CN102690352A - 含有glp-1的融合蛋白、其药物组合物及用途 - Google Patents
含有glp-1的融合蛋白、其药物组合物及用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102690352A CN102690352A CN201110067152XA CN201110067152A CN102690352A CN 102690352 A CN102690352 A CN 102690352A CN 201110067152X A CN201110067152X A CN 201110067152XA CN 201110067152 A CN201110067152 A CN 201110067152A CN 102690352 A CN102690352 A CN 102690352A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- glp
- fusion protein
- ggggs
- linker peptide
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 97
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 97
- DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N Glucagon-like peptide 1 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N 0.000 title claims abstract description 73
- 101710198884 GATA-type zinc finger protein 1 Proteins 0.000 title claims abstract description 66
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims abstract description 9
- 102100025101 GATA-type zinc finger protein 1 Human genes 0.000 title claims abstract 15
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 8
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 15
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 14
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 14
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 6
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 5
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 claims description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 abstract description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 abstract description 7
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 abstract 1
- 102400000322 Glucagon-like peptide 1 Human genes 0.000 description 52
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 description 18
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 9
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 9
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 8
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 7
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 7
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 7
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 6
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 5
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 5
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 5
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 4
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 4
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 4
- 239000012982 microporous membrane Substances 0.000 description 4
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 3
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 3
- 230000002218 hypoglycaemic effect Effects 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 3
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 3
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 3
