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CN102770440A - 纯化肽的制备性rp-hplc方法 - Google Patents

纯化肽的制备性rp-hplc方法 Download PDF

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CN102770440A
CN102770440A CN2011800118239A CN201180011823A CN102770440A CN 102770440 A CN102770440 A CN 102770440A CN 2011800118239 A CN2011800118239 A CN 2011800118239A CN 201180011823 A CN201180011823 A CN 201180011823A CN 102770440 A CN102770440 A CN 102770440A
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CN2011800118239A
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X.吴
A.博格斯内斯
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Novo Nordisk AS
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Novo Nordisk AS
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Abstract

描述了在RP-HPLC系统上将目标多肽与至少一种不想要的成分分离的方法，其中至少一个洗脱步骤在或接近目标肽的pI值下进行。

Description

纯化肽的制备性RP-HPLC方法
发明领域
本发明涉及在RP-HPLC系统上将目标多肽与至少一种不想要的成分分离的方法，其中至少一个洗脱步骤在或接近目标肽的pI值下进行。
背景技术
对于蛋白质和肽(多肽)的纯化(即与杂质分离)和分析，色谱是一种熟知且广泛使用的方法。可以应用多个不同的色谱原理，反相高效液相色谱(RP-HPLC)就是其中之一。RP-HPLC的分离原理基于多肽溶液和色谱树脂表面上的疏水性配体之间的疏水缔合。RP-HPLC纯化通常由一个或多个下面的部分组成：平衡、加载、洗涤、洗脱和再生。
传统的RP-HPLC是在液相的pH低于或高于待纯化目标分子的pI下进行的，一些杂质很难被分离。由于存在无法控制产品(即目标肽)沉降的风险，在pI下进行洗脱一般不是优选的操作模式。ScienceDirect, Talanta 75 (2008), 第76-82页披露了用于分离肽的pH梯度。在此通过重复从2.5到10.5的相同的pH梯度，应用了重复pH梯度。
已经描述了多种制备性反相色谱法。US2009036652涉及使用制备性反相色谱法纯化蛋白质，WO2007071767涉及使用制备性反相色谱法纯化维生素K依赖性多肽，US20060211616涉及纯化胰高血糖素样肽。
然而，需要优化的RP-HPLC纯化方法，其中获得好的纯化效果而无需使用包括重复pH梯度的粗放方法
发明概述
本发明涉及在RP-HPLC系统上将液体混合物中的目标的多肽与至少一种不想要的成分分离的方法，所述方法包括：
a. 在RP-HPLC系统中引入含有目标多肽的混合物，该混合物溶解于流动相，其中该流动相的pH值与目标多肽的pI值相差至少1个单位；
b. 将流动相的pH调节至与目标多肽的pI值相差小于1个单位的pH值，其中调节pH通过分段过程或采用pH梯度进行；
c. 洗脱目标多肽从而获得其纯化的组合物(composition)。
本发明的一个方面，在步骤b和步骤c之间又增加了一个步骤，其中，pH被再次调节至与待纯化肽或蛋白质的pI值相差至少1个单位的pH值，其中所述的调节通过分段过程或采用pH梯度进行。
本发明的一个方面，所述方法包括与步骤b同时应用有机修饰剂梯度，以在RP-HPLC系统上保留目标肽的同时去除不想要的杂质。
附图说明
图1. 制备性分离的AU280对时间的色谱图，洗脱在pH 4.5下进行；
图2. 分离的AU280对时间的色谱图，洗脱在pH 5.2下进行；
图3. 分离的AU280对时间的色谱图，洗脱在pH 5.5下进行；
图4. 在不同的pH4.5、5.2和5.5下进行实验的重叠的色谱图；
图5. 分离的AU280对时间的色谱图。洗脱如下进行：首先在pH (从中性至pI或接近pI)和EtOH梯度(刚好在目标肽峰出现之前)的组合下进行，然后用从4.5到中性的pH梯度洗脱。
图6. 分离的AU280对时间的DesB30人胰岛素色谱图。洗脱如下进行：首先在pH(从4.0提高至pI或接近pI)和EtOH梯度(刚好在目标肽峰出现之前)的组合下进行，接下来在pI或接近pI的pH下、然后在从5.8到8.0的pH梯度下分段洗脱。
图7. 分离的AU280对时间的Arg34,Lys26(Nε-(γ-Glu(Nα-十六酰)))-GLP-1(7-37)肽的色谱图。洗脱如下进行：首先在pH(从pH8.0降低至pI或接近pI)和EtOH梯度(刚好在目标肽峰出现之前)的组合下进行，接下来在pI或接近pI的pH下、然后在从5.1到4.0的pH梯度下分段洗脱。
发明描述
本发明涉及用于纯化多肽的制备性反相高效液相色谱法(RP-HPLC)，其中至少一个洗脱步骤在或接近目标肽的pI值下进行。
更特别地，本发明涉及用于纯化含有目标多肽的混合物的制备性RP-HPLC，所述方法包括以下步骤：
a. 在RP-HPLC系统中引入含有目标多肽的混合物，该混合物溶解于流动相，其中该流动相的pH值与目标多肽的pI值相差至少1个单位；
b. 将RP-HPLC系统的pH调节至与目标多肽的pI值相差小于1个单位的pH值，其中调节pH通过分段过程或采用pH梯度进行；
c. 洗脱目标多肽从而获得其纯化的组合物。
本发明的一个方面，在步骤b中使用pH梯度来调节pH。
发明人发现：当采用本发明的方法时，获得了从目标肽中分离杂质的出乎意料地好的分离效果。特别是已经可能分离那些由传统的RP-HPLC方法难以去除的杂质，例如相关杂质。
另外，通过应用本发明的纯化方法，避免了需要达到从至少一种不想要的成分中进行目标多肽的所需分离的复杂纯化方法。
本文使用的术语“色谱”是指用于混合物和组分的化学分离的任何方法，其依赖于混合物的组分对固定相的选择性吸引。实例包括吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱和亲和色谱。
本文使用的术语“RP-HPLC”是指反相高效液相色谱或反相高压液相色谱。HPLC用于基于化合物的极性以及与色谱柱固定相的相互作用来分离化合物。反相色谱是应用在液相色谱中的洗脱过程，在该过程中流动相比固定相显著地具有更高的极性。
