶体具有不同的特异性或亲和力。另外，可重建的干燥的试剂还可以包括一个或多个额外的标记检测试剂，检测试剂和额外的检测试剂可以对结合配偶体具有不同的特异性或亲和力。任选地，结合表面适合用作电化学发光分析中的电极。

在具有分析孔和干燥剂孔的多孔板的特定的实施方式中，板体是单片注射成型件。或者，板体包括具有多个限定出孔壁的通孔的板顶和密封所述板顶并限定出孔底的板底。所述通孔和板底可以限定出所有的孔或者仅仅一部分孔，例如仅仅限定出所述的分析孔或仅仅限定出所述的干燥剂孔。板底可以任选地提供暴露于孔的内容积中的导电电极表面。

本发明也提供了多孔板，包括

a)具有多个限定于其中的含有干燥的分析试剂的孔的板体，所述板体包括具有多个限定出孔壁的通孔的板顶以及密封所述板顶并限定出孔底的板底。

b)密封所述板体的板盖，据此将所述的多个孔与外周环境分开；和

c)干燥剂材料。

任选地排列板，使得孔处于标准的孔排列(例如排列于方形中的4x6、8x12、16x24或32x48孔阵列)。板底可以任选地提供暴露于孔的内容积中的导电电极表面。合适的分析孔构型包括但不限于具有如在上面的实施方式中所述的干燥的试剂(例如捕获试剂和/或检测试剂)的孔。在特定的实施方式中，板盖、板盖和板顶之间的衬垫层、板顶、板顶和板底之间的衬垫层和/或板底包括干燥剂。例如，干燥剂可以被掺入(impregnate)到这些组件内或者可以是在这些组件的涂层内。或者，板体可以限定出一个或多个带有干燥剂的附加孔。

在一个实施方式中，分析孔包括具有固定化于其上的捕获试剂的结合表面和可重建的干燥的标记检测试剂。任选地，结合表面适合用作电化学或电化学发光分析中的电极。分析孔还可以包括一种或多种额外的固定化的捕获试剂，捕获试剂和额外的捕获试剂在所述结合表面上形成图案化的结合区阵列，所述结合区对结合配偶体具有不同的特异性或亲和力。另外，可重建的干燥的试剂还可以包括一个或多个额外的标记检测试剂，检测试剂和额外的检测试剂可以对结合配偶体具有不同的特异性或亲和力。

附图说明

图1a-1e显示了包括干燥的试剂的多孔板的一些实施方式的不依比例的示意图。

图2a-2j显示了具有带架状元件的孔壁的孔的一些实施方式的不依比例的俯视图和横截面图，所述架状元件包括可以用于支持干燥的试剂的壁架(ledge)(图2a-2f)、桥状物(图2g-2h)和台状物(图2i-2j)。

图3a-3c显示了具有检测孔和试剂重建孔的多孔板的示意图。

图4a-4b显示了具有检测孔和试剂重建孔的板的一个实施方式的俯视图和横截面图，试剂重建孔可以位于检测孔之间的间隙内。

图5a-5f显示了具有分析孔和干燥剂孔的多孔板500(图5a-5b)、520(图5c-5d)和540(图5e-5f)的示意图。

图6是多孔分析板的一个实施方式的立体示意图。

图7a-7c显示了三个被构造成实施基于阵列的多路电化学发光分析的多孔板的示意图。

图8显示了具有干燥的试剂壁架和每孔7个点的方形孔板的一个实施方式。

图9显示了具有干燥的试剂壁架、每孔7个点和相邻孔对之间的干燥管路的方形孔板的一个实施方式。

图10显示了将干燥剂孔整合到分析板内对存放于板中的干燥的试剂的稳定性的影响。

具体实施方式

我们描述了具有预装于分析模块的孔、室或分析区内的分析试剂的分析模块(例如分析板、盒、多孔分析板、反应容器等)。在特定的实施方式中，存放干燥状态下的这些分析试剂。此外，分析模块可以包括用于将所述分析试剂保持在干燥状态的干燥剂材料。预装有分析试剂的分析模块可以极大地提高速度并减少分析测定的复杂性，同时保持存放期间的极好的稳定性。我们也描述了用于制备这些分析模块的方法以及在分析中使用这些模块的方法。

干燥的分析试剂可以是任何一种可以被干燥、然后在用于分析之前被重建的分析试剂。这些分析试剂包括但不限于结合分析中所用的结合试剂、酶、酶底物、指示剂染料和其他可以用于检测感兴趣的分析物的反应化合物。分析试剂也可以包括不直接参与检测机制但在分析中起到辅助作用的物质，所述物质包括但不限于封闭剂、稳定剂、去污剂、盐、pH缓冲剂、防腐剂等。试剂可以是游离形式或者是受固相支持的，所述固相包括分析模块的隔室(例如室、管路、流动池、孔)的表面或者胶体、珠或其他微粒支持物的表面。在特定的实施方式中，所包括的干燥的试剂(例如可重建的干燥的试剂)包括磷酸铵作为缓冲组分，包括其他铵盐，和/或包括小于约1％(w/w)或小于约0.1％(w/w)的钠离子或钾离子。

描述了带有用于结合分析的干燥的捕获试剂和检测试剂的多孔板的多个实施方式，其中按照使得它们不会彼此相互接触的方式将捕获试剂和检测试剂存放于板上。但是，本领域人员要明白这些实施方式可以被更广泛地应用于按照使得它们在使用之前不会彼此接触的方式存放任何数目不同的干燥的分析试剂(无论它们是固定的或未固定的、标记的或未标记的结合试剂等等)。同样，虽然多个图都用“Y”符号表示试剂或结合试剂，但是使用这个符号不应当被解释为将这些试剂限定为抗体，除非有特别的说明。也要明白的是，实施方式可以被更广泛地应用于存放在非孔的其他类型的隔室(例如室、管路、流动池等)中的分析试剂。

术语“可重建的干燥的”可以用于表示干燥的试剂是可重建的干燥的试剂以及标记检测试剂或者干燥的可重建的保护层等。该名词用来表示通过加入样品或溶剂形成溶液或悬浮液来重建的干燥的试剂。优选地，它们是水溶性的或者通过加入水性样品后可被重建的。相反地，术语“固定化的”试剂在此表示在实施分析期间加入样品之后仍正常地保持在表面上的试剂，尽管可以用特殊的条件将其从表面脱离下来。

可以在分析模块的隔室内(例如多孔分析板的孔内)原位制备出可重建的干燥的试剂。例如，可以将一份液态试剂分配到孔或其他隔室内并干燥(例如经空气干燥、真空干燥、冷冻干燥等)形成可重建的干燥的试剂。通过添加少量仍被限定在隔室的分离的表面(例如孔的底部或孔壁上的分离的位置)上的试剂，所形成的干燥的试剂可以仍然固定地限定在所述位置。或者，可以加入足以扩散到整个底面或者足以填满隔室的体积的试剂，以便形成布满整个连续表面上的干燥的试剂层。可以在分析模块外制备出可重建的干燥的试剂，并将干燥形式的所述试剂(例如干粉末或者独立存在的干丸)加入到模块的隔室内(例如多孔板的孔内)。丸在此表示紧密的干燥的物质例如压缩的干片剂或冻干的干珠(例如美国专利5,413,732)。