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L sodium disulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)S([O-])(=O)=O HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 235000010262 sodium metabisulphite Nutrition 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108010011459 Exenatide Proteins 0.000 description 2
- 101800004266 Glucagon-like peptide 1(7-37) Proteins 0.000 description 2
- 102400000324 Glucagon-like peptide 1(7-37) Human genes 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- -1 PH adjusters Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 2
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 2
- 229960001519 exenatide Drugs 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229940093429 polyethylene glycol 6000 Drugs 0.000 description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000017550 sodium carbonate Nutrition 0.000 description 2
- 229940001584 sodium metabisulfite Drugs 0.000 description 2
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 2
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- DDYAPMZTJAYBOF-ZMYDTDHYSA-N (3S)-4-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-5-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-4-amino-1-[[(2S,3R)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-4-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-4-amino-1-[[(2S)-4-amino-1-[[(2S,3S)-1-[[(1S)-1-carboxyethyl]amino]-3-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1,4-dioxobutan-2-yl]amino]-1,4-dioxobutan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-1,4-dioxobutan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxobutan-2-yl]amino]-1,4-dioxobutan-2-yl]amino]-4-methylsulfanyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-1,5-dioxopentan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-6-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-(1H-imidazol-4-yl)propanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]hexanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical class [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DDYAPMZTJAYBOF-ZMYDTDHYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- HTQBXNHDCUEHJF-XWLPCZSASA-N Exenatide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 HTQBXNHDCUEHJF-XWLPCZSASA-N 0.000 description 1
- 108010088406 Glucagon-Like Peptides Proteins 0.000 description 1
- 101800000224 Glucagon-like peptide 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 208000013016 Hypoglycemia Diseases 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 241000270322 Lepidosauria Species 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003472 antidiabetic agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 238000003287 bathing Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 235000021152 breakfast Nutrition 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- JUFFVKRROAPVBI-PVOYSMBESA-N chembl1210015 