本文使用的术语“引入液体混合物”是指在流动相液体中引入含有目标多肽和至少一种不想要的成分的混合物。
本文使用的术语“pI”是指等电点，是特定的分子(例如多肽)不带净电荷时的pH。
在其pI下的蛋白质不具有净电荷，因而水溶性此时最低。因此，增高蛋白质浓度时存在着沉淀的风险。在比pI高或低一个pH单位的情况下，静电荷显著增加(取决于涉及的氨基酸，净电荷增加至最大净电荷的90%)，溶解性可设想达到约10倍，因此蛋白质不大倾向于沉淀。一般认为在与肽或蛋白质的pI值相差约1.5-2个单位的pH值下可最好地避免沉淀，其中特定的蛋白质结构域以及其它的特点可能影响这些值。
本文使用的与目标的多肽的pI值相关的术语“单位”是指用作测定pH的标准的确定的量值。举例来说，若目标的多肽的pI值为4.5，与该多肽的pI值相差一个单位则为3.5或5.5，与该多肽的pI值相差1.5个单位则为3.0或6.0。
本文使用的与色谱(例如RP-HPLC)相关的术语“制备性”是指经色谱纯化足量的物质(例如多肽)以便以纯化的形式进一步应用。因此制备性色谱法与分析性色谱法相对，分析性色谱法仅用于分析目的。
在本发明的一个方面，所述方法中应用pH和有机修饰剂梯度的组合作为第一步，于所述肽的pI值或接近该pI值开始的pH梯度用作第二步。按照这样的方面，应用了如下的方法：其中第一步包括与有机修饰剂梯度相结合的pH梯度，其中所述pH梯度开始于与目标多肽的pI值相差至少1个单位的pH值、并且变至与所述目标多肽的pI值相等或接近的pH，直到一种或多种杂质(其比目标多肽洗脱得要快)由RP-HPLC系统洗脱下来，而目标多肽则保留在该系统上；第二步进一步应用pH梯度，其中所述pH梯度从与所述目标多肽的pI值相等或接近的pH变为与所述目标多肽的pI值相差至少1个单位的pH。发明人发现了通过pH和有机修饰剂调节的这种组合达到了特别理想的纯化。
本发明的一个方面，在pH等于或接近目标多肽的pI值的步骤后，在附加的步骤中将流动相的pH调节到高于目标多肽的pI值至少1个单位。发明人发现该附加步骤甚至进一步将不想要的产品沉降最小化。
本文使用的术语“流动相”是指引入色谱柱中的溶剂。
本发明的一个方面，在至少一个洗脱步骤中使用涉及pH和/或有机修饰剂浓度的等度洗脱。
本文使用的涉及pH和/或有机修饰剂浓度中使用的术语“等度洗脱”是指在一定条件下的洗脱，在该条件下洗脱组合物中的pH和有机修饰剂的浓度在整个过程中分别保持恒定。
本发明的一个方面，HPLC方法在20℃或更高的温度下进行。在另一个方面，HPLC方法在升高的温度下进行，即在高于室温的温度例如在30℃和70℃之间进行。在另一方面，所述温度在40℃和60℃之间。在再一个方面，所述温度约50℃。在一个方面，所述温度约为室温。
本发明使用的固定相可以是任何合适的材质，例如取代的硅胶或多聚基质材料。在本发明的一个方面，所述固定相选自具有多至20个碳原子(C20)的直链或支链烷基链的硅胶、或者苯基或苯取代的硅胶。在另一个方面，所述固定相是反相(RP)胶(RP gel)，即任何可用有机溶剂洗脱的固定相。RP胶是本领域技术人员所知的，包括例如聚苯乙烯硅胶或聚二乙烯基苯硅胶。在另一个方面，所述反相胶是ODDMS (十八烷基-二甲基甲硅烷基，C18-)取代的硅胶。
本文使用的术语“固定相”是指应用于色谱中的固定相，流动相成分对其表现出选择性亲和性。因为这样的亲和性除了吸附以外可采用多种形式(包括尺寸排阻或络合)，所以该术语是指吸附液体混合物中组分的固定相、以及在技术上不吸附流动相组分但是通过在色谱系统中减慢一种组分相对于另一种组分的移动速率而仍然作为吸附剂的固定相。吸附剂(即色谱固定相材料)的非限制性实例为例如取代的二氧化硅，例如C-4二氧化硅、C-6二氧化硅、C-12二氧化硅、C-18二氧化硅和基于苯基的二氧化硅，以及多聚材料例如聚苯乙烯。色谱固定相的其它实例是膜、整体材料和过滤器。
当使用反相胶作为固定相时，它可以被配体取代。在一个方面，该反相胶被选自下面的配体所取代：C4-、C6-、C8-、C12-、C16-、C18、C20-配体。在一个方面，该反相胶被C18 (十八烷基-二甲基甲硅烷基)配体所取代。
当固定相为反相胶时，颗粒的直径可为2-200μm。在本发明的一个方面，该反相胶的颗粒直径约为15μm。该反相胶的孔径为100?到1000?。在一个方面，该反相胶的孔径为50?到150?，例如孔径约为100?。
当涉及组分或部分时术语“纯化的”表明其相对浓度(组分或部分的重量除以液体混合物中所有组分或部分的重量)至少提高20%。在一个系列的方面中，相对浓度至少提高40%、50%、60%、75%、100%、150%或200%、300%、400%或500%。与其纯化分离的组分的相对浓度(与其纯化分离的组分或部分的重量除以液体混合物中所有组分或部分的重量)下降至少20%、40%、50%、60%、75%、85%、95%、98%或100%时，也可说组分或部分被纯化了。在另一个系列的方面中，该组分或部分被纯化到相对浓度至少为50%、65%、75%、85%、90%、97%、98%或99%。在一些方面中，当称组分或部分与其它组分或部分“分离”时，可理解为该组分或部分被“纯化”。
本文使用的术语“目标多肽”是指任何需要具有纯化形式的肽、多肽或蛋白质。该术语包括合成的、半重组的或重组的肽、多肽以及蛋白质。在一些方面，“目标多肽”是适合于治疗糖尿病的肽、多肽或蛋白质，例如胰岛素肽(例如人胰岛素、胰岛素类似物或胰岛素衍生物)、胰高血糖素样肽、GLP-1肽(例如人GLP-1、GLP-1类似物或GLP-1衍生物))或支链淀粉肽。
本发明的一个方面，该目标多肽是胰高血糖素样肽，例如GLP-1、GLP-1类似物、GLP-1衍生物、毒蜥外泌素-4)或毒蜥外泌素-3。本发明的一个方面，该目标多肽是GLP-1类似物或衍生物。本发明的一个方面，该目标多肽是GLP-1衍生物。本发明的一个方面，该目标多肽通过重组技术制得。
本文使用的术语“杂质”是指出现在含有目标蛋白质的液体混合物中的成分，其不是目标蛋白质并且需要与目标蛋白质分离。该“杂质”可包括宿主细胞蛋白、多肽或肽，重组多肽的其它不想要的形式(例如糖基化形式、脱酰胺形式或氧化形式)，以及液体混合物中出现的其它组分。
在一些方面，该杂质为重组蛋白。在一些方面，该“杂质”是类似于目标多肽的肽、多肽或蛋白质(本文也称为“相对杂质”)，其结构与目标多肽类似，例如所述目标多肽的糖基化形式、脱酰胺形式、截短形式、延伸形式、脱酰胺形式、不正确的折叠形式或氧化形式、具有不想要的糖基化的形式、由外消旋产生的形式、在肽内链(intra-peptide chain)中缺乏氨基酸的形式、在肽内链中具有额外氨基酸的形式、以及在不希望的另一个残基上发生酰化的形式。在一些方面，该相对杂质是类似于目标多肽的具有疏水性的肽、多肽或蛋白质。在一些方面，该相对杂质是与目标多肽类似的具有结构相似性和疏水性的肽、多肽或蛋白质。