一些实施方式包括或采用了可以用于实施结合分析的干燥的结合试剂。可以用于分析模块或方法中的结合试剂包括但不限于抗体、受体、配体、半抗原、抗原、表位、模拟表位(minitopes)、适体、杂交配偶体和嵌入剂(intercalaters)。合适的结合试剂组合物包括但不限于蛋白、核酸、药物、类固醇、激素、脂质、多糖、及其组合。已经证实核酸和蛋白(特别是抗体)对于结合分析是特别有用的。本领域人员能够鉴定出用于特殊应用中的合适的结合试剂。术语“抗体”在此包括完整的抗体分子(包括通过在体外重新组合抗体亚基装配出的杂交抗体)、包括抗体的抗原结合区的抗体片段和重组蛋白构建体(例如Porter&Weir，J.Cell.Physiol.，61(Suppl.1)：51-64，1966和Hochmanetal.Biochemistry12：1130-1135，1973所述)。该术语也包括已经被化学修饰例如通过引入标记修饰的完整抗体分子、抗体片段和抗体构建体。术语核酸在此将被广泛地用于不仅包括DNA和RNA，还包括参与与DNA或RNA序列的特殊的Watson-Crick或Hoogstein杂交反应的类似物(例如肽核酸或硫代磷酸酯连接的核酸)，也包括已经被化学修饰例如通过引入标记修饰的核酸和类似物。

术语“捕获试剂”在此表示被固定于表面上以形成用于固相结合分析中的结合表面的结合试剂。分析模块和方法也可以采用或包括另一种结合试剂。可以测定出参与结合表面上的结合反应的“检测试剂”。通过测定试剂的内在特性例如颜色、发光度、放射性、磁场、电荷、折光率、质量、化学活性等可以测定出检测试剂。或者，可以用可检测的标记物标记检测试剂，并通过测定标记的特性测定出检测试剂。合适的标记包括但不限于选自由电化学发光标记、发光标记、荧光标记、磷光标记、放射性同位素、酶标记、电活性标记、磁性标记和光散射标记组成的组中的标记。

可以实施的分析包括“三明治分析”，其采用了可以同时结合于感兴趣的分析物的固定化的捕获试剂和检测试剂，使得具有隔离结合表面上的检测试剂的作用。因此，通过测定检测试剂在表面上的蓄积可以测定出分析物的存在。分析也可以包括“竞争性分析”，其i)采用了与分析物竞争性结合检测试剂的固定化的捕获试剂，或者ii)与分析物竞争性结合固定化的捕获试剂的检测试剂。对于竞争性分析而言，分析物的存在造成了结合表面上检测试剂量的可测定的减少。

捕获试剂或检测试剂可以直接地结合(或竞争性结合)感兴趣的分析物，或者可以通过一个或多个桥接配体间接的相互作用。因此，干燥的分析试剂可以包括这些桥接配体。例如，通过采用生物素标记的结合或竞争性结合感兴趣的分析物的桥接试剂可以将抗生物素链菌素或抗生物素蛋白用作捕获或检测试剂。同样，通过采用半抗原标记的结合或竞争性结合感兴趣的分析物的结合试剂可以将抗半抗原抗体用作捕获或检测试剂。在另一个实例中，抗种类抗体或Fc受体(例如蛋白A、G或L)通过其结合分析物特异性抗体的能力可以用作捕获试剂或检测试剂。这些技术在结合分析领域是已知的，本领域一般熟练人员能够容易地鉴定出用于特殊应用的桥接配体。

分析模块/板的特定实施方式包括固定化于模块/板的表面上的捕获试剂，以便形成结合表面。利用固相结合分析技术领域熟知的固定化技术可以实施所述固定化，例如已知用于实施ELISA分析或基于阵列的结合分析的技术。在一个实例中，结合试剂可以被非特异性地吸附到多孔板的孔底表面。表面可以是未经处理过的或者已经处理过的(例如用血浆或带电荷的聚合物处理过的)以便增强表面的吸附性能。在另一个实例中，表面可以具有活性的化学官能团，使得能够容许共价偶联结合试剂。在固定试剂之后，表面可以任选地接触试剂，所述试剂包括用于封闭表面上的未涂覆部位的封闭剂。为了进行多路测定，可以使用有着不同捕获试剂阵列的结合表面。各种用于形成捕获试剂阵列的技术在基于阵列的分析技术领域都是熟知的。

任选地用可重建的干燥的保护层涂覆结合表面。可以用保护层稳定结合表面，以便预防结合表面在生产或存放期间接触到检测试剂，或者只是简单地作为存放检测试剂例如桥接剂、封闭剂、pH缓冲剂、盐、去污剂、电化学发光共反应剂等的场所。保护层中可见的稳定剂包括但不限于糖(蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇等)、多糖和糖聚合物(葡聚糖、FICOLL等)、聚合物(聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮等)、两性离子渗透剂(甘氨酸、甜菜碱等)和其他稳定渗透剂(三甲胺-N-氧化物等)。封闭剂是阻止分析组分特别是检测试剂与结合表面的非特异结合的物质，包括蛋白(例如血清白蛋白、伽玛球蛋白、免疫球蛋白、奶粉或纯化酪蛋白、明胶等)、聚合物(例如聚环氧乙烷和聚环氧丙烷)和去污剂(例如已知商品名为BRIJ、TRITON、TWEEN、THESIT、LUBROL、GENAPOL、PLURONIC、TETRONIC、和SPAN的非离子型去污剂或表面活性剂)。在特定的实施方式中，引入保护层，其包括磷酸铵作为缓冲组分，包含其他铵盐，和/或包含低于1％或0.1％(w/w)钠离子或钾离子。

一个实施方式是多孔板，其包括至少一个具有(1)第一干燥的分析试剂和(2)第二干燥的分析试剂的孔，其中所述第一和第二干燥的试剂中的一种或两种试剂是可重建的干燥的试剂，其中所述第一和第二干燥的试剂不会彼此相互接触。孔还可以包括一种或多种额外的干燥的试剂。包括一种或多种不会接触第一和/或第二干燥的试剂的额外的可重建的干燥的试剂。实施方式也包括用于在这些板中进行感兴趣的分析物的分析的方法，包括将液体样品加入到板的一个或多个孔内，重建孔内的可重建的干燥的试剂并测定出分析物依赖的分析信号，以便测定出样品中的分析物。本领域人员根据分析技术领域的知识能够容易地选出用于测定各种分析物的试剂和检测方法。可以被测定到的可检测信号包括但不限于光学吸光度、光致发光(例如荧光)、化学发光、电流或电能、催化活性、化学活性、光散射、凝集、放射活性、电化学发光、磁性、折光率变化、和其他已经用于分析测定中的信号。

另一个实施方式是多孔板，其包括至少一个具有(1)具有固定化于其上的第一结合试剂的结合表面，和(2)至少一种额外的干燥的试剂的孔，其中至少一种额外的干燥的试剂是不会接触结合表面的可重建的干燥的试剂。多孔板可以具有整合于多孔板中的至少一个孔内的电极表面和结合表面。