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO[C@]3(O[C@@H](C[C@H](O)[C@H](O)CO)[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C3)C(O)=O)O2)O)[C@@H](CO)O1)NC(C)=O)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 JUFFVKRROAPVBI-PVOYSMBESA-N 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 238000012469 hypoglycemic assay Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 229920002796 poly[α-(4-aminobutyl)-L-glycolic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229940057838 polyethylene glycol 4000 Drugs 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000000291 postprandial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L sodium thiosulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=S AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019345 sodium thiosulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种含有GLP-1的融合蛋白、其药物组合物及用途，具有如下通式：GLP-1-连接肽-GLP-1-连接肽-GLP-1-连接肽-人源蛋白-连接肽-GLP-1-连接肽-GLP-1-连接肽-GLP-1。所述连接肽为：GGGGS。所述人源蛋白为HSA。GLP-1融合蛋白能够有效增加GLP-1的血液半衰期，克服其因为半衰期短而无法在临床上使用的现状。在2型糖尿病治疗药物领域较有前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种融合蛋白，尤其是一种具有延长胰高血糖素样肽类体内半衰期的含有GLP-1的融合蛋白及药物组合物，以及在制备糖尿病药物方面的应用。
背景技术
GLP-1(glucagon-likepeptide-1，以下简称：GLP-1)主要是由小肠L细胞分泌的一种37个氨基酸组成的多肽，其活性形式为GLP-1(7-37)OH和GLP-1(7-36)NH2(Mojsov S，J Clin Invest.1987Feb；79(2)：616-9)。GLP-1有明显减低人用餐后的血糖，能刺激胰岛素的产生，同时还能起到一定减肥效应，并且不会引起低血糖症(Drucker D J，Diabetes.1998Feb；47(2)：159-69)。近期研究还表明GLP-1对胰腺再生作用(Drucker D J，2003Dec；144(12)：5145-8)。然而，GLP-1(7-37)的血清半衰期仅仅为3-5分钟，涉及GLP-1肽的治疗用途，来自蜥蜴唾液的人的GLP-1类似物Exendin-4的合成物Exenatide，2005年在美国作为降糖药上市，血中的半衰期到2.5小时左右，每天需要在早饭及晚饭前注射给药，每天多次注射给药在临床使用中非常不方便，因此，延长GLP-1类似物的体内时间对于方便临床应用具有重要的意义。
目前已经有不少研究采用GLP-1类似物融合蛋白技术解决GLP-1类似物在体内的存留时间[CN90101167.3、CN200710018734.2、CN200410054397.9、CN01820232.2、CN200380110152.7、CN200510039265.3、CN200610127237.1、CN200910009642.7]，然而，现有的技术与临床理想的目标还有很大距离，存在GLP-1半衰期短的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，针对GLP-1在体内的存留时间较短，导致治疗作用较短每天需要多次注射给药的缺限，提供具有下述通式I结构的含有GLP-1的融合蛋白。
本发明的另一个目的是提供含有通式I结构的GLP-1融合蛋白作为有效成分以及-种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的药用组合物，及其在制备糖尿病治疗药物中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种含有GLP-1的融合蛋白，具有如下通式I的结构：
GLP-1-连接肽-GLP-1-连接肽-GLP-1-连接肽-人源蛋白-连接肽-GLP-1-连接肽-GLP-1-连接肽-GLP-1
通式I。
所述连接肽为：GGGGS。
所述人源蛋白为HSA。
所述含有GLP-1的融合蛋白具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列或与该序列有90％以上同源性。
所述含有GLP-1的融合蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列SEQ ID NO：5或其互补核苷酸序列。
含有上述任一种GLP-1的融合蛋白的药物组合物。
所述的组合物为液体注射剂或冻干注射剂。
含有上述任一种GLP-1的融合蛋白的组合物在制备治疗糖尿病、肥胖症药物中的应用。
本发明的GLP-1融合蛋白具有更长的体内存留时间，可作为有效成分制备糖尿病治疗药物。相当宽的剂量范围内是有效的，剂量可由医生根据有关的情况来决定，这些情况包括：被治疗者的身体状态、给药途径、年龄、体重、对药物的个体反应，症状的严重程度等。一般来说，本发明活性成分的有效量1×10-7-20mg/kg/天，可以单剂量给药或成分剂量给药。
附图说明
图1显示了本发明的融合蛋白免疫印迹结果(1：GLP-1；2：融合蛋白的GLP-1免疫印迹；3：融合蛋白的HSA免疫印迹)。
图2显示了本发明融合蛋白对小鼠耐糖能力的影响。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：
本发明的通式I的GLP-1或类似物融合蛋白如下述所示：
GLP-1-连接肽-GLP-1-连接肽-GLP-1-连接肽-人源蛋白-连接肽
-GLP-1-连接肽-GLP-1-连接肽-GLP-1
通式I
其中，
连接肽优选为含有5个氨基酸残基的肽链，序列为GGGGS；
GLP-1的氨基酸序列为：7-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-36人源蛋白为：人血清白蛋白。
本发明的通式I的GLP-1融合蛋白是通过下述方法制备的：