按照本发明的方法，待纯化液体混合物中“目标多肽”和“不想要的成分”之间的关系可以为例如至少1:1例如2:1，即当液体混合物中存在1当量“不想要的成分”时，存在至少2当量“目标多肽”。在本发明的一个方面，液体混合物中“目标多肽”和“不想要的成分”之间的关系是至少4:1，在另一个方面该关系是至少6:1，在另一个方面该关系是至少8:1，在另一个方面该关系是至少9:1，在另一个方面该关系是至少14:1，在另一个方面该关系是至少19:1，在另一个方面该关系是至少20:1，在另一个方面该关系是至少50:1，在又一个方面该关系是至少90:1。
本文使用的术语“约(about)”或“接近、大约(approximately)”是指所给出数值的合理的接近，例如加或减10%，或对于pH值为加或减0.2。
本文使用的术语“胰高血糖素样肽”是指胰高血糖素家族的肽、毒蜥外泌素(exendin)及其类似物和衍生物。胰高血糖素家族的肽由前胰高血糖素原基因编码，包括3种具有高度同源性的短肽，即胰高血糖素(1-29)、GLP-1 (1-37)和GLP-2 (1-33)。毒蜥外泌素是表达于蜥蜴的肽且与GLP-1相似，为促胰岛素的。毒蜥外泌素的实例有毒蜥外泌素-3和毒蜥外泌素-4。
本文使用的术语“类似物”是指修饰的胰高血糖素样肽，其中该胰高血糖素样肽的一个或多个氨基酸残基被另外的氨基酸残基所取代，和/或一个或多个氨基酸残基从胰高血糖素样肽上缺失，和/或一个或多个氨基酸残基添加在胰高血糖素样肽上。这样的氨基酸残基的添加或缺失可发生在例如胰高血糖素样肽的N-末端和/或该肽的C-末端。采用简单的系统来描述类似物：例如Arg34-GLP-1(7-37)表示GLP-1(7-37)的类似物，其中在34位上天然存在的赖氨酸被精氨酸取代。如果没有另外指出光学异构体，则术语“氨基酸”任何时候使用都应理解为表示L异构体。
术语“氨基酸”包括蛋白质来源的氨基酸(由遗传密码编码，包括天然氨基酸和标准氨基酸)，和非蛋白质来源的(未在蛋白质中发现的，和/或没有在标准遗传密码中编码的)氨基酸，以及合成氨基酸。因此，所述氨基酸可选自蛋白质来源的氨基酸、非蛋白质来源的氨基酸和合成氨基酸。
不由遗传密码编码的氨基酸的非限制性实例为γ-羧基谷氨酸盐、鸟氨酸和磷酸丝氨酸。合成氨基酸的非限制性实例为氨基酸的D异构体，例如D-丙氨酸和D-亮氨酸、Aib (α-氨基异丁酸)、β-丙氨酸和脱氨基组氨酸(desH，或者称为咪唑并丙酸，也缩写为Imp)。
同样地，按照IUPAC-IUB命名法使用氨基酸的标准单字母缩写。
在一个方面，本发明的类似物相对于胰高血糖素样蛋白包括多至17个修饰(取代、缺失、添加)。在一个方面，类似物相对于胰高血糖素样蛋白包括少于16个修饰(取代、缺失、添加)。在一个方面，类似物相对于胰高血糖素样蛋白包括少于15个修饰(取代、缺失、添加)。在另一个方面，类似物相对于胰高血糖素样蛋白包括少于14个修饰(取代、缺失、添加)。在另一个方面，类似物相对于胰高血糖素样蛋白包括少于13个修饰(取代、缺失、添加)。在另一个方面，类似物相对于胰高血糖素样蛋白包括少于12个修饰(取代、缺失、添加)。在另一个方面，类似物相对于胰高血糖素样蛋白包括少于11个修饰(取代、缺失、添加)。在另一个方面，类似物相对于胰高血糖素样蛋白包括少于10个修饰(取代、缺失、添加)。在另一个方面，类似物相对于胰高血糖素样蛋白包括少于9个修饰(取代、缺失、添加)。在另一个方面，类似物相对于胰高血糖素样蛋白包括少于8个修饰(取代、缺失、添加)。在一个方面，类似物相对于胰高血糖素样蛋白包括少于7个修饰(取代、缺失、添加)。在一个方面，类似物相对于胰高血糖素样蛋白包括少于6个修饰(取代、缺失、添加)。在另一个方面，类似物相对于胰高血糖素样蛋白包括少于5个修饰(取代、缺失、添加)。在另一个方面，类似物相对于胰高血糖素样蛋白包括少于4个修饰(取代、缺失、添加)。在另一个方面，类似物相对于胰高血糖素样蛋白包括少于3个修饰(取代、缺失、添加)。在另一个方面，类似物相对于胰高血糖素样蛋白包括少于2个修饰(取代、缺失、添加)。
本文使用的术语“亲脂性修饰的肽”是指含有共价连接于所述肽的一个或多个氨基酸的一个或多个亲脂性基团(例如亲脂性侧链)的肽。本发明的一个方面，亲脂性基团为亲脂性侧链。亲脂性修饰的肽可通过任何合适的方法来制备，例如通过缀合化学(例如烷基化、酰化、酯形成、酰胺形成或马来酰亚胺偶联)来连接亲脂性基团。本发明的一个方面，本发明的亲脂性修饰的肽相对于未经亲脂性修饰的相同的肽具有基本相同的活性。
在一个方面，本发明的药学组合物中所含有的亲脂性修饰的肽为GLP-1激动剂，该激动剂包含通过肽键连接的至少5个成分氨基酸和所连接的酰基。
本文使用的术语“GLP-1激动剂”是指任何亲脂性修饰的胰高血糖素样肽，其完全或部分激活人GLP-1受体。在优选的方面，该“GLP-1激动剂”是任何结合GLP-1受体的亲脂性修饰的胰高血糖素样肽，优选具有由本领域已知的方法(参见例如WO 98/08871)所测得的低于1μM(例如低于100nM)的亲和常数(KD)或效价(EC50)，并且表现出促胰岛素活性，其中促胰岛素活性可由本领域一般技术人员所知的体内或体外测定所检测。举例来说，该GLP-1激动剂可给予动物并且随时间的流逝检测胰岛素的浓度。
在一个方面，本发明的亲脂性修饰的胰高血糖素样肽被酰化(即其具有连接的酰基)作为亲脂性修饰。
酰基(IUPAC名称为alkanoyl(烷酰基))是从酮酸去除一个或多个羟基所得到的官能团。在有机化学中，酰基通常由RCOOH形式的羧酸衍生。因此其具有RC(=O)-的结构式，在碳原子和氧原子之间具有双键(即羰基)，在R和碳之间具有单键。酰基也可由其它类型的酸例如磺酸、膦酸和其它酸衍生。
在本发明的酰化修饰的胰高血糖素样肽中，酰基含有官能团，该官能团可连接于母体胰高血糖素样肽的氨基酸的一个下述的官能团：
(a) 连接到N-末端氨基酸α-碳的氨基，
(b) 连接到C-末端氨基酸α-碳的羧基，
(c) 任何赖氨酸残基的ε-氨基，
(d) 任何天冬氨酸和谷氨酸残基的R基的羧基，
(e) 任何酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基的R基的羟基，
(f) 任何色氨酸、天门冬酰胺、谷酰胺、精氨酸和组氨酸残基的R基的氨基，或
(g) 任何半胱氨酸残基的R基的巯基。
在一个方面，酰基连接到R基的羧基，即任何天冬氨酸和谷氨酸残基的侧链。在另一个方面，酰基连接到与C-末端氨基酸的α-碳连接的羧基上。在又一个方面，酰基连接到任何赖氨酸残基的ε-氨基上。
本发明的一个方面，酰基借助间隔区连接到母体胰高血糖素样肽。间隔区必须含有至少两个官能团，一个连接到酰基的官能团上，另一个连接到母体胰高血糖素样肽的官能团上。