图1a-1e显示了多孔板的孔100的一些实施方式的不依比例的示意图。用孔底120和孔壁110限定出孔。底120和壁110可以是由单一连续的材料组成，或者可以是拼接在一起的分离的组分(例如板顶和板底)。孔100也可以含有位于底120上的第一干燥的试剂130，如图所示，所述干燥的试剂130可以是固定于底120上并形成结合表面的一种或多种捕获试剂。第一干燥的试剂130可以包括多个固定化的捕获试剂(例如试剂130a、130b和130c)，其被图案化成多个分离的结合区(例如阵列)。有利地，结合试剂/区可以对结合配偶体具有不同的亲和力或特异性；这些结合区可以被用于实施多路的基于阵列的测定。可重建的保护层140覆盖干燥的试剂130。可以省略保护层140，例如当不需要物理地分离试剂130和150时。孔100也包括第二干燥的试剂150，其是可重建的干燥的试剂。第二干燥的试剂150可以包括检测试剂例如标记检测试剂160。任选地，第二干燥的试剂150包括多个在其与结合配偶体结合的结合亲和力或特异性方面有所不同的检测试剂。孔100也可以包括任选的、额外的可重建的干燥的试剂170，其包括分析对照分析物180(如图1c-1e所示)。也显示了板盖190。板盖190可以被省略，其盖住了孔110的顶面，以便阻止干燥的试剂接触到环境。

图1a显示了一个实施方式，其中用可重建的保护层140涂覆第一干燥的试剂130。将第二干燥的试剂150铺层在保护层140的上方，所述保护层阻止了第二干燥的试剂150接触到第一干燥的试剂层130。在本实施方式的一个实例中，通过将液体形式的第二干燥的试剂150分配到保护层140上进行所述试剂的铺层；选出具有足够厚度或质量的保护层140，使得它能够吸收这种液体且不会容许其接触干燥的试剂130。然后液体被干燥形成第二干燥的试剂150。在另一个实例中，引入液体形式的保护层140，并将其在孔内冷冻形成第一冷冻层。然后引入液体形式的试剂150，并在第一冷冻层之上冷冻成第二冷冻层。冻干两个冷冻层提供了分层的干燥的试剂结构。

图1b显示了一个实施方式，其中试剂130和150都被固定地位于底120的非重叠区。额外的干燥的试剂例如检测对照试剂(未显示)可以位于底120的其他非重叠区。利用图案化的试剂装配或分配的标准技术可以实现试剂在底120的选定区域内的定位。任选地，底120具有由相对疏水性区域围绕的相对亲水性区域，使得分配到亲水性区域上的合适体积的试剂能够渗入到由疏水性区域限定出的明确界线。在这个和其他的实施方式中，其中可重建的干燥的试剂位于表面，可以用封闭剂预处理表面，以便阻止试剂吸附于表面，和/或试剂组合物包括有封闭剂。

图1c显示了一个实施方式，其中第二干燥的试剂150以一个或多个干燥的试剂丸的形式被固定地定位于壁110上。例如通过将一滴或多滴试剂(液体形式)分配到壁110上并将其干燥形成干燥的试剂丸就可以形成所述丸。图1c也显示了被固定地定位于壁110上的另一个非重叠区的任选的额外的干燥的试剂170以及对照分析物180。图1d显示了与图1c所示类似的实施方式，除了试剂150和170位于壁110的架状物115上。通过将其分配到架状物115上并干燥或者将其分配到架状物115的上方使得它们顺着壁110流到它们所要被干燥的架状物115上就可以由液体试剂形成干燥的试剂150和170。或者，独立存在的干燥的试剂丸可以被放置在架状物115上。

最后，图1e显示了一个实施方式，其中试剂150和任选的试剂170都是独立的干燥的试剂丸。也包括孔100的实施方式，其中有着一些孔底、孔壁、孔架状物上的和/或独立形式的可重建的干燥的试剂的组合。在另一个实施方式中，采用了一些固定定位的和独立存在的可重建的干燥的试剂的组合。

如图1中的实施方式所示，多孔板包括那些具有多种、物理分离的、干燥的试剂的孔的多孔板。同样，为了在不同的孔内进行不同的分析，不同的孔可以有着不同的干燥的试剂。例如为了质量控制的目的，需要确保板的孔内有着正确的干燥的试剂。因此，干燥的试剂可以包括指示物(例如染料或荧光团)，使得它们可以被用于对板的光学观察。通过在不同的干燥的试剂中使用不同的可区别的指示物，使得能够光学观察板，以确保在板的合适的孔内的合适位置上有着正确的试剂。

图2显示了一些具有架状元件的孔的实施方式的不依比例的示意图，其中在架状元件上，可以保留并干燥液体试剂和/或可以在孔底部的上方支持独立的干燥的试剂。架状元件可以包括如下所述的壁架、桥状物或台状物。图2a是显示出孔底200和孔壁210的孔200的横截面，孔壁具有能够支持干燥的试剂的壁架例如壁架230和235。壁架230具有一个与正好在壁架上方的壁有着基本上90°或小于90°的角，使得合适体积的试剂可以被分配到壁架230，并在壁架230上聚集，而不会向下流到孔底200。壁架也可以具有有助于含有试剂的其他特点例如壁架235上的口缘240。

架状元件例如壁架235可以位于高出孔底240(h_b＝0)并低于孔高(h_w)的任何高度处(h_s)。在一些实施方式中，h_s大于或等于0.02h_w、0.05h_w或0.1h_w，但小于或等于0.1h_w、0.25h_w或0.5h_w。在其他实施方式中，h_s大于或等于约0.1mm、0.2mm、0.5mm或1mm，但小于或等于约1mm、2mm、或5mm。通过在检测期间正确选择架状物高度和添加的样品/试剂的体积，可以控制分析反应的顺序或时机。在一个实例中，选择架状物高度和样品体积，使得加入到孔内的样品所提供的液体高度既能够接触到孔底部的试剂，同时也重建一个或多个架状物上的试剂。或者，也可以选择架状物高度，使得加入给定体积的第一液体能够接触到孔底部的干燥的试剂(重建底部的可重建的试剂和/或容许反应进行到涉及存放于底部的试剂的过程)，但是不会达到一个或多个架状物的高度。可以在稍晚的时候通过加入有效量的第二液体的体积开始涉及架状物上的试剂的反应，使得液体水平达到架状物的高度，以便重建架状物上的干燥的试剂。在实施反应的时候，被测定的样品可以是第一液体、第二液体或两者。

图2b-2f显示了孔200的一些实施方式的俯视图，并显示出孔口可以是各种不同的形状，包括但不限于方形(图2b-2d)和圆形(图2e-2f)。此外，架状元件可以围绕着孔的周界延伸，例如图2b和2e所示，或者可以是仅仅部分绕壁延伸的一个或多个分离的架状元件，如图2c-2d和2f所示。孔也可以包括孔内的不同高度上的多个架状元件。图2g-2h分别显示了孔290的横截面和俯视图，其中架状元件是横跨孔的桥状物250。图2i-2j分别显示了孔295的横截面和俯视图，其中架状元件I是从孔底220的某个部分垂直延伸的台状物260。

本发明提供了多孔板，其包括板体，所述板体具有限定于其中的多个孔，所述多个孔包括a)多个带有可重建的第一干燥的试剂的第一试剂孔和b)多个带有第二干燥的试剂(其可以是可重建的干燥的试剂或固定化的试剂)的第二试剂孔，其中第一和第二试剂是用于实施分析的相匹配的试剂(即它们都被用于实施相关的分析)。试剂可以以独立存在的丸或粉末等形式位于孔的不同位置例如孔底、孔壁、架状元件。本发明提供了用于在这些板内实施分析的方法，包括a)向一个第一试剂孔内加入样品，b)重建第一试剂孔内的可重建的干燥的标记检测试剂，以形成反应混合物，c)将测试用量的反应混合物转移到其中一个或多个第二试剂孔内；和d)温育第二试剂孔内的反应混合物，以便在所述样品中实施所述分析。在一个实施方式中，多孔分析板可以被分成多个由第一试剂孔和一个或多个第二试剂孔组成的孔组，方法还包括在每个孔组内重复过程(a)-(d)。