1、构建编码本发明的融合蛋白的DNA
本发明中的融合蛋白可以从各种来源获得野生型白蛋白和免疫球蛋白，例如这些蛋白可以从由表达野生型白蛋白及免疫球蛋白的mRNA的组织或细胞的cDNA文库获得。本发明采用标准的PCR方法对相关的融合蛋白的mRNA进行筛选，通过公开的白蛋白及免疫球蛋白的DNA、蛋白序列设计引物。
本发明的融合蛋白(白蛋白、免疫球蛋白)优选来源于天然人序列，以减少融合蛋白在人体内潜在的免疫原性危险。本发明中将根据人血清白蛋白的公开序列设计PCR引物，从人血RNA中钓取人血清白蛋白及人免疫球蛋白的mRNA。通过标准的mRNA逆转录技术，将融合的mRNA逆转录为DNA。
2、构建本发明中GLP-1的DNA
本发明参考专利CN1363654A中GLP-1中双链DNA全长的合成方法，进行GLP-1双链DNA全长的合成。本发明中GLP-1经过标准的DNA测序进行序列验证。
3、构建本发明中GLP-1融合蛋白载体
利用本领域常规的PCR突变技术制备连接有连接短肽的GLP-1用以与蛋白表达质粒的连接。连接技术是本领域常规操作，本发明利用PCR将含有连接肽的GLP-1与蛋白表达质粒通过T4连接酶进行连接，得到本发明中所有融合蛋白的表达载体。一旦产生了编码完整融合蛋白的表达载体，它可以用来传染大肠杆菌，生产融合蛋白。重组DNA载体转化或转染细胞的技术是本领域的常规技术。
4、用于重组表达本发明的融合蛋白的一般方法
用本发明中的表达载体转染或转化宿主细胞，用于表达融合蛋白。参考本领域常规的蛋白表达技术优化本发明中各种融合蛋白的表达，用于增加细胞培养物的原则、技术(例如培养基、温度、pH等)可以参见MammalianCell Biotechnology：A PracticalApproach，M.Butler。本发明中的GLP-1融合蛋白的表达采用本领域常规的lac启动子大肠杆菌融合蛋白表达技术，使用IPTG启动GLP-1融合蛋白的产生。
5、本发明融合蛋白的纯化：
一旦本发明的融合蛋白在适当的宿主细胞中表达，可以通过标准的蛋白分离和纯化技术对本发明中的融合蛋白进行纯化。例如根据融合蛋白表达载体内的标签进行融合蛋白的粗提纯。本发明中，纯化后的融合蛋白可以通过超滤方法将其浓缩至药用浓度，融合蛋白经过紫外线的处理用以增加其药用的安全性。
6、本发明的融合蛋白的表征：
本发明中，可以用许多方法表征本发明的融合蛋白。这些方法中的一些包括：与蛋白染色偶联的SDS-PAGE或免疫印迹技术。本发明中的融合蛋白通过免疫印迹的鉴定，例如使用GLP-1的抗体。
7、本发明的组合物：
本发明的GLP-1融合蛋白，可以与一种或多种药学上可接受的辅料共同制成药物组合物，这些辅料包括：水溶性填充剂、PH调节剂、稳定剂、注射用水、渗透压调节剂等等。该药物组合物可以通过肌肉、静脉内、皮下注射途经进行给药，优选的剂型为冻干或溶液注射剂。
本发明所述的水溶性填充剂辅料包括：甘露醇、低分子右旋糖苷、山梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖、半乳糖等一种或几种的组合。PH调节剂是枸橼酸、磷酸、盐酸等非挥发性的酸以及氢氧化钾、氢氧化钠、或钾或铵、碳酸钠或钾或铵盐、碳酸氢钠或钾或铵盐等生理可接受的有机或无机酸和碱及盐；
稳定剂是EDTA-2Na、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、磷酸氢二钾、碳酸氢钠、碳酸钠、精氨酸、谷氨酸、聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、十二烷基硫酸钠或三羟甲基氨基甲烷的一种或几种的组合。优选焦亚硫酸钠、磷酸氢二钾、精氨酸、聚乙二醇6000、三羟甲基氨基甲烷的一种或几种的组合。
渗透压调节剂，是氯化钠、氯化钾的一种或两种的组合。
所述注射制剂的制备方法包括以下步骤：
(1)冻干剂
取GLP-1融合蛋白和水溶性填充剂、稳定剂、渗透压剂等，加入注射用水适量，调节PH值至5-8.5使其溶解，加水至刻度，加入0.1-0.5％活性炭，在10-25℃下搅拌10-20分钟，脱碳，采用微孔滤膜过滤除菌，滤液进行分装，采用冷冻干燥法，制得白色疏松块状物，封口即得。
(2)溶液注射液
取GLP-1融合蛋白和水溶性填充剂、稳定剂、渗透压剂等，加入注射用水适量，调节PH值至5-8.5使其溶解，加水至刻度，加入0.1-0.5％活性炭，在10-25℃下搅拌10-20分钟，脱碳，采用微孔滤膜过滤除菌，滤液进行分装，封口即得。
下列结合具体实施例对本发明进行详细说明：
实施例1人血清白蛋白编码DNA的构建
本发明中将根据人血清白蛋白的公开序列设计PCR引物，从人血RNA中钓取人血清白蛋白的mRNA。在进行人血清白蛋白mRNA逆转录实验中，设计PCR引物使人血清白蛋白的编码DNA末端含有适合与载体连接的酶切位点(KpnI-HSA-NotI)。通过标准的mRNA逆转录技术，将融合的mRNA逆转录为DNA。
引物1：5 GGT ACC AAG TGG GTA ACC TTT ATT TCC CTT3
引物2：5 GCG GCC GC TAA GCC TAA GGC AGC TTG ACT TGC AGC AA3
将PCR产物进行KpnI/NotI双酶切，产物进行纯化以去除内切酶。
实施例2“GLP-1-GGGGS-GLP-1-GGGGS-GLP-1-GGGGS-”编码DNA的构建
本专利采用全基因合成方法制备编码“GLP-1-GGGGS-GLP-1-GGGGS-GLP-1-GGGGS-”的DNA，基因序列为SEQ ID NO 1及其反向互补序列。
将SEQ ID NO1与其反向互补序列等摩尔混合，95℃水浴5分钟后缓慢冷却至室温，形成双链DNA。利用PCR技术对此双链DNA进行扩增并使其3末端具有与HSA 5末端连接的位点(KpnI)及5末端与表达载体(pET15b)连接的位点(NdeI)。将产物进行(KpnI/NdeI)双酶切，并进行纯化。实施例3“-GGGGS-GLP-1-GGGGS-GLP-1-GGGGS-GLP-1”编码DNA的构建
本专利采用全基因合成方法制备编码“-GGGGS-GLP-1-GGGGS-GLP-1-GGGGS-GLP-1”的DNA，基因序列为SEQ ID NO 3及其反向互补序列。
将SEQ ID NO 3与其反向互补序列等摩尔混合，95℃水浴5分钟后缓慢冷却至室温，形成双链DNA。利用PCR技术对此双链DNA进行扩增并使其5末端具有与HSA 3末端连接的位点(NotI)及3末端具有与表达载体(pET15b)连接的位点(BamHI)将产物进行(NotI/BamHI)双酶切，并纯化。
SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列对应的氨基酸序列SEQ ID NO：2.
SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列对应的氨基酸序列SEQ ID NO：4.