在一个方面，酰基是直链或支链脂肪酸。在一个方面，酰基具有CH3(CH2)nCO-的结构式，其中n为4-38的整数，例如12-38的整数。在一个方面，酰基选自CH3(CH2)12CO-、CH3(CH2)14CO-、CH3(CH2)16CO-、CH3(CH2)18CO-、CH3(CH2)20CO-和CH3(CH2)22CO-。在另一个方面，酰基为十四烷酰基。在又一个方面，酰基为十六烷酰基。
在本发明的另外方面，酰基具有带负电荷的基团，例如羧酸基团。举例来说，酰基可以是式HOOC(CH2)mCO-的直链或支链的烷烃α,ω-二羧酸，其中m是4-38的整数，例如12-38的整数。在一个方面，酰基选自HOOC(CH2)14CO-、HOOC(CH2)16CO-、HOOC(CH2)18CO-、HOOC(CH2)20CO-或HOOC(CH2)22CO-。
在一个方面，间隔区是二肽(例如Gly-Lys)或是除了Cys或Met的氨基酸残基。就本发明而言，短语“例如Gly-Lys的二肽”是指除了Cys或Met之外的任何两个氨基酸的组合，在一个方面，二肽的C-末端氨基酸残基是Lys、His或Trp(例如Lys)，N-末端氨基酸残基是Ala、Arg、Asp、Asn、Gly、Glu、Gln、Ile、Leu、Val、Phe、Pro、Ser、Tyr、Thr、Lys、His和Trp。在一个方面，母体肽的氨基与氨基酸残基或二肽间隔区的羧基形成了酰胺键，氨基酸残基或二肽间隔区的氨基与酰基的羧基形成酰胺键。
本发明间隔区的实例包括赖氨酰、谷氨酰、天冬酰胺酰、甘氨酰、β-丙氨酰和γ-氨基丁酰，它们中的每个都构成独立的方面。在一个方面，间隔区是谷氨酰和β-丙氨酰。当间隔区是Lys、Glu或Asp时，其羧基可与氨基酸残基的氨基形成酰胺键，其氨基可与酰基的羧基形成酰胺键。当Lys用作间隔区时，在一些例子中可在Lys的ε-氨基和酰基之间插入另外的间隔区。在一个方面，这样的另外的间隔区是琥珀酸，其与Lys的ε-氨基和酰基中存在的氨基形成酰胺键。在另一方面，这样的另外的间隔区是Glu或Asp，其与Lys的ε-氨基形成酰胺键，与酰基中的羧基形成另一个酰胺键，换句话说，该酰基是Nε–酰化的赖氨酸残基。
在另一个方面，该间隔区是具有1-7个亚甲基的无支链的烷烃α,ω-二羧酸基团，该间隔区在母体肽的氨基和取代基的氨基之间形成桥。在一个方面，该间隔区是琥珀酸。
在又一个方面，具有连接的间隔区的酰基是式CH3(CH2)pNH-CO(CH2)qCO-的基团，其中p是8-33的整数，或者12-28的整数，且q是1-6的整数，或者是2。
在又一个方面，具有连接的间隔区的酰基是式CH3(CH2)rCO-NHCH(COOH)(CH2)2CO-的基团，其中r是4-24的整数，例如10-24的整数。
在又一个方面，具有连接的间隔区的酰基是式CH3(CH2)sCO-NHCH((CH2)2COOH)CO-的基团，其中s是4-24的整数，例如10-24的整数。
在又一个方面，该酰基是式COOH(CH2)tCO-的基团，其中t是6-24的整数。
在又一个方面，具有连接的间隔区的酰基是式-NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)uCH3的基团，其中u是8-18的整数
在又一个方面，具有连接的间隔区的酰基是式CH3(CH2)vCO-NH-(CH2)z-CO的基团，其中v是4-24的整数且z是1-6的整数。
在又一个方面，具有连接的间隔区的酰基是式-NHCH(COOH)(CH2)4NH-COCH((CH2)2COOH)NH-CO(CH2)wCH3的基团，其中w是10-16的整数。
在又一个方面，具有连接的间隔区的酰基是式-NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)2CH(COOH)NHCO(CH2)xCH3的基团，其中x是0或1-22的整数，例如10-16的整数。
本发明还提供亲脂性修饰的胰高血糖素样肽，其中所述胰高血糖素样肽是GLP-1(7-37)类似物，其选自Arg34GLP-1(7-37)、Aib8,22,35 GLP-1(7-37)、Aib8,35 GLP-1(7-37)、Aib8,22 GLP-1(7-37)、Aib8,22,35 Lys37GLP-1(7-37)、Aib8,35Lys37GLP-1(7-37)、Aib8Arg34GLP-1(7-37)和Aib8,22Lys37GLP-1(7-38)、[脱氨基His7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)酰胺、[脱氨基His7,Arg34]GLP-1-(7-37)、[Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺、[脱氨基His7, Glu22 Arg26, Arg 34, Phe(m-CF3)28]GLP-1-(7-37)酰胺、[脱氨基His7,Glu22,Arg26,Arg34]GLP-1-(7-37)-Lys、[脱氨基His7,Glu22,Arg26,Arg34]GLP-1-(7-37)-Lys、[脱氨基His7,Arg26,Arg34,]GLP-1-(7-37)-Lys、[脱氨基His7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺、[脱氨基His7,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺、[脱氨基His7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)、[脱氨基His7,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)、[脱氨基His7,Glu22,Arg26,Glu30,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)、[Aib8, Glu22, Arg26, Arg34,]GLP-1-7-37)-Lys和Gly8-GLP-1(7-36)，其中所述GLP-1类似物是被酰化的。
在另外的方面，本文使用的亲脂性修饰的胰高血糖素样肽是指酰化的GLP-1(7-37)及其促胰岛素类似物。GLP-1类似物以及酰化GLP-1类似物的非限制性实例是GLP-1(7-36)酰胺、Arg34-GLP-1(7-37)、Gly8-GLP-1(7-37)、Val8-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Asp22-GLP-1(7-37)、脱氨基-His7, Arg26, Lys34(Nε-(γ-Glu(Nα-十六烷酰基)))-GLP-1(7-37)、脱氨基-His7, Arg26, Lys34(Nε-辛酰基)-GLP-1(7-37)、Arg26,34, Lys38(Nε-(ω-羧基十五烷酰基))-GLP-1(7-38)、Arg26,34, Lys36(Nε-(γ-Glu(Nα-十六烷酰基)))-GLP-1(7-36)和Arg34, Lys26(Nε-(γ-Glu(Nα-十六烷酰基)))-GLP-1(7-37)。