图3a是一个实施方式的(不依比例的)示意图，显示了多孔板300的两个孔的横截面。孔302是包括一种或多种可重建的干燥的试剂的试剂重建孔，其可以包括标记检测试剂(例如包括标记检测试剂360的干燥的试剂350)或分析对照分析物(例如包括分析对照分析物380的干燥的试剂370)。这些干燥的试剂可以包括额外的试剂组分例如封闭剂、稳定剂、防腐剂、盐、pH缓冲剂、去污剂、桥接剂、ECL共反应剂等。试剂可以位于孔底、孔底的特殊位置、孔壁、架状元件之上或者可以是独立存在的(例如图1和2部分所讨论的那样)。孔301是包括一种或多种干燥的试剂的检测孔，其可以包括可重建的干燥的试剂或固定的干燥的试剂。如图所示，孔301包括固定化的捕获试剂330，其被图案化成三个结合区330a、330b和330c，以便形成结合表面。孔301也包括可以被省略的可重建的保护层340。在检测的一个实施方式中，向试剂重建孔内加入样品，其中重建出可重建的干燥的试剂。然后将样品转移到检测孔内，其中实施分析测定。或者，可以用可重建的缓冲剂重建试剂重建孔内的试剂；然后混合重建缓冲液和检测孔内的样品。图3a也显示了密封孔301和302的开口的板盖390，以保护孔内容物不接触外界环境。

多孔板的检测和试剂重建孔可以被成组为多个由一个试剂重建孔和一个或多个检测孔组成的检测组，组内的试剂重建孔和检测孔包括用于测定感兴趣的分析物的相匹配的捕获试剂和检测试剂。图3b显示了排列，其中一组具有一个试剂重建孔302和3个检测孔301。在分析期间，将加入到孔302中的样品分配到3个相关的检测孔301内，以便进行多个重复或者在检测孔带有不同的试剂时进行多个不同的分析。图3c显示了排列，其中一组具有一个试剂重建孔302和一个检测孔301。

试剂重建孔和检测孔可以是相似的大小和形状或者可以具有不同的大小和/或形状。在一些实施方式中，标准多孔板中的孔被分成了两种类型。图4显示了孔排列的不依比例的示意图。图4a显示了具有检测孔440的多孔板400的俯视图，所述孔按规则的二维模式排列并且具有检测孔壁430，所述孔壁具有内壁表面和外壁表面。多孔板也具有位于检测孔之间的间隙内的试剂重建孔460。试剂重建孔460具有由检测孔壁430的外孔表面和连接相邻孔的孔壁430的外表面(在最外面的孔中，是板框壁410的内表面)的肋状元件450限定出的孔壁。如图所示，检测孔可以被成型为没有凹陷(即向内突出)的弯曲或角，而间隙孔可以具有凹陷的弯曲和/或角。图4b显示了沿着图4a的虚线的横截面图，以及显示了两种类型的孔的底面(其可以是在板体的不同高度上)。板可以是由单一的连续材料形成的。在另一个实施方式中，板是由沿着图4b所示的虚线相匹配的板顶405和板底420组成的。有利地，圆形孔以及由孔壁和肋状元件限定出的间隙孔的阵列的基本排列是许多注射成型的96孔板和板顶的常见特点，并容许这些组件被用于形成如图4所示的干燥的试剂板。

本发明提供了多孔板，包括a)具有多个限定于其中的孔的板体：i)多个包括干燥的分析试剂的分析孔；和ii)多个包括干燥剂的干燥剂孔，和b)密封所述板体的板盖，据此分开所述的多个孔和外周环境。在一些实施方式中，分析孔包括用于在分析孔内实施分析的必要的试剂。也包括实施方式，其中干燥剂孔经干燥管路与分析孔相连接，所述管路容许水蒸汽从分析孔弥散到干燥剂孔，但是在分析孔的干燥的试剂位置上方的某个高度处与孔相交。除了含有干燥的试剂和干燥剂的多孔板，还提供了板本身(即没有干燥的试剂和干燥剂)，特别是具有适用于连接干燥剂孔和具有干燥的试剂的分析孔的组的管路和槽元件(如下面所述的图5所示)的板。

图5显示了具有分析孔501和干燥剂孔502的多孔板500的不依比例的示意图(没有显示出干燥剂和干燥的试剂)。图5a是俯视图，显示了孔壁510和连接干燥剂孔和一个(如A列所示)或多个(如B列所示)分析孔的管路508。图5b显示了沿着图5a的虚线的横截面图，其与图5a一起显示了封闭板体顶面的槽的板盖515是如何形成管路508的。板盖515封闭住这些槽以及孔顶，以便形成经管路相互连接并与环境和其他孔组分开的分析孔和干燥剂孔的组。因此，一个或多个孔组可以被开封并用于分析，剩下的孔组仍被保留在受干燥环境保护的环境中。板500可以是由单一连续的材料形成的。在另一个实施方式中，板500是由沿着图5b所示的虚线相匹配的板顶505和板底512组成的，板底512限定出了其中至少一些孔的底部。

板500的分析孔或孔组可以包括一个或多个上面所述的例如图1到4描述的任一含干燥的试剂的孔，以及可以包含分析孔和试剂重建孔。用于干燥剂孔的干燥剂可以选自己知的干燥剂材料，包括但不限于二氧化硅、活性铝、活性粘土、分子筛和其他沸石、吸水性盐(例如无水的硫酸钙、硫酸镁、硫酸钠、氢氧化钠和氯化锂)、吸水性溶液(例如氯化锂的浓缩溶液)和水反应性材料例如五氧化磷。在一些实施方式中，干燥剂是游离的干粉末或颗粒材料。在其他实施方式中，干燥剂是干丸，例如压缩片剂或掺入干燥剂的聚合物材料。在其他实施方式中，干燥剂存在于水蒸汽可通透的袋子或容器(例如商品化的二氧化硅包)内。有利地，丸形式或预装容器内的干燥剂可以被“压缩符合于”干燥剂孔，以避免其在转送或使用期间在孔内的移动。

图5c-5d显示了具有分析孔和干燥剂孔的多孔板520的一个实施方式的俯视图和横截面图。板520具有按规则的二维模式排列的分析孔521(其可以含有干燥的分析试剂)以及具有内壁表面和外壁表面的分析孔壁523。也可以具有位于间隙内的干燥剂孔522(或者，孔521被用作干燥剂孔和孔522被用作分析孔)。干燥剂孔522具有由分析孔壁523的外孔表面和连接相邻孔的孔壁523的外表面(在最外面的孔中，是板框壁526的内表面)的肋状元件525限定出的孔壁。当与板盖相匹配时，凹陷到孔壁523顶部内的槽524提供了水蒸汽从分析孔移动到干燥剂孔的通路。如图所示，分析孔可以被成型为没有凹陷(即向内突出)的弯曲或者角，而间隙孔可以具有凹陷的弯曲和/或角。图5d显示了沿着图5c的虚线的横截面图，以及显示了与板顶相匹配并形成了经管路524连接的但与其他孔和环境分开的分析孔和干燥剂孔的组的板盖527。板520可以是由单一的连续材料形成的。在另一个实施方式中，板520是由沿着图5d所示的弯曲相匹配的板顶528和板底529组成的。