实施例4构建编码“GLP-1-GGGGS-GLP-1-GGGGS-GLP-1-GGGGS-HSA-GGGGS-GLP-1-GGGGS-GLP-1-GGGGS-GLP-1”的DNA
将实施例2中的酶切过的GLP-1-GGGGS-GLP-1-GGGGS-GLP-1-GGGGS-与酶切过的HSA通过KpnI酶切位点进行连接。然后将此连接产物与酶切后的-GGGGS-GLP-1-GGGGS-GLP-1-GGGGS-GLP-1通过NotI酶切位点进行连接。PCR扩增，酶切及连接技术为本领域内熟知的知识及技术。所得核苷酸序列SEQ ID NO 5.
实施例5构建本发明中GLP-1融合蛋白表达载体及融合蛋白的纯化
将表达质粒pET15b进行双酶切(NdeI/BamHI)，然后与实施例4中的产物通过NdeI/BamHI酶切位点进行连接。-旦产生了编码完整融合蛋白的表达载体，它可以用来传染大肠杆菌，生产融合蛋白。重组DNA载体转化或转染细胞的技术是本领域的常规技术。将构建完毕的pET15b[GLP-1-GGGGS-GLP-1-GGGGS-GLP-1-GGGGS-HSA-GGGGS-GLP-1-GGGGS-GLP-1-GGGGS-GLP-1](命名为pET15b6GLP1HSA)以热击转化的方法转入BL21(DE3)感受态细胞，热击转化方法为本领域常规的技术。将转化后的融合蛋白表达载体在含有氨苄青霉素抗生素的LB培养平皿上培养筛选具有氨苄青霉素抗性的细胞。将得到的具有氨苄青霉素抗性的细菌细胞扩大培养后，进行质粒提取及纯化，质粒进行序列鉴定完全正确。将过夜的菌液1：100比例以LB新鲜培养基稀释，37℃培养菌液直至OD600达到0.6，使用IPTG启动融合蛋白的表达，并将体系温度降至25℃。融合蛋白表达16h后，将菌液离心，收集后，超声波破碎菌体，操作程序为：10cycles，15秒/cycle。将破碎后的菌液高速离心，上清液被注入镍柱。用镍柱去捕获含6×HIS标签的融合蛋白，并利用咪唑的浓度梯度对融合蛋白进行洗脱。将洗脱的蛋白收集，利用具有10kDa半透膜的离心管对收集的蛋白进行透析及浓缩。凝血酶处理纯化后的融合蛋白用来切除N末端的6×HIS标签，凝血酶的酶切技术参考Invitrogen公司的实验手册。利用Gel Filtration S-200蛋白纯化柱进行反应混合物的分离，同时对目标融合蛋白进行精纯。上述纯化后的融合蛋白经10K过滤膜过滤浓缩后，紫外线灭菌处理，所得氨基酸序列SEQID NO 6。
实施例6GLP-1融合蛋白的免疫印迹鉴定
用含1％SDS和2mg溴酚蓝的PBS稀释纯化后的融合蛋白。煮沸变性后，取20μl样品置SDS-PAGA胶上，电泳后，将蛋白转至硝酸纤维膜上。用5％脱脂奶粉温室封闭2小时，加入鼠抗人GLP-1的单抗(SantaCruz，USA)室温下孵育1小时，然后用HRP标记的兔抗鼠的多抗进行二抗结合，用ECL试剂盒发光显色(Amersham Pharmacia Biotech，USA)。结果如图1所示本发明的融合蛋白得到了较好的表达。
实施例7
取实施例6的融合蛋白10mg，稳定剂精氨酸0.2g，聚乙二醇60000.05g置于容器中，加注射用水80ml，搅拌使溶解，再加入甘露醇8g、山梨醇2g，搅拌使溶解，以0.1mol/L的氢氧化钠调节PH至6.0-8.0，补加水至100ml。加入0.3g活性碳，在10-25℃下搅拌20分钟，脱碳，采用微孔滤膜过滤除菌，滤液按每支1ml进行分装。预冻2小时后，冷冻下减压干燥18小时，至样品温度到15-20℃后，再干燥5小时，制得白色疏松块状物，封口即得白色冻干粉针，规格100ug/支。
实施例8
取实施例6的融合蛋白25mg，加稳定剂磷酸氢二钾0.05g，氯化钠0.9g，置于容器中，加注射用水70ml搅拌使溶解，再加甘露醇12g，乳糖7g搅拌使溶解，用0.1mol/L的氢氧化钠调节PH至6.5-8.5，补加水至100ml，加入0.25g活性碳，在10-20℃下搅拌20分钟，脱碳，采用微孔滤膜过滤除菌，滤液按每支2ml进行分装，预冻2小时后，冷冻下减压干燥15小时，至样品温度到15-20℃后，再干燥5小时，制得白色疏松块状物，封口即得白色冻干粉针，规格500ug/支。
实施例9
取实施例6的融合蛋白50mg，加入稳定剂三羟甲基氨基甲烷0.2g，焦亚硫酸钠0.1g、氯化钠0.9g至容器中，加注射用水80ml中搅拌溶解，加入碳酸氢钠调节PH为6-8，补加水至100ml，加入0.2g活性炭，在10-25℃搅拌吸附20分钟，除炭，采用微孔滤膜过滤除菌，以每支2ml灌封，即得融合蛋白注射液，规格1000ug/支。