在一个方面，本发明的亲脂性修饰的胰高血糖素样肽是二肽基氨基肽酶IV防护的。本文使用的术语“二肽基氨基肽酶IV防护的”是指化合物(例如酰化的GLP-1类似物)对二肽基氨基肽酶IV(DPP-IV)较天然化合物(例如GLP-1(7-37))具有更高的抵抗性。亲脂性修饰的胰高血糖素样肽对二肽酰基基肽酶IV降解的抵抗性由下述的降解测试方法所检测。
在37℃、100μl的0.1M的三乙胺-HCl缓冲液, pH 7.4中，将亲脂性修饰的胰高血糖素样肽等分样(5nmol)与1μl纯化的二肽基氨基肽酶IV(相应的酶活性为5mU)孵育10-180分钟。通过加入5μl的10%的三氟乙酸终止酶反应，分离肽降解产物并使用HPLC对其进行定量。进行该分析的一个方法中，将该混合物加载在Vydac C18宽孔(30nm的孔，5μm的颗粒) 250x4.6mm柱(C18-取代的(十八烷基-二甲基甲硅烷基)二氧化硅树脂)上，按照Siegel等[Regul. Pept. (1999) 79:93-102]和Mentlein等[Eur. J. Biochem. (1993) 214:829-35]的描述，采用在0.1%三氟乙酸中的乙腈的线性分段梯度(0%乙腈3min、0-24%乙腈17min、24-48%乙腈1min)进行洗脱，流速为1ml/min。通过220nm (肽键)或280nm (芳香氨基酸)的吸光度来监测肽以及其降解产物，并通过相对于标准的峰区的峰区积分来进行定量。评估了在孵育期的被二肽基氨基肽酶IV水解的亲脂性修饰的胰高血糖素样肽的水解率，结果显示低于10%的亲脂性修饰的胰高血糖素样肽被水解。
在另外的方面，本发明的药物组合物所含有的亲脂性修饰的胰高血糖素样肽是亲脂性修饰的GLP-2或其类似物。当本发明的药物组合物所含有的亲脂性修饰的胰高血糖素样肽是亲脂性修饰的GLP-2或其类似物时，亲脂性修饰的GLP-2或其类似物的浓度为约1mg/ml-约100mg/ml，优选浓度为1mg/ml-约10mg/ml。
在另外的方面，亲脂性修饰的胰高血糖素样肽是亲脂性修饰的毒蜥外泌素-4或亲脂性修饰的毒蜥外泌素-3或其类似物。本发明所包括的毒蜥外泌素及其类似物的实例是WO 97/46584、US 5424286和WO 01/04156中披露的毒蜥外泌素及其类似物。US 5424286描述了用毒蜥外泌素肽刺激胰岛素释放的方法。WO 97/46584描述了截短形式的毒蜥外泌素肽。这些披露的肽提高胰岛素的分泌和生物合成，但降低胰高血糖素的分泌和生物合成。WO 01/04156描述了毒蜥外泌素-4类似物和衍生物以及这些分子的制备。
这里使用的术语“毒蜥外泌素-4肽”是指毒蜥外泌素-4(1-39)、毒蜥外泌素-4(1-39)类似物、毒蜥外泌素-4(1-39)衍生物或毒蜥外泌素-4(1-39)类似物的衍生物、其促胰岛素片段、其促胰岛素类似物以及其促胰岛素衍生物。毒蜥外泌素-4的促胰岛素片段是完整序列可在毒蜥外泌素-4中发现的促胰岛素肽，并且其缺失至少一个末端氨基酸。毒蜥外泌素-4(1-39)的促胰岛素片段的实例为毒蜥外泌素-4(1-38)和毒蜥外泌素-4(1-31)。
可通过本领域已知的体内或体外测定方法来检测化合物的促胰岛素活性。举例来说，可将该化合物给予动物并监测随时间流逝的胰岛素的浓度。毒蜥外泌素-4(1-39)的促胰岛素类似物是指其中一个或多个氨基酸残基被另外的氨基酸残基所取代和/或一个或多个氨基酸残基缺失和/或一个或多个氨基酸残基添加的相应分子，条件是该类似物是促胰岛素的或者是促胰岛素化合物的药物前体。毒蜥外泌素-4(1-39)的促胰岛素类似物的实例为Ser2Asp3-毒蜥外泌素-4(1-39)，其中2位和3位的氨基酸残基分别被丝氨酸和天冬氨酸取代(这种特定的类似物在本领域中也被称为毒蜥外泌素-3)。毒蜥外泌素-4(1-39)及其类似物的促胰岛素衍生物是本领域技术人员所认为的这些肽的衍生物，即具有至少一个在母体肽分子中不存在的取代基的衍生物，条件是所述的类似物是促胰岛素的或者是促胰岛素化合物的药物前体。取代基的实例是酰胺、糖类、烷基、酯和亲脂性取代基。因此毒蜥外泌素-4(1-39)及其类似物的促胰岛素衍生物的实例为Tyr31-毒蜥外泌素-4(1-31)-酰胺。
这里使用的术语“稳定的毒蜥外泌素-4化合物”是指化学修饰的毒蜥外泌素-4(1-39)，即酰化的毒蜥外泌素-3或酰化的毒蜥外泌素-4类似物，经常规方法检测，其表现出在人体中至少10小时的体内血浆排除半寿期。
在一个方面，本发明的亲脂性修饰的胰高血糖素样肽是促胰岛素的。本文使用涉及亲脂性修饰的胰高血糖素样肽的术语“促胰岛素的”是指应答于升高的血糖水平的刺激胰岛素分泌的能力。促胰岛素的肽和化合物是GLP-1受体激动剂。化合物的促胰岛素活性可通过本领域已知的体内或体外的测定方法来检测。可采用下面的体外测定方法来检测化合物(例如肽)的促胰岛素性质。在下面的测定中，优选促胰岛素的化合物表现出小于5nM的EC50值，更优选EC50值小于500pM。
让表达克隆的人GLP-1受体的幼仓鼠肾细胞(BHK) (BHK 467-12A)生长在添加100IU/ml青霉素、100μl/ml链霉素、10%胎牛血清和1mg/ml遗传霉素G-418 (Life Technologies)的DMEM培养基上。在缓冲液(10mM Tris-HCl、30mM NaCl和1mM二硫苏糖醇，pH 7.4，另外含有5mg/ml亮肽酶素(leupeptin, Sigma)、5mg/l抑肽素(pepstatin, Sigma)、100mg/l杆菌肽(bacitracin, Sigma)和16mg/l抑肽酶(aprotinin, Calbiochem-Novabiochem, La Jolla, CA))中进行匀浆化制备质膜。将匀浆置于41%w/w蔗糖层的顶部进行离心。位于两层之间的白色条带经缓冲液稀释后离心。质膜在-80℃下储存备用。
通过检测作为对促胰岛素肽或促胰岛素化合物刺激的应答的cAMP来进行功能受体测定。孵育在总体积140ml的96孔微量滴定板上进行，并具有下面的终浓度：50mM Tris-HCl、1mM EGTA、1.5mM MgSO4、1.7mM ATP、20mM GTP、2mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、0.01%w/v Tween-20、pH 7.4。化合物用缓冲液溶解并稀释。新鲜制备GTP用于每个实验：在每个孔内加入2.5μg的膜，混合物在室温、暗处、摇动下孵育90min。加入25ml、0.5M的HCl终止反应。形成的cAMP经邻近闪烁分析(RPA 542, Amersham, UK)来检测。绘制该化合物的剂量反应曲线并使用GraphPad Prism软件计算EC50值。