图5e显示了具有分析孔(其可以含有干燥的试剂)和干燥剂孔的多孔板的另一个实施方式的示意图，以及显示了具有经板体的槽542连接成了孔组的分析孔541和干燥剂孔543的板540。多孔板540与图5a-5b所描述的板500的实施方式基本类似，除了在板540中，干燥剂孔542比分析孔来得更浅以及面积更小，这容许更多的板足迹(footprint)可以被用作分析测定的孔。图5f显示了沿着图5e的虚线的横截面图以及也显示了密封板顶形成相连的分析孔和干燥剂孔的组的板盖544。板540可以是由单一的连续材料形成的。在另一个实施方式中，板540是由沿着图5f所示的虚线相匹配的板顶545和板底546组成的，板底546也限定出了分析孔541的底面。

图6是多孔分析板的一个实施方式的立体示意图。多孔分析板600包括板顶610以及限定出孔壁的通孔615。板顶610经衬垫625密封板底620，使得板底620限定出了孔底。任选地，板顶610直接密封板底620，并省略了衬垫625。通过常用的密封技术例如粘合剂、溶剂焊接、热封、离子焊接等都可以实现密封。在另一个任选的实施方式中，板顶610完全限定出了孔的侧面和底面，可以省略板底620和衬垫625。通过用板盖630直接或经任选的衬垫635密封板顶610(通过传统的密封技术)可以将孔内容物与外周环境分开，所述孔包括被配置成含有如上所述的干燥的试剂和/或干燥剂的孔。

板600的组分可以是由各种不同的材料制成的，所述材料包括但不限于塑料、金属、陶瓷、橡胶、玻璃或其组合。根据所用的特殊检测技术对板的要求，被选出的一些组分或所有组分都是透明的、有颜色的、不透明的、或者高度光散射的。在一个实施方式中，板顶610是注射成型的塑料例如注射成型的聚苯乙烯、聚丙烯、或环烯烃共聚物(COC)。任选地，一种或多种组分可以是由具有低水蒸汽渗透率的材料制成的或者包括所述材料(例如涂层的形式)，所述低水蒸汽渗透率例如是渗透100μm厚度为小于每天1g/m²的水蒸汽渗透率。低水蒸汽渗透率材料包括但不限于玻璃、金属或金属膜(例如铝膜)、COC、聚偏二氯乙烯(PvDC)、聚丙烯、聚氯三氟乙烯(PCTFE)和液晶聚合物(LCP)。

板600可以含有如上所述的干燥剂孔。再者或另外，干燥剂可以被直接整合到板底610、板底620、板盖630、衬垫625和/或衬垫635内。例如Hekal等的美国专利6，174,952描述了含有干燥剂的聚合掺和物可以被成模、浇铸成衬圈或成型为薄膜、薄层、珠或片。

在一些实施方式中，板底620具有促进试剂在孔底图案化的特点(例如受疏水性区域包围的图案化的亲水特点)和/或导电层，这提供了暴露于板600的孔的内容积中的电极，使得可以实施电化学或电极诱导的发光检测(例如电化学发光分析)。板底620也可以包括电极接片，以便容许外在装置给电极施加电能/电流。Wohlstadter等的美国出版物2004/0022677和2005/0052646中所述的那些方法、配置和组成包括这些特点、导电层和电极接片的合适的方法、配置和组成。可以被用于利用分析模块实施ECL测量的合适的装置和方法包括在分别为美国申请10/185,274和10/185,363的美国出版物2004/0022677和2005/0052646、美国申请10/238,391的美国出版物2003/0113713、美国申请10/980,198的美国出版物2005/0142033、以及刚刚提交的Clinton等的题为“分析装置、方法和试剂”的美国申请11/，中所述的装置和方法。

图7提供了一个具体的实施方式的示意图，其包括一些上面所述的关于被配置成实施基于阵列的多路电化学发光分析的多孔板的发明概念。图7a显示了多孔板700的一部分，所述多孔板具有多个包括干燥的试剂的分析孔710和多个包括干燥剂的干燥剂孔720。板700顶面上的槽725连接每个干燥剂孔和分析孔。任选地，可以省略干燥剂孔720和槽725。分析孔710可以具有壁架712，其可以被用于支持可重建的干燥的试剂(例如包括检测对照和/或ECL标记检测试剂的干燥的试剂)。分析孔也具有覆盖有图案化的电介质层716的工作电极表面714，使得暴露出多个被暴露的电极表面或“点”(用孔内的圆圈表示)。另外，提供了另一电极718，以提供完整的电化学电路。任选地，电介质层716的表面相对于电极表面714是疏水性的，使得在点上被图案化的少量试剂可以被保持局限于所述点内。不同的点可以具有固定化于其上的不同的捕获试剂，以便形成具有在其与结合配偶体(例如感兴趣的分析物)结合的结合特异性或亲和力方面有所不同的结合区阵列的结合表面。或者，一些点可以具有限定于其上的可重建的干燥的试剂，例如可以含有分析对照物和/或ECL标记检测试剂。分析孔还可以包括覆盖在结合表面上的可重建的保护层。

图7b提供了沿着图7a的虚线的剖面图，并显示了一种形成分析孔710中的电极/电介质层的方法。多孔板包括限定出干燥剂孔720的板顶730以及具有限定出分析孔710的孔壁和壁架712的通孔。板顶730也具有槽725，但当板盖750密封板顶730的顶面时，所述槽725形成了分析孔710和干燥剂孔720之间的管路。在一个非限制性的实例中，板顶730是由具有低水蒸汽渗透率的塑料所成模的注射成型件。在另一个非限制性的实例中，板盖750是包括低水蒸汽渗透性的塑料或金属箔(例如铝箔)的可热封的膜。

图7b也显示了密封板顶730并限定出分析孔710的孔底的板底740。板底740包括支持为电极714和718提供的图案化的导电层的基层715。电极上图案化的电介质层716限定了暴露的电极点。可以提供各种材料的基层、导电层和电介质层(见例如美国出版物2004/0022677和2005/0052646)。在一个非限制性的实例中，基层是塑料膜(由例如聚酯例如MYLAR、聚氯乙烯、或低水蒸汽渗透性材料例如COC制成的)，导电层是网版印刷的可导电性油墨(例如网版印刷碳油墨)以及电介质层是网版印刷绝缘油墨。也如图7b所示，作为基层715底面上的导电层的电极接片780和785为电极714和718提供了连接性(例如通过基层上的导电通孔)。通过网版印刷的导电墨水也可以提供电极接片，其在印刷期间可以填充基层715上的孔，这可以提供导电通孔。有利地，导电通孔可以直接位于孔壁的下面，以限制水蒸汽渗透过孔。另外，任选的底部密封层790可以密封基层715的底部。底部密封层790是由低水蒸汽渗透性材料制成的，并覆盖了基层715的大部分底面，除了密封层790上的给定开口，所述开口位于容许板阅读装置接触电极接片780和785的位置上。

图7c显示了板700的一个实施方式的更详细的倾斜图，并显示了被加压到干燥剂孔720内的干燥剂丸722。

可以检测各种可以包含感兴趣的分析物或活性的样品。在一个实施方式中，将样品引入到分析板或具有预装的可重建的干燥的试剂的分析板的一个或多个孔内，因此重建这些检测试剂并测定出检测信号，以便测定(定量或定性)出样品中分析物的数量。试剂可以包括发光剂、电化学发光剂、化学分光计、和/或氧化还原活性物。因此，检测信号优选地是发光或电化学的信号。可以被实施的检测格式包括均质的或异质的方法。