实施例10
取实施例6的融合蛋白5mg，稳定剂谷氨酸0.01g、氯化钾0.09g至容器中，加注射用水70ml搅拌使溶解，加入葡萄糖2g、半乳糖1g搅拌溶解。加氢氧化钠调节PH为7.0-8.5，补加水至100ml，加入0.05g活性炭，在10-25℃搅拌吸附20分钟，除炭，采用微孔滤膜过滤除菌，以每支1ml灌封、即得融合蛋白注射液，规格50ug/支。
实施例11融合蛋白的体内药代动力学
给大鼠注射GLP-1及其融合蛋白(折合含GLP-1为0.5mg/kg)，分别于注射前及注射后0.5、1、3、6、9、12、24、36和48小时后于眼丛静脉取血约0.2ml，制备血清备用。
GLP-1浓度测定方法：采用酶联免疫吸附方法(ELISA)检测小鼠血清中融合蛋白的浓度，操作如下：4℃离心分离血浆。用羊抗鼠的GLP-1浓度测定试剂盒(R&D System Co.，Ltd)对鼠血浆中的GLP-1融合蛋白的浓度进行测定。将1∶1稀释后的鼠血浆样品加入96孔板，加入同体积的GLP-1抗体后，37℃孵育1小时。使用洗液清洗96孔板3次，加入HRP后孵育30分钟。同样的方法对96孔板进行清洗，然后加入50l底物A及底物B，37℃孵育10分钟。用硫酸中止反应后测定450-570nm值，并与标准浓度的GLP-1进行比对及根据ELISA结果计算药代动力学参数。
融合蛋白的体内药代动力学结果见表1，结果显示本发明的融合蛋白在体内的半衰期较单独的GLP-1明显延长，具有长效特性。
表1融合蛋白在大鼠体内的末相半衰期
| 样品来源 | 半衰期(小时) |
| GLP-1 | 0.1 |
| GLP-1融合蛋白 | 8.3 |
实施例12融合蛋白的降血糖实验
给小鼠分别注射GLP-1及融合蛋白(折合含GLP-1为100g/kg)，分别于给药后0.5、1、3、6、9、12、24、36和48小时注射葡萄糖并于尾端测定血糖含量，结果显示GLP-1在0.5小时后基本丧失其降血糖功能，但是融合蛋白药物却在给药24小时后依然存在降血糖功能，图2。
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。
Claims (8)
1.一种含有GLP-1的融合蛋白，其特征在于，具有如下通式I的结构：
GLP-1-连接肽-GLP-1-连接肽-GLP-1-连接肽-人源蛋白-连接肽-GLP-1-连接肽-GLP-1-连接肽-GLP-1
通式I。
2.根据权利要求1所述的含有GLP-1的融合蛋白，其特征在于，所述连接肽为：GGGGS。
3.根据权利要求1或2所述的含有GLP-1的融合蛋白，其特征在于，所述人源蛋白为HSA。
4.根据权利要求3所述的含有GLP-1的融合蛋白，其特征在于，所述含有GLP-1的融合蛋白具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列或与该序列有90％以上同源性。
5.根据权利要求4所述的含有GLP-1的融合蛋白，其特征在于，所述含有GLP-1的融合蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列SEQ ID NO：5或其互补核苷酸序列。
6.含有权利要求1-5任一种GLP-1的融合蛋白的药物组合物。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述的组合物为液体注射剂或冻干注射剂。
8.含有权利要求1-5任一种GLP-1的融合蛋白的组合物在制备治疗糖尿病、肥胖症药物中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110067152XA CN102690352A (zh) | 2011-03-21 | 2011-03-21 | 含有glp-1的融合蛋白、其药物组合物及用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110067152XA CN102690352A (zh) | 2011-03-21 | 2011-03-21 | 含有glp-1的融合蛋白、其药物组合物及用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102690352A true CN102690352A (zh) | 2012-09-26 |
Family
ID=46856103