现有技术中熟知多肽和肽(例如待进行亲脂性修饰的胰高血糖素样肽)的制备。举例来说，多肽或肽可通过经典的肽合成制得，例如使用t-Boc或Fmoc化学的固相肽合成或者其它成熟的技术，参见例如Greene和Wuts [Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley & Sons (1999)]。多肽和肽还可通过下面的方法获得，该方法包括在允许表达该肽的条件下在合适的营养培养基中培养含有编码该肽或多肽并且能够表达该肽或多肽的DNA序列的宿主细胞。对于含有非天然氨基酸残基的肽或多肽来说，重组细胞应该经过修饰，使得这样该非天然氨基酸例如通过使用tRNA突变体被加入该肽或多肽中。
本文使用的术语“利拉糖肽(liraglutide)”用于胰高血糖素样肽(GLP-1)衍生物－Arg34,Lys26(Nε-(γ-Glu(Nα-十六烷酰基)))-GLP-1(7-37)。
本发明进一步概括为下面的内容：
1. 在RP-HPLC系统上将液体混合物中的目标多肽与至少一种不想要的成分分离的方法，所述方法包括：
a. 在RP-HPLC系统中引入含有目标多肽的混合物，该混合物溶解于流动相，其中该流动相的pH值与目标多肽的pI值相差至少1个单位；
b. 将流动相的pH调节至与目标多肽的pI值相差小于1个单位的pH值，其中调节pH通过分段过程或采用pH梯度进行；
c. 洗脱目标多肽从而获得其纯化的组合物。
2. 按照方面1的方法，其中还在步骤b和步骤c之间增加一个步骤，其中，再次将pH调节至与待纯化的肽或蛋白质的pI值相差至少1个单位的pH值，其中所述调节通过分段过程或采用pH梯度进行。
3. 按照方面1或2所述的方法，其中步骤a中的pH值与待纯化的肽或蛋白质的pI值相差至少1.5个单位。
4. 按照前述任一方面所述的方法，其中步骤a中的pH值与待纯化的肽或蛋白质的pI值相差至少2个单位。
5. 按照前述任一方面所述的方法，其中步骤a中的pH值与待纯化的肽或蛋白质的pI值相差至少2.5个单位。
6. 按照前述任一方面所述的方法，其中步骤a中的pH值高于待纯化的肽或蛋白质的pI值。
7. 按照前述任一方面所述的方法，其中步骤a中的pH值为5.5-9.0。
8. 按照前述任一方面所述的方法，其中步骤a中的pH值为6.0-8.5。
9. 按照前述任一方面所述的方法，其中步骤a中的pH值为7.0-8.0。
10. 按照前述任一方面所述的方法，其中步骤a中的pH值为7.0-9.0。
11. 按照前述任一方面所述的方法，其中步骤a中的pH值为大约8.0。
12. 按照前述任一方面所述的方法，其中步骤a中的pH值为2.5-5.0。
13. 按照前述任一方面所述的方法，其中步骤a中的pH值为2.5-4.0。
14. 按照前述任一方面所述的方法，其中步骤a中的pH值为2.5-3.5。
15. 按照前述任一方面所述的方法，其中步骤b中的pH值与待纯化的肽或蛋白质的pI值相差小于0.8个单位。
16. 按照前述任一方面所述的方法，其中步骤b中的pH值与待纯化的肽或蛋白质的pI值相差小于0.6个单位。
17. 按照前述任一方面所述的方法，其中步骤b中的pH值与待纯化的肽或蛋白质的pI值相差小于0.5个单位。
18. 按照前述任一方面所述的方法，其中步骤b中的pH值高于待纯化的肽或蛋白质的pI值。
19. 按照前述任一方面所述的方法，其中步骤b中的pH值为3.5-5.5。
20. 按照前述任一方面所述的方法，其中步骤b中的pH值为4.0-5.5。
21. 按照前述任一方面所述的方法，其中步骤b中的pH值为4.5-5.2。
22. 按照前述任一方面所述的方法，其中步骤b中的pH值为4.5-7.0。
23. 按照前述任一方面所述的方法，其中步骤b中的pH值为4.8-6.5。
24. 按照前述任一方面所述的方法，其中步骤b中的pH值为5.0-6.0。
25. 按照前述任一方面所述的方法，其中步骤b中采用pH梯度来调节流动相的pH。
26. 按照前述任一方面所述的方法，其中所述方法包括与步骤b同时应用有机修饰剂梯度以去除不想要的杂质，同时在RP-HPLC系统中保留目标肽。
27. 按照方面26所述的方法，其中步骤b中的有机修饰剂梯度从约25%-约48%，且pH梯度从pH 7.4-4.5。
28. 按照前述任一方面所述的方法，其中步骤b)中的pH梯度从约7.4至约4.5。
29. 按照前述任一方面所述的方法，其中将所述反相胶上的温度升高。
30. 按照前述方面1-28所述的方法，其中所述反相胶上的温度为20-70℃。
31. 按照前述任一方面所述的方法，其中所述反相胶上的温度升高为40-60℃。
32. 按照前述任一方面所述的方法，其中所述反相胶上的温度升高为约50℃。
33. 按照前述方面1-28中任一个所述的方法，其中所述反相胶上的温度约为室温。
34. 按照前述任一方面所述的方法，其中所述在RP HPLC系统中使用的吸收剂选自下面的组：取代的二氧化硅例如C-4二氧化硅、C-6二氧化硅、C-12二氧化硅、C-18二氧化硅和基于苯基的二氧化硅，聚合体材料例如聚苯乙烯、膜、整体材料和过滤器。
35. 按照前述任一方面所述的方法，其中所述在RP HPLC系统中使用的吸收剂是被C18 (十八烷基-二甲基甲硅烷基)配体取代的凝胶体，其具有约15μm的颗粒且孔径约100?。
36. 按照前述任一方面所述的方法，其中所述肽或蛋白质选自GLP-1肽、毒蜥外泌素肽或GLP-1衍生物。
37. 按照方面26和27所述的方法，其中所述有机修饰剂选自乙醇、甲醇、丙醇和乙腈。
38. 按照前述任一方面所述的方法，其中所述目标多肽是适于治疗糖尿病的多肽。
39. 按照前述任一方面所述的方法，其中所述目标多肽是胰高血糖素样肽或GLP-1激动剂。
40. 按照前述任一方面所述的方法，其中所述目标多肽是GLP-1 (1-37)或其类似物或衍生物。
41. 按照前述任一方面所述的方法，其中所述GLP-1 (1-37)或其类似物或衍生物是重组得到的。
42. 按照前述任一方面所述的方法，其中所述至少一种不想要的成分是所述多肽的其它形式，例如是所述多肽的糖基化形式、脱酰胺形式或氧化形式。
43. 按照前述任一方面所述的方法，其中所述目标多肽与所述至少一种不想要的成分的关系为至少4:1。
44. 按照前述任一方面所述的方法，其中所述目标多肽与所述至少一种不想要的成分的关系为至少10:1。
45. 按照前述任一方面所述的方法，其中所述目标多肽与所述至少一种不想要的成分的关系为至少20:1。
46. 按照前述任一方面所述的方法，其中所述目标多肽与所述至少一种不想要的成分的关系为至少50:1。
47. 按照前述任一方面所述的方法，其中所述目标多肽与所述至少一种不想要的成分的关系为至少80:1。
实施例
实施例1