可以被实施的检测包括采用固相支持物使得能够将测量分析物或活性与将标记试剂分成液相或固相支持部分结合在一起的格式。实例包括固相结合分析，其测定材料及其特异的结合配偶体(对中的一个被固定或者能够被固定在固相支持物上)的复合物的形成、三明治复合物的形成(包括被固定或者能够被固定在固相支持物上的捕获试剂)、两种竞争物与结合配偶体(结合配偶体或者其中一个竞争物被固定或者能够被固定在固相支持物上)的竞争作用、对来自固定在或者能够被固定在固相支持物上的试剂的标记(或标记材料)的酶裂解或化学裂解以及标记(或标记材料)与固定或者能够被固定在固相支持物上的试剂的酶或化学的连接。术语“能够被固定”在此指的是可以参与溶液中的反应以及随后在检测期间或之前被固相捕获的桥接剂。例如，利用被固定在固相上的试剂的特异的结合配偶体可以捕获试剂。或者，试剂可以连接于被固定在固相上的捕获基序以及捕获基序的特异性结合配偶体。有用的捕获基序结合配偶体对的实例包括生物素-抗生物素链菌素(抗生物素蛋白)、抗体-半抗原、受体-配体、核酸-互补核酸等。

在固相支持物上实施的检测中，利用i)表面选择技术；ii)溶液选择技术和/或iii)两相分离之后，通过测定固相支持物和/或溶液中的标记的量可以确定出分析物或活性的量。在电化学发光法中，固相支持物也可以是用于诱导与固相结合的标记的电化学发光的工作电极。电化学发光法可以包括在加入ECL共反应剂(例如叔胺如三丙胺或哌嗪-1，4-二(2-乙基磺酸))之前进行洗涤以便去除未结合的电化学发光标记的试剂，并施加电能以便诱导出未结合标记的ECL。或者，由于电化学发光测量的表面选择性，可以在没有洗涤的情况下实施所述方法。有利地，在未洗涤的分析中，可以向分析孔内预先加入可重建的干燥的试剂或保护层形式的ECL共反应剂。

另一个实施方式涉及用于实施分析的试剂盒，包括分析模块/多孔板。试剂盒可以包括一个或多个容器内的一个或多个额外的试剂，所述额外的试剂包括但不限于分析校准剂、分析对照物、分析稀释剂、ECL共反应剂、和洗涤缓冲剂。

在一个实施方式中，试剂盒包括一个或多个板孔内的一种或多种分析组分，优选的是干燥形式的分析组分。在一个优选的实施方式中，试剂盒包括分析板，所述分析板具有固定在分析模块内的一个或多个工作电极上的结合试剂以及一种或多种直接安放在孔内(优选的在空间上不同于工作电极的位置上)或者安放在一个或多个间隙孔内的干珠、片剂或丸形式的额外的检测试剂。试剂盒的孔优选地包含有任何液体。

实施例

下面的实施例是对本发明的范围之内的一些方法和装置的举例说明。它们当然不能作为对本发明的任何形式的限制。本领域一般熟练人员在无需过多试验的情况下可以对本发明进行多种改变和修饰。

材料和方法

标记的检测抗体

用NHS酯(MesoScaleDiscovery，Gaithersburg，MD)(一种基于钌-三-二吡啶的磺酸衍生物的电化学发光标记)(下面绘出的化合物1)标记物标记的检测抗体。用SEPHADEXG-50(Pharmacia)的分子排阻色谱法纯化出标记抗体。

冻干的检测抗体丸

由包含1μg/mL每种标记抗体、2％牛血清白蛋白和20％蔗糖的磷酸缓冲盐的溶液制成包括一种或多种标记的检测抗体的丸。通过将20μL溶液液滴放置在液氮中形成这个溶液的冷冻滴。将冷冻滴转移到放置在ADVANTAGEXL冻干器(Virtis)的架状物上被冷冻了的(≤-78℃)铝盘上。在引入铝盘之前，冻干器的架状物被预先冷却到≤-45℃，并用导电糊提高架状物和含有珠的铝盘之间的热传递。在经典的冻干方案中，将冻干器室腔抽成真空，架状物温度在约24小时内逐渐增加到-78℃、-20℃、-15℃、最后增加到+20℃(室温)。保持每个水平的温度足够长的时间，以便容许平衡，同时控制室压为0.01托耳。对冻干珠的KarlFisher滴定通常显示水含量小于4％重量。通过在干燥剂中延长存放可以将水含量降低到不足2％。

用于电化学发光测量的多孔板

利用特殊设计的具有整合的用于实施电化学发光测量的网版印刷碳油墨电极的多孔板(多阵列或多点板，MesoScaleDiscovery，MesoScaleDiagnostics的分部，LLC，Gaithersburg，MD)实施电化学发光测量。在每个孔底部的工作电极上图案化的电介质层暴露出了工作电极上的一个或多个区域或“点”。在一些试验中，在将抗体固定在电极表面之前先用含氧血浆处理所述电极表面。通过利用纳升分配器(Bio-Dot公司)将抗体溶液微分配到点上可以将不同的捕获抗体固定在不同的点上。选定分配到点上的体积，使得它们可以扩散到电介质层所限定出的界线，但仍限定在点上，因此容许将每种抗体固定(经被动吸附)在工作电极的给定区域内；如果电极表面是未经血浆处理过的，向成点溶液中加入少量TRITONX-100去污剂，以便增强扩散。容许进行吸附至少2个小时，之后用稳定的洗涤缓冲液(2％蔗糖、185mM磷酸氢二铵、13mM磷酸二氢铵、0.1％TWEEN20和KATHONCG/ICPII防腐剂)洗涤板，干燥，并存放在干燥剂中。通过控制在干燥之前残留在孔内的洗涤缓冲液的量(一般在5-20μL之间)，可以将具有不同厚度的蔗糖膜覆盖在工作电极的表面。

电化学发光测量装置

利用Sector(R)Imager6000读板器或Sector(R)PR400读板器(两者都来自MesoScaleDiscovery，MesoScaleDiagnostics的分部，LLC，Gaithersburg，MD)在MULTI-SPOT板内诱导并测定电化学发光。Sector(R)Imager6000装置给板内的工作电极施加电能，并显像出所形成的ECL。采用图形分析算法区分并定量出从孔内的每个点所发出的光。Sector(R)PR400装置在一定时间内给板的一列孔的工作电极施加电能。用光电二极管阵列测定了出从所述列的孔中发出的ECL。

实施例1：利用冻干珠上的标记的检测抗体进行的多路细胞因子检测

如上制备出具有抗7种不同的人细胞因子(TNF-α、IL1-β、IL2、IL5、IL6、IL8、IL12、和GM-CSF)的捕获抗体的7点阵列的高结合力多点板以及含有抗相同的7种细胞因子的标记的检测抗体的冻干珠。每个孔内都放置一个珠，并将板存放在有干燥剂的地方，直到使用为止。通过向板的孔内引入预定浓度的细胞因子溶液(每孔40μl在加有10％胎牛血清的RPMI细胞培养基中制备出的溶液)，并在摇板器上室温下温育板2个小时可以实施多路细胞因子检测。向孔内加入2x浓度的MSDREADBUFFERP(MesoScaleDiscovery)(一种含叔铵ECL共反应剂的溶液)(110μl/孔)，并在Sector(R)Imager6000装置中分析板。对于10和10000pg/ml之间的所有7种细胞因子而言，每个点上所形成的信号都显示出了较好的线性关系。信号的标准差通常小于平均信号的10％。背景信号和计算敏感性与当向孔内加入液体溶液形式的抗体时得到的那些结果相似。