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201110067152XA Pending CN102690352A (zh) | 2011-03-21 | 2011-03-21 | 含有glp-1的融合蛋白、其药物组合物及用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102690352A (zh) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015014228A1 (zh) * | 2013-08-01 | 2015-02-05 | 江苏泰康生物医药有限公司 | Glp-1类似物融合蛋白，及其制备方法和用途 |
| CN104945514A (zh) * | 2015-07-17 | 2015-09-30 | 李瑛� | 一种胰高血糖样素肽-1的融合蛋白、其制备方法及其药物组合物 |
| CN105884901A (zh) * | 2014-10-11 | 2016-08-24 | 北京美福源生物医药科技有限公司 | 具持续控制血糖含量功能的重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽融合蛋白 |
| CN111944061A (zh) * | 2020-08-10 | 2020-11-17 | 广东药科大学 | 一种胰高血糖素样肽-1类似物单体及其二聚体和应用 |
| WO2020259111A1 (zh) * | 2019-06-24 | 2020-12-30 | 王跃驹 | 植物生产胰高血糖素样肽-1短肽与转铁蛋白的融合蛋白制造口服降糖胶囊的应用 |
| WO2022111713A1 (zh) * | 2020-11-30 | 2022-06-02 | 中国医学科学院药物研究所 | 一种含有二硫键且具有抑制丝氨酸蛋白酶活性的多肽、其衍生的杂交肽及其应用 |
| CN115850503A (zh) * | 2022-07-15 | 2023-03-28 | 赣江中药创新中心 | 一种双靶点融合蛋白及其制备方法和应用 |
| WO2023045996A1 (zh) * | 2021-09-26 | 2023-03-30 | 康霖生物科技（杭州）有限公司 | 一种用于糖代谢相关疾病基因治疗的核酸构建体 |
-
2011
- 2011-03-21 CN CN201110067152XA patent/CN102690352A/zh active Pending
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015014228A1 (zh) * | 2013-08-01 | 2015-02-05 | 江苏泰康生物医药有限公司 | Glp-1类似物融合蛋白，及其制备方法和用途 |
| CN105884901A (zh) * | 2014-10-11 | 2016-08-24 | 北京美福源生物医药科技有限公司 | 具持续控制血糖含量功能的重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽融合蛋白 |
| CN105884901B (zh) * | 2014-10-11 | 2019-10-18 | 北京美福源生物医药科技有限公司 | 具持续控制血糖含量功能的重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽融合蛋白 |
| CN104945514A (zh) * | 2015-07-17 | 2015-09-30 | 李瑛� | 一种胰高血糖样素肽-1的融合蛋白、其制备方法及其药物组合物 |
| CN104945514B (zh) * | 2015-07-17 | 2018-04-27 | 黄秀举 | 一种胰高血糖样素肽-1的融合蛋白、其制备方法及其药物组合物 |
| WO2020259111A1 (zh) * | 2019-06-24 | 2020-12-30 | 王跃驹 | 植物生产胰高血糖素样肽-1短肽与转铁蛋白的融合蛋白制造口服降糖胶囊的应用 |
| CN111944061A (zh) * | 2020-08-10 | 2020-11-17 | 广东药科大学 | 一种胰高血糖素样肽-1类似物单体及其二聚体和应用 |
| CN111944061B (zh) * | 2020-08-10 | 2023-03-10 | 广东药科大学 | 一种胰高血糖素样肽-1类似物单体及其二聚体和应用 |