用RP HPLC方法纯化N-ε 26 -[2-(-2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷酰基氨基)-4(S)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基] [Aib 8 ,Arg 34 ] GLP-1(7-37)肽
合成制备了N-ε26-[2-(-2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷酰基氨基)-4(s)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基] [Aib8,Arg34] GLP-1(7-37)肽。该酰化的混合物首先经传统的离子交换进行纯化，然后得到的含有N-ε26-[2-(-2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷酰基氨基)-4(s)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基] [Aib8,Arg34] GLP-1(7-37)肽以及相关杂质的合并物经水稀释。在20ml C18-取代的(十八烷基-二甲基甲硅烷基)二氧化硅树脂(颗粒尺寸：15μm)上装入10ml液体混合物(4.5mg/ml)，该二氧化硅树脂经约120ml的10mmol/kg的柠檬酸缓冲液，50mmol/kg的NaCl和25%w/w的乙醇, pH 4.5平衡。色谱柱经60ml平衡溶液洗涤，用400ml41-46%w/w乙醇的线性梯度(10mmol/kg的柠檬酸缓冲液，50mmol/kg的NaCl)洗脱。色谱温度保持在50℃。
制备性纯化的色谱图如图1所示。从该色谱图中可以看到杂质2与目标肽峰分离。杂质2相对于目标肽的相对保留体积约为0.93，在pI值观察到了杂质2和目标肽的良好分离。
实施例2
用RP HPLC法纯化N-ε 26 -[2-(-2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷酰基氨基)-4(s)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基] [Aib 8 ,Arg 34 ] GLP-1(7-37)肽
合成制备了N-ε26-[2-(-2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷酰基氨基)-4(s)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基] [Aib8,Arg34] GLP-1(7-37)肽。该酰化的混合物首先经传统的离子交换进行纯化，然后得到的含有N-ε26-[2-(-2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷酰基氨基)-4(s)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基] [Aib8,Arg34] GLP-1(7-37)肽和相关杂质的合并物经水稀释。在20ml C18-取代的(十八烷基-二甲基甲硅烷基)二氧化硅树脂(颗粒尺寸：15μm)上装入10ml液体混合物(4.5mg/ml)，该二氧化硅树脂经约120ml的10mmol/kg的柠檬酸缓冲液，50mmol/kg的NaCl和25%w/w的乙醇,pH 5.2平衡。色谱柱经60ml平衡溶液洗涤，用400ml39-44%w/w乙醇的线性梯度(10mmol/kg的柠檬酸缓冲液，50mmol/kg的NaCl)洗脱。色谱温度保持在50℃。
制备性纯化的色谱图如图2所示。从该色谱图中可以看到杂质2与目标肽峰分离。杂质2相对于目标肽的相对保留体积约为0.94，在pH接近pI值时获得了杂质2与目标肽的良好分离。
实施例3 
RP HPLC方法纯化N-ε 26 -[2-(-2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷酰基氨基)-4(s)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基] [Aib 8 ,Arg 34 ] GLP-1(7-37)肽
合成制备了N-ε26-[2-(-2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷酰基氨基)-4(s)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基] [Aib8,Arg34] GLP-1(7-37)肽。该酰化的混合物首先经传统的离子交换进行纯化，然后得到的含有N-ε26-[2-(-2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷酰基氨基)-4(s)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基] [Aib8,Arg34] GLP-1(7-37)肽和相关杂质的合并物经水稀释。在20ml C18-取代的(十八烷基-二甲基甲硅烷基)二氧化硅树脂(颗粒尺寸：15μm)上装入10ml该液体混合物(4.5mg/ml)，该二氧化硅树脂经约120ml的10mmol/kg的柠檬酸缓冲液，50mmol/kg的NaCl和25%w/w的乙醇,pH 5.5平衡。色谱柱经60ml平衡溶液洗涤，用400ml38-43%w/w乙醇的线性梯度(10mmol/kg的柠檬酸缓冲液，50mmol/kg的NaCl)洗脱。色谱温度保持在50℃。
制备性纯化的色谱图如图3所示。从该色谱图中可以看到杂质2与目标肽峰分离。杂质2相对于目标肽的相对保留体积约为0.96。结果表明：在在或接近pI值的pH获得了杂质2与目标肽的最佳分离。在pH高于5.5时则没有观察到杂质2与目标肽的分离(图未显示)。
实施例4 
RP HPLC法纯化N-ε 26 -[2-(-2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷酰基氨基)-4(s)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基] [Aib 8 ,Arg 34 ] GLP-1(7-37)肽