实施例2：利用在覆盖捕获表面上的保护层上干燥的标记的检测抗体进行的细胞因子测量

这个分析使用具有每孔单个点的小点多阵列板。如材料和方法部分所述的那样，用含有抗人TNF-α捕获抗体的溶液处理点，以便将抗体固定在点表面上。然后用75μl加有7％FICOLL(高分支的亲水性的蔗糖聚合物)的4xMSD(R)READBUFFERP填充孔，并将板冷却到冷冻，并冻干过夜，以便提供孔底面上的保护性“蛋糕”层。将小滴(35nL)标记的抗人TNF-α检测抗体的浓缩溶液分配到蛋糕的表面上。然后将板真空干燥5分钟，然后存放在有干燥剂的地方，直到使用。通过向孔内加入150μl含有预定浓度的人TNF-α的加有10％胎牛血清的RPMI细胞培养基的溶液并摇晃2个小时来实施分析。然后在Sector(R)Imager6000装置上分析板。计算出的检测限为5-6pg/mL，这与在利用液态的检测抗体溶液的未洗涤的分析中观察到的结果相当。

实施例3：利用在多孔板的孔的侧面上干燥的标记的检测抗体进行的细胞因子测量

这个检测使用具有每孔单个点的小点多阵列板。如在材料和方法部分所述的那样，用抗人TNF-α捕获抗体涂覆点。将24μl/mL检测抗体的4.8％蔗糖溶液的液滴(1μL)分配到孔的内侧壁上，并容许干燥。将板存放在有干燥剂的地方，直到被用于检测。检测方案包括向每个孔内加入80μLTNF-α溶液，在室温下摇晃板30分钟，洗涤板，加入150μL1xMSD(R)READBUFFERT(MesoScaleDiscovery)，并在Sector(R)Imager6000装置上分析板。将板在室温或4℃下存放18天，得到的检测限小于1pg/mL，这与在采用液态的检测抗体溶液的洗涤分析中观察到的结果相当。

实施例4：利用具有经含蛋白的保护层涂覆的捕获层以及孔壁上的干燥的标记的检测抗体的多孔板进行的细胞因子测量

这个检测使用具有每孔单个点的小点多阵列板。用抗生物素链菌素(抗生物素链菌素MULTI-ARRAY板，MesoScaleDiscovery)预先涂覆每个孔内的工作电极。根据下面的方案将抗IL-1β单克隆抗体固定在工作电极上。用PBS洗涤孔3次，然后用20μl的3μg/mg生物素标记的抗IL-1β溶液处理孔。容许在摇板器的摇晃下进行固定2个小时。然后用PBS洗涤孔3次。向孔内加入20μl体积的BSA和蔗糖的缓冲液，然后将其在真空下干燥，以便在板的底面上形成干膜。

根据下面的方案在孔壁上形成SULFO-TAG标记的抗IL-1β多克隆抗体的干丸。利用BIO-DOT微分配器(Bio-Dot，Inc.)以及倾斜的尖头将100nL的482μg/mL标记抗体溶液的微滴分配到每个孔壁上。液滴被保留在孔壁上，其中其被容许在干燥剂室内干燥30分钟。然后用板热封密封住孔。在一些试验中，向检测抗体溶液中加入低浓度的荧光素。通过鉴定所有孔内是否有检测抗体沿孔壁流下或者飞溅到孔底部可以用荧光素荧光提供质控检查。荧光素不会影响分析性能。

通过向孔内加入125μl含有已知量的IL-1β的溶液并在摇晃板的同时温育板37分钟来实施IL-1β的检测。然后用PBS洗涤板3次。加入MSDREADBUFFERT，并在Sector(R)PR400装置上分析板。以与使用液态检测抗体溶液的检测相当的模式进行利用板和干燥检测抗体的检测。

实施例5：使用干燥的试剂的多孔板分析：干燥的标记抗体在孔的台状物上的存放

这个检测使用如图8所示的那样配置的多点板。这个板与图7所示的板相似，除了使用7点模式以及省略了干燥剂孔720、管路725、干燥剂丸722以及底密封层790。板顶是注射成型的聚丙烯。通过在单个点上分配抗肉毒毒素A(BotA)、二硝基苯基(DNP)、蓖麻毒素、葡萄球菌肠毒素B(SEB)、委内瑞拉马脑炎(VEE)、和鼠疫耶尔森菌(YP)的抗体可以固定捕获抗体。将未免疫的小鼠IgG固定在剩余的点上，用作阴性对照。通过分配75nL包括100-500μg/mL之间的抗体、750μg/mLBSA和0.03％TRITONX-100的溶液可以实施固定。其中一个例外是BotA捕获抗体，其是被生物素化的，以及在其预先结合1200μg/mL抗生物素蛋白之后将其固定，在没有BSA的条件下将其固定。

未免疫的IgG不应当参与三明治复合物并且对于所有的样品应当都只能给出低信号。如果这个信号高出了选定的范围，应当被认为是测量伪象造成了与检测抗体的非特异性结合的增加的指示，这就有假阳性结果的危险。更一般的，可以使用不与相应的检测试剂配对的任一结合试剂。任选地，可以选择共享有测试的捕获试剂的结构特征的结合试剂，例如在免疫分析中，其可以包括来自其他捕获抗体所来源的一种或多种物种的免疫球蛋白。抗DNP点被用作阳性对照。孔也包括干燥的SULFO-TAG标记的抗荧光素(FL)抗体以及给定量的经DNP和FL标记的干BSA(DNP-FL-BSA)。阳性对照信号因此应当给出给定量的DNP-FL-BSA的恒定的阳性信号指示。如果该信号降低到选定的范围之下，将被用作为样品干扰结合反应或信号生成的指示，因此这带来了假阴性结果的危险。更普遍的，阳性对照可以是对可以被插入到反应混合物中的任一分析物的检测。优选地，在相关样品中发现该分析物的可能性是低的。

捕获抗体溶液被容许在干燥环境中干燥30分钟，然后在真空下干燥30到60分钟。用在材料和方法部分所述的含蔗糖的稳定的洗涤缓冲液洗涤孔，用5％BSA封闭45分钟，并再用稳定洗涤缓冲液洗涤一次。加入稳定/封闭溶液(20μL的305mM磷酸铵、100mM氯化铵、0.02％TRITONX-100、2％蔗糖、2％BSA、和0.02％KATHON防腐剂，pH7.4)，并在真空下干燥孔内的溶液，以便在孔底形成干燥的试剂蛋糕。

将STAG标记的检测抗体(0.5μL浓度在40-240μg/mL的抗BotA、FL、蓖麻毒素、SEB、VEE和YP抗体的稳定/封闭溶液的混合物)的混合物分配(利用带倾斜分配尖头的BIO-DOT分配器)到正好处于干燥的试剂壁架的孔壁上，并容许所述溶液向下流到壁架上。将含有80ng/mL阳性对照分析物(DNP-FL-BSA)的溶液分配到对面的孔壁上。检测抗体和对照溶液被容许在真空下干燥30到60分钟。然后将板与干燥剂包装在一起，直到使用。