| WO2022111713A1 (zh) * | 2020-11-30 | 2022-06-02 | 中国医学科学院药物研究所 | 一种含有二硫键且具有抑制丝氨酸蛋白酶活性的多肽、其衍生的杂交肽及其应用 |
| WO2023045996A1 (zh) * | 2021-09-26 | 2023-03-30 | 康霖生物科技（杭州）有限公司 | 一种用于糖代谢相关疾病基因治疗的核酸构建体 |
| CN115850503A (zh) * | 2022-07-15 | 2023-03-28 | 赣江中药创新中心 | 一种双靶点融合蛋白及其制备方法和应用 |
| CN115850503B (zh) * | 2022-07-15 | 2023-09-08 | 赣江中药创新中心 | 一种双靶点融合蛋白及其制备方法和应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11358995B2 (en) | Compositions and methods of use for treating metabolic disorders | |
| CN102690352A (zh) | 含有glp-1的融合蛋白、其药物组合物及用途 | |
| KR101993714B1 (ko) | 대사 장애를 치료하는데 이용하기 위한 조성물과 방법 | |
| US10610568B2 (en) | Compositions and methods of use for treating metabolic disorders | |
| JP6006309B2 (ja) | 作用持続期間が増大し、免疫原性が減少した操作されたポリペプチド | |
| CN103957926B (zh) | 具有增强的作用持续时间和降低的免疫原性的工程改造的多肽 | |
| JP2017529059A5 (zh) | ||
| CN107698684B (zh) | 包含突变的免疫球蛋白Fc部分的GLP-1融合蛋白 | |
| CN102311501A (zh) | 含有glp-1或其类似物的融合蛋白、制备方法及其应用 | |
| US20210253662A1 (en) | Long-Acting Recombinant GLP1-Fc-CD47 Protein and Preparation and Use Thereof | |
| US20190322717A1 (en) | High-activity long-acting hypoglycemic fusion protein as well as preparation method and medical application thereof | |
| JP6612360B2 (ja) | 薬用作用を有する融合タンパク質複合体および融合タンパク質 | |
| CN104945514B (zh) | 一种胰高血糖样素肽-1的融合蛋白、其制备方法及其药物组合物 | |
| CN113105561B (zh) | 一种双靶点融合蛋白的制备方法和应用 | |
| CN118344462B (zh) | 一种用于肺部给药的索马鲁肽突变体、融合蛋白及相关产品 | |
| CN104558198A (zh) | GLP-1类似物和amylin类似物的融合蛋白制备及其用途 | |
| CN102453095A (zh) | 含有glp-1的融合蛋白、制备方法及其应用 | |
| US10017555B2 (en) | Long-acting blood sugar decreasing fusion protein | |
| CN102952192A (zh) | 一种含有Exendin-4的融合蛋白及其用途 | |
| WO2023130875A1 (zh) | 一种肉毒毒素蛋白组合物 | |
| KR20240029769A (ko) | 융합단백질 및 이의 응용 | |
| US10385113B2 (en) | Engineered FGF compositions and methods of use thereof | |
| CN114106194B (zh) | 一种用于治疗糖尿病和/或肥胖症的融合蛋白 | |
| CN102453094A (zh) | 含有Exendin-4的融合蛋白、制备方法及其应用 | |
| KR970009354B1 (ko) | 모티린형 폴리펩티드 및 그 용도 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20120926 |