合成制备了N-ε26-[2-(-2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷酰基氨基)-4(s)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基] [Aib8,Arg34] GLP-1(7-37)肽。该酰化的混合物首先经传统的离子交换进行纯化，然后得到的含有N-ε26-[2-(-2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷酰基氨基)-4(s)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基] [Aib8,Arg34] GLP-1(7-37)肽和相关杂质的合并物经水稀释。在20ml C18-取代的(二甲基甲硅烷基)二氧化硅脂(颗粒尺寸：15μm)上装入10ml该液体混合物(4.5mg/ml)，该二氧化硅树脂经约40ml的10mmol/kg的柠檬酸缓冲液，125mmol/kg的NaCl和25%w/w的乙醇,pH 7.4平衡。色谱柱经60ml的25-48%w/w乙醇的线性梯度(10mmol/kg的柠檬酸缓冲液，125mmol/kg的NaCl，pH 4.5)洗涤，然后经48%w/w的EtOH和pH 4.5的等度洗涤液40ml (10mmol/kg的柠檬酸缓冲液，50mmol/kg的NaCl)。然后目标多肽经300ml的pH 4.5至7.4(10mmol/kg柠檬酸缓冲液，125mmol/kg NaCl，EtOH 48%w/w)的线性pH梯度洗脱。色谱温度保持在50℃。
制备性纯化的色谱图如图5所示。从该色谱图中可以看到杂质2与目标肽峰分离。杂质2相对于目标肽的相对保留体积约为0.96-0.97，在用开始于pI值的pH梯度获得了杂质2与目标肽的满意的分离。
实施例5
RP HPLC法纯化胰岛素ASPART
通过ALP酶切人胰岛素aspart前体制得了人胰岛素aspart desB 30，人胰岛素aspart前体由酵母发酵得到。将含有胰岛素aspart desB 30以及相关杂质的0.52g晶体溶解于40ml的20mmol/kg柠檬酸缓冲液、16%w/w乙醇，pH 4.0中，并将pH调节至约3.7以溶解desB30。在20ml C18-取代的(十八烷基-二甲基甲硅烷基)二氧化硅树脂(颗粒尺寸：15μm)上装入20ml液体混合物(11mg/ml)，该二氧化硅树脂经约60ml的20mmol/kg柠檬酸缓冲液、16%w/w的乙醇，pH 4.0平衡。色谱柱经20ml平衡溶液洗涤，经200ml的16-29%w/w乙醇的线性梯度(20mmol/kg柠檬酸缓冲液，pH 5.8)洗脱，然后经29%w/w的EtOH且pH 5.8的等度洗涤液40ml(20mmol/kg的柠檬酸缓冲液，pH 5.8)。然后目标人胰岛素desB30经pH 5.8-8.0(20mmol/kg Tris缓冲液，EtOH 29%w/w，pH 8.0)的200ml线性pH梯度洗脱。色谱温度保持室温。
制备性纯化的色谱图如图6所示。从该色谱图中可以观察到杂质峰刚好在目标肽峰之前被洗脱。
实施例6
RP HPLC法纯化棕榈酰基-γ-Glu-Lys 26 -Arg 34  GLP-1(7-37)肽
通过酵母发酵制得棕榈酰基-γ-Glu-Lys26-Arg34 GLP-1(7-37)肽。含有棕榈酰基-γ-Glu-Lys26-Arg34 GLP-1(7-37)肽和相关杂质的酰化混合物经水稀释。在20ml C18-取代的(十八烷基-二甲基甲硅烷基)二氧化硅树脂(颗粒尺寸：15μm)上装入36ml液体混合物(4mg/ml)，该二氧化硅树脂经约60ml的20mmol/kg的Tris缓冲液，20%w/w的乙醇，pH 7.5平衡。色谱柱经20ml平衡溶液洗涤，并经200ml的20-50%w/w乙醇的线性梯度(20 mmol/kg柠檬酸缓冲液，pH 5.1)洗脱，然后经50%w/w的EtOH且pH 5.1的等度洗涤液40ml (20mmol/kg柠檬酸缓冲液，pH 5.1)。然后目标棕榈酰基-γ-Glu-Lys26-Arg34 GLP-1(7-37)肽经200ml的pH 5.1-4.0 (20mmol/kg柠檬酸缓冲液，EtOH 50% w/w，pH 4.0)的线性pH梯度洗脱。色谱温度维持在60℃。
制备性纯化的色谱图如图7所示。从该色谱图中可以观察到杂质峰与目标肽峰分离。
本文所引述的所有的参考文献，包括出版物、专利申请和专利通过全文参照加入本说明书中，并且以每篇参考文献被独立和特定地表明用于参照加入并且以其全文被提出的相同程度(法律所允许的最大程度)加入本说明书中。
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本发明包括对随附的权利要求书中记载的主题的、被适用的法律所允许的所有修改和等同物。

Claims (15)

1. 在RP-HPLC系统上将液体混合物中的目标多肽与至少一种不想要的成分分离的方法，所述方法包括：
a.在RP-HPLC系统中引入含有目标多肽的混合物，该混合物溶解于流动相，其中该流动相的pH值与目标多肽的pI值相差至少1个单位；
b.将流动相的pH调节至与目标多肽的pI值相差小于1个单位的pH值，其中调节pH通过分段过程或采用pH梯度进行；
c.洗脱目标多肽从而获得其纯化的组合物。
2. 如权利要求1所述的方法，在步骤b和步骤c之间增加一个步骤，其中，pH再次被调节至与待纯化的肽或蛋白质的pI值相差至少1个单位的pH值，其中所述调节通过分段过程或采用pH梯度进行。
3. 如权利要求1或2所述的方法，其中所述步骤a中的pH值高于待纯化的肽或蛋白质的pI值。
4. 如前述权利要求任一项所述的方法，其中所述步骤a中的pH值为5.5-9.0。
5. 如前述权利要求任一项所述的方法，其中所述步骤b中的pH值为3.5-5.5。
6. 如前述权利要求任一项所述的方法，其中所述步骤b中流动相pH的调节采用pH梯度进行。
7. 如前述权利要求任一项所述的方法，其中所述方法包括与步骤b同时应用有机修饰物梯度，以去除不想要的杂质而同时在RP-HPLC系统上保留目标肽。
8. 如权利要求7所述的方法，其中所述步骤b中有机修饰物梯度为约25%-约48%，且流动相pH的调节采用pH 7.4-4.5的pH梯度进行。
9. 如前述权利要求任一项所述的方法，其中所述步骤b中将流动相的pH由约7.4调节至约4.5。
10. 如前述权利要求任一项所述的方法，其中所述反相胶上的温度为20-70℃。
11. 如前述权利要求任一项所述的方法，其中RP-HPLC系统中使用的吸附剂选自：取代的二氧化硅例如C-4二氧化硅、C-6二氧化硅、C-12二氧化硅、C-18二氧化硅和基于苯基的二氧化硅，聚合体材料例如聚苯乙烯、膜、整体材料和过滤器。
12. 如权利要求7-11中任一项所述的方法，其中所述有机修饰剂选自乙醇、甲醇、丙醇和乙腈。
13. 如前述权利要求任一项所述的方法，其中所述目标多肽为适用于治疗糖尿病的多肽。
14. 如前述权利要求任一项所述的方法，其中所述目标多肽是胰高血糖素样肽或GLP-1激动剂。
15. 如前述权利要求任一项所述的方法，其中所述至少一种不想要的成分是所述多肽的其它形式，例如是所述多肽的糖基化形式、脱酰胺形式或氧化形式。
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