用这些板实施分析的方案是：加入80μL样品(给定量的0.1％TRITONX-100磷酸缓冲液(PBS)中的一种或多种靶向分析物)，摇晃下温育1个小时，用PBS洗涤，加入150μL的1xMSDREADBUFFERT(MesoScaleDiagnostics，LLC)，并用MSDSector(R)Imager6000装置分析板。用照射灭活该检测所用的VEE和YP。用福尔马林灭活该分析所用的BotA。

下面的表显示出了在每个点上观察到的不含分析物(-)的样品或者含有10ng/mLBotA、1ng/mL蓖麻毒素、50ng/mLSEB、1000ng/mLVEE、或10,000CFU/mLYP的样品的信号。表显示了靶向分析物的检测敏感性和特异性以及阳性和阴性对照点的合适的性能。

下面的表比较了用这些板观察到的信号和在除了使用液态检测试剂外相当的条件下实施的分析中观察到的信号。该表只提供了具体点上的给定分析物的信号，并提供了存在分析物(10ng/mLBotA、1ng/mL蓖麻毒素、50ng/mLSEB、1000ng/mLVEE、或10,000CFU/mLYP)时的信号以及没有分析物时的背景信号。该表显示了比较进行的干燥检测和湿检测。

实施例6：在具有分析孔和干燥剂孔的多孔板中进行的检测

本检测使用如图9所示配置的多点板。板与图8所示的板相似，除了包括连接相邻孔对的管路910。通过被插入到分离相邻孔的孔壁内的浅刻痕提供了所述管路。在这个实施例中，用每对孔中的一个孔实施多路免疫分析，用另一个孔存放用于在存放期间将分析孔保持在干燥状态的干燥剂。本检测使用如实施例5所述制备出的具有干捕获试剂和检测试剂的多路三明治免疫分析。捕获抗体是抗枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilisvar.Niger)(BG)、抗MS2噬菌体、抗FL、抗DNP、以及小鼠IgG作为阴性对照。干燥检测抗体丸包括标记的抗BG、抗MS2和抗卵白蛋白(Ova)(用于检测FL-Ova和DNP-Ova)。

在制备出板之后，向干燥剂孔内粗略地充入50mg到200mg硅胶或DRIERITE(硫酸钙)干燥剂，用铝箔热封密封板。在将箔封密封住板顶之后，孔上的刻痕提供了分析孔和干燥剂孔组之间的管路。为了比较，制备出了一些在干燥剂孔内没有干燥剂的板。将板在4℃干燥条件下放置数天，以便容许干燥的试剂完全干燥。然后在将其用于实施测量靶向有机物(利用实施例5的分析方案)之前，将板暴露在提高了稳定和湿度的环境下数天。

图10提供了含有给定量的靶向分析物的样品的信号，并比较了来自在暴露于60％湿度、30℃的环境下7天之后的具有二氧化硅干燥剂、硫酸钙干燥剂和无干燥剂的板的信号。提供了作为从同时制备出的但是被保持在4℃干燥条件下7天的板中得到的信号百分比的信号。结果表明干燥剂孔在提供干燥的试剂在热和潮湿环境下的稳定性方面是非常有效的。

通过引用将本说明书引用的专利、专利申请书和出版物的全部内容都并入本申请。

本发明的范围并不受在此所述的具体实施方式的限制。事实上，除了在此所述的这些内容以外，本领域人员明白通过前述的描述和附图可以对本发明进行各种修饰。这些修饰预计也在本权利要求书的范围之内。

对于使用“包括”一词的权利要求，这意味着加入其他元件仍落入该权利要求的范围之内；一些权利要求也使用了“主要由...组成”(即容许加入其他元件，而仍属于权利要求的范围之内，条件是所述其他元件不会实质性地影响本发明的实施)或“由...组成”(即只容许权利要求所列的元件，而不包括与本发明一般相关的不纯的或无关紧要活动的元件)替换术语“包括”来描述本发明。这三种中的任何一种均可以用来描述本发明的保护范围。

Claims

1.多孔分析板，其包括板体，所述板体具有限定于其中的多个孔，其中所述多个孔的至少一个孔包括：

(a)结合表面，其具有固定化于其上的捕获试剂，和

(b)可重建的干燥的试剂，其中所述干燥的试剂位于与所述结合表面不重叠的所述孔的表面。

2.权利要求1的多孔分析板，其中所述可重建的干燥的试剂包括标记的检测试剂。

3.权利要求2的多孔分析板，其中所述结合表面位于所述孔的底面，而所述可重建的干燥的试剂位于所述孔的孔壁。

4.权利要求3的多孔分析板，其中所述孔的所述孔壁包括试剂存放用架状物，其中所述可重建的干燥的试剂位于所述试剂存放用架状物。

5.权利要求2到4中任一项的多孔分析板，其中所述结合表面涂覆有可重建的保护层。

6.在权利要求2的多孔分析板中实施分析的方法，所述方法包括：

(a)向所述多个孔的一个或多个孔内加入样品；

(b)重建所述一个或多个孔内的可重建的干燥的试剂，形成反应混合物；

(c)在促进所述捕获试剂和检测试剂与它们相应的结合配偶体结合的条件下温育所述反应混合物；和

(d)测定包括所述固定化的捕获试剂和所述标记的检测试剂的复合物的形成。

7.权利要求6的方法，其中所述分析是三明治结合分析，且所述捕获试剂和所述检测试剂可以同时结合于感兴趣的分析物。

8.权利要求6的方法，其中所述分析是竞争性结合分析，且所述捕获试剂结合感兴趣的分析物，而所述检测试剂与所述分析物竞争性结合所述捕获试剂；或者，所述检测试剂结合感兴趣的分析物，而所述捕获试剂与所述分析物竞争性结合所述检测试剂。

9.制备用于分析的权利要求1所述的多孔分析板的方法，所述方法包括在所述板的至少两个孔内实施下面的步骤：

(a)将捕获试剂固定化于所述板的孔的表面上，以便形成结合表面；

(b)将包括标记的检测试剂的液体试剂分配到所述孔的表面上，所述表面与所述结合表面不重叠；和

(c)干燥所述液体试剂，以形成可重建的干燥的检测试剂。

10.权利要求9的方法，其中所述结合表面位于所述孔的底面上。

11.权利要求10的方法，其中所述液体试剂被分配到所述孔的壁上并干燥。

12.权利要求11的方法，其中所述壁包括液体存放用架状物，且所述液体试剂

(i)被分配到所述架状物上并干燥；或者

(ii)被分配到所述壁的位于所述架状物上方的位置上，使得所述架状物能够收集沿着所述壁流下的液体试剂，随后所述液体试剂在所述架状物上被干燥。

13.权利要求9的方法，还包括：

(d)将包括分析对照物的额外的液体试剂分配到所述孔的表面上，所述表面与所述结合表面不重叠，所述分析对照物对所述捕获试剂和/或所述标记的检测试剂具有结合亲和力；以及

(e)干燥所述额外的液体试剂，以形成可重建的干燥的分析对照物；

其中所述干燥的检测试剂和干燥的分析对照物没有物理的接触。

14.权利要求9到13中任一项的方法，还包括将保护试剂分配到所述结合表面上，并干燥所述保护试剂，以便在所述结合表面上形成可重建的保护层，其中在分配包括标记的检测试剂的所述液体试剂之前进行所述保护试剂的所述分配和干燥。

15.权利要求14的方法，其中所述液体试剂还包括一种或多种额外的标记的检测试剂，且所述标记的检测试剂和额外的标记的检测试剂对结合配偶体具有不同的特异性或亲